JPH043823B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するもので
ある。さらに詳しくは本発明は、蛋白質、核酸な
どの生体由来物質の分析およびオートラジオグラ
フイーを用いた分析に適した電気泳動用媒体材料
に関するものである。

［発明の背景］ 電気泳動分析法は、導電性のある媒体中での電
場による移動度が物質によつて異なることを利用
して分析を行うものである。近年において電気泳
動分析法は生体成分の分析に多用されており、特
に病気診断のための生化学検査においてDNAや
蛋白質等の生体高分子の分析を目的として頻繁に
用いられている。

電気泳動分析法及びそれに用いる電気泳動媒体
膜の詳細については、電気泳動学会編「電気泳動
実験法（改訂第５版）」（文光堂、1975年発行）、
青木・永井編著「最新電気泳動法」（広川書店、
1973年発行）等に記載されている。上記文献中に
も明らかなように電気泳動分析法には様々な種類
のものがある。それら各種の電気泳動分析法のう
ちで特に重要なものとして、平板型の電気泳動分
析法を挙げることができる。

平板型の電気泳動分析法は、生化学や医学の分
野における蛋白質や核酸などの生体由来物質の分
離分析に欠くべからざる手段となつているもので
ある。とりわけ、遺伝子工学あるいは遺伝病の研
究等において重要なDNAの塩基配列の決定操作
は、四種の塩基について特異的に分解あるいは合
成されたDNA断片の泳動距離を相互に比較する
ことが必要であるため、平板型の電気泳動分析法
を用いることが必須である。

一般に平板型の電気泳動分析法はシート状であ
る支持体と電気泳動用媒体膜から構成されてい
る。従来の平板型の電気泳動分析法においては、
支持体としてはガラス板を用い、電気泳動用媒体
膜としては支持体に寒天、セルロース、セルロー
スアセテート、デンプン、シリカゲル、ポリアク
リルアミド等の膜形成材料を塗布または流延して
製造したゲル膜を用いている。試料の分析にあた
つては、上記電気泳動用媒体膜に緩衝液をしみこ
ませて、この上に試料を付着させ、支持体の両端
に電圧をかけ、支持体の上または内部で展開（移
動）させている。そして、上記支持体上の試料を
染色し、この染色した試料の光学濃度を測定して
物質の各成分の定量または定性分析を行なつてい
る。

また、上記染色と光学濃度の測定による分析の
代りに、ラジオアイソトープで試料中の目的成分
を標識し、電気泳動分離した後に、オートラジオ
グラフイーによつて試料中の目的成分の分離像を
得ることがしばしば行なわれる。このオートラジ
オグラフイーを用いる方法においては、ラジオア
イソトープで標識された試料を含む電気泳動用媒
体膜とラジオアイソトープの放射線を記録する写
真フイルムを重ねて暗所に放置する操作（これを
露光操作という）を行う。

従来の平板型の電気泳動分析法において、自己
支持性のないアガロース、アクリルアミドなどの
高分子ゲルを電気泳動用媒体膜として用いる場合
には、一枚の支持体の上または二枚の支持体の間
に膜状物（層状物）としてゲルを形成する方法が
用いられてきた。

しかし、一枚の支持体の上にゲル膜を形成して
そのまま分析に使用する方法では、ゲル膜の保存
中、泳動槽にセツトする時、あるいは分析試料を
添加するときなどにあやまつてゲル膜をこわした
り、試料以外のものをゲル膜の上に落してゲル膜
を損つたりすることなどがあり、操作上細心の注
意と熟練が必要であつた。

一方、二枚の支持体の間にゲル膜を形成して分
析に使用する方法では、上記の操作上の注意が少
なくてすむ代りに、ゲルの厚さを均一にすること
が困難であつたり、ゲル形成液がゲル化しないう
ちに、狭いモールド内にゲル液を注入しなければ
ならないことなど操作上高度の熟練を要してい
た。特に、DNAの塩基配列決定操作においては、
一枚のゲルで出来るだけ多くのDNAの断片を分
析できるように、長いゲルを作ることが望ましい
が、そのようなゲルはその製造および取扱いがむ
ずかしかつた。

さらに一枚の支持体の上にゲル膜を形成してか
ら、ゲル膜上にカバーシートを設けて、保存およ
び分析操作を行なう方法も用いられている。しか
し、この方法を用いてもオートラジオグラフイー
における露光操作を行なう場合には、カバーシー
トを取り外す必要がある。オートラジオグラフイ
ーによる分析においてカバーシートの取り外しが
必要なのは、ゲル膜中の試料のアイソトープから
の放射線がカバーシートを通過する際に吸収され
て、その強度が弱められるのを防止するためであ
る。このカバーシートを取り除く操作時に、あや
まつてゲル膜を壊してしまうことがあつたり、ゲ
ル膜の一部が上のカバーシートに付着するような
こともあり、ゲル膜を損傷することなくカバーシ
ートのみを取り除くには熟練が必要であつた。

またカバーシートを取り除いたのちオートラジ
オグラフイーにおける露光操作を行なう際には、
写真フイルムが湿らないように、ゲルを乾燥させ
るか、ゲルの上にプラスチツク製ラツピングシー
トなどの水不透過性の薄いシートをかぶせなけれ
ばならない。このゲルを乾燥させる操作は、得ら
れるオートラジオグラフイーの感度が向上すると
いう利点を有するが、操作中にゲル膜が損傷した
り汚染を受ける危険性があるために、さらに操作
上の注意が必要となる。一方、プラスチツク製ラ
ツピングシートのような薄いシートをかぶせる方
法では、ゲルとシートとの間に気泡が残つたり、
シートにしわができたりすることが多く、このた
めゲルと写真フイルムとの密着性が悪くなり、得
られたオートラジオグラフが、ぼけてしまい、分
解能が低下するという大きな欠点がある。

オートラジオグラフイーによる露光操作におい
てカバーシートを取り外すために生じる上記諸問
題は、特開昭59−126237号公報記載の厚さが
50μm以下であるカバーシートを用いる電気泳動
用分析材料の使用で解決が図られている。すなわ
ち、上記の薄いカバーシートを使用することで、
カバーシートを設けたままでのオートラジオグラ
フイーの露光操作が可能となる。

しかし、オートラジオグラフの感度および分解
能を考慮すると、オートラジオグラフイーにおけ
る露光操作を行なう電気泳動用媒体膜は、操作時
に乾燥した状態にあることがより望ましい。

上記諸問題は電気泳動用媒体膜としてゲル膜を
用いる場合に顕著であるが、他の素材からなる
膜、たとえば自己支持性多孔質膜（例、セルロー
スアセテート多孔質膜、濾紙）等を電気泳動用媒
体膜として用いる場合にも類似した問題が生じて
いる。

［発明の目的］ 本発明の目的は、電気泳動用媒体膜を形成する
操作中、保存中、電気泳動中およびオートラジオ
グラフイーにおける露光操作中において取り扱い
やすい電気泳動用媒体材料を提供することにあ
る。

本発明の他の目的はオートラジオグラフイーを
用いた露光操作における、感度および分解能がす
ぐれている電気泳動用媒体材料を提供することに
ある。

［発明の要旨］ 本発明は、電気泳動用媒体膜をカバーシートと
支持体との間に設けてなる電気泳動用媒体材料で
あつて、上記カバーシートが、シート平面を横切
るような、平均孔径0.01μm〜20μmの微孔（連続
微孔、すなわち透孔）を有するメンブランフイル
ターからなることを特徴とする電気泳動用媒体材
料にある。

［発明の効果］ 本発明の電気泳動用媒体材料はカバーシートを
有することで電気泳動用媒体膜の作成が容易であ
り、保存中および電気泳動中に電気泳動用媒体膜
が壊れにくいという特徴を有する。さらに、本発
明の電気泳動用媒体材料のカバーシートは、シー
ト平面を横切るような連続微孔を有する通気性の
微多孔性メンブランフイルターからなるので、オ
ートラジオグラフイーのために電気泳動用媒体膜
を乾燥する操作においてカバーシートを取りはず
す必要がない。したがつて、本発明の電気泳動用
媒体材料は、作成時から分析操作に至るまで、常
にカバーシートを設けた状態として取り扱うこと
ができる。

すなわち本発明の電気泳動用媒体材料は、作成
中、保存中および電気泳動中に電気泳動用媒体膜
の表面に異物が接触しても、また電気泳動用媒体
膜の部分を持つて取り扱つても、電気泳動用媒体
膜が壊れる危険は殆んどなく、従来の電気泳動媒
体材料より取り扱いが容易である。さらに試料注
入時に、試料口以外のところにサンプルなどを落
してもふきとることができる利点もある。

また、本発明の電気泳動用媒体材料は、オート
ラジオグラフイーの露光操作において電気泳動用
媒体膜が乾燥した状態にあるため、得られるオー
トラジオグラフの感度および分解能が優れてい
る。以上の本発明の効果は、さらにオートラジオ
グラフイーの失敗を少なくすることができること
も意味する。通常、オートラジオグラフイーの露
光には長時間を要しており、もしも前述のような
問題のため、露光に失敗すると、ラジオアイソト
ープの放射能の減衰により次の露光には前回より
もさらに長時間の露光時間を必要とするため、時
間的な損失は非常に大きなものとなる。

それゆえ、本発明によつてオートラジオグラフ
イーの操作が簡便化されることは、実験時間の短
縮に大いに寄与しうるのである。また本発明の電
気泳動用媒体材料は、試料を含む電気泳動膜を乾
燥状態で保存するため、電気泳動後の試料の保存
性が優れている。特に試料が蛋白質である場合に
は、本発明の電気泳動用媒体材料は長期保存が可
能である。さらに本発明の電気泳動用媒体材料
は、シート状であるため、積み重ねて保存でき、
スペースをとらないとの利点もある。

［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体材料の構成例として
は、第１図に示したような、電気泳動用媒体膜２
をカバーシート１および支持体３で挟んだ構成の
ものを挙げることができる。

本発明の電気泳動用媒体材料ではカバーシート
が、シート平面を横切るような連続微孔を有する
微多孔性シートからなることを特徴とする。本発
明において「シート平面を横切るような連続微孔
を有する微多孔性シート」とは、微細（好ましく
は平均孔径が約0.01μm〜約20μm、より好ましく
は約0.01μm〜約10μm）かつ連続した空隙からな
る多数の孔状部が、シート平面に垂直もしくは略
垂直に設けられており、これにより通気性のある
シート状構造体を形成していることを意味する。

上記カバーシートに設けられた連続微孔は、電
気泳動用媒体材料の作成中、保存中および分析操
作中において電気泳動用媒体膜が空気中の微生物
や微粒子による汚染を受けることがないように、
充分に小さな孔径のものであることが望ましい。
すなわち、分析対象となる物質や保存条件および
分析条件等に応じて、連続した空隙からなる孔状
部の平均孔径が決定されるが、一般には20μm以
下、空気中の細菌や同程度の大きさの微粒子の汚
染を完全に防ぐ（すなわち無菌状態とする）ため
には1μm以下、さらにビールスや同程度の超微粒
子の混入を防ぐ必要がある場合にはは0.1μm以下
の平均孔径であることが好ましい。また、微生物
や微粒子による汚染の防止が完全であるために
は、全ての連続微孔がほぼ均一な孔径を有してい
ることが好ましい。

本発明の電気泳動用媒体材料を用いて、カバー
シートを設けたままで電気泳動用媒体膜を乾燥す
る操作を行なう場合、その乾燥操作に要する時間
はカバーシートの空孔率に最も影響を受ける。し
たがつて、乾燥操作に要する時間を短縮するため
には空孔率が高いカバーシートを用いる必要があ
る。また空孔率は、連続微孔の数および平均孔径
によつて決定されるものであるから、連続微孔の
平均孔径を小さくする必要がある場合には、カバ
ーシートの単位面積当りの連続微孔の数が充分に
存在しなければならない。一方、連続微孔の数が
多すぎる（空孔率が大きすぎる）場合にはカバー
シートとしての強度が不足し、取扱いに不便また
は取扱い不可能となることがある。従つてカバー
シートの空孔率は、具体的には約25％〜約90％、
好ましくは約50％〜約85％である。

カバーシート（メンブランフイルター）の材質
は、製造に際して上記の連続微孔を有する構造を
形成することが可能であれば特に制限はないが、
乾燥操作中にカバーシートが歪み等の変形を生じ
るおそれがある場合には、疎水性の素材を用いる
ことが好ましい。疎水性の素材の例としては、ポ
リアミド（ナイロン類）、塩化ビニル、弗素含有
ポリマー（例、ポリテトラフルオロエチレン、テ
トラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレ
ンコポリマー、ポリクロロトリフルオロエチレン
等）、ポリエチレンおよびビスフエノールＡのポ
リカーボネート等を挙げることができる。

カバーシート（メンブランフイルター）の連続
微孔を有する構造は、様々な方法を用いることで
形成することができる。たとえば、コロイド溶液
を凝固させることで上記カバーシートを製造する
方法、シートを膨潤用溶液へ浸すことによつて膨
潤させて連続微孔を形成する方法およびシートを
中性子線で照射後、化学エツチングを用いて連続
微孔を形成する方法、微粉末をシート状に成型し
て加熱シンターする方法等を挙げることができ
る。

メンブランフイルターの詳細については、ロバ
ート・イー・ケステイング（Robert E.
Kesting）著の合成高分子メンブラン（Synthetic
Polymeric Membranes；1971，マグロウ・ヒ
ル・ブツク・カンパニー［McGraw‐Hill Book
Company］）等の文献、米国特許第1421341号明
細書および特公昭53−21677号公報にそれぞれ記
載されている。これらの文献中に記載されている
メンブランフイルターの製造方法を参考にして、
保存条件や分析条件等に応じた、平均孔径、空孔
率および材質等の特性を有する本発明のカバーシ
ートを製造することは容易である。また、メンブ
ランフイルターは、既に多くのメーカーから様々
な種類のものが市販されており、これらの市販品
の中から必要に応じて選択して、本発明のカバー
シートとして用いることもできる。

上記メンブランフイルターの具体例としては、
ポリテトラフルオロエチレン微多孔膜、ポリエチ
レン微多孔膜等を挙げることができる。

カバーシートの厚さ（第１図におけるD¹）は、
カバーシートを通してオートラジオグラフイー用
の露光を実施する場合には、できるだけ薄いもの
が好ましい。具体的には約7μmから約200μmのも
のが用いられ、実用上好ましいのは厚さ約10μm
から約150μmのものであり、特に好ましいのは厚
さ約20μmから約100μmの範囲のものである。

本発明の電気泳動用媒体材料に用いられる支持
体は、平面性のよいシート状のもので、非導電性
かつ実質的に水不透過性であることが好ましい。
支持体の具体例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネートの
ようなポリエステル、ポリメチルメタクリレー
ト、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルなどのビニル系重合体、ナイロンなどのポリア
ミドなど、およびそれらの共重合体（例、塩化ビ
ニリデン・塩化ビニルコポリマー）等を挙げるこ
とができる。

支持体の厚さ（第１図におけるD³）は、約
5μmから約５mm、好ましくは約8μmから約３mmの
範囲から選ばれる。支持体の厚さはカバーシート
と同じであつても異なつていてもよいが、支持体
はカバーシートより厚く腰が強いものであること
が好ましい。

カバーシート１と支持体３は第２図に示すよう
に、左右の両端でシール６ａ，６ｂされているこ
とが望ましい。シールのための幅（L³）は、カ
バーシート１と支持体３がとめられていればよ
く、２mmから20mmの範囲から選ぶことが好まし
い。また、後述するスペーサーにカバーシートと
支持体を接着してシールに代えることもできる。
また他の二辺はシールされていてもよいし、開放
のままでもよい。

本発明の電気泳動用媒体材料に用いられる電気
泳動用媒体膜は特に限定する条件はない。電気泳
動用媒体膜の素材として代表的なものとしては、
アクリルアミドゲル、アガロースゲル、澱粉ゲ
ル、寒天ゲル、セルロースアセテート多孔質膜、
濾紙などを挙げることができる。また、電気泳動
用媒体膜の形状としては、たとえば第１図（断面
模式図）および第２図（平面模式図）に示される
ものを挙げることができる。この電気泳動用媒体
膜の厚さ（D²）は、分離の目的に応じて選ばれ
るが、通常は50μmから約10mmの範囲、好ましく
は、ゲル膜の場合には約200μmから約５mmの範
囲、また多孔質膜や濾紙の場合には約70μmから
約１mmの範囲とされる。また、電気泳動用媒体膜
の大きさ（L¹＋L⁴）は目的に応じて自由に選択
できるが、特にDNAの塩基配列決定用のゲル膜
の場合にはL¹が20cmから40cmの範囲、L⁴が30cm
から60cmの範囲であることが好ましい。

電気泳動用媒体膜の両外側には第２〜５図にそ
れぞれ示すように、電気泳動用媒体膜の厚さを保
持し保護するためのスペーサー５ａ，５ｂがある
ことが望ましい。スペーサーは少なくとも支持体
に接着固定されているか支持体と一体であること
が望ましい。スペーサーと支持体が一体である場
合には、スペーサーと支持体とを一体にモールド
成形等の方法により製造することができる。スペ
ーサーの厚さは、電気泳動用媒体膜２の厚さ
（D²）より大きいことはない。またスペーサーの
幅L²は、５mmから20mmの範囲で選ぶことが好ま
しい。

電気泳動用媒体膜の一端には、垂直式電気泳動
分析を実施する際に試料の注入口として用いられ
るスロツト４（第２図）、あるいは水平式電気泳
動分析を実施する際に試料の注入口として用いら
れる試料溝７（第３〜５図）をあらかじめ成形し
ておくことが便利である。試料注入用スロツト４
を設けた電気泳動用媒体材料は、スロツト全体が
カバーシートに覆われている構造としてもよい
が、スロツトに連なる部分（第２図におけるスロ
ツト４の右側）に試料を注入保持できる範囲をカ
バーシートで覆われるようにして、残部を露出さ
せる構造とすることもできる。また、試料溝７を
設けた電気泳動用媒体材料においては試料溝７が
カバーシート１で覆われている構造としてもよい
し（第３図）、その部分のみカバーシートがない
構造としてもよい（第４図および第５図）。ただ
し、第４図および第５図に示されるような試料溝
の上にカバーシートがない構造の方が望ましい。
また試料溝部分のカバーシートを剥離して開閉で
きる構造にすることもできる。

本発明の電気泳動用媒体材料を作成するには、
たとえば、水平に置いた支持体の上に、流延、塗
布あるいは接着等の公知の方法により電気泳動用
媒体膜を形成した後に、カバーシートをローラー
またはへらなどで押しつけてラミネートする方法
を利用することができる。カバーシートおよび支
持体のそれぞれ電気泳動用媒体膜と接する面は、
電気泳動用媒体膜との親和性をよくするため、公
知の親水化処理方法（例、紫外線照射、グロー放
電処理、コロナ放電処理、電子線照射、火焔処
理、ケミカルエツチング、電解エツチング等）に
よつて処理しておくことが好ましい。また電気泳
動用媒体膜としてゲル膜を用いる場合には、二枚
のシートをガラス板などに貼りつけておき、これ
を用いてモールドを作り、その中でゲル形成液を
ゲル化させることによつて本発明の電気泳動用媒
体材料を製造することもできる。

なお電気泳動用媒体膜中の水分の蒸発を防止す
るために、電気泳動用媒体膜の周囲の適当な辺お
よび本発明のカバーシート（メンブランフイルタ
ー）上を、ヒートシールなどでシールする等の乾
燥防止対策を行なうことが好ましい。上記電気泳
動用媒体膜の乾燥防止対策としては、不透湿紙な
どの袋の中で電気泳動用媒体材料を保存する方法
も挙げることができる。

次に本発明の実施例と比較例を記載する。

［実施例１および比較例１］ 紫外線照射処理により表面を親水性にした厚さ
175μmの無色透明ポリエチレンテレフタレート
（PET）シート（支持体）の上に、以下の組成の
電気泳動用媒体膜形成用溶液100mlに重合開始剤
としてペルオクソ二硫酸アンモニウム（10重量
％）1.3mlとＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチ
レンジアミン50μを加えたものを0.5mmの厚さで
成型し、窒素中でポリアクリルアミドゲル膜を得
た。

電気泳動用媒体膜形成用溶液： 100ml中 アクリルアミド 9.5ｇ Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド 0.5ｇ 尿素 42ｇ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
1.08ｇ ホウ酸 0.55ｇ EDTA・2Na塩 93mg 上記ポリアクリルアミドゲルよりなる電気泳動
用媒体膜の上に、カバーシートとしてポリテトラ
フルオロエチレン（厚み100μm、平均孔径
0.45μmのメンブランフイルター）をのせて、本
発明の電気泳動用媒体材料を作成した。

比較のために二枚のガラスセルを用いてポリア
クリルアミドゲル膜を作成して、比較用電気泳動
用媒体材料とした。この二種類の電気泳動用媒体
材料を用いて、以下の実験を行なつた。

³²Pで標識したDNAをマキサム・ギルバート分
解した試料を上記二種類の電気泳動用媒体材料を
用いて電気泳動分析を行ない、オートラジオグラ
フイーを用いてDNAの塩基配列を決定した。

本発明の電気泳動用媒体材料は、電気泳動終了
後に、カバーシートを取り除くことなく、ゲルド
ライヤーを用いて減圧下で電気泳動用媒体膜を乾
燥させることができた。

これに対して、比較用の電気泳動用媒体材料の
乾燥にはガラス板を除去する必要があり、この除
去操作および乾燥操作の実施には細心の注意を必
要とした。

以上の操作ののちに、それぞれの各電気泳動用
媒体材料についてオートラジオグラフイー操作を
実施したところ、いずれについても鮮鋭な分離像
が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動用媒体材料の構成例
を示す断面模式図である。第２図は本発明の電気
泳動用媒体材料の他の構成例を示す平面模式図で
ある。第３図、第４図および第５図は、全て本発
明の電気泳動用媒体材料の他の各種の構成例の断
面模式図（上側の図）およびその平面模式図（下
側の図）である。 １…カバーシート（メンブランフイルター）、
２…電気泳動用媒体膜、３…支持体、４…試料注
入用スロツト、５ａ，５ｂ…スペーサー、６ａ，
６ｂ…シール部分、７…試料溝、D¹…カバーシ
ート（メンブランフイルター）の厚さ、D²…電
気泳動用媒体膜の厚さ、D³…支持体の厚さ、L¹
…電気泳動用媒体膜の幅、L²…スペーサーの幅、
L³…シール部分の幅、L⁴…電気泳動用媒体膜の
長さ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 電気泳動用媒体膜をカバーシートと支持体と
   の間に設けてなる電気泳動用媒体材料において、
   上記カバーシートが、シート平面を横切るよう
   な、平均孔径0.01μm〜20μmの微孔を有するメン
   ブランフイルターからなることを特徴とする電気
   泳動用媒体材料。 ２ 上記メンブランフイルターが疎水性のメンブ
   ランフイルターである請求項第１項記載の電気泳
   動用媒体材料。 ３ 上記メンブランフイルターが弗素含有ポリマ
   ーからなるメンブランフイルターである請求項第
   １項記載の電気泳動用媒体材料。