JPH0440892A

JPH0440892A - 新規ハイブリドーマ，その製造法および生理活性物質の製造法

Info

Publication number: JPH0440892A
Application number: JP2145180A
Authority: JP
Inventors: Hidekazu Sawada; 澤田　秀和; Keiji Iwamoto; 圭司岩本; Kazuaki Kitano; 北野　一昭
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1992-02-12
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: EP0459372A2; EP0459372A3; CA2043535A1; US5213980A; JP3008208B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、リンパ球を片方の親細胞とするバイブｌ）　
トーマにＦＧＦ蛋白質遺伝子を導入することによってハ
イブリドーマを育種・改良する方法に係わる。更に詳し
くは、ＦＧＦ蛋白質遺伝子をハイブリドーマに導入し、
培養物中（細胞内もしくは培地中）に発現させたＦＧＦ
蛋白質によりハイブリドーマの増殖能力を向上させるこ
とによって、無血清培地中でのハイブリドーマのクロー
ニングや培養を容易ならしめ、またハイブリドーマから
目的生産物を安定的かつ効率的に製造する技術に関する
。

従来の技術リンパ球系細胞株を培養することは、インターフェロン
、インターロイキンなどのリンフォカイン類やモノクロ
ーナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略記することがある）な
どの有用生理活性物質の生産を行う上で重要である。リ
ンパ球系細胞株の培養には、他の細胞の場合と同様、血
清を１０％程度添加した培地が主として用いられ、とり
わけ牛胎児血清（Ｆｅ２）含有培地が常用されてきた。

無血清培地も種々考案されているが、血清含有培地に比
べて一般に細胞増殖性が悪く、そのために細胞継代時の
播種密度を高くする必要がある。

一方、無血清培地での増殖を改良する目的で、細胞を無
血清培地に馴化させたり、あるいは突然変異を誘発する
方法により、増殖能の向上した細胞株の取得が試みられ
ている。しかし、遺伝子組み換え技術を用いて、合目的
的にハイブリドーマなどのリンパ球系細胞株の増殖能を
改良した例は全く知られていない。

近年、細胞増殖因子に関する研究が進み、各種の因子が
単離され、またその遺伝子も明らかにされている。該因
子の一つである線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、Ｇｏ
ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚにより　ウシの下垂体から見出
された細胞成長因子（ネーチャー２４９巻　１２３頁　
１９７４年）で、等電点が塩基性のｂａｓｉｃ　　ＦＧ
Ｆ　（ｂＦＧＦ）と酸性のａｃｉｄｉｃＦ　Ｇ　Ｆ　（
ａＦ　Ｇ　Ｆ　）があり、共に全アミノ酸配列が明らか
にされている。このＦＧＦは線維芽細胞（ジャーナル・
オブ・セル・バイオロジー、６６巻　４５１頁　１９７
５年）をはじめ、副腎細胞Ｙ１（エンドクリノロジー、
９７巻　１２０頁　１９７５年）、筋原細胞（ジャーナ
ル・オブ・セル・バイオロジー　７０巻　３９５頁　１
９７６年）、軟骨細胞（ジャーナル・オブ・セルラー・
フイジオロジー、９１巻　９７７頁　１９７７年）、血
管内皮細胞（プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、７３巻　４１２
０頁１９７６年）など中胚葉由来のほとんどの細胞に対
して増殖促進作用を示す細胞成長因子である。しかし、
ＦＧＦは上皮細胞に対して一般に増殖促進作用を示さな
いことが知られている（細胞成長因子２　日本組織培養
学会線　朝食書店、３２頁　１９８４年）。庫た、ＦＧ
Ｆを添加した接ｔｔｈでハイブリドーマなどのリンパ球
系細胞を培養するとリンパ球系細胞から生理活性物質が
効率よく生産できることが本発明者らによって見い出さ
れている（特願平２−５６２０３号明細書参照）か、Ｆ
ＧＦ単独によるリンパ球系細胞に対する増殖促進作用は
これまでに全く報告されていない。

方、ＦＧＦの遺伝子に関しては、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦと
も既にその塩基配列が決定されており、両ＦＧＦともに
最初１５５個のアミノ酸を持つペプチドとして合成され
ること、またその配列中に分泌のためのシグナルペプチ
ドの配列が認められないことが分かっている（Ｊ、　Ａ
、　Ａｂｒａｈａｍら、サイエンス、２３３，５４５−
５４８（１９８６）；　　Ｍ。

Ｊａｙｅら、サイエンス、２３３，５４１−５４５（１
９８６））。

発明が解決しようとする課題動物細胞を培養し有用物質を生産する場合、血清培地の
使用には種々の問題点が指摘されている。

すなわち血清にロット間変動がある、マイコプラズマや
ウィルスによる汚染の危険性がある、精製過程が繁雑と
なり、生産物品質への悪影響か懸念される等である。し
たがって無血清培地を用いるのが有利であるが、一般に
細胞の増殖性が悪（、そのために有用物質の生産性も劣
る場合が多い。

細胞増殖の悪い条件下では、高い播種密度で細胞を移植
する必要かある（例えば、ヒト型モノクローナル抗体を
産生ずるヒト−ヒトハイブリドーマの無血清培養では、
約１×ｌＯ５細胞／−の播種密度とすることが必要であ
る）ため、工業的規模の大量培養では細胞の継代回数か
多くなる煩雑さがあり、雑菌汚染の危険性も高くなる。

また無血清培地を用いて制限希釈培養法により細胞をク
ローニングする技術は未だ確立されていない。

本発明者らは、無血清培地中でも高い増殖能を示す変異
細胞株が得られれば、このような問題点が解決できると
考え、変異等の従来法による細胞の改良を種々試みたが
、良好な成果を得るには至らなかった。また、たとえ目
的とする変異細胞株が取れたとしても、時間もかかり、
また確実な方法とは言いがたい。

近年、動物細胞を宿主とする発現ベクターが種々開発さ
れているが、本発明は遺伝子操作技術を用いてハイブリ
ドーマの増殖性を改良することにより、上述のような課
題を解決しようとして行われたものである。

課題を解決するための手段本発明者らは、無血清培地を用いるハイブリドーマの単
個細胞あるいは低播種密度からの細胞培養方法を確立す
べく鋭意努力を重ねてきた結果、ＦＧＦ遺伝子を細胞に
導入することによって細胞の増殖能が著しく向上するこ
とを見い出し、これに基づいて更に研究を重ね、本発明
を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ
）蛋白質遺伝子発現ヘクターを保持するノ＼イブリドー
マ、（２）ＦＧＦ蛋白質遺伝子発現ベクターによりハイ
ブリトーマを形質転換することを特徴とする上記（１）
項のハイブリドーマの製造法、および（３）ＦＧＦ蛋白
質以外の生理活性物質を生産するハイブリドーマを用い
て上記（２）項の製造法により得られるノ１イブリドー
マを培地中で培養し、培養物中にＦＧＦ蛋白質を生成さ
せるとともに該生理活性物質を生成・蓄積させ、該生理
活性物質を採取することを特徴とする生理活性物質の製
造法である。

本発明におけるＦＧＦ蛋白質としては、ＦＧＦ活性を有
するポリペプチドもしくは蛋白質であればいずれでもよ
く、また該ＦＧＦ蛋白質は等電点が塩基性のｂＦＧＦ蛋
白質あるいは等電点が酸性のａＦＧＦ蛋白質のいずれで
あってもよい。

さらにＦＧＦ蛋白質は、組換えＤＮＡ技術により得られ
ることが知られているＦＧＦ（ＰＣＴ国際公開Ｎｏ、Ｗ
Ｏ／　８７　／　０１７２８号公報；フエブス・レター
ズ、第２１３巻　１８９頁　１９８７年；ヨーロッパ特
許出願公開第２３７，９６６号公報（特開昭６３−２２
６２８７号公報））あるいはＦＧＦムティン（ヨーロッ
パ特許出願公開第２８１．８２２号公報（特開平２−１
９３号公報）；バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ、第１５１巻　
第７０１頁　１９８８年：ヨーロッパ特許出願公開第３
２６．９０７号公報）なとてあってもよい。

上記ＦＧＦムティンは、本来、元のペプチドあるいは蛋
白質のアミノ酸配列か変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸の付加構成アミノ酸の欠損、
他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少な（とも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、ングナルペプチドは含まれないものである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少な（とも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）か認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。

該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端側ｉｏ残基・Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ
　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ　−ＡｓｐＧ
　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒヒトｂＦＧＦのアミ／末端側１４残基：■ Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−ＡｓｐＧ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。

ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側４１残基：Ｍｅｔ−Ｐｒ。

Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−・　・・　−Ｖａｌ。

ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのカルボキシル末端側６１残基：など
が挙げられる。さらに、ＦＧＦムティンとして、ｂＦＧ
Ｆの元のペプチドあるいは蛋白質のカルボキシル末端側
の７個〜４６個の構成アミノ酸が欠損したものが挙げら
れる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているＦＧＦムティンにおける置換さ
れる前の少な（とも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数とし
ては、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、シスチンなどが挙げられるが、システィンが特に好ま
しい。置換される前の構成アミノ酸としてシスティン以
外のものとしては、アスパラギン酸、アルギニン、グリ
シン、セリン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸かシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸か好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン。

アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロンン。

フェニルアラニン、ヒスチンン、トリプトファン。

セリン　スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特
に、セリン、スレオニンか好ましい。

置換される前の構成アミノ酸かシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノとしてアスパラ
ギン、スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギ
ニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニ
ンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミンスレオニン、ロイ
シン、フェニルアラニン、アスパラギン酸が挙げられる
が、特にグルタミンか好ましい。

置換される前の構成アミノ酸かグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イ７ン　フェニルアラニン　セリン、グルタミン酸、ア
ルキニンなどか挙げられ、特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸かセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン　システィン　グルタミン、アルキニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロインン
、プロリン、グリシン、リジンアスパラギン酸などが挙
げられ、特にセリンか好ましい。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラキン、グ
ルタミン、アルキニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとじては、構成
アミノ酸であるシスティンかセリンに置換されたものか
挙げられる。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸か置換され
るのか好ましい。

該ＦＧＦムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つ
または３つか組み合わさったものでもよい。

該ＦＧＦムティンとしては、少なくとも１個のヒト４Ｍ
性ＦＧＦ構成アミノ酸か別のアミノ酸で置換されている
ムティンが好ましい。

本発明て用いられるＦＧＦ蛋白質遺伝子としては、上記
したＦＧＦ蛋白質をコートする遺伝子であればいずれて
もよく、例えばヒト、サル、ウサギ、ラット、ヒンジ、
ウン、ニワトリ、イヌ、ブタ、マウスなとの補乳動物の
脳、網膜、腎、前立腺なとの細胞、あるいは各種のＦＧ
Ｆ蛋白質産生形質転換細胞から得ることができる。ＦＧ
Ｆ蛋白質遺伝子の取得は公知の常法により、例えば前述
の細胞からメツセンジャーＲＮＡ　（ＯＩＲＮＡ）を抽
出し、その相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を酵素的に作製し
、適当なベクターを結合せしめて大腸菌のような宿主中
で増殖せしめ、ＦＧＦ蛋白質遺伝子を組み込んたベクタ
ーを有する単一コロニーを選択するクローニングの手法
を用いて取得することができる。また、市販の各種ｃＤ
ＮＡライブラリーを使用することもできる。さらに、ウ
シやヒトのｂＦＧＦ及びａＦＧＦのアミノ酸配列やそれ
らの遺伝子の塩基配列は既に発表されているので（Ｔ。

Ｋｕｒｏｋａｗａ　ら、フエブス０レターズ、２１３．
１８９　１９４　（１９８７）　；　Ｆ、　Ｅｓｃｈら
、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーンヨンズ、１３３，５５４−５６２（
１９８５）など）、これらに基づいて適当な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを公知の常法により有機合成
してプローブとし、上記クローニングにおけるコロニー
選択に用いることができる。一方、ＦＧＦ蛋白質遺伝子
が組み込まれたベクター（プラスミドなど）あるいは該
ベクターを保持する形質転換細胞から、ＦＧＦ蛋白質遺
伝子を調製することが可能であり、更に公知のａＦ　Ｇ
　ＦおよびｂＦＧＦあるいはそれらのムティンのアミノ
酸配列やそれらの遺伝子の塩基配列に基づいて化学合成
によっても調製することが可能である。本発明において
は、ｂＦＧＦあるいはａＦＧＦをフードする遺伝子のみ
ならずそれらの変異遺伝子（ＦＧＦムティンをコードす
る遺伝子など）もまた、ＦＧＦ蛋白質として発現させた
時のＦＧＦ活性が著しく低下しないものであればＦＧＦ
蛋白質遺伝子として使用することができる。

該ＦＧＦ蛋白質遺伝子は、構成的にまたは誘導的に発現
可能な状態でハイブリドーマに導入されるが、そのため
には、構成的または誘導的に作動可能なプロモーター、
翻訳開始コドン（Ａ　Ｔ　Ｇ）及びＦＧＦ蛋白質遺伝子
をこの順序で配列したＤＮＡが適当なベクターに組み込
まれているＦＧＦ蛋白質遺伝子発現ベクター（以下、発
現ベクターと略記することがある）を当該ハイブリドー
マに導入し形質転換するのがよい。

該発現ベクターに用いるベクターの例としては、たとえ
ばｐｓＶＬ［Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　４，
８１７（１９８４）ＬｐＣＨ１１０［Ｊ、　　Ｍｏ１．
　　Ａｐｐ、　　Ｇｅｎ、　　１０１（１９８３）　；
　Ｃｅ１ｌ。

３９．６５３（１９１１１５）］、　　ｐＫｓＶ−１０
［ｃｅｌｌ、　　２３，１７５（１９８１）］ｐＳ’／
２［Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、、　　ｕｓＡ　　７８．２０７２（１９８１）］、
　　ｐＢＴＶｅｅｔ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　　１０１．３８７（１９８３）：ｉ、　　
ｐＨＥＢｏ［Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　
　５，４１０（１９８５）］ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ［Ｃ
ｅ１１．　３７，１０５３（１９８４）］、　　ｐＭＡ
Ｍｎｅ。

［Ｎａｔｕｒｅ、　２９４，２２８（１９８１）］など
が挙げられるか、これらに限定されるものではない。

上記翻訳開始コドンの上流に組み込まれるプロモーター
は、ＦＧＦ蛋白質遺伝子の発現に用いるハイブリドーマ
に適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、
たとえば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（ハ
メル、Ｄ、Ｈ，，アニュアル・レビュー・オブ・バイオ
ケミストリー、５５巻　９３頁　１９８６年）、あるい
はＳＶ（シミアンウィルス）４０のプロモーター領域［
岡山う。

モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジー第３巻
、２８０〜２８９頁（１９８３）コや種々のレトロウィ
ルスＬ　Ｔ　Ｒ（Ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐ
ｅａｔ）領域に存在するプロモーターなどが挙げられる
。

レトロウィルスＬＴＲ領域由来のプロモーターとしては
、たとえば下記のものが挙げられる。

二一ベルソン　マウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬＶ）
［ボッ、ｓ、ｐら、セル、第２２巻、７７７〜７８５頁
（１９８０）］　。

モロニー　マウス白血病ウィルス（Ｍ　−Ｍ　ｕ　ＬＶ
）　　［月利ら、セル、第３２巻、１１０５〜１１１３
頁（１９８３）ｉ　。

成人下細胞白血病ウィルス（ＡＴＬＶ）［吉田ら、ブロ
ンージング　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイ
エンス　ＵＳＡ、第７９巻、６８９９〜６９０２頁（１
９８２）ｌ　。

トリ肉腫ウィルス（ＡＳＶ）［上材ら、ネイチャ、第２
９７巻、２０５〜２０８頁（１９ｇ２）］。

メタロチオネイン遺伝子のプロモーターは、構成的にも
発現するが、Ｃｄ、　　Ｚｎ、　　Ｈｇ、　　Ａｇ、　
　Ｃｕ。

Ａｕなどの重金属によって、より強く発現が誘導される
。

本発明においては、上記したプロモーターを１個または
２個以上用いてもよい。

また、上記発現ベクターは、ＦＧＦ蛋白質遺伝子の５′
末端の上流に、例えば特開昭６１−５２２９３号公報の
第２図における一２１番目から１番目のコドンからなる
シグナルペプチドをコードする塩基配列を有していても
よい。

また、上記発現ベクターは、ＦＧ、Ｆ蛋白質遺伝子の３
′末端に、翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまた
はＴＡＧを有していてもよく、とりわけＴＡＧが好まし
い。

本発明でハイブリドーマの形質転換に用いるＦＧＦ蛋白
質遺伝子発現ベクターは、さらにエンハンサ−を有して
いてもよい。エンハンサ−としては、ウィルス由来のエ
ンハンサ−が挙げられ、例えばＳＶ４０プロモーター領
域に存在するエンハンサ−［岡山ら、前出］やレトロウ
ィルスＬＴＲ領域に存在するエンハンサ−が挙げられ、
とりわけ上記ＬＴＲ領域の塩基配列繰返し部分のエンハ
ンサ−が好ましい。

レトロウィルス由来のエンハンサ−として（茎、たとえ
ば下記のものが挙げられる。

Ａ−ＭｕＬＶ［コブ、ｓ、ｐ、ら、前出］。

Ｍ−ＭｕＬＶ［月明ら、前出］。

ＡＴＬＶ　　　［吉田ら、前出］ＡＳＶ　　　　［上材ら、前出］。

本発明においては、上記したエンノ＼ンサーを１個また
は２個以上用いてもよい。

ＦＧＦ蛋白質遺伝子のハイブリドーマへの導入すなわち
ハイブリドーマの形質転換にあたっては、目的とする形
質転換体の選別を容易にするために、ＦＧＦ蛋白質遺伝
子をネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子とともに同
一の発現ベクター上にのせてハイブリドーマに導入する
ことにより、あるいは共形質転換［セル（Ｃｅｌｌ）、
　　１６　：　７７７　（１９７９）］などにより有利
に目的を達することができる。

共形質転換においては、形質転換体を選択する目印とな
る遺伝子（Ａ）（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイ
シン耐性あるいはハイグロマイシン耐性遺伝子等の抗生
物質を不活化する遺伝子）を保持するプラスミドと、導
入したいＦＧＦ蛋白質遺伝子（Ｂ）を保持するプラスミ
ドとを、（Ａ）よりも（Ｂ）を多量にして電気穿孔法な
とて同時に細胞に導入する。遺伝子（Ａ）の耐性薬剤存
在下で培養し、増殖するクローンを選択すると遺伝子（
Ａ）と遺伝子（Ｂ）を同時に持つ株を得ることができる
。

本発明に用いられるハイプリドーマ株としては、例えば
リンパ球系細胞を片方の親細胞とするマウスハイブリド
ーマ、マウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリドーマ、ヒト
−ヒトハイブリドーマなどを挙げることが出来る。より
具体的には、マウスハイブリドーマＥ　２３５１６３　
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　４．４７（１９８５））、マ
ウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリドーマ１１２　２２、
２５　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ１２９、２６（１９８５））、ヒト−ヒトハ
イブリドーマＷ４７１　７　、２４　（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、
　１４２．８０５（１９８７））、　　ＨＢＷ−４，１
６，ＨＢＷ−６，２０（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　７．３７４（Ｉｎ２乃などあるいはそれらから誘導
されるハイブリドーマなどを挙げることが出来、なかで
もモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマとりわ
けヒトモノクローナル抗体を産生ずるヒト−ヒトハイブ
リドーマが好ましく用いられる。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられるＦＧ
Ｆ蛋白質以外の生理活性物質を産生ずるハイブリドーマ
としては、たとえばマウスモノクローナル抗体を産生ず
るＥ２３５　＋６３、ヒトモノクローナル抗体を産生ず
るＩ　１２−２２．２５゜Ｗ４７１−７．２４．）ＩＢ
Ｗ−４，１６，）（ＢＷ６．２０などあるいはそれらか
ら誘導されるハイブリトーマなとか挙げられる。

ハイブリドーマの培養に用いる培地としては、通常用い
られる血清含有培地、血清代替物質含有培地もしくは無
血清培地か利用できる。血清培地としては、１０％牛脂
児血清を添加した培地か、また血清代替物質含有培地と
しては、血清由来増殖促進因子画分（Ｃ，ＦＳ）Ｃ第２
回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジ
ー予講集１６１頁、　１９８４年〕を３　ｍｇ／−程度
添加した培地などが例示できるが、モノクローナル抗体
などの有用生理活性物質産生用培地としては、精製が容
易であること、培地か安価であること等の理由から無血
清培地が望ましい。無血清培地としては、基本合成培地
に、インシュリン　トランスフェリンエタノールアミン
、セレニウム、ポリエチレングリコール等の因子を添加
した培地が用いられる。

基本合成培地としては、イスコツＭ地［１ｓｃｏｖｅ。

Ｎ、　Ｎ、　＆　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ、Ｆ、、　Ｊ、　Ｅ
ｘｐ、Ｍｅｄ、　１４　’Ｌ　　９２３　（１９７ｇ）
）　、　／’ムＦ１２培地［Ｒ，Ｇ、　Ｈａｍ、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　５３．　２８８
（１９６５）〕、　　Ｌ　１５培地［Ａ、　Ｌｅｉｂｏ
ｖｉｔｚ、　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｈｙｇ、＋　７　Ｌ　
　１７３　（１９６３））　、　Ｔ培地〔特開昭６０−
１４５０８８号：］、ＴＬ−２培地（イスコツ培地、ハ
ムＦ１２培地及びＬ１５培地のｌ：１：２混合物）等が
用いられるが、好ましくはＴ培地もしくはＴＬ−２培地
が用いられる。

ハイブリドーマの培養には通常培養に用いられる容器ま
たは装置が用いられる。たとえば、マルチウェルプレー
ト、培養フラスコ　スピナーフラスコ、ジャーファーメ
ンタ−、ファー、ｌン９−さらにホローファイバー培養
装置、セラミックマトリックスを用いた培養装置やマイ
クロカプセル培養法などが適宜採用される。

本発明の培養は、用いられるハイブリドーマの培養に適
した条件が採用される。−射的には、培養温度約３７°
Ｃ前後で、ｐＨ約６．５〜７．５で、数日〜３か月培養
される。たとえば、本発明の培地に通常０．１〜５Ｘ１
０’個／ｄの細胞を播種し、マルチウェルプレートやフ
ラスコの場合にハ約り７℃、５％炭酸ガス培養器（炭酸
ガス濃度５％の培養器）中でｐＨ約６．５〜７．５で約
１〜２０日間培養される。ジャーファーメンタ−やファ
ーメンタ−などでは通気撹拌培養が行われる。またこれ
らの培養槽やホローファイバー　セラミックマトリック
ス、マイクロカプセルなどを用いた培養においては培地
を回分的、または連続的に交換することにより生理活性
物質の生産性を向上させることができる。連続潅流培養
の場合には工ないし数ケ月（約３か月）も続ける場合が
ある。また、必要により通気される。

培養液から細胞を採取するには、培養液を直接遠心分離
機やろ過機にかけて集める。またハイブリトーマの培養
によって生産されるＦＧＦ蛋白質以外の生理活性物質は
、その物質か培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠
心分離によって上澄液を得、これから採取される。また
細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過または遠心分
離によって得た細胞を物理的方法（例、超音波、フレン
チプレス、ダイノミルなど）または化学的方法（例、塩
酸グアニジン等）にて処理し、生産物を抽出したのち、
上澄液を得る。

上記上澄液から生理活性物質を分離、精製するには目体
公知の分離、精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。たとえば生理活性物質か蛋白質またはペプチドの場
合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法
、透析法、限外ろ適法、ケルろ適法、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドケル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法；　イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフ
イーなとの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法９
等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが
適用される。

実施例以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。なお、後述
の実施例２で得られた形質転換ヒト−ヒトハイブリドー
マＨＰ○−７５，２９−８７４は、平成２年５月８日か
ら財団法人発酵研究所（ＴＰＯ）に受託番号ＩＦＯ５０
２４５として寄託されている。また、該ハイプリドーマ
株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ
）に平成２年　６月　７日から受託番号ＦＥＲＭＢ　Ｐ
　−Ｌ’？　３？としてブリペスト条約に基づき寄託さ
れている。

実施例１）　ヒト−ヒトハイブリドーマへのｂＦＧＦ遺伝子の導
入ｂＦ　Ｇ　Ｆ遺伝子を含有するベクターとしてはｐＴＢ
　７３２　（Ｒ，５ａｓａｄａ　ら、　　Ｍｏ１．　　
Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、、８．５８８−５９４（１９
８８）　）を使用した。抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏＡｂ産生
ヒト−ヒトハイブリドーマＨＢＷ−４，１６（Ｋ、　　
１ａｒａｄａら、　　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
７，３７４−３７７（１９８９））から誘導された抗体
高産生株ＨＰ○−７５，２９０を０．３Ｍショ糖溶液（
無菌）にｌＸｌ０’細胞／ｄの密度で懸濁し、その１０
０μＣにプラスミドｐＴ　Ｂ　７３２を制限酵素Ｃ１ａ
Ｉ処理したもの２５ＭｇとプラスミドｐＲＳ　Ｖ　ｎｅ
ｏ［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２１巻　５５１頁
　１９８３年］を制限酵素ＢａｍＨＩで処理したもの５
Ｍｇとを混合した。この混合液をＤＥＰ社製電気穿孔装
置の遠心チャンバーに入れ、２００Ｏｒｐｍ２分間遠心
後、１００ＯＶ／３ＩＩＩＩｍの電圧を３０秒、１回か
け氷水中に１０分間放置した。抗生物質Ｇ４１８（シグ
マ社製、米国）をｌｌｌ１ｇ／−の濃度で添加したＩｓ
Ｆ培地にＩＸ　１０５細胞／ｌｄの割合でエレクトロポ
レーション処理した細胞を浮遊させ、９６穴マルチプレ
ートに１００μＱずつ播種し、３７°Ｃ炭酸ガス培養器
中で２週間培養し、増殖するクローン７株を選択した。

ｉｉ）　　導入遺伝子の検出細胞（ＩＸＩＯ’個）を１１０１１Ｉトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）２００μｇに懸濁し、等量の０゜４Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、１００ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｇプロテアーゼＫ　
（ＢＲＬ社、米国）を加え、６０°Ｃて１時間処理した
。等量のフェノール・クロロホルムを加えて上清を分取
し、さらに等量のクロロホルムを加え、再び上清を分取
した。得られたＤＮＡ溶液に３Ｍ　　ＮａＯＨを０．１
容加え、６０’Ｃで１時間処理したのち、室諷に冷却し
、等量の２Ｍ−酢酸アンモニウムを加えて中和した。バ
イオラッド社製ドツトブロッティング装置を用いてあら
かｕめ１Ｍ酢酸アンモニウムで湿らせたニトロセルロー
スフィルターに吸着させ、８０℃で２時間乾燥させた。

一方、プラスミドｐ”ｒ　Ｂ　７３２を制限酵素Ｅｃ。

ＲＩとＰｓｔｌで処理したのち、アガロースゲル電気泳
動に付し、ｂＦＧＦ遺伝子を含むバンドを切り出した。

ウルトラフリーＣ３ＨＶ　（ミリボア社製、米国）を用
いて精製し、オリゴラベリングキット（ファルマシア社
製、スエーデン）を用いて３！Ｐ−ｄＣＴＰでランダム
ブライミングにより標識した。

プラスチックバッグにニトロセルロースフィルターとプ
レハイブリダイゼーション溶液［５０％ホルムアミド、
５ＸＳＳＣ，５ｘデンハ一ト液５０ｍＭ　　リン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，５）。

２５０ｎｇ／−１本鎖ＤＮＡ］を入れ、４２°Ｃ１８時
間インキュベーションした。次に液をハイブリダイゼー
ション溶液［５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，ＩＸデ
ンハート液、２０ａ＋Ｍ　　リン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ６，５）、１０％デ牛ストラン硫酸、１００μｇ／
−１本鎖ＤＮＡ、熱処理したプローブ］に入替え、４２
°Ｃで１５時間インキュベートした。フィルターを２Ｘ
ＳＳＣ，０゜１％ＳＤＳで１０分間２回洗浄後、６８°
Ｃに熱した同じ緩衝液でさらに２０分間２回洗浄した。

フィルターを２ＸＳＳＣで２回洗浄後、濾紙で水分を取
り、オートラジオグラフィー（−７０℃、２日間）に供
した。

注、ＳＳＣ０，１５Ｍ食塩、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，０）オートラジオグラフィーの結果、プラスミドを導入して
いない対照細胞に比べて明らかに強℃・オートラジオグ
ラムを与えるヒト−ヒトハイブリドーマＨＰＯ−７５，
２ｌ−Ｎ２７．ＨＰ○−７５゜２９−Ｎ５８および）（
ＰＯ−７５，２９−Ｎ７３を取得した。

実施例２プラスミドｐＴ　Ｂ　７３２を制限酵素ＣＩａＩ処理し
たちの２５μｇとプラスミドｐ２０１　（Ｊ、　Ｌ、　
Ｙａｔｅｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３，８１２−８
１５（１９８５））を制限酵素ＢａｍＨ１で処理したち
の５Ｍｇとを混合し、実施例１の１）に示した方法と同
じ方法で、ヒト−ヒトハイブリドーマＨＰＯ−７５，２
９Ｃ株に共導入した。なお遺伝子導入クローンの選択薬
剤としては、ハイグロマイシン５００μｇ／Ｊ（ベーリ
ンガー・マンハイム山の内（株乃を使用した。導入遺伝
子の検出は、実施例１の１１）に示した方法と同じ方法
により行った。その結果、ｂＦＧＦ遺伝子の導入が確認
された株としてヒト−ヒトハイブリトーマＨＰ○−７５
，２９−Ｈ５４およびＨＰＯ−７５，２９−８７４を取
得した。

実施例３実施例１および２て得られたクローンを、それぞれ無血
清培地Ｐ　Ｅ　Ｇ　　８６　１　（Ｙ、　５ｈｉｎｔａ
ｎｉら。

Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏＬ、、２７，５３３−５３７（１９８ｇ））に約ｌＸ
ＩＯ３細胞／１ｎｌの割合で播種し、２４穴マルチプレ
ートに１ｉずつ分注して、５％炭炭酸ガス培養器中子７
Ｃ１７日問および１４日間静置培養した。得られた培養
液中の細胞数を測定し、表１に示す結果を得た。

表１　親株およびｂＦＧＦ遺伝子導入株の増殖量の比較
（プレート培養）親株ＨＰＯ−７５，２９ＣはｌＸｌ０’細胞／ＩＲＩｌ
の播種では増殖量は低かったが、ｂＦＧＦ遺伝子を導入
した株では著しい増殖の促進が認められた。

実施例４実施例３で最もよく増殖したヒト−ヒトハイブリドーマ
ＨＰＯ−７５，２９−８７４株（ＩＦＯ５０２４５、Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−パ３？）および親株ヒト−ヒトハイブ
リドーマＨＰＯ−７５，２９０を無血清培地ＰＥＧ−８
６−１に約Ｉ　Ｘ　１０３／威の密度でそれぞれ播種し
、１２５２１ｔ１２容テクネ・スピナフラスコを用いて
３７°Ｃ１１５日間、撹拌培養したところ、第１図に示
す結果を得た（第１図中、−・−は総細胞数を示し、−
〇−は生細胞数を示し、−ム−は抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏ
Ａｂの産生量（μｇ／−）を示す）。

第１図から明らかなように、親株に比へてｂＦＧＦ遺伝
子導入株では、細胞増殖量および抗体産生量が著しく増
加していた。

実施例５ヒト−ヒトハイブリドーマＨＰＯ−７５，２９８７４お
よび親株ヒト−ヒトハイブリドーマＨＰ○−７５，２９
Ｃをそれぞれ９６穴プラスチツクプレートに１穴あたり
０．５個の細胞になるよう、１００μｇの無血清培地Ｐ
ＥＧ−８６−１中に植え込み、５％炭酸ガス培養器中で
３７°Ｃ２１５日間培養した。親株のＨＰＯ−７５，２
９Ｃでは９６穴プレート４枚すなわち３８４穴すべてに
細胞増殖が認められなかったが、ＨＰＯ−７５゜２９−
８７４株では３８４穴中１０個に細胞の増殖が認められ
た。

発明の効果ＦＧＦ蛋白質遺伝子をヒト−ヒトハイブリドーマに導入
し発現せしめることにより、ハイブリトーマを低播種条
件下でも無血清培地で培養できる。

さらにＦＧＦ蛋白質の発現により、細胞増殖か促進され
、それに伴って生理活性物質の産生量も増加するので、
無血清培地を用いて抗体等の生理活性物質を効率良く生
産採取することかでき、工業的生産上有利である。

また、ＦＧＦ蛋白質遺伝子の導入および発現によって無
血清培地でのクローニングか可能となり、このことは無
血清培地で単個細胞を選別できることを意味しており、
ハイブリドーマを育種改良する上で極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、低播種からの撹拌培養におけるｂＦＧＦ遺伝
子非導入親株（第１図Ａ）およびｂＦＧＦ遺伝子導入株
（第１図Ｂ）の培養経過を示す（実施例４参照）。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）蛋白質遺伝子発現
ベクターを保持するハイブリドーマ。
（２）ハイブリドーマがヒト−ヒトハイブリドーマであ
る請求項１記載のハイブリドーマ。
（３）ＦＧＦ蛋白質遺伝子発現ベクターによりハイブリ
ドーマを形質転換することを特徴とする請求項１記載の
ハイブリドーマの製造法。
（４）形質転換されるハイブリドーマがＦＧＦ蛋白質以
外の生理活性物質を生産するハイブリドーマである請求
項３記載の製造法。
（５）生理活性物質がモノクローナル抗体である請求項
４記載の製造法。
（６）請求項４記載の製造法により得られるハイブリド
ーマを培地中で培養し、培養物中にＦＧＦ蛋白質を生成
させるとともに該生理活性物質を生成・蓄積させ、該生
理活性物質を採取することを特徴とする生理活性物質の
製造法。
（７）培地が血清を含まない培地である請求項６記載の
製造法。