JPH043949B2 - - Google Patents
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- JPH043949B2 JPH043949B2 JP58039597A JP3959783A JPH043949B2 JP H043949 B2 JPH043949 B2 JP H043949B2 JP 58039597 A JP58039597 A JP 58039597A JP 3959783 A JP3959783 A JP 3959783A JP H043949 B2 JPH043949 B2 JP H043949B2
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- beads
- water
- collagen fibrils
- aqueous solution
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
- C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、再生コラーゲンフイブリルを含有す
る基質に関し、詳細には、細胞培養用基質又は血
小板の粘着能測定用担体として有用な前記基質に
関するものである。
る基質に関し、詳細には、細胞培養用基質又は血
小板の粘着能測定用担体として有用な前記基質に
関するものである。
動物細胞を大量に培養し、細胞の生産する有用
な物質を大量に分離して利用するための技術は、
生物工学の一分野として注目を浴びている。ま
た、人工臓器の学問領域でも動物細胞を組み込ん
だ型の人工臓器の研究が盛んになりつつある。こ
れら何れの場合にも、生体から取り出した細胞を
培養することによつて、細胞を生理活性を保持さ
せたまた大量に増殖させることが最も重要とな
る。
な物質を大量に分離して利用するための技術は、
生物工学の一分野として注目を浴びている。ま
た、人工臓器の学問領域でも動物細胞を組み込ん
だ型の人工臓器の研究が盛んになりつつある。こ
れら何れの場合にも、生体から取り出した細胞を
培養することによつて、細胞を生理活性を保持さ
せたまた大量に増殖させることが最も重要とな
る。
コラーゲンは生体中では各臓器及び組織を構成
する細胞の支持物質即ち基質として重要な役割を
果している。従つて、現存する物質のうちでは最
もすぐれた細胞培養の基質であるということがで
きる。一般に動物細胞は基質に粘着して成長増殖
するので、有効な基質の存在が細胞の活性維持に
は不可欠である。
する細胞の支持物質即ち基質として重要な役割を
果している。従つて、現存する物質のうちでは最
もすぐれた細胞培養の基質であるということがで
きる。一般に動物細胞は基質に粘着して成長増殖
するので、有効な基質の存在が細胞の活性維持に
は不可欠である。
動物細胞を大量に培養増殖させる場合、巨大な
基質表面が必要となるため、基質の形状は平板状
であるよりは微粒子状である方が著しく有利であ
る。そこで、近年、例えば架橋デキストランを用
いたビーズ状微粒子担体が大量の細胞を培養する
ビーズ基質として開発され、市販されている（フ
アルマシア・ジヤパン株式会社、カタログ
Cytodex1、Beaded Microcarrier for Cell
Culture参照）。
基質表面が必要となるため、基質の形状は平板状
であるよりは微粒子状である方が著しく有利であ
る。そこで、近年、例えば架橋デキストランを用
いたビーズ状微粒子担体が大量の細胞を培養する
ビーズ基質として開発され、市販されている（フ
アルマシア・ジヤパン株式会社、カタログ
Cytodex1、Beaded Microcarrier for Cell
Culture参照）。
前記の通り生体内で各種細胞の基質の役割を果
しているコラーゲンは、これまでも細胞培養の基
質として利用されてきた。しかしながら、従来、
コラーゲンはガラスやプラスチツクの各種製品の
表面に塗布された状態で基質として用いられる
か、コラーゲン酸性液を生理条件に中和して得ら
れるコラーゲンゲルの状態で、このゲルの表面又
は内部において細胞を培養するという方法で用い
られてきたに過ぎない。本発明者らは、コラーゲ
ン基質をビーズ状に形成して細胞が粘着する基質
表面を従来の基質に比べて著しく大きくすれば、
細胞の大量培養が容易に行なわれるようになるこ
とに着目して鋭意研究の結果、本発明を完成する
に至つた。即ち、本発明によつて、不規則にから
み合つた太さ10〜500ｍμの再生コラーゲンフイ
ブリルと、前記再生コラーゲンフイブリルの間に
存在する水溶液とからビーズ形状に構成され、前
記再生コラーゲンフイブリルの含有量が20〜0.01
重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフ
イブリルを含有する基質（以下、これをコラーゲ
ンビーズという）が提供される。
しているコラーゲンは、これまでも細胞培養の基
質として利用されてきた。しかしながら、従来、
コラーゲンはガラスやプラスチツクの各種製品の
表面に塗布された状態で基質として用いられる
か、コラーゲン酸性液を生理条件に中和して得ら
れるコラーゲンゲルの状態で、このゲルの表面又
は内部において細胞を培養するという方法で用い
られてきたに過ぎない。本発明者らは、コラーゲ
ン基質をビーズ状に形成して細胞が粘着する基質
表面を従来の基質に比べて著しく大きくすれば、
細胞の大量培養が容易に行なわれるようになるこ
とに着目して鋭意研究の結果、本発明を完成する
に至つた。即ち、本発明によつて、不規則にから
み合つた太さ10〜500ｍμの再生コラーゲンフイ
ブリルと、前記再生コラーゲンフイブリルの間に
存在する水溶液とからビーズ形状に構成され、前
記再生コラーゲンフイブリルの含有量が20〜0.01
重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフ
イブリルを含有する基質（以下、これをコラーゲ
ンビーズという）が提供される。
前記コラーゲンビーズは、本発明の方法に従つ
て、コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒
中に多数の小滴として分散させて乳濁液を形成
し、前記乳濁液に水と混和する有機溶媒とアルカ
リとを加えて前記小滴を固化させることによつて
得ることができる。
て、コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒
中に多数の小滴として分散させて乳濁液を形成
し、前記乳濁液に水と混和する有機溶媒とアルカ
リとを加えて前記小滴を固化させることによつて
得ることができる。
本発明のコラーゲンビーズは太さ10〜500ｍμ
の再生コラーゲンフイブリルを20〜0.01重量％含
有し、この再生コラーゲンフイブリルは不規則に
からみ合つていることが走査型電子顕微鏡によつ
て確められる。この再生コラーゲンフイブリルの
間には水溶液が存在し、この水溶液は、他の、水
と混和しうる液体と置換可能である。例えば、生
理食塩水が再生コラーゲンフイブリルの間に存在
するコラーゲンビーズの場合、このコラーゲンビ
ーズを細胞培養用の水性培地に浸漬すると、前記
生理食塩水はこの水性培地によつて置換される。
の再生コラーゲンフイブリルを20〜0.01重量％含
有し、この再生コラーゲンフイブリルは不規則に
からみ合つていることが走査型電子顕微鏡によつ
て確められる。この再生コラーゲンフイブリルの
間には水溶液が存在し、この水溶液は、他の、水
と混和しうる液体と置換可能である。例えば、生
理食塩水が再生コラーゲンフイブリルの間に存在
するコラーゲンビーズの場合、このコラーゲンビ
ーズを細胞培養用の水性培地に浸漬すると、前記
生理食塩水はこの水性培地によつて置換される。
本発明において用いられるコラーゲンは、若い
動物のコラーゲン組織を、中性塩水溶液及び希酸
水溶液でそれぞれ抽出して得られる中性塩可溶性
コラーゲン及び酸可溶性コラーゲンであつてよ
い。又、これらの抽出操作では可溶性を示さない
不溶性コラーゲンをペプシンのようなタンパク質
加水分解酵素で処理して可溶性とした酵素溶解コ
ラーゲン（アテロコラーゲン）や、同じく不溶性
コラーゲンをアルカリ処理により可溶化したコラ
ーゲンを本発明で用いられるコラーゲンとするこ
とができる。ここで、アテロコラーゲン
（Atelocollagen）とは、テロペプチドのとれたコ
ラーゲンに対して比較的最近つけられた名称であ
る。前記の不溶性コラーゲンは、分子末端に存在
するテロペプチドを介し形成されている分子間架
橋によつて不溶性となつている。タンパク質加水
分解酵素であるペプシンを不溶性コラーゲンに作
用させるとテロペプチドのみが消化されて分子間
架橋が切断されるので、この不溶性コラーゲンは
可溶化されてアテロコラーゲンが得られる。アテ
ロコラーゲンは又、希酸や中性塩の水溶液で抽出
された可溶性コラーゲンをペプシン処理しても得
られる。
動物のコラーゲン組織を、中性塩水溶液及び希酸
水溶液でそれぞれ抽出して得られる中性塩可溶性
コラーゲン及び酸可溶性コラーゲンであつてよ
い。又、これらの抽出操作では可溶性を示さない
不溶性コラーゲンをペプシンのようなタンパク質
加水分解酵素で処理して可溶性とした酵素溶解コ
ラーゲン（アテロコラーゲン）や、同じく不溶性
コラーゲンをアルカリ処理により可溶化したコラ
ーゲンを本発明で用いられるコラーゲンとするこ
とができる。ここで、アテロコラーゲン
（Atelocollagen）とは、テロペプチドのとれたコ
ラーゲンに対して比較的最近つけられた名称であ
る。前記の不溶性コラーゲンは、分子末端に存在
するテロペプチドを介し形成されている分子間架
橋によつて不溶性となつている。タンパク質加水
分解酵素であるペプシンを不溶性コラーゲンに作
用させるとテロペプチドのみが消化されて分子間
架橋が切断されるので、この不溶性コラーゲンは
可溶化されてアテロコラーゲンが得られる。アテ
ロコラーゲンは又、希酸や中性塩の水溶液で抽出
された可溶性コラーゲンをペプシン処理しても得
られる。
本発明の方法に使用される、水と混和しない有
機溶媒として、トルエン、四塩化炭素、クロロホ
ルム、シクロヘキサン、エーテル、石油エーテ
ル、ベンゾールなどが挙げられる。これらの有機
溶媒を適当に混合して、その比重を、分散させよ
うとするコラーゲン水溶液の比重にできる限り近
づけて、コラーゲン水溶液が浮き上つたり、沈降
したりするのを防ぐことが、コラーゲン水溶液を
小滴に分散させるのに好ましい。コラーゲン溶液
を小滴に分散させて乳濁液を形成するには、水と
混和しない有機溶媒にコラーゲン水溶液を入れ、
撹拌又は振盪するなど、慣用の乳濁液調製法を用
いることができる。分散される小滴の大きさの調
節は、撹拌又は振盪の程度を加減することによつ
て行なうことができる。コラーゲン溶液の使用量
は有機溶媒と等量又はそれより少ないことが望ま
しい。コラーゲン水溶液の濃度はコラーゲン５％
以下が望ましく、５％を超すと粘稠になり過ぎて
分散が困難となる。又、形成された乳濁液の安定
性をよくするために、界面活性剤を少量添加する
ことが好ましい。使用される界面活性剤は非イオ
ン界面活性剤が好ましく、例えばソルビタン脂肪
酸エステルについての米国アトラス・パウダー社
の登録商標であるスパン（Ppan）系のもの及び
ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル
についてのアトラス・パウダー社の登録商標であ
るトウイーン（Tween）系のものが挙げられる。
界面活性剤の使用量は、有機溶媒とコラーゲン溶
液との混合物の重量を基準にして0.1％以下が好
ましい。
機溶媒として、トルエン、四塩化炭素、クロロホ
ルム、シクロヘキサン、エーテル、石油エーテ
ル、ベンゾールなどが挙げられる。これらの有機
溶媒を適当に混合して、その比重を、分散させよ
うとするコラーゲン水溶液の比重にできる限り近
づけて、コラーゲン水溶液が浮き上つたり、沈降
したりするのを防ぐことが、コラーゲン水溶液を
小滴に分散させるのに好ましい。コラーゲン溶液
を小滴に分散させて乳濁液を形成するには、水と
混和しない有機溶媒にコラーゲン水溶液を入れ、
撹拌又は振盪するなど、慣用の乳濁液調製法を用
いることができる。分散される小滴の大きさの調
節は、撹拌又は振盪の程度を加減することによつ
て行なうことができる。コラーゲン溶液の使用量
は有機溶媒と等量又はそれより少ないことが望ま
しい。コラーゲン水溶液の濃度はコラーゲン５％
以下が望ましく、５％を超すと粘稠になり過ぎて
分散が困難となる。又、形成された乳濁液の安定
性をよくするために、界面活性剤を少量添加する
ことが好ましい。使用される界面活性剤は非イオ
ン界面活性剤が好ましく、例えばソルビタン脂肪
酸エステルについての米国アトラス・パウダー社
の登録商標であるスパン（Ppan）系のもの及び
ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル
についてのアトラス・パウダー社の登録商標であ
るトウイーン（Tween）系のものが挙げられる。
界面活性剤の使用量は、有機溶媒とコラーゲン溶
液との混合物の重量を基準にして0.1％以下が好
ましい。
本発明の方法において、小滴の固化に使用され
るアルカリとして、アンモニア、リン酸水素二ナ
トリウム（Na2HPO4）、水酸化ナトリウムなど
の塩基性物質を挙げることができる。又、小滴の
固化に使用される、水と混和する有機溶媒とし
て、メタノール、エタノール、アセトンなどが挙
げられる。これらのアルカリ及び有機溶媒は、乳
濁液にこれらを同時に加えるか、又は有機溶媒を
加えた後にアルカリを加えるようにして使用され
る。水と混和する有機溶媒の使用量は乳濁液の重
量を基準にして50％以上であることが好ましい。
アルカリの使用量は分散したコラーゲン水溶液の
小滴を中和するだけの量であればよい。水と混和
する有機溶媒と塩基性物質の水溶液との混合物を
乳濁液に加えて小滴を固化させる方法が特に好ま
しく、特にアンモニア水をメタノール、エタノー
ル又はアセトンに加えた混合物が好ましく、アン
モニア含有量は通常１〜２％である。
るアルカリとして、アンモニア、リン酸水素二ナ
トリウム（Na2HPO4）、水酸化ナトリウムなど
の塩基性物質を挙げることができる。又、小滴の
固化に使用される、水と混和する有機溶媒とし
て、メタノール、エタノール、アセトンなどが挙
げられる。これらのアルカリ及び有機溶媒は、乳
濁液にこれらを同時に加えるか、又は有機溶媒を
加えた後にアルカリを加えるようにして使用され
る。水と混和する有機溶媒の使用量は乳濁液の重
量を基準にして50％以上であることが好ましい。
アルカリの使用量は分散したコラーゲン水溶液の
小滴を中和するだけの量であればよい。水と混和
する有機溶媒と塩基性物質の水溶液との混合物を
乳濁液に加えて小滴を固化させる方法が特に好ま
しく、特にアンモニア水をメタノール、エタノー
ル又はアセトンに加えた混合物が好ましく、アン
モニア含有量は通常１〜２％である。
アルカリと、水と混和する有機溶媒とを加えた
後、乳濁液をゆるやかに１時間以上撹拌すると、
コラーゲン水溶液の小滴が固化する。この際、用
いる容器に予めシリコーンオイルなどを塗布して
おくと、固化したコラーゲンビーズが容器壁に粘
着するのを防ぐことができるので好都合である。
後、乳濁液をゆるやかに１時間以上撹拌すると、
コラーゲン水溶液の小滴が固化する。この際、用
いる容器に予めシリコーンオイルなどを塗布して
おくと、固化したコラーゲンビーズが容器壁に粘
着するのを防ぐことができるので好都合である。
固化したコラーゲンビーズは遠心分離又は網で
ろ別分離され、メタノール、エタノール、アセト
ンなどの、水と混和する有機溶媒で繰り返し洗浄
され、次に水でさらに繰り返し洗浄される。
ろ別分離され、メタノール、エタノール、アセト
ンなどの、水と混和する有機溶媒で繰り返し洗浄
され、次に水でさらに繰り返し洗浄される。
こうして得られたコラーゲンビーズはその粒度
が多少不揃いなので、ふるい分けにより各メツシ
ユ範囲の画分、例えば48メツシユふるい上、48〜
100メツシユ画分、100〜200メツシユ画分及び200
メツシユふるい下のように粒度を揃えることがで
きる。
が多少不揃いなので、ふるい分けにより各メツシ
ユ範囲の画分、例えば48メツシユふるい上、48〜
100メツシユ画分、100〜200メツシユ画分及び200
メツシユふるい下のように粒度を揃えることがで
きる。
本発明のコラーゲンビーズは、前記の通り不規
則にからみ合つた再生コラーゲンフイブリルを含
み、培養液中に懸濁した状態で細胞培養の基質と
して用いると、細胞粘着に有効な基質表面を大き
くすることができ、細胞の大量培養を容易にす
る。
則にからみ合つた再生コラーゲンフイブリルを含
み、培養液中に懸濁した状態で細胞培養の基質と
して用いると、細胞粘着に有効な基質表面を大き
くすることができ、細胞の大量培養を容易にす
る。
コラーゲン水溶液として例えば濃度１％の溶液
を使用した場合、水洗後に最終的に得られるコラ
ーゲンビーズのコラーゲン含量は約１％であり、
残り99％が主として水である。従つて、このビー
ズが培養液中で平衡化すると、ビーズ中の水の大
部分は培養液で置換され、ビースの比重は培養液
の比重と殆んど一致するようになり、培養中もゆ
るやかな撹拌によつてビーズはゆつくり移動し、
ビーズに粘着した細胞を損傷することがない。
を使用した場合、水洗後に最終的に得られるコラ
ーゲンビーズのコラーゲン含量は約１％であり、
残り99％が主として水である。従つて、このビー
ズが培養液中で平衡化すると、ビーズ中の水の大
部分は培養液で置換され、ビースの比重は培養液
の比重と殆んど一致するようになり、培養中もゆ
るやかな撹拌によつてビーズはゆつくり移動し、
ビーズに粘着した細胞を損傷することがない。
本発明のコラーゲンビーズはまた血小板の粘着
能測定にも利用することができる。血小板はコラ
ーゲンフイブリルに粘着し、さらに凝集反応を起
こすことが知られている。従つて、本発明のコラ
ーゲンビーズをカラムに充てんし、このカラム
に、血小板を含む試料溶液（血液；クエン酸ナト
リウム、EDTAなど血液凝固阻止剤を添加した
血液；又は多血小板血漿など）を通し、カラム内
のコラーゲンビーズに粘着する血小板数を数える
ことによつて血小板粘着能を測定することができ
る。この粘着能測定値から血液の凝固活性を知る
ことができ、血液が関係する病気例えば血栓症の
診断の１つとして利用することができるのであ
る。
能測定にも利用することができる。血小板はコラ
ーゲンフイブリルに粘着し、さらに凝集反応を起
こすことが知られている。従つて、本発明のコラ
ーゲンビーズをカラムに充てんし、このカラム
に、血小板を含む試料溶液（血液；クエン酸ナト
リウム、EDTAなど血液凝固阻止剤を添加した
血液；又は多血小板血漿など）を通し、カラム内
のコラーゲンビーズに粘着する血小板数を数える
ことによつて血小板粘着能を測定することができ
る。この粘着能測定値から血液の凝固活性を知る
ことができ、血液が関係する病気例えば血栓症の
診断の１つとして利用することができるのであ
る。
本発明のコラーゲンビーズの製造を無菌条件下
で行なうと無菌のビーズを得ることができるが、
無菌条件下で製造されなかつたコラーゲンビーズ
は、密封容器に入れ、γ線を好ましくは0.5〜
1.5Mrad照射することによつて無菌とすることが
できる。
で行なうと無菌のビーズを得ることができるが、
無菌条件下で製造されなかつたコラーゲンビーズ
は、密封容器に入れ、γ線を好ましくは0.5〜
1.5Mrad照射することによつて無菌とすることが
できる。
次に本発明を実施例について詳細に説明する。
実施例 １
取り出した新鮮な仔牛の真皮をステフアン
（Stephan）社製のミクロカツターで微細に粉砕
し、この微細粉を0.1M酢酸ナトリウム水溶液で
くり返し洗浄後、水洗した。次に、水洗後の微細
粉を0.5M酢酸水溶液を用いて抽出処理を行ない、
残渣である不溶性コラーゲンをガラスフイルター
でろ別した。抽出された酸可溶性コラーゲンを含
むろ液を0.02Mリン酸水素二ナトリウム
（Na2HPO4）水溶液を用いて透析を行ない、酸
可溶性コラーゲンをコラーゲンフイブリルとして
沈殿させた。このコラーゲンフイブリルをくり返
し水洗した後、0.01N塩酸に溶解して、コラーゲ
ン濃度を１重量％とした。この酸可溶性コラーゲ
ン溶液の比重は約1.00であつた。
（Stephan）社製のミクロカツターで微細に粉砕
し、この微細粉を0.1M酢酸ナトリウム水溶液で
くり返し洗浄後、水洗した。次に、水洗後の微細
粉を0.5M酢酸水溶液を用いて抽出処理を行ない、
残渣である不溶性コラーゲンをガラスフイルター
でろ別した。抽出された酸可溶性コラーゲンを含
むろ液を0.02Mリン酸水素二ナトリウム
（Na2HPO4）水溶液を用いて透析を行ない、酸
可溶性コラーゲンをコラーゲンフイブリルとして
沈殿させた。このコラーゲンフイブリルをくり返
し水洗した後、0.01N塩酸に溶解して、コラーゲ
ン濃度を１重量％とした。この酸可溶性コラーゲ
ン溶液の比重は約1.00であつた。
一方、容器にトルエン800mlとクロロホルム220
mlを入れて混合溶媒を調製した。この混合溶媒の
比重は前記酸可溶性コラーゲン溶液の比重とほぼ
等しかつた。この混合溶媒にスパン20（スパン
（Span）はソルビタンモノラウリン酸エステル系
非イオン界面活性剤についてのアトラス・パウタ
ー社の登録商標）を混合溶媒の重量の0.1％にな
るように加えた後、さらに前記１％濃度の酸可溶
性コラーゲン水溶液300mlを加えた。次に、容器
を約30秒間激しく振盪した後、直ちに２％のアン
モニアを含有するエタノール１を加え、ゆるや
かに２時間撹拌したところ、固化した分散状態の
微粒子状コラーゲンビーズが得られた。このビー
ズの分散液を200メツシユのステンレス製金網で
ろ過してビーズをろ別した。得られたビーズを
500mlのエタノールに浸漬−ろ別する方法で合計
３回の洗浄を行なつた。次にこのビーズに１の
蒸留水による洗浄を３回くり返し行なつた後、48
メツシユ、100メツシユ及び200メツシユの各ステ
ンレス製金網で順次ふるい分けを行つて粒度分布
を測定し、次の結果を得た。
mlを入れて混合溶媒を調製した。この混合溶媒の
比重は前記酸可溶性コラーゲン溶液の比重とほぼ
等しかつた。この混合溶媒にスパン20（スパン
（Span）はソルビタンモノラウリン酸エステル系
非イオン界面活性剤についてのアトラス・パウタ
ー社の登録商標）を混合溶媒の重量の0.1％にな
るように加えた後、さらに前記１％濃度の酸可溶
性コラーゲン水溶液300mlを加えた。次に、容器
を約30秒間激しく振盪した後、直ちに２％のアン
モニアを含有するエタノール１を加え、ゆるや
かに２時間撹拌したところ、固化した分散状態の
微粒子状コラーゲンビーズが得られた。このビー
ズの分散液を200メツシユのステンレス製金網で
ろ過してビーズをろ別した。得られたビーズを
500mlのエタノールに浸漬−ろ別する方法で合計
３回の洗浄を行なつた。次にこのビーズに１の
蒸留水による洗浄を３回くり返し行なつた後、48
メツシユ、100メツシユ及び200メツシユの各ステ
ンレス製金網で順次ふるい分けを行つて粒度分布
を測定し、次の結果を得た。
48メツシユふるい上 約30％
48〜100メツシユ画分 約50％
100〜200メツシユ画分 約10％
200メツシユふるい下 約10％
第１図はこのコラーゲンビーズの走査型電子顕
微鏡写真を示している。第１図から明らかなよう
に、再生コラーゲンフイブリルが不規則にからみ
合つている。
微鏡写真を示している。第１図から明らかなよう
に、再生コラーゲンフイブリルが不規則にからみ
合つている。
これらの各粒度のビーズを密封ガラス瓶に入
れ、γ線を0.75Mrad照射して滅菌を行なつた。
このうち、48〜100メツシユ画分の粒度のコラー
ゲンビーズを用いてヒト真皮繊維芽細胞の培養試
験を行なつたところ、細胞は数時間でビーズ上に
粘着し、５日後にはビーズの表面を完全に覆う程
増殖し、このビーズは細胞の基質としてすぐれた
ものであることがわかつた。第２図は、前記培養
試験に使用した後のコラーゲンビーズの形状を示
す位相差顕微鏡写真である。
れ、γ線を0.75Mrad照射して滅菌を行なつた。
このうち、48〜100メツシユ画分の粒度のコラー
ゲンビーズを用いてヒト真皮繊維芽細胞の培養試
験を行なつたところ、細胞は数時間でビーズ上に
粘着し、５日後にはビーズの表面を完全に覆う程
増殖し、このビーズは細胞の基質としてすぐれた
ものであることがわかつた。第２図は、前記培養
試験に使用した後のコラーゲンビーズの形状を示
す位相差顕微鏡写真である。
実施例 ２
実施例１で仔牛の真皮から酸可溶物を抽出した
後の残渣である不溶性コラーゲンを湿潤状態で
100ｇ採取し、これに0.5M酢酸１を加え、さら
にペプシン0.1ｇを加えて、20℃で３日間撹拌を
行なつた。この処理によつて不溶性コラーゲンは
溶解して粘稠なペプシン可溶化コラーゲン（即ち
アテロコラーゲン）溶液となつた。このアテロコ
ラーゲン溶液をガラスフイルターでろ過後、ろ液
に苛性ソーダ水溶液を加えてPH7.5に調節したと
ころ、繊維状の沈殿が生成した。この沈殿を遠心
分離機によつて分離した後、蒸留水で３回洗浄を
行ない、次に適当量の0.01N塩酸に溶解し、コラ
ーゲン濃度２％の溶液（比重約1.01）を調製し
た。
後の残渣である不溶性コラーゲンを湿潤状態で
100ｇ採取し、これに0.5M酢酸１を加え、さら
にペプシン0.1ｇを加えて、20℃で３日間撹拌を
行なつた。この処理によつて不溶性コラーゲンは
溶解して粘稠なペプシン可溶化コラーゲン（即ち
アテロコラーゲン）溶液となつた。このアテロコ
ラーゲン溶液をガラスフイルターでろ過後、ろ液
に苛性ソーダ水溶液を加えてPH7.5に調節したと
ころ、繊維状の沈殿が生成した。この沈殿を遠心
分離機によつて分離した後、蒸留水で３回洗浄を
行ない、次に適当量の0.01N塩酸に溶解し、コラ
ーゲン濃度２％の溶液（比重約1.01）を調製し
た。
トルエン400mlとクロロホルム115mlとから混合
溶媒（比重約1.008）を調製し、これに非イオン
界面活性剤トウイーン80（トウイーン（Tween）
はソルビタンモノオレアートのエチレンオキシド
縮合物系非イオン界面活性剤についてのアトラ
ス・パウダー社の登録商標）を混合溶媒の重量に
対して0.1％加え、さらに前記の２％コラーゲン
水溶液を150ml加えた。得られた溶液を高速回転
のホモジナイザーを用いて10000rpmで１分間高
速撹拌を行なつて均質にした後、直ちにアンモニ
アを２％含有するメタノール中に混合し、ゆつく
り撹拌を行なつたところ、微粒子ビーズが固化し
た状態で得られた。
溶媒（比重約1.008）を調製し、これに非イオン
界面活性剤トウイーン80（トウイーン（Tween）
はソルビタンモノオレアートのエチレンオキシド
縮合物系非イオン界面活性剤についてのアトラ
ス・パウダー社の登録商標）を混合溶媒の重量に
対して0.1％加え、さらに前記の２％コラーゲン
水溶液を150ml加えた。得られた溶液を高速回転
のホモジナイザーを用いて10000rpmで１分間高
速撹拌を行なつて均質にした後、直ちにアンモニ
アを２％含有するメタノール中に混合し、ゆつく
り撹拌を行なつたところ、微粒子ビーズが固化し
た状態で得られた。
これらの微粒子ビーズを金網で分別し、メタノ
ールで３回洗浄し、さらに３回水洗を行なつた
後、実施例１と同様にして粒度分布を測定して次
の結果を得た。
ールで３回洗浄し、さらに３回水洗を行なつた
後、実施例１と同様にして粒度分布を測定して次
の結果を得た。
48メツシユふるい上 約10％
48〜100メツシユ画分 約60％
100〜200メツシユ画分 約20％
200メツシユふるい下 約10％
これらのビーズはいずれもコラーゲンフイブリ
ルから構成されていることが走査型電子顕微鏡観
察によつて確認された。
ルから構成されていることが走査型電子顕微鏡観
察によつて確認された。
ふるい分けた各ビーズを密封ガラス瓶に入れ、
γ線を1Mrad照射して消毒した。このうち、48
〜100メツシユ画分のビーズとヒト真皮繊維芽構
胞とを用いて懸濁培養を行なつたところ、このコ
ラーゲンビーズはすぐれた基質であることがわか
つた。
γ線を1Mrad照射して消毒した。このうち、48
〜100メツシユ画分のビーズとヒト真皮繊維芽構
胞とを用いて懸濁培養を行なつたところ、このコ
ラーゲンビーズはすぐれた基質であることがわか
つた。
実施例 ３
実施例２と同様の方法で得られたペプシン可溶
化コラーゲン（アテロコラーゲン）を0.01N塩酸
に溶解し、コラーゲンの濃度が１％になるように
調製した。この１％アテロコラーゲン溶液を、オ
ートクレーブ消毒した細孔径0.45μのフイルター
に通して無菌溶液とした。
化コラーゲン（アテロコラーゲン）を0.01N塩酸
に溶解し、コラーゲンの濃度が１％になるように
調製した。この１％アテロコラーゲン溶液を、オ
ートクレーブ消毒した細孔径0.45μのフイルター
に通して無菌溶液とした。
一方、トルエン400mlとクロロホルム110mlとの
混合溶媒に、非イオン界面活性剤スパン20（実施
例１参照）を0.1％加え、この混合溶媒を、消毒
した0.22μのミクロフイルターに通して無菌とし
た。得られた無菌の混合溶媒に前記の無菌の１％
アテロコラーゲン水溶液を100ml加え、激しく30
秒間振盪した。その後直ちに、この溶液に、細孔
径0.22μのフイルターに通して無菌としたエタノ
ールを500ml加え、ゆるやかに２時間撹拌した後、
２％アンモニア水を10ml加え、ゆるやかな撹拌を
さらに２時間続けた結果、分散状態で固化した微
粒子ビーズが得られた。
混合溶媒に、非イオン界面活性剤スパン20（実施
例１参照）を0.1％加え、この混合溶媒を、消毒
した0.22μのミクロフイルターに通して無菌とし
た。得られた無菌の混合溶媒に前記の無菌の１％
アテロコラーゲン水溶液を100ml加え、激しく30
秒間振盪した。その後直ちに、この溶液に、細孔
径0.22μのフイルターに通して無菌としたエタノ
ールを500ml加え、ゆるやかに２時間撹拌した後、
２％アンモニア水を10ml加え、ゆるやかな撹拌を
さらに２時間続けた結果、分散状態で固化した微
粒子ビーズが得られた。
このビーズを、実施例１と同様の操作で、かつ
無菌下でエタノール洗浄、水洗を行ない、さらに
ふるい分けを行なつた。ふるい分けの結果は次の
通りであつた。
無菌下でエタノール洗浄、水洗を行ない、さらに
ふるい分けを行なつた。ふるい分けの結果は次の
通りであつた。
48メツシユふるい上 約25％
48〜100メツシユ画分 約55％
100〜200メツシユ画分 約10％
200メツシユふるい下 約10％
こうして得られたコラーゲンビーズは走査型電
子顕微鏡観察の結果、再生コラーゲンフイブリル
からなつていることがわかり、又、細胞培養試験
の結果、すぐれた基質であることがわかつた。
子顕微鏡観察の結果、再生コラーゲンフイブリル
からなつていることがわかり、又、細胞培養試験
の結果、すぐれた基質であることがわかつた。
第１図は本発明の実施例１において得られた、
培養試験に使用する前のコラーゲンビーズが含有
する再生コラーゲンフイブリルの繊維の形状の走
査型電子顕微鏡写真（倍率：8000）、第２図は、
実施例１において培養試験に使用した後の、第１
図に示すコラーゲンビーズの粒子構造を示す位相
差顕微鏡写真（倍率：70）である。
培養試験に使用する前のコラーゲンビーズが含有
する再生コラーゲンフイブリルの繊維の形状の走
査型電子顕微鏡写真（倍率：8000）、第２図は、
実施例１において培養試験に使用した後の、第１
図に示すコラーゲンビーズの粒子構造を示す位相
差顕微鏡写真（倍率：70）である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 不規則にからみ合つた太さ10〜500ｍμの再
生コラーゲンフイブリルと、前記再生コラーゲン
フイブリルの間に存在する水溶液とからビーズ形
状に構成され、前記再生コラーゲンフイブリルの
含有量が20〜0.01重量％であることを特徴とする
再生コラーゲンフイブリルを含有する基質。 ２ コラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒
中に多数の小滴として分散させて乳濁液を形成
し、前記乳濁液に水と混和する有機溶媒とアルカ
リとを加えて前記小滴を固化させ、これによつ
て、不規則にからみ合つた太さ10〜500ｍμの再
生コラーゲンフイブリルと、前記再生コラーゲン
フイブリルの間に存在する水溶液とからビース形
状に構成され、前記再生コラーゲンフイブリルの
含有量が20〜0.01重量％である再生コラーゲンフ
イブリルを含有する基質を製造する方法。 ３ 水と混和する有機溶媒とアルカリとを同時に
加えることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ４ 水と混和する有機溶媒を加えた後にアルカリ
を加えることを特徴とする特許請求の範囲第２項
記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039597A JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
| US06/586,944 US4565580A (en) | 1983-03-10 | 1984-03-07 | Substrate consisting of regenerated collagen fibrils and method of manufacturing same |
| DE8484301602T DE3478468D1 (en) | 1983-03-10 | 1984-03-09 | A substrate comprising regenerated collagen fibrils |
| EP84301602A EP0119076B1 (en) | 1983-03-10 | 1984-03-09 | A substrate comprising regenerated collagen fibrils |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039597A JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59164723A JPS59164723A (ja) | 1984-09-17 |
| JPH043949B2 true JPH043949B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=12557515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58039597A Granted JPS59164723A (ja) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | 再生コラーゲンフイブリルを含有する基質及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4565580A (ja) |
| EP (1) | EP0119076B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59164723A (ja) |
| DE (1) | DE3478468D1 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE454518B (sv) * | 1984-05-21 | 1988-05-09 | Statens Bakteriologiska Lab | Forfarande for odling av diploida celler i nervaro av cellulosafibrer |
| JPS61122222A (ja) * | 1984-11-19 | 1986-06-10 | Koken:Kk | コラ−ゲン又はゼラチンとプロタミンとよりなる止血剤 |
| JPS61230728A (ja) * | 1985-04-06 | 1986-10-15 | Koken:Kk | アシル化コラ−ゲンまたはアシル化ゼラチンからなる界面活性剤及びその製造方法 |
| SE464816B (sv) * | 1985-10-15 | 1991-06-17 | Nilsson Kjell | Makroporoesa partiklar, foerfarande foer dess framstaellning och dess anvaendning |
| FR2597499A1 (fr) * | 1986-04-18 | 1987-10-23 | Merieux Inst | Procede de culture microbiologique sur supports de collagene, supports pour ce procede et produits obtenus |
| DE68913890T2 (de) * | 1988-04-18 | 1994-08-04 | Nitta Gelatin Kk | Verfahren zur züchtung tierischer zellen in grossem massstab und verfahren zur herstellung von trägermaterial dafür. |
| US5258028A (en) * | 1988-12-12 | 1993-11-02 | Ersek Robert A | Textured micro implants |
| US5219895A (en) * | 1991-01-29 | 1993-06-15 | Autogenesis Technologies, Inc. | Collagen-based adhesives and sealants and methods of preparation and use thereof |
| AU3941293A (en) * | 1992-04-06 | 1993-11-08 | Uroplasty, Inc. | Treatment of reflux disorder by microparticles injection |
| DE69327793T2 (de) * | 1992-11-02 | 2000-07-20 | Nippon Meat Packers, Inc. | Absorbierbares topisches blutstillungsmittel |
| US5656492A (en) * | 1993-02-12 | 1997-08-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cell induction device |
| US5711853A (en) * | 1993-06-16 | 1998-01-27 | Ranpak Corp. | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
| US5316942A (en) * | 1993-06-16 | 1994-05-31 | Battelle Memorial Institute | Process for the production of low-cost soluble high-molecular weight collagen |
| US5700353A (en) * | 1993-06-16 | 1997-12-23 | Ranpak Corporation | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
| US5700354A (en) * | 1993-06-16 | 1997-12-23 | Ranpak Corp. | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
| TW586934B (en) * | 1997-05-19 | 2004-05-11 | Sumitomo Pharma | Immunopotentiating composition |
| DE19934894A1 (de) * | 1999-07-24 | 2001-02-01 | Pharma Concepts Gmbh & Co Kg | Verfahren zur Herstellung von Kollagenpartikeln |
| US6183498B1 (en) | 1999-09-20 | 2001-02-06 | Devore Dale P. | Methods and products for sealing a fluid leak in a tissue |
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| US20080226723A1 (en) * | 2002-07-05 | 2008-09-18 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable Polymeric Particles for Therapeutic Use in Erectile Dysfunction and Methods of Preparing and Using the Same |
| US7544381B2 (en) * | 2003-09-09 | 2009-06-09 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Lubricious coatings for medical device |
| US9114162B2 (en) * | 2004-10-25 | 2015-08-25 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable polymeric particles for enhanced imaging in clinical applications and methods of preparing and using the same |
| ATE503465T1 (de) | 2004-10-25 | 2011-04-15 | Celonova Biosciences Germany Gmbh | Beladbare polyphosphazenhaltige teilchen für therapeutische und/oder diagnostische anwendungen sowie herstellungs- und verwendungsverfahren dafür |
| US20210299056A9 (en) | 2004-10-25 | 2021-09-30 | Varian Medical Systems, Inc. | Color-Coded Polymeric Particles of Predetermined Size for Therapeutic and/or Diagnostic Applications and Related Methods |
| US9107850B2 (en) * | 2004-10-25 | 2015-08-18 | Celonova Biosciences, Inc. | Color-coded and sized loadable polymeric particles for therapeutic and/or diagnostic applications and methods of preparing and using the same |
| US20060222680A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Chunlin Yang | Method of preparing crosslinked collagen microspheres |
| US20090111763A1 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable polymeric particles for bone augmentation and methods of preparing and using the same |
| US20090110738A1 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable Polymeric Particles for Cosmetic and Reconstructive Tissue Augmentation Applications and Methods of Preparing and Using the Same |
| US20090110730A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-04-30 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable Polymeric Particles for Marking or Masking Individuals and Methods of Preparing and Using the Same |
| US20090110731A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-04-30 | Celonova Biosciences, Inc. | Loadable Polymeric Microparticles for Therapeutic Use in Alopecia and Methods of Preparing and Using the Same |
| FR3033697B1 (fr) | 2015-03-17 | 2020-03-27 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Suspensions de collagene injectables, leur procede de preparation et leurs utilisations, notamment pour la formation de matrices denses de collagene |
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|---|---|---|---|---|
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| US2920000A (en) * | 1955-11-07 | 1960-01-05 | Ethicon Inc Ethicon Inc | Removable valve Collagen article and the manufacture thereof |
| US2919998A (en) * | 1957-11-07 | 1960-01-05 | Ethicon Inc | Collagen article and the manufacture thereof |
| US2919999A (en) * | 1958-10-22 | 1960-01-05 | Ethicon Inc | Collagen article and the manufacture thereof |
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| US3551535A (en) * | 1964-12-01 | 1970-12-29 | Union Carbide Corp | Freezing-mixing process for making homogeneous collagen mixtures |
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| US3632361A (en) * | 1969-06-26 | 1972-01-04 | Fmc Corp | Water-insoluble microcrystalline collagen absorbent mat |
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| FR2470794A1 (fr) * | 1979-12-05 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Nouvelles microparticules, leur preparation et leurs applications en biologie, notamment a la culture de cellules diploides humaines |
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| EP0097907A3 (en) * | 1982-06-25 | 1985-01-09 | Flow General, Inc. | Cell culture microcarriers |
-
1983
- 1983-03-10 JP JP58039597A patent/JPS59164723A/ja active Granted
-
1984
- 1984-03-07 US US06/586,944 patent/US4565580A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-09 EP EP84301602A patent/EP0119076B1/en not_active Expired
- 1984-03-09 DE DE8484301602T patent/DE3478468D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0119076B1 (en) | 1989-05-31 |
| EP0119076A2 (en) | 1984-09-19 |
| US4565580A (en) | 1986-01-21 |
| JPS59164723A (ja) | 1984-09-17 |
| DE3478468D1 (en) | 1989-07-06 |
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