JPH0441308B2 - - Google Patents
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- JPH0441308B2 JPH0441308B2 JP58122888A JP12288883A JPH0441308B2 JP H0441308 B2 JPH0441308 B2 JP H0441308B2 JP 58122888 A JP58122888 A JP 58122888A JP 12288883 A JP12288883 A JP 12288883A JP H0441308 B2 JPH0441308 B2 JP H0441308B2
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- G01—MEASURING; TESTING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はトランスホーミンググロスフアクター
（Transforming Growth Factor；以下、TGFと
いう）の定量方法に関する。 TGFは、ヒトおよびけつ歯動物のガン細胞で
つくられ、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質
（形質転換および増殖）をさせるポリペプチドで
ある。ヒトおよび動物の正常細胞は、軟寒天培地
においてはコロニーを形成しないが、これに
TGFを加えるとコロニー形成能を有するように
なる。1978年ジ・ゼ・トダロら〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、75、4001（1978）〕により、肉腫細胞
の培養上清から始めてTGFの存在が報告されて
以来、多数のTGFがヒトおよびけつ歯動物の培
養ガン細胞およびガン患者のガン組織からも発見
されている〔ロバーツ・エ・ビら；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、77、3494（1980）〕。最近、デ
イ・アイ・タージツクら〔JNCL、69、793
（1982）〕およびジ・ゼ・トダロら〔Cancer
Res.、43、403（1983）〕は、ガン患者の尿から分
子量約30000〜35000の高分子型TGFを抽出して
いるが詳しい物性は未だ明らかでない。 従つてまた、TGFを類似している種々のグロ
スフアクターを明瞭に識別する適切な手段がな
く、TGFを判定するに当つて、TGFの有する正
常細胞のコロニー形成能に基づいて行なつていた
にすぎず、かつ煩雑な操作をも必要とし、定量性
に欠けるものであつた。さらにTGFの体液、例
えば血液、尿などにおける存在、含有量、さらに
その消長などに関してあまり報告されていないも
のであつた。 本発明者らは、先に、高分子型のTGFは正常
人尿には存在せず、ガン患者尿のみ特異的に存在
すること、しかもこのものが正常細胞に対して前
述のような生物学的活性を有するもので極めて重
要な物質と考えて研究した結果、種々のガン患者
の尿を透析して無機イオンその他の低分子物質を
除去し、さらに必要に応じてゲル過した後、次
いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフイー
または／および吸着クロマトグラフイーを行な
い、極めて高純度に精製されたヒトTGFを得た
ものである（特願昭58−61102号明細書（特開昭
59−186994号参照）。 さらに本発明者らは研究し続けた結果、この
TGFを用いて、ヒト以外の哺乳動物に注射して
免疫せしめ、その血液を採取し、このTGFに対
するヒトTGF抗体が良好に得られることを知り、
さらに研究の結果、免疫させた補修動物の脾臓を
摘出し、その抗体産生能を有する単細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合せしめることによりTGFに対
するヒトTGF抗体としてのモノクロナール抗体
産生細胞を得、これを培養してヒトTGF抗体を
良好に得ることを完成した。さらに本発明者ら
は、得られたヒトTGF抗体と免疫反応を良好に
行ない得るTGFの放射性同位元素（以下RIとい
う）標識体を得、TGFを含有する被検液中の
TGF定量における、上述のヒトTGF抗体および
RI標識TGFを用いるRI免疫測定法（以下RIAと
いう）を確立した。 本発明は、上記の知見に基いて完成したもの
で、被検液に、RI標識TGFと、TGF抗体とを反
応せしめ、次いでRI標識TGF−TGF抗体結合体
と未反応RI標識TGFとを分離し、その後分離し
たいずれか一方のRI標識体を定量する方法にお
いて、該トランスホーミンググロスフアクターが
ニンヒドリン反応陽性、SDS−電気泳動において
単一であり、酸および熱に対して安定で、トリプ
シンおよびジチオスレイトール処理により失活
し、ゲル過により推定分子量28000〜35000を示
す理化学的特性を有するものであることを特徴と
する被検液中のTGFの定量方法である。さらに
本発明において、そのTGF抗体として不溶性担
体に固定化した固相体として用いる固相法による
競争反応の定量法を行なつてもよく、また可溶性
のままのTGF抗体を用いてその反応後の分離に
おいてTGF抗体に対する特異的抗体を用いてな
る２抗体法による競争反応の定量法を行なえばよ
い。 まず本発明のRI標識TGFおよびヒトTGF抗体
を得るためのヒトTGFは、例えば肺ガン、絨毛
腫瘍、胃ガン、咽頭ガン、結脹ガン、乳ガン、黒
色肉腫、卵巣ガンなどのガン患者の尿の原料とし
て精製、回収することが簡便である。これらのガ
ン患者尿からのTGFの精製手段について例示す
ると、集められたガン患者尿は、まず低分子の不
純物を除くため、水を透析外液として透析膜の分
子量カツト約10000以下の膜を用いて透析する。
次いで得られた透析内液は、必要に応じて、凍
結、融解を反復して不純物を析出させ、遠心分離
や５ミクロン程度の細孔を有するフイルターを通
して微細な沈澱の粒子を除去してもよい。さらに
必要に応じて、透析内液は、バイオゲル
（Biogel）ｐ−60、ｐ−100（バイオラド社製）、
セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−50（フアルマシ
ア社製）などのゲル過剤にてゲル過して
TGF活性を示す画分を集めればよい。この際、
TGF活性を示す画分としては、推定分子量28000
〜35000の位置に存在し、後述する試験法によつ
て識別することができる。次いで、前述の尿の透
析内液またはゲル過して集めた活性画分につい
て、イオン交換クロマトグラフイーや分子篩膜例
えば分子量10000〜20000程度の限外過膜による
分子篩処理や、吸着クロマトグラフイーの少なく
とも１以上の操作またはこれらの操作を組み合せ
て精製されたTGF活性画分が採取される。イオ
ン交換クロマトグラフイーは、例えばCM−セフ
アデツクス（Sephadex）（フアルマシア社製）、
SP−セフアデツクス（Sephadex）（フアルマシ
ア社製）、CM−52（ワツトマン社製）、バイオ・
レツクス（Bio−Rex）70（バイオ・ラド社製）
などの陽イオン交換体を基材としたカラムを用い
て、上記のTGF含有液を加えて吸着せしめる。
次いで遂次濃度を上昇勾配させた中性塩、好まし
くは塩化ナトリウムの水溶液を用いて傾斜溶出し
て、そのTGF活性画分を回収すればよい。次い
で好ましくは分子量10000〜20000程度の限外過
膜を用いて濃縮、脱塩を行なえばよい。さらに吸
着クロマトグラフイーとしては、例えばシンクロ
パツク（Synchropak）PRシリーズ（シンクロー
ム社製）の炭素数３〜20のアルキル基のような疎
水性基で修飾されたシリカゲルやMCI Gel
CH20Pシリーズ（三菱化成工業社製）、アンバー
ライト（Amberlite）XADシリーズ（アンバー
ライト社製）のようなポリスチレン系ハイポーラ
吸着樹脂などの基材のカラムを用いて、上記の
TGF含有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次
濃度を上昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例え
ばエタノール、プロピルアルコールのような低級
脂肪族アルコールまたはアセトン、アセトニトリ
ルのような低級脂肪族ケトンなどの水溶液を用い
て傾斜溶出して、そのTGF活性画分を回収すれ
ばよい。このようにして得られるTGF活性画分
は、必要に応じて凍結乾燥などの乾燥手段にて乾
燥粉末として得てもよく、この乾燥粉末は白色
で、ニンヒドリン反応陽性、分子量28000〜35000
（ゲル過法）、SDS−電気泳動において単一であ
り、酸および熱に対して安定で、トリプシンおよ
びジチオスレイトール処理により失活される理化
学的性質を有しており、極めて高度に精製された
ヒトTGFである。 次いでこのようなTGFを用いて、RI標識
TGF、TGF抗体を得るのであるが、用いられる
TGFは何んら前述の精製手段に限定されるもの
ではない。 まずヒトTGF抗体を得るに当つては、前述の
ヒトTGFを抗源として、ヒト以外の哺乳動物、
例えばモルモツト、ウサギ、ラツト、マウスやヤ
ギなどの抗体産生能のある動物を用い、通常の方
法に従つて免疫した後採血して抗血清を得、さら
に抗体を分離する。この際抗源として用いる
TGFは、上述の如くまで高度に精製した単一の
蛋白標品であることが望ましいが、必ずしもこれ
に限定されるものではない。また抗体を得るに当
つて、例えば上述のヒトTGF粉末0.1〜１mgを生
理食塩水0.1〜５mlに溶解し、これに同量のコン
プリート・フロイント・アジユバント
（Complete Freund′s adjuvant）を加え、充分乳
化した後用いる哺乳動物、例えばウサギやマウス
などの皮下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回
注射して免疫せしめる。その後、最終免疫の日よ
り一定期間後採血し、これを放置し、凝固せしめ
て遠心分離し、ヒトTGF抗体を含有する抗血清
を得る。またこの場合に用いる動物としては抗体
産生能のある動物であれば何れを用いてもよく、
大量の抗体を得るには大型動物を用いるのが好ま
しく、通常はウサギ、マウスやヤギを用いるが、
何んら限定されるものではない。さらにこれらの
動物から得られたヒトTGF抗体を含有する抗血
清からヒトTGF抗体を得るには、通常用いられ
る抗体の精製手段の方法によつて行なえるもの
で、例えば抗血清を硫安分画し、次いでイオン交
換クロマトグラフイーあるいはゲル過によつて
精製、採取すればよい。さらに高純度に精製する
にはヒトTGFを固定化した不溶性担体を基材と
して用いるアフイニテイークロマトグラフイーに
て吸着し、次いで溶出を行なつて得ればよい。さ
らにヒトTGF抗体を得る別法としては、ヒト
TGFを抗原として免疫させたヒト以外の哺乳動
物の脾細胞とミエローマ細胞とを用いて融合せし
め、この融合細胞からヒトTGFに対するモノク
ロナール抗体産生細胞を分離し、この融合細胞を
用いるヒトTGFモノクロナール抗体を製造する
方法で、特に哺乳動物としてマウスを用いる方法
がよく利用されている〔Nature、256、495〜497
（1975）、Nature、276、397〜399（1978）、Cell、
14、９〜20（1978）、Nature、266、550〜552
（1977）、Eur.J.Immunol.、６、511〜519（1976）、
Chemical and Engineering News、Jan.1.1979、
15〜17〕。例えばBalb／Ｃマウスの皮下に、TGF
含有生理食塩水とコンプリート・フロイント・ア
ジユバントの乳化液を注射し、１〜３週間後複数
回追加免疫を行ない、最終免疫の３〜５日後にマ
ウスの脾臓を摘出し、適当な媒体中で脾細胞の単
一細胞化した懸濁液を調製する。次いでこの脾細
胞３〜10量に対して、マウス由来のミエローマ細
胞、例えばP3−NS1／１−Ag4−Ｉの１量を用
いて、37℃、40〜50％ポリエチレングリコール
1000〜1500の存在下適当な培地、例えばRPMI培
地〔J.A.M.A.、199、519（1967）、J.Nat.Cancer
Inst.、36、405（1966）、In Vitro、６、89（1970）
〕
で融合せしめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児血
清含有RPMI培地に加え、さらにこの細胞懸濁液
の微量づつを、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、ウシ胎児血清を含有するRPMI培
地（HAT培地）にて選択培養し、各培養液の上
清を採取し、その抗体価の高い培養細胞を選択
し、さらに用いたマウスBalb／ｃの胸腺細胞を
フイダーセルとして用いる限界希釈法法によりク
ローニングを行ない、ヒトTGFモノクロナール
抗体産生細胞を分取する。さらにこの細胞を、ウ
シ胎児血清含有RPMI培地やダルベツコ変法イー
グル培地にて培養し、その上清を取得し、これを
硫安分画、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル
過やアフイニテイークロマトグラフイーを行な
つて精製されたヒトTGFモノクロナール抗体を
得る。または、ヒトTGFモノクロナール抗体産
生細胞を、組織適合動物や無胸腺のヌードマウス
の体内で腫瘍として生育せしめ、これから採取、
精製してもよい。さらにこのヒトTGFモノクロ
ナール抗体産生細胞は、ジメチルスルホキサイド
やグリセロールなどの凍結保護剤を用いて血清含
有増殖培地にて液体窒素約−196℃で凍結保存す
ればよい。 さらにこのヒトTGF抗体またはヒトTGFモノ
クロナール抗体は、不活性担体に固体化した固相
体として用いてもよい。さらにそれらの抗体をパ
パイン処理して得られるそのＦ（ab′）2、さらにこ
れを還元処理して得られるFab′、抗体をペプシ
ン処理して得られるそのＦ（ab）2などのフラグメ
ントとして不溶性担体に結合せしめた固相体とし
て用いてもよい。 このような固相体としては、不溶性担体と上記
の抗体とを、前述の多官能性試薬を用いて結合せ
しめたTGFに体する免疫結合活性を保持してい
るものであればよい。また両者の結合において、
不溶性担体および抗体のいずれか一方または両方
にあらかじめ任意のスペーサー導入を行なつても
よく、例えばスクシンアルデヒド、グルタルアル
デヒド、アジポアルデヒドなどのジアルデヒド化
合物、ｗ−アミノ酪酸、ｗ−アミノグルタミン酸
の酸クロライド、スクシンイミドエステル、ｐ−
ニトロフエニルエステルなどの反応性誘導体、マ
ロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸など
のジカルボン酸化合物またはその反応性誘導体、
ヘキサメチレンジアミン、デカメチレンジアミン
などのジアミン化合物、３−（2′−ピリジル−ジ
チオ）プロピオン酸、３−（2′−ベンゾチアゾリ
ル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハライド、２−アミ
ノエタンチオールなどのチオール化合物などのス
ペーサー導入試薬の１種または２種以上を用いて
新たにアルデヒド基、カルボキシル基、アミノ
基、チオール基などの官能基を導入してもよい。
次いでこの不溶性担体や抗体の有するアミノ基、
水酸基、カルボキシル基、チオール基などや、さ
らに導入された官能基に基いて、両者を結合し得
る架橋試薬を用いて不溶性担体と抗体の結合体が
得られる。また用いられる架橋試薬としては、ア
ミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基な
どの官能基と反応し得る基を二以上有する多官能
性試薬であればよく、例えばスクシンアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなど
のジアルデヒド化合物、マロン酸、コハク酸、グ
ルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸または
その反応性誘導体、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、２，４−トルエンジイソシアナートなどの
ジイソシアナート化合物、ヘキサメチレンジイソ
チオシアナートなどのジイソチオシアナート化合
物、マレイミド安息香酸、マレイミドフエニル酢
酸などのマレイミドカルボン酸またはその反応性
誘導体、Ｎ，N′−エチレンビスマレイミド、Ｎ，
N′−０−フエニレンジマレイミドなどのジマレ
イミド化合物、ビスジアゾベンジジン、ジエチル
マロンイミデート、ジメチルアジピンイミデー
ト、Ｎ，N′−ポリメチレンビスヨードアセトア
ミドや３−（2′−ベンゾチアゾリン−ジチオ）プ
ロピオン酸、３−（2′−ピリジル−ジチオ）プロ
ピオン酸などのチオカルボン酸化合物またはその
反応性誘導体、Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチ
オ）エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミド、１−（2′−ベンゾチアゾ
リル−ジチオ）−２−（2′−ピリジル−ジチオ）エ
タンなどのジチオ化合物などが挙げられ、これら
の多官能性試薬は、用いる不溶性担体と抗体の結
合に関与するアミノ基、カルボキシル基、アルデ
ヒド基、水酸基、チオール基などの官能基を考慮
して選択使用すればよい。 さらに用いられる不溶性担体としては、用いる
抗体または多官能性試薬の官能基と反応し得る基
を有していればよく、または必要に応じて前述の
如くスペーサー導入試薬を用いて反応し得る基を
導入せしめたものであればよく、例えばアルブミ
ンやゼラチンなどの蛋白質の不溶化したもの、ア
ガロース、セルロースやデキストリンなどの多糖
類のエピクロルヒドリン処理による不溶化したも
のや臭化シアン処理およびアミノ基導入のための
スペーサー導入試薬処理やチオール基導入のため
のスペーサー導入試薬処理した不溶化したものな
ど不溶性半合成高分子系担体、アクリロニトリ
ル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアク
リル酸、メタアクリル酸エステル、ビニルアルコ
ール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチレン、
クロルスチレン、スルホンスチレン、マレイン
酸、フマル酸などの重合体または共重合体などの
不溶性合成高分子系担体やケイ素やアルミニウム
などの無機化合物のアミノ基を導入した不溶性無
機系担体が挙げられる。これらの不溶性担体は、
通常少なくとも過などの手段により容易に単離
できる粒径のものがよく、例えば径１mm以上、好
ましくは５mm以上のものがよく、ビーズ状のもの
が繁用される。またビーズ状の代りに、免疫反応
管の管底部の形状と相似した紡錘形の形状のもの
として用いてもよい。このような形状の不溶性担
体としては、第５図、第６図、第７図、第８図に
例示される（特開昭58−5657号公報参照）。詳し
くは、第５図の符号１に不溶性担体が総括的に示
してある。不溶性担体１は、通常高分子樹脂材料
からなり、不溶性担体の本体２と該本体２の上面
２ａの中央部に突出して設けられた取付脚３とか
ら構成されている。取付脚３には、他の操作棒
（図示せず）が取付けられる。該本体２は紡錘形
（弾丸状）に成型されていて、その外径は反応管
４の内径とわずかな隙間を保つ様な径に形成され
る。また該本体２の下周面の頂部には突起５、好
ましくはクサビ状の突起が設けてあり、この突起
５により、該本体２の弧状外周面２ｂと免疫反応
管４との弧状内周面４ａとの間に間隙部６が保持
されるものである。この突起部の高さとしては、
該本体２と免疫反応管４の管内壁面との幅とが同
一となればよい。さらに該本体２の上面部２ａに
は、第６図の如くの、取付脚３を中心にした切り
込み溝８が付設してある。切り込み溝８の終端
は、該本体２の終縁部に開口させ、上面部２ａの
延長線上での反応液の表面張力を弱めるように考
慮してある。また反応管の形状が異なる場合の変
形例として第７図を挙げるが、その構造を第５図
と同じくする部分には同じ番号を付したもので、
脱明は省略する。また例示すれば、免疫反応に使
用される試験管が15×105mm（内径12.8mm±0.1
mm）の場合、用いられる不溶性担体としては第８
図に符号ＡないしＩで示す各部寸法のものが使用
できる。すなわち、Ａ：半径６mmの半球部、Ｂ：
円柱部の高さ10mm、Ｃ：円錐状突起部の高さ0.4
mm、Ｄ：円錐状突起部の円錐の半径0.5mm、Ｅ：
半径0.75mmの半円状溝、Ｆ：対向する溝間の中心
部距離7.5mm、 Ｇ：操作棒を挿着するための凸部の直径４mm、 Ｈ：操作棒挿着孔の直径２mm、Ｉ：操作棒挿着 のための凸部の高さ３mmの寸法にて示される円柱
部、からなる高さ10mm、直径12mm、半径６mmの半
径部からなる不溶性担体の本体である。さらに免
疫反応管の材質、例えばガラスや合成高分子材自
体を不溶性担体として利用してもよいものであ
る。次いでこのような不溶性担体の反応し得る基
に基いてヒトTGF抗体を直接または多官能性試
薬を用いて結合せしめるのであるが、結合におい
ては、通常PH６〜8.5の緩衝液、有機溶媒または
これらの混合媒体中、０℃〜40℃にて各々を反応
せしめればよい。また別の固相体を製造する方法
としては、用いる不溶性担体の多孔性の吸着能を
利用して吸着固定化せしめてもよい。さらに、こ
のTGF抗体に対する特異的抗体、即ちこのTGF
抗体産生の哺乳動物の免疫グロブリン分画を用い
て他種の哺乳動物、特に大型動物に免疫せしめて
得られた第２抗体を用い、この第２抗体を不溶性
担体に固定化せしめ、次いでこれにこのTGF抗
体を免疫的手段にて結合せしめることによる
TGF抗体の活性をほとんど失活せしめることの
ない固定化手段によつて固相体を得てもよい。さ
らにこのようにして得られた固相体は、洗浄、保
存すればよい。 さらにまた上記の固相体を用いる代りに、
TGF抗体を可溶性のままで用いる場合には、被
検液中のTGFの定量反応におけるTGFまたはRI
標識TGFとTGF抗体との結合体と未反応物とを
分離するに、TGF抗体に対する特異的抗体が用
いられる。この特異的抗体は第２抗体とも呼ば
れ、即ちTGF抗体産生の哺乳動物の免疫グロフ
リン分画を抗原として用い、これを公知の免疫手
段に基いて、他種の哺乳動物、特に大型動物に皮
下、皮内に注射せしめて免疫し、その血液から抗
体血清を得、さらに公知の精製手段により抗体を
得ればよく、この際通常抗血の状態にて利用する
ことが簡便である。しかしまた、この第２抗体を
常法により精製し、これを不溶性担体に固定化し
て第２抗体の固相体として用いてもよい。 また本発明に用いられるRI標識TGFにおいて、
RIとしては通常 125Iや 131Iが用いられ、一般的
には 125Iが用いらえる。またこれらのヨウ素を
TGFに結合せしめるには、例えばヨウ素をTGF
の分子内に直接的に結合せしめるクロラミン−Ｔ
法による方法や、TGF分子にヨウ素付加したフ
エニル基を結合せしめる間接的なヨウ素の結合で
あるボルトン・ハンター（Bolton ＆ Hunter）
法などの手段がよく用いられる。特にクロラミン
−Ｔ法ではヨウ素はヨウ化ナトリウムの形で用い
られ、またボルトン・ハンター法ではボルトン・
ハンター試薬、例えば３−（４−ヒドロキシ−５
−〔 125I〕ヨードフエニル）プロピオン酸スクシ
ンイミドエステルの形でよく用いられるものであ
る。このようなRIを用いてTGFを標識するに当
つては、上記のクロラミン−Ｔ法や、オルトン・
ハンター法に基いて常法により行なえばよく、ま
た反応終了後はゲル過などの精製手段により
RI標識TGFの精製物を回収すればよい。さらに
RIの標識手段としては上記方法に限られず、公
知の種々の方法によつて標識してもよいのであ
る。 次いで本発明を実施するに当つて、まずTGF
の含有量を測定しようとする被検液、例えばヒト
の尿または血清の50μ〜１ml、RI標識TGFおよ
びTGF抗体とを免疫反応媒体、例えばリン酸緩
衝液やベロナール緩衝液100μ〜５ml中にて４
〜５℃にて約15時間〜72時間インキユベイトして
競争反応せしめる。次いでこの反応により免疫的
に結合した部分、特にRI標識TGF−TGF抗体の
結合部（Bond：Ｂ）と結合していない未反応の
遊離部分、特に未反応のRI標識TGFの遊離部
（Free：Ｆ）とを分離するためにＢ−Ｆ分離を行
なう。このＢ−Ｆ分離に当つて、用いるTGF抗
体が固相体である固相法の場合には競争反応後固
相体と反応液層とを過などの手段にて分別し、
洗浄後、固相体あたは液層のいずれか一方の
RI標識TGFの放射能を測定すればよい。またＢ
−Ｆ分離に当つては、用いる抗体が可溶性のまま
で第２抗体を用いる２抗体法の場合には競争反応
後第２抗体、さらに好ましくはその第２抗体を含
有する抗血清、必要に応じてTGF抗体作成に用
いた哺乳動物と同一種の動物の正常血清を加えて
１〜12時間インキユベイトし、その後3000rpm、
10〜30分間程度遠心分離して免疫反応によつて結
合し、沈澱した部分Ｂと上清Ｆとを分別し、洗浄
後沈澱物または上清のいずれか一方の放射能を測
定すればよい。さらに上記の免疫反応の結合部で
ある固相体や沈澱物、または未反応物を含む液
や上清の放射能の測定に当つては、ガイガーミユ
ラー計数管やシンチレーシヨンカウンターなどの
放射能カウンターにて行なえばよい。 このようにして、ヒトTGFを用いて得られる
RI標識TGF、およびTGF抗体を用いることによ
り、極めて正確かつ簡便に被検液中のTGFの定
量をなし得たもので、ガンの判定に有用に利用さ
れるものである。 次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具
体的に述べるが、本発明は何んらこれによつて限
定されるものではない。 実施例 １ (1) 抗ヒトTGF血清の作成 TGF（後述参考例１によつて製造したヒト
TGF）0.5mgを生理食塩水0.5mlに溶解し、これ
に同量のコンプリート・フロント・アジユバン
トを加え、充分に乳化混合した後、家ウサギの
四肢指の皮中および背中の皮下数ケ所に注射し
た。２週間おきに同量の乳剤を６回皮下注射
し、最終の免疫より10日後にその全血を採取
し、60分間室温に放置し凝固せしめた後、
3000rpmで10分間遠心分離を行ないヒトTGF
抗体含有抗血清を得た。 (2) 125I標識TGFのクロラミン−Ｔ法による調
整 ２ｍCiの放射活性を有する 125I−NaIを含有
する0.5Mリン酸緩衝液（PH7.5）50μに、
TGFを2μｇ含有する水溶液10μ、および0.35
％クロラミンＴ液20μを加えて30秒間撹拌反
応せしめた後、0.45％重亜硫酸ナトリウム液
50μを加えて反応を停止させた。次いで反応
液に５％人血清アルブミン（HSA）含有する
0.1N酢酸溶液500μを加えた後、セフアデツ
クスＧ−25（1.0×50cm）のカラムに添加し、
0.5％HSAを含有する0.1N酢酸溶液で溶出せし
め、その素通り画分に 125I標識TGFを得た。 (3) ヒトTGF抗血清の抗体価測定 (1)で得られた抗血清を10ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.4）（0.25％ウシ血清アルミン（BSA）、0.1
％アジ化ナトリウム、５ｍMEDTA、0.9％
NaCl含有）−免疫反応用緩衝液−で、100、
1000、10000、100000倍に希釈し、それぞれ
100μをRIA用シオノギチユーブに分注し、
これに 125I標識TGF液100μを加えて５℃で
16時間反応せしめた。次いでラビツトＩｇ
G12μｇ、抗ラビツトＩｇＧヤギ血清を加えて
37℃で２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生
理食塩水３mlを加えた後、3000rpmで10分間遠
心分離を行ない回収し、沈澱物の放射能を測定
した。抗血清の各希釈濃度における 125I標識
TGFとの免疫反応による結合率を測定し、結
果を第１図に示した。 (4) 液相RIAによるTGFの測定 TGFを免疫反応用緩衝液を用いて、１mlあ
たり、1.25、5.0、20、80、320、1280nｇの各
濃度に溶解させたものを標準TGF液とした。
RIA用シオノギチユーブに各TGF標準液100μ
、 125I標識TGF100μ、およびヒトTGF抗
血清の30000倍希釈液100μを加えて５℃で16
時間反応せしめた。次いで、ラビツトＩｇ
G12μｇが、抗ラビツトＩｇＧヤギ血清を加え
37℃で２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生
理食塩水３mlを加えた後、3000rpmで10分間遠
心分離を行ない回収し沈澱物の放射能を測定し
た。 結果は第２図に示す通りであり、本測定系は
きわめて良好な定量曲線を示すものであつた。
なお被検液（血清、尿等）中のTGF量を測定
する場合は、標準TGF液の代りに被検液100μ
を加え、前記と同様の操作を行ない、定量曲
線と対照することにより被検液中のTGF濃度
を求めればよい。 実施例 ２ (1) ヒトTGFに対するモノクロナール抗体の作
成 TGF1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これに
同量のコンプリート・フロイント・アジユバン
トを加え充分に乳化混合した。乳化剤0.2mlを
Balb／ｃマウスの背中皮下数ケ所に注射した。
10日間隔に同様の方法で２回追加免疫を行な
い、さらに２週間後TGF100μｇを溶解させた
生理食塩水0.2mlを静脈内投与を行なつた。最
終免疫後３日目にマウスの脾臓を無菌的に取り
出し、単細胞化させ、混入した赤血球細胞は、
0.83％塩化アンモニウム液で融解された。この
脾細胞の懸濁液を冷却したハンクス液で数回洗
滌後、別に培養調製したマウスミエローマ細胞
（P3−NS1／１−Ａｇ４−１）と３対１の細胞
量比で混合させた。遠心分離を行ない、得られ
た脾細胞とミエローマ細胞のペレツトに、予め
37℃に加温させた50％ポリエチレングリコール
1000含有RPMI培地１mlを遠心管を回転させな
がら１分かけてゆつくりと加えた。次いで37℃
で90秒加温後、冷却したハンクス液５mlをゆつ
くり加え、さらに冷ハンクス液を５ml、及び10
mlとそれぞれおだやかに加えた後、遠心分離を
行ない得られたペレツトを10％ウシ胎児血清
（FCS）を含むRPMI倍地34mlを加え細胞懸濁
液とした。細胞懸濁液を96穴プレート（ムンク
社製）に100μづつ分注し炭酸ガスふらん器
（95％空気、５％CO2；温度37℃、湿度100％）
に入れて培養を開始し、１日後２倍濃度の
HAT倍地（100μMヒポキサンチン、104μMア
ミノプテリン、16μMチミジン、10％FCSを含
有するRPMI倍地）を100μ添加しHAT選択
培養を開始し、その後１〜３日間隔で倍地の半
分量をHAT培地と交換した。７〜14日後にハ
イブリドーマの生育してきたウエルの培養上清
を採取し、抗体価の高いものを５コ選んだ。次
にフイーダーセルとしてBalb／ｃの胸腺細胞
を用い、限界希釈法によりクローニングを行な
い、25コのモノクナール抗体産生細胞を分散し
た。その中で最も高い抗体価を示したNo.15のハ
イブリドーマを用い、96穴ウエルから24穴ウエ
ル、それから50mlの培養とスケールアツプして
いき、約1000mlの培養上清を取得し、これをヒ
トTGFモノクロナール抗体溶液として用いた。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の抗体価測定
培養上液を免疫反応用緩衝液で、10、100、
1000、10000倍に希釈した液100μを反応小試
験管に加え、次いで 125I標識TGF液を加えて、
５℃で16時間反応させた。これに正常マウス血
清の100倍希釈液100μ、および抗マウスＩｇ
Ｇラビツト血清100μを加えて、37℃で１時
間反応せしめ、生成する沈澱物を３mlの生理食
塩水を加えた後、3000rpmで10分間遠心分離を
行ない回収し、沈澱物の放射能を測定した。No.
15のハイブリドーマの培養上清は、約4000倍の
希釈濃度で 125I標識TGFの50％と結合した。 (3) 固相RIAによるTGFの測定 (1) ヒトTGF抗体固定化担体の作製 前記(2)で得られたヒトTGFモノクロナー
ル抗体を含有する培養上清より、硫安分画、
DEAE−セルロースクロマトグラフイーを行
ない精製したモノクロナール抗体0.1mgを100
ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解させた液
20mlに、ポリスチレン系ビーズ（積水化学社
製、粒径6.35mm）100粒を加え、５℃で16時
間、37℃で１時間反応させ抗体をビーズに固
定化せしめた。ビーズは生理食塩水で充分洗
滌後、免疫反応用緩衝液中に浸漬し、５℃で
保存し固相体とした。 (2) 測定法 反応用小試管（シオノギチユーブ）に免疫
反応用緩衝液200μ、標準TGF液（1.25〜
1280nｇ／ml）100μ、及び 125I標識TGF液
100μを加え、これに上記の固相体を１粒
加え、５℃で40時間反応せしめた。反応終了
後、生理食塩水２mlを加え撹拌洗滌後、洗液
をアスピレーターで吸引除去した。この操作
を２回くり返し行なつた後、ビーズを新しい
チユーブに移しその放射能を測定した。 結果は第３図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお、被検液（血清・尿等）中のTGF
量を測定する場合は、標準TGF液の代りに
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない定量曲線と対照することにより被検液
中のTGF濃度を求められる。 実施例 ３ (1) ヒトTGFに対するモノクロナール抗体の作
成 実施例２と同様の方法で作成した。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の抗体価測定 実施例２と同じ方法で測定した。 (3) 抗マウスＩｇＧ血清の作成 Balb／ｃマウス100匹より採血調製した血清
50mlより、通常の硫安分画、およびDEAE−セ
ルロースクロマトグラフを行ないマウスＩｇＧ
分画を調製した。マウスＩｇG5mgを含む生理
食塩水１mlに、同量のコンプリート・フロイン
ト・アジユバントを加え、充分に乳化混合した
後、家ウサギの四肢指の皮中、および背中の皮
下数ケ所に注射した。２週間おきに同量の乳剤
を６回皮下注射し、最終の免疫より10日後にそ
の全血を採取し、60分間室温に放置し凝固せし
めた後、3000rpmで10分間遠心分離を行ないマ
ウスIgG抗体含有抗血清を得た。 (4) 固相RIAによるTGFの測定 (1) ヒトTGF抗体固定化担体の作製 ポリスチレン系不溶性担体（第８図記載の
形状を示す）をスキツトXNで洗滌後、抗マ
ウスＩｇＧウサギ血清のＩｇＧ分画32μｇを
含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）0.4
mlを含む小試験管15×105mm（内径12.8mm±
0.1mm）に上記の不溶性担体を挿入し、５℃
にて16時間反応させ、この不溶性担体１個あ
たり8.6μｇのＩｇＧを固相化せしめた固相体
を得た。次いで固相体を生理食塩水で充分洗
滌後、ヒトTGFモノクロナール抗体0.08μｇ
を含有する免疫反応用緩衝液0.4mlを含む小
試験管（前述）に挿入し、５℃で40時間反応
させ、不溶性担体−マウスＩｇＧ抗体−ヒト
TGFモノクロナール抗体結合物を作製し、
この固相体は生理食塩水で充分に洗滌後免疫
反応用緩衝液中に浸漬し、５℃で保存しヒト
TGF抗体固定化担体の固相体とした。 (2) 測定法 小試験管（前述）に免疫反応用緩衝液
100μ、標準TGF液（1.25〜1280nｇ／ml）
100μ、および 125I標識TGF液100μを加
え、37℃で４時間反応せしめた。反応終了
後、生理食塩水５mlを加え、固相体を洗滌し
ながら引き抜き、この固相体を新しい小試験
管に加えてその放射能を測定した。 結果は第４図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお、被検液（血清・尿等）中のTGF
量を測定する場合は、標準TGF液の代りに
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない定量曲線と対照することにより被検液
中のTGF濃度が求められる。 また以下にTGFの製造例を挙げるが、何
んらこれに限定されるものではなく、例えば
特願昭58−61102号明細書に記載の方法によ
つてTGFを製造し、これを用いてもよい。 参考例 １ 肺ガン患者尿1100mlを0.01Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対し分子量カツト10000の透析膜（三光純
薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なつた。
透析内液は12000×ｇにて60分間遠心分離し、沈
澱を除く。SP−セフアデツクス（フアルマシヤ、
ジヤパン社製）をカラム（容量4.5cm×33cm）に
詰め、0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）で平衡化し
た後、上記透析内液を流下し、有効成分を吸着さ
せた後、同緩衝液で充分洗浄し、ついで同緩衝液
中、塩化ナトリウム0.01M〜1.5Mの傾針溶出を
行なつた。（流速22.5ml／時、温度４℃、塩化ナ
トリウム傾斜濃度緩衝液4.8使用）。TGFは同
緩衝液中、塩化ナトリウム濃度0.6〜1.0Mの位置
に溶出され、活性分画62.0mlを得た。本活性分画
は後記のTGF活性試験法において、5μで正常
細胞は変質されコロニーを形成した。本活性分画
全量をダイヤフロー分子篩膜PM−10（アミコン、
フアーイースト、リミテツド社製（日本））を用
いて脱塩、濃縮をくり返し、1.2mlをし、これに
トリフロロ酢酸を加えて0.05％トリフロロ酢酸溶
液とした。 アルキル基（C18）を結合させたシリカゲルを
担体とするシンクロパツクRP−Ｐ（シンクローム
社製）をカラム（容量4.1mm×250mm）に詰め0.05
％トリフロロ酢酸で平衡化し、このカラム１本に
上記TGF、トリフロロ酢酸溶液の1/3を流し吸着
後0.05％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同液中
０〜90％アセトニトリルの傾斜溶出を行ないアセ
トニトリル濃度55〜75％位置に溶出される活性分
画をとる。以上の操作を３回行ない前記の分子篩
による濃縮調製液全量を処理しTGF活性分画7.9
mlを分取した。本分画を凍結乾燥後、再び3.0ml
の生理食塩水に溶解し、この溶液をTGF試験法
にかけ0.4μで正常細胞は変質されコロニー形成
能を示した。 【表】 TGF活性試験法 材 料 (1) NRK−細胞（株49F） (2) ５％牛胎児血清及び１％非不可欠アミノ酸添
加ダルベツコ変法イーグル培地 (3) 精製寒天（Agar Noble、Difco社製） (4) 直径60mmのペトリ皿 操 作 0.5％寒天含有の(1)の培地をペトリ皿一枚に５
mlずつ注加して下層培地とする。 この上にNRK細胞１×103個／mlを含む0.3％
寒天含有培地をペトリ皿一枚に２mlずつ積層し上
層培地とし、この上に0.5mlの生理食塩水に溶解
いた試料を加え、炭酸ガスインキユベーター中に
37℃で培養する、14日後に培養器から取り出し、
40倍のケンビ鏡でペトリ皿上の２mm×２mm視野を
10ケ所を無作為にえらび、細胞数10個以上よりな
るコロニーの数をかぞえて総数を成績とする。
（Transforming Growth Factor；以下、TGFと
いう）の定量方法に関する。 TGFは、ヒトおよびけつ歯動物のガン細胞で
つくられ、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質
（形質転換および増殖）をさせるポリペプチドで
ある。ヒトおよび動物の正常細胞は、軟寒天培地
においてはコロニーを形成しないが、これに
TGFを加えるとコロニー形成能を有するように
なる。1978年ジ・ゼ・トダロら〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、75、4001（1978）〕により、肉腫細胞
の培養上清から始めてTGFの存在が報告されて
以来、多数のTGFがヒトおよびけつ歯動物の培
養ガン細胞およびガン患者のガン組織からも発見
されている〔ロバーツ・エ・ビら；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、77、3494（1980）〕。最近、デ
イ・アイ・タージツクら〔JNCL、69、793
（1982）〕およびジ・ゼ・トダロら〔Cancer
Res.、43、403（1983）〕は、ガン患者の尿から分
子量約30000〜35000の高分子型TGFを抽出して
いるが詳しい物性は未だ明らかでない。 従つてまた、TGFを類似している種々のグロ
スフアクターを明瞭に識別する適切な手段がな
く、TGFを判定するに当つて、TGFの有する正
常細胞のコロニー形成能に基づいて行なつていた
にすぎず、かつ煩雑な操作をも必要とし、定量性
に欠けるものであつた。さらにTGFの体液、例
えば血液、尿などにおける存在、含有量、さらに
その消長などに関してあまり報告されていないも
のであつた。 本発明者らは、先に、高分子型のTGFは正常
人尿には存在せず、ガン患者尿のみ特異的に存在
すること、しかもこのものが正常細胞に対して前
述のような生物学的活性を有するもので極めて重
要な物質と考えて研究した結果、種々のガン患者
の尿を透析して無機イオンその他の低分子物質を
除去し、さらに必要に応じてゲル過した後、次
いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフイー
または／および吸着クロマトグラフイーを行な
い、極めて高純度に精製されたヒトTGFを得た
ものである（特願昭58−61102号明細書（特開昭
59−186994号参照）。 さらに本発明者らは研究し続けた結果、この
TGFを用いて、ヒト以外の哺乳動物に注射して
免疫せしめ、その血液を採取し、このTGFに対
するヒトTGF抗体が良好に得られることを知り、
さらに研究の結果、免疫させた補修動物の脾臓を
摘出し、その抗体産生能を有する単細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合せしめることによりTGFに対
するヒトTGF抗体としてのモノクロナール抗体
産生細胞を得、これを培養してヒトTGF抗体を
良好に得ることを完成した。さらに本発明者ら
は、得られたヒトTGF抗体と免疫反応を良好に
行ない得るTGFの放射性同位元素（以下RIとい
う）標識体を得、TGFを含有する被検液中の
TGF定量における、上述のヒトTGF抗体および
RI標識TGFを用いるRI免疫測定法（以下RIAと
いう）を確立した。 本発明は、上記の知見に基いて完成したもの
で、被検液に、RI標識TGFと、TGF抗体とを反
応せしめ、次いでRI標識TGF−TGF抗体結合体
と未反応RI標識TGFとを分離し、その後分離し
たいずれか一方のRI標識体を定量する方法にお
いて、該トランスホーミンググロスフアクターが
ニンヒドリン反応陽性、SDS−電気泳動において
単一であり、酸および熱に対して安定で、トリプ
シンおよびジチオスレイトール処理により失活
し、ゲル過により推定分子量28000〜35000を示
す理化学的特性を有するものであることを特徴と
する被検液中のTGFの定量方法である。さらに
本発明において、そのTGF抗体として不溶性担
体に固定化した固相体として用いる固相法による
競争反応の定量法を行なつてもよく、また可溶性
のままのTGF抗体を用いてその反応後の分離に
おいてTGF抗体に対する特異的抗体を用いてな
る２抗体法による競争反応の定量法を行なえばよ
い。 まず本発明のRI標識TGFおよびヒトTGF抗体
を得るためのヒトTGFは、例えば肺ガン、絨毛
腫瘍、胃ガン、咽頭ガン、結脹ガン、乳ガン、黒
色肉腫、卵巣ガンなどのガン患者の尿の原料とし
て精製、回収することが簡便である。これらのガ
ン患者尿からのTGFの精製手段について例示す
ると、集められたガン患者尿は、まず低分子の不
純物を除くため、水を透析外液として透析膜の分
子量カツト約10000以下の膜を用いて透析する。
次いで得られた透析内液は、必要に応じて、凍
結、融解を反復して不純物を析出させ、遠心分離
や５ミクロン程度の細孔を有するフイルターを通
して微細な沈澱の粒子を除去してもよい。さらに
必要に応じて、透析内液は、バイオゲル
（Biogel）ｐ−60、ｐ−100（バイオラド社製）、
セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−50（フアルマシ
ア社製）などのゲル過剤にてゲル過して
TGF活性を示す画分を集めればよい。この際、
TGF活性を示す画分としては、推定分子量28000
〜35000の位置に存在し、後述する試験法によつ
て識別することができる。次いで、前述の尿の透
析内液またはゲル過して集めた活性画分につい
て、イオン交換クロマトグラフイーや分子篩膜例
えば分子量10000〜20000程度の限外過膜による
分子篩処理や、吸着クロマトグラフイーの少なく
とも１以上の操作またはこれらの操作を組み合せ
て精製されたTGF活性画分が採取される。イオ
ン交換クロマトグラフイーは、例えばCM−セフ
アデツクス（Sephadex）（フアルマシア社製）、
SP−セフアデツクス（Sephadex）（フアルマシ
ア社製）、CM−52（ワツトマン社製）、バイオ・
レツクス（Bio−Rex）70（バイオ・ラド社製）
などの陽イオン交換体を基材としたカラムを用い
て、上記のTGF含有液を加えて吸着せしめる。
次いで遂次濃度を上昇勾配させた中性塩、好まし
くは塩化ナトリウムの水溶液を用いて傾斜溶出し
て、そのTGF活性画分を回収すればよい。次い
で好ましくは分子量10000〜20000程度の限外過
膜を用いて濃縮、脱塩を行なえばよい。さらに吸
着クロマトグラフイーとしては、例えばシンクロ
パツク（Synchropak）PRシリーズ（シンクロー
ム社製）の炭素数３〜20のアルキル基のような疎
水性基で修飾されたシリカゲルやMCI Gel
CH20Pシリーズ（三菱化成工業社製）、アンバー
ライト（Amberlite）XADシリーズ（アンバー
ライト社製）のようなポリスチレン系ハイポーラ
吸着樹脂などの基材のカラムを用いて、上記の
TGF含有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次
濃度を上昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例え
ばエタノール、プロピルアルコールのような低級
脂肪族アルコールまたはアセトン、アセトニトリ
ルのような低級脂肪族ケトンなどの水溶液を用い
て傾斜溶出して、そのTGF活性画分を回収すれ
ばよい。このようにして得られるTGF活性画分
は、必要に応じて凍結乾燥などの乾燥手段にて乾
燥粉末として得てもよく、この乾燥粉末は白色
で、ニンヒドリン反応陽性、分子量28000〜35000
（ゲル過法）、SDS−電気泳動において単一であ
り、酸および熱に対して安定で、トリプシンおよ
びジチオスレイトール処理により失活される理化
学的性質を有しており、極めて高度に精製された
ヒトTGFである。 次いでこのようなTGFを用いて、RI標識
TGF、TGF抗体を得るのであるが、用いられる
TGFは何んら前述の精製手段に限定されるもの
ではない。 まずヒトTGF抗体を得るに当つては、前述の
ヒトTGFを抗源として、ヒト以外の哺乳動物、
例えばモルモツト、ウサギ、ラツト、マウスやヤ
ギなどの抗体産生能のある動物を用い、通常の方
法に従つて免疫した後採血して抗血清を得、さら
に抗体を分離する。この際抗源として用いる
TGFは、上述の如くまで高度に精製した単一の
蛋白標品であることが望ましいが、必ずしもこれ
に限定されるものではない。また抗体を得るに当
つて、例えば上述のヒトTGF粉末0.1〜１mgを生
理食塩水0.1〜５mlに溶解し、これに同量のコン
プリート・フロイント・アジユバント
（Complete Freund′s adjuvant）を加え、充分乳
化した後用いる哺乳動物、例えばウサギやマウス
などの皮下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回
注射して免疫せしめる。その後、最終免疫の日よ
り一定期間後採血し、これを放置し、凝固せしめ
て遠心分離し、ヒトTGF抗体を含有する抗血清
を得る。またこの場合に用いる動物としては抗体
産生能のある動物であれば何れを用いてもよく、
大量の抗体を得るには大型動物を用いるのが好ま
しく、通常はウサギ、マウスやヤギを用いるが、
何んら限定されるものではない。さらにこれらの
動物から得られたヒトTGF抗体を含有する抗血
清からヒトTGF抗体を得るには、通常用いられ
る抗体の精製手段の方法によつて行なえるもの
で、例えば抗血清を硫安分画し、次いでイオン交
換クロマトグラフイーあるいはゲル過によつて
精製、採取すればよい。さらに高純度に精製する
にはヒトTGFを固定化した不溶性担体を基材と
して用いるアフイニテイークロマトグラフイーに
て吸着し、次いで溶出を行なつて得ればよい。さ
らにヒトTGF抗体を得る別法としては、ヒト
TGFを抗原として免疫させたヒト以外の哺乳動
物の脾細胞とミエローマ細胞とを用いて融合せし
め、この融合細胞からヒトTGFに対するモノク
ロナール抗体産生細胞を分離し、この融合細胞を
用いるヒトTGFモノクロナール抗体を製造する
方法で、特に哺乳動物としてマウスを用いる方法
がよく利用されている〔Nature、256、495〜497
（1975）、Nature、276、397〜399（1978）、Cell、
14、９〜20（1978）、Nature、266、550〜552
（1977）、Eur.J.Immunol.、６、511〜519（1976）、
Chemical and Engineering News、Jan.1.1979、
15〜17〕。例えばBalb／Ｃマウスの皮下に、TGF
含有生理食塩水とコンプリート・フロイント・ア
ジユバントの乳化液を注射し、１〜３週間後複数
回追加免疫を行ない、最終免疫の３〜５日後にマ
ウスの脾臓を摘出し、適当な媒体中で脾細胞の単
一細胞化した懸濁液を調製する。次いでこの脾細
胞３〜10量に対して、マウス由来のミエローマ細
胞、例えばP3−NS1／１−Ag4−Ｉの１量を用
いて、37℃、40〜50％ポリエチレングリコール
1000〜1500の存在下適当な培地、例えばRPMI培
地〔J.A.M.A.、199、519（1967）、J.Nat.Cancer
Inst.、36、405（1966）、In Vitro、６、89（1970）
〕
で融合せしめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児血
清含有RPMI培地に加え、さらにこの細胞懸濁液
の微量づつを、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、ウシ胎児血清を含有するRPMI培
地（HAT培地）にて選択培養し、各培養液の上
清を採取し、その抗体価の高い培養細胞を選択
し、さらに用いたマウスBalb／ｃの胸腺細胞を
フイダーセルとして用いる限界希釈法法によりク
ローニングを行ない、ヒトTGFモノクロナール
抗体産生細胞を分取する。さらにこの細胞を、ウ
シ胎児血清含有RPMI培地やダルベツコ変法イー
グル培地にて培養し、その上清を取得し、これを
硫安分画、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル
過やアフイニテイークロマトグラフイーを行な
つて精製されたヒトTGFモノクロナール抗体を
得る。または、ヒトTGFモノクロナール抗体産
生細胞を、組織適合動物や無胸腺のヌードマウス
の体内で腫瘍として生育せしめ、これから採取、
精製してもよい。さらにこのヒトTGFモノクロ
ナール抗体産生細胞は、ジメチルスルホキサイド
やグリセロールなどの凍結保護剤を用いて血清含
有増殖培地にて液体窒素約−196℃で凍結保存す
ればよい。 さらにこのヒトTGF抗体またはヒトTGFモノ
クロナール抗体は、不活性担体に固体化した固相
体として用いてもよい。さらにそれらの抗体をパ
パイン処理して得られるそのＦ（ab′）2、さらにこ
れを還元処理して得られるFab′、抗体をペプシ
ン処理して得られるそのＦ（ab）2などのフラグメ
ントとして不溶性担体に結合せしめた固相体とし
て用いてもよい。 このような固相体としては、不溶性担体と上記
の抗体とを、前述の多官能性試薬を用いて結合せ
しめたTGFに体する免疫結合活性を保持してい
るものであればよい。また両者の結合において、
不溶性担体および抗体のいずれか一方または両方
にあらかじめ任意のスペーサー導入を行なつても
よく、例えばスクシンアルデヒド、グルタルアル
デヒド、アジポアルデヒドなどのジアルデヒド化
合物、ｗ−アミノ酪酸、ｗ−アミノグルタミン酸
の酸クロライド、スクシンイミドエステル、ｐ−
ニトロフエニルエステルなどの反応性誘導体、マ
ロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸など
のジカルボン酸化合物またはその反応性誘導体、
ヘキサメチレンジアミン、デカメチレンジアミン
などのジアミン化合物、３−（2′−ピリジル−ジ
チオ）プロピオン酸、３−（2′−ベンゾチアゾリ
ル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハライド、２−アミ
ノエタンチオールなどのチオール化合物などのス
ペーサー導入試薬の１種または２種以上を用いて
新たにアルデヒド基、カルボキシル基、アミノ
基、チオール基などの官能基を導入してもよい。
次いでこの不溶性担体や抗体の有するアミノ基、
水酸基、カルボキシル基、チオール基などや、さ
らに導入された官能基に基いて、両者を結合し得
る架橋試薬を用いて不溶性担体と抗体の結合体が
得られる。また用いられる架橋試薬としては、ア
ミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基な
どの官能基と反応し得る基を二以上有する多官能
性試薬であればよく、例えばスクシンアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなど
のジアルデヒド化合物、マロン酸、コハク酸、グ
ルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸または
その反応性誘導体、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、２，４−トルエンジイソシアナートなどの
ジイソシアナート化合物、ヘキサメチレンジイソ
チオシアナートなどのジイソチオシアナート化合
物、マレイミド安息香酸、マレイミドフエニル酢
酸などのマレイミドカルボン酸またはその反応性
誘導体、Ｎ，N′−エチレンビスマレイミド、Ｎ，
N′−０−フエニレンジマレイミドなどのジマレ
イミド化合物、ビスジアゾベンジジン、ジエチル
マロンイミデート、ジメチルアジピンイミデー
ト、Ｎ，N′−ポリメチレンビスヨードアセトア
ミドや３−（2′−ベンゾチアゾリン−ジチオ）プ
ロピオン酸、３−（2′−ピリジル−ジチオ）プロ
ピオン酸などのチオカルボン酸化合物またはその
反応性誘導体、Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチ
オ）エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミド、１−（2′−ベンゾチアゾ
リル−ジチオ）−２−（2′−ピリジル−ジチオ）エ
タンなどのジチオ化合物などが挙げられ、これら
の多官能性試薬は、用いる不溶性担体と抗体の結
合に関与するアミノ基、カルボキシル基、アルデ
ヒド基、水酸基、チオール基などの官能基を考慮
して選択使用すればよい。 さらに用いられる不溶性担体としては、用いる
抗体または多官能性試薬の官能基と反応し得る基
を有していればよく、または必要に応じて前述の
如くスペーサー導入試薬を用いて反応し得る基を
導入せしめたものであればよく、例えばアルブミ
ンやゼラチンなどの蛋白質の不溶化したもの、ア
ガロース、セルロースやデキストリンなどの多糖
類のエピクロルヒドリン処理による不溶化したも
のや臭化シアン処理およびアミノ基導入のための
スペーサー導入試薬処理やチオール基導入のため
のスペーサー導入試薬処理した不溶化したものな
ど不溶性半合成高分子系担体、アクリロニトリ
ル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアク
リル酸、メタアクリル酸エステル、ビニルアルコ
ール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチレン、
クロルスチレン、スルホンスチレン、マレイン
酸、フマル酸などの重合体または共重合体などの
不溶性合成高分子系担体やケイ素やアルミニウム
などの無機化合物のアミノ基を導入した不溶性無
機系担体が挙げられる。これらの不溶性担体は、
通常少なくとも過などの手段により容易に単離
できる粒径のものがよく、例えば径１mm以上、好
ましくは５mm以上のものがよく、ビーズ状のもの
が繁用される。またビーズ状の代りに、免疫反応
管の管底部の形状と相似した紡錘形の形状のもの
として用いてもよい。このような形状の不溶性担
体としては、第５図、第６図、第７図、第８図に
例示される（特開昭58−5657号公報参照）。詳し
くは、第５図の符号１に不溶性担体が総括的に示
してある。不溶性担体１は、通常高分子樹脂材料
からなり、不溶性担体の本体２と該本体２の上面
２ａの中央部に突出して設けられた取付脚３とか
ら構成されている。取付脚３には、他の操作棒
（図示せず）が取付けられる。該本体２は紡錘形
（弾丸状）に成型されていて、その外径は反応管
４の内径とわずかな隙間を保つ様な径に形成され
る。また該本体２の下周面の頂部には突起５、好
ましくはクサビ状の突起が設けてあり、この突起
５により、該本体２の弧状外周面２ｂと免疫反応
管４との弧状内周面４ａとの間に間隙部６が保持
されるものである。この突起部の高さとしては、
該本体２と免疫反応管４の管内壁面との幅とが同
一となればよい。さらに該本体２の上面部２ａに
は、第６図の如くの、取付脚３を中心にした切り
込み溝８が付設してある。切り込み溝８の終端
は、該本体２の終縁部に開口させ、上面部２ａの
延長線上での反応液の表面張力を弱めるように考
慮してある。また反応管の形状が異なる場合の変
形例として第７図を挙げるが、その構造を第５図
と同じくする部分には同じ番号を付したもので、
脱明は省略する。また例示すれば、免疫反応に使
用される試験管が15×105mm（内径12.8mm±0.1
mm）の場合、用いられる不溶性担体としては第８
図に符号ＡないしＩで示す各部寸法のものが使用
できる。すなわち、Ａ：半径６mmの半球部、Ｂ：
円柱部の高さ10mm、Ｃ：円錐状突起部の高さ0.4
mm、Ｄ：円錐状突起部の円錐の半径0.5mm、Ｅ：
半径0.75mmの半円状溝、Ｆ：対向する溝間の中心
部距離7.5mm、 Ｇ：操作棒を挿着するための凸部の直径４mm、 Ｈ：操作棒挿着孔の直径２mm、Ｉ：操作棒挿着 のための凸部の高さ３mmの寸法にて示される円柱
部、からなる高さ10mm、直径12mm、半径６mmの半
径部からなる不溶性担体の本体である。さらに免
疫反応管の材質、例えばガラスや合成高分子材自
体を不溶性担体として利用してもよいものであ
る。次いでこのような不溶性担体の反応し得る基
に基いてヒトTGF抗体を直接または多官能性試
薬を用いて結合せしめるのであるが、結合におい
ては、通常PH６〜8.5の緩衝液、有機溶媒または
これらの混合媒体中、０℃〜40℃にて各々を反応
せしめればよい。また別の固相体を製造する方法
としては、用いる不溶性担体の多孔性の吸着能を
利用して吸着固定化せしめてもよい。さらに、こ
のTGF抗体に対する特異的抗体、即ちこのTGF
抗体産生の哺乳動物の免疫グロブリン分画を用い
て他種の哺乳動物、特に大型動物に免疫せしめて
得られた第２抗体を用い、この第２抗体を不溶性
担体に固定化せしめ、次いでこれにこのTGF抗
体を免疫的手段にて結合せしめることによる
TGF抗体の活性をほとんど失活せしめることの
ない固定化手段によつて固相体を得てもよい。さ
らにこのようにして得られた固相体は、洗浄、保
存すればよい。 さらにまた上記の固相体を用いる代りに、
TGF抗体を可溶性のままで用いる場合には、被
検液中のTGFの定量反応におけるTGFまたはRI
標識TGFとTGF抗体との結合体と未反応物とを
分離するに、TGF抗体に対する特異的抗体が用
いられる。この特異的抗体は第２抗体とも呼ば
れ、即ちTGF抗体産生の哺乳動物の免疫グロフ
リン分画を抗原として用い、これを公知の免疫手
段に基いて、他種の哺乳動物、特に大型動物に皮
下、皮内に注射せしめて免疫し、その血液から抗
体血清を得、さらに公知の精製手段により抗体を
得ればよく、この際通常抗血の状態にて利用する
ことが簡便である。しかしまた、この第２抗体を
常法により精製し、これを不溶性担体に固定化し
て第２抗体の固相体として用いてもよい。 また本発明に用いられるRI標識TGFにおいて、
RIとしては通常 125Iや 131Iが用いられ、一般的
には 125Iが用いらえる。またこれらのヨウ素を
TGFに結合せしめるには、例えばヨウ素をTGF
の分子内に直接的に結合せしめるクロラミン−Ｔ
法による方法や、TGF分子にヨウ素付加したフ
エニル基を結合せしめる間接的なヨウ素の結合で
あるボルトン・ハンター（Bolton ＆ Hunter）
法などの手段がよく用いられる。特にクロラミン
−Ｔ法ではヨウ素はヨウ化ナトリウムの形で用い
られ、またボルトン・ハンター法ではボルトン・
ハンター試薬、例えば３−（４−ヒドロキシ−５
−〔 125I〕ヨードフエニル）プロピオン酸スクシ
ンイミドエステルの形でよく用いられるものであ
る。このようなRIを用いてTGFを標識するに当
つては、上記のクロラミン−Ｔ法や、オルトン・
ハンター法に基いて常法により行なえばよく、ま
た反応終了後はゲル過などの精製手段により
RI標識TGFの精製物を回収すればよい。さらに
RIの標識手段としては上記方法に限られず、公
知の種々の方法によつて標識してもよいのであ
る。 次いで本発明を実施するに当つて、まずTGF
の含有量を測定しようとする被検液、例えばヒト
の尿または血清の50μ〜１ml、RI標識TGFおよ
びTGF抗体とを免疫反応媒体、例えばリン酸緩
衝液やベロナール緩衝液100μ〜５ml中にて４
〜５℃にて約15時間〜72時間インキユベイトして
競争反応せしめる。次いでこの反応により免疫的
に結合した部分、特にRI標識TGF−TGF抗体の
結合部（Bond：Ｂ）と結合していない未反応の
遊離部分、特に未反応のRI標識TGFの遊離部
（Free：Ｆ）とを分離するためにＢ−Ｆ分離を行
なう。このＢ−Ｆ分離に当つて、用いるTGF抗
体が固相体である固相法の場合には競争反応後固
相体と反応液層とを過などの手段にて分別し、
洗浄後、固相体あたは液層のいずれか一方の
RI標識TGFの放射能を測定すればよい。またＢ
−Ｆ分離に当つては、用いる抗体が可溶性のまま
で第２抗体を用いる２抗体法の場合には競争反応
後第２抗体、さらに好ましくはその第２抗体を含
有する抗血清、必要に応じてTGF抗体作成に用
いた哺乳動物と同一種の動物の正常血清を加えて
１〜12時間インキユベイトし、その後3000rpm、
10〜30分間程度遠心分離して免疫反応によつて結
合し、沈澱した部分Ｂと上清Ｆとを分別し、洗浄
後沈澱物または上清のいずれか一方の放射能を測
定すればよい。さらに上記の免疫反応の結合部で
ある固相体や沈澱物、または未反応物を含む液
や上清の放射能の測定に当つては、ガイガーミユ
ラー計数管やシンチレーシヨンカウンターなどの
放射能カウンターにて行なえばよい。 このようにして、ヒトTGFを用いて得られる
RI標識TGF、およびTGF抗体を用いることによ
り、極めて正確かつ簡便に被検液中のTGFの定
量をなし得たもので、ガンの判定に有用に利用さ
れるものである。 次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具
体的に述べるが、本発明は何んらこれによつて限
定されるものではない。 実施例 １ (1) 抗ヒトTGF血清の作成 TGF（後述参考例１によつて製造したヒト
TGF）0.5mgを生理食塩水0.5mlに溶解し、これ
に同量のコンプリート・フロント・アジユバン
トを加え、充分に乳化混合した後、家ウサギの
四肢指の皮中および背中の皮下数ケ所に注射し
た。２週間おきに同量の乳剤を６回皮下注射
し、最終の免疫より10日後にその全血を採取
し、60分間室温に放置し凝固せしめた後、
3000rpmで10分間遠心分離を行ないヒトTGF
抗体含有抗血清を得た。 (2) 125I標識TGFのクロラミン−Ｔ法による調
整 ２ｍCiの放射活性を有する 125I−NaIを含有
する0.5Mリン酸緩衝液（PH7.5）50μに、
TGFを2μｇ含有する水溶液10μ、および0.35
％クロラミンＴ液20μを加えて30秒間撹拌反
応せしめた後、0.45％重亜硫酸ナトリウム液
50μを加えて反応を停止させた。次いで反応
液に５％人血清アルブミン（HSA）含有する
0.1N酢酸溶液500μを加えた後、セフアデツ
クスＧ−25（1.0×50cm）のカラムに添加し、
0.5％HSAを含有する0.1N酢酸溶液で溶出せし
め、その素通り画分に 125I標識TGFを得た。 (3) ヒトTGF抗血清の抗体価測定 (1)で得られた抗血清を10ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.4）（0.25％ウシ血清アルミン（BSA）、0.1
％アジ化ナトリウム、５ｍMEDTA、0.9％
NaCl含有）−免疫反応用緩衝液−で、100、
1000、10000、100000倍に希釈し、それぞれ
100μをRIA用シオノギチユーブに分注し、
これに 125I標識TGF液100μを加えて５℃で
16時間反応せしめた。次いでラビツトＩｇ
G12μｇ、抗ラビツトＩｇＧヤギ血清を加えて
37℃で２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生
理食塩水３mlを加えた後、3000rpmで10分間遠
心分離を行ない回収し、沈澱物の放射能を測定
した。抗血清の各希釈濃度における 125I標識
TGFとの免疫反応による結合率を測定し、結
果を第１図に示した。 (4) 液相RIAによるTGFの測定 TGFを免疫反応用緩衝液を用いて、１mlあ
たり、1.25、5.0、20、80、320、1280nｇの各
濃度に溶解させたものを標準TGF液とした。
RIA用シオノギチユーブに各TGF標準液100μ
、 125I標識TGF100μ、およびヒトTGF抗
血清の30000倍希釈液100μを加えて５℃で16
時間反応せしめた。次いで、ラビツトＩｇ
G12μｇが、抗ラビツトＩｇＧヤギ血清を加え
37℃で２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生
理食塩水３mlを加えた後、3000rpmで10分間遠
心分離を行ない回収し沈澱物の放射能を測定し
た。 結果は第２図に示す通りであり、本測定系は
きわめて良好な定量曲線を示すものであつた。
なお被検液（血清、尿等）中のTGF量を測定
する場合は、標準TGF液の代りに被検液100μ
を加え、前記と同様の操作を行ない、定量曲
線と対照することにより被検液中のTGF濃度
を求めればよい。 実施例 ２ (1) ヒトTGFに対するモノクロナール抗体の作
成 TGF1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これに
同量のコンプリート・フロイント・アジユバン
トを加え充分に乳化混合した。乳化剤0.2mlを
Balb／ｃマウスの背中皮下数ケ所に注射した。
10日間隔に同様の方法で２回追加免疫を行な
い、さらに２週間後TGF100μｇを溶解させた
生理食塩水0.2mlを静脈内投与を行なつた。最
終免疫後３日目にマウスの脾臓を無菌的に取り
出し、単細胞化させ、混入した赤血球細胞は、
0.83％塩化アンモニウム液で融解された。この
脾細胞の懸濁液を冷却したハンクス液で数回洗
滌後、別に培養調製したマウスミエローマ細胞
（P3−NS1／１−Ａｇ４−１）と３対１の細胞
量比で混合させた。遠心分離を行ない、得られ
た脾細胞とミエローマ細胞のペレツトに、予め
37℃に加温させた50％ポリエチレングリコール
1000含有RPMI培地１mlを遠心管を回転させな
がら１分かけてゆつくりと加えた。次いで37℃
で90秒加温後、冷却したハンクス液５mlをゆつ
くり加え、さらに冷ハンクス液を５ml、及び10
mlとそれぞれおだやかに加えた後、遠心分離を
行ない得られたペレツトを10％ウシ胎児血清
（FCS）を含むRPMI倍地34mlを加え細胞懸濁
液とした。細胞懸濁液を96穴プレート（ムンク
社製）に100μづつ分注し炭酸ガスふらん器
（95％空気、５％CO2；温度37℃、湿度100％）
に入れて培養を開始し、１日後２倍濃度の
HAT倍地（100μMヒポキサンチン、104μMア
ミノプテリン、16μMチミジン、10％FCSを含
有するRPMI倍地）を100μ添加しHAT選択
培養を開始し、その後１〜３日間隔で倍地の半
分量をHAT培地と交換した。７〜14日後にハ
イブリドーマの生育してきたウエルの培養上清
を採取し、抗体価の高いものを５コ選んだ。次
にフイーダーセルとしてBalb／ｃの胸腺細胞
を用い、限界希釈法によりクローニングを行な
い、25コのモノクナール抗体産生細胞を分散し
た。その中で最も高い抗体価を示したNo.15のハ
イブリドーマを用い、96穴ウエルから24穴ウエ
ル、それから50mlの培養とスケールアツプして
いき、約1000mlの培養上清を取得し、これをヒ
トTGFモノクロナール抗体溶液として用いた。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の抗体価測定
培養上液を免疫反応用緩衝液で、10、100、
1000、10000倍に希釈した液100μを反応小試
験管に加え、次いで 125I標識TGF液を加えて、
５℃で16時間反応させた。これに正常マウス血
清の100倍希釈液100μ、および抗マウスＩｇ
Ｇラビツト血清100μを加えて、37℃で１時
間反応せしめ、生成する沈澱物を３mlの生理食
塩水を加えた後、3000rpmで10分間遠心分離を
行ない回収し、沈澱物の放射能を測定した。No.
15のハイブリドーマの培養上清は、約4000倍の
希釈濃度で 125I標識TGFの50％と結合した。 (3) 固相RIAによるTGFの測定 (1) ヒトTGF抗体固定化担体の作製 前記(2)で得られたヒトTGFモノクロナー
ル抗体を含有する培養上清より、硫安分画、
DEAE−セルロースクロマトグラフイーを行
ない精製したモノクロナール抗体0.1mgを100
ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解させた液
20mlに、ポリスチレン系ビーズ（積水化学社
製、粒径6.35mm）100粒を加え、５℃で16時
間、37℃で１時間反応させ抗体をビーズに固
定化せしめた。ビーズは生理食塩水で充分洗
滌後、免疫反応用緩衝液中に浸漬し、５℃で
保存し固相体とした。 (2) 測定法 反応用小試管（シオノギチユーブ）に免疫
反応用緩衝液200μ、標準TGF液（1.25〜
1280nｇ／ml）100μ、及び 125I標識TGF液
100μを加え、これに上記の固相体を１粒
加え、５℃で40時間反応せしめた。反応終了
後、生理食塩水２mlを加え撹拌洗滌後、洗液
をアスピレーターで吸引除去した。この操作
を２回くり返し行なつた後、ビーズを新しい
チユーブに移しその放射能を測定した。 結果は第３図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお、被検液（血清・尿等）中のTGF
量を測定する場合は、標準TGF液の代りに
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない定量曲線と対照することにより被検液
中のTGF濃度を求められる。 実施例 ３ (1) ヒトTGFに対するモノクロナール抗体の作
成 実施例２と同様の方法で作成した。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の抗体価測定 実施例２と同じ方法で測定した。 (3) 抗マウスＩｇＧ血清の作成 Balb／ｃマウス100匹より採血調製した血清
50mlより、通常の硫安分画、およびDEAE−セ
ルロースクロマトグラフを行ないマウスＩｇＧ
分画を調製した。マウスＩｇG5mgを含む生理
食塩水１mlに、同量のコンプリート・フロイン
ト・アジユバントを加え、充分に乳化混合した
後、家ウサギの四肢指の皮中、および背中の皮
下数ケ所に注射した。２週間おきに同量の乳剤
を６回皮下注射し、最終の免疫より10日後にそ
の全血を採取し、60分間室温に放置し凝固せし
めた後、3000rpmで10分間遠心分離を行ないマ
ウスIgG抗体含有抗血清を得た。 (4) 固相RIAによるTGFの測定 (1) ヒトTGF抗体固定化担体の作製 ポリスチレン系不溶性担体（第８図記載の
形状を示す）をスキツトXNで洗滌後、抗マ
ウスＩｇＧウサギ血清のＩｇＧ分画32μｇを
含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）0.4
mlを含む小試験管15×105mm（内径12.8mm±
0.1mm）に上記の不溶性担体を挿入し、５℃
にて16時間反応させ、この不溶性担体１個あ
たり8.6μｇのＩｇＧを固相化せしめた固相体
を得た。次いで固相体を生理食塩水で充分洗
滌後、ヒトTGFモノクロナール抗体0.08μｇ
を含有する免疫反応用緩衝液0.4mlを含む小
試験管（前述）に挿入し、５℃で40時間反応
させ、不溶性担体−マウスＩｇＧ抗体−ヒト
TGFモノクロナール抗体結合物を作製し、
この固相体は生理食塩水で充分に洗滌後免疫
反応用緩衝液中に浸漬し、５℃で保存しヒト
TGF抗体固定化担体の固相体とした。 (2) 測定法 小試験管（前述）に免疫反応用緩衝液
100μ、標準TGF液（1.25〜1280nｇ／ml）
100μ、および 125I標識TGF液100μを加
え、37℃で４時間反応せしめた。反応終了
後、生理食塩水５mlを加え、固相体を洗滌し
ながら引き抜き、この固相体を新しい小試験
管に加えてその放射能を測定した。 結果は第４図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお、被検液（血清・尿等）中のTGF
量を測定する場合は、標準TGF液の代りに
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない定量曲線と対照することにより被検液
中のTGF濃度が求められる。 また以下にTGFの製造例を挙げるが、何
んらこれに限定されるものではなく、例えば
特願昭58−61102号明細書に記載の方法によ
つてTGFを製造し、これを用いてもよい。 参考例 １ 肺ガン患者尿1100mlを0.01Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対し分子量カツト10000の透析膜（三光純
薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なつた。
透析内液は12000×ｇにて60分間遠心分離し、沈
澱を除く。SP−セフアデツクス（フアルマシヤ、
ジヤパン社製）をカラム（容量4.5cm×33cm）に
詰め、0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）で平衡化し
た後、上記透析内液を流下し、有効成分を吸着さ
せた後、同緩衝液で充分洗浄し、ついで同緩衝液
中、塩化ナトリウム0.01M〜1.5Mの傾針溶出を
行なつた。（流速22.5ml／時、温度４℃、塩化ナ
トリウム傾斜濃度緩衝液4.8使用）。TGFは同
緩衝液中、塩化ナトリウム濃度0.6〜1.0Mの位置
に溶出され、活性分画62.0mlを得た。本活性分画
は後記のTGF活性試験法において、5μで正常
細胞は変質されコロニーを形成した。本活性分画
全量をダイヤフロー分子篩膜PM−10（アミコン、
フアーイースト、リミテツド社製（日本））を用
いて脱塩、濃縮をくり返し、1.2mlをし、これに
トリフロロ酢酸を加えて0.05％トリフロロ酢酸溶
液とした。 アルキル基（C18）を結合させたシリカゲルを
担体とするシンクロパツクRP−Ｐ（シンクローム
社製）をカラム（容量4.1mm×250mm）に詰め0.05
％トリフロロ酢酸で平衡化し、このカラム１本に
上記TGF、トリフロロ酢酸溶液の1/3を流し吸着
後0.05％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同液中
０〜90％アセトニトリルの傾斜溶出を行ないアセ
トニトリル濃度55〜75％位置に溶出される活性分
画をとる。以上の操作を３回行ない前記の分子篩
による濃縮調製液全量を処理しTGF活性分画7.9
mlを分取した。本分画を凍結乾燥後、再び3.0ml
の生理食塩水に溶解し、この溶液をTGF試験法
にかけ0.4μで正常細胞は変質されコロニー形成
能を示した。 【表】 TGF活性試験法 材 料 (1) NRK−細胞（株49F） (2) ５％牛胎児血清及び１％非不可欠アミノ酸添
加ダルベツコ変法イーグル培地 (3) 精製寒天（Agar Noble、Difco社製） (4) 直径60mmのペトリ皿 操 作 0.5％寒天含有の(1)の培地をペトリ皿一枚に５
mlずつ注加して下層培地とする。 この上にNRK細胞１×103個／mlを含む0.3％
寒天含有培地をペトリ皿一枚に２mlずつ積層し上
層培地とし、この上に0.5mlの生理食塩水に溶解
いた試料を加え、炭酸ガスインキユベーター中に
37℃で培養する、14日後に培養器から取り出し、
40倍のケンビ鏡でペトリ皿上の２mm×２mm視野を
10ケ所を無作為にえらび、細胞数10個以上よりな
るコロニーの数をかぞえて総数を成績とする。
第１図は実施例１で得られたTGF抗血清の抗
力価測定曲線を示し、第２図は液相RIAによる
TGFの定量曲線を示し、第３図および第４図は
固相RIAによるTGFの定量曲線を示し、第５図
は固相RIAに用いられる不溶性担体の拡大部分断
面図、第６図はその平面図、第７図は不溶性担体
の変形例の拡大部分断面図、第８図は実施例３で
用いる不溶性担体の実測図を示す。
力価測定曲線を示し、第２図は液相RIAによる
TGFの定量曲線を示し、第３図および第４図は
固相RIAによるTGFの定量曲線を示し、第５図
は固相RIAに用いられる不溶性担体の拡大部分断
面図、第６図はその平面図、第７図は不溶性担体
の変形例の拡大部分断面図、第８図は実施例３で
用いる不溶性担体の実測図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検液に、放射性同位元素標識トランスホー
ミンググロスフアクターと、トランスフオーミン
ググロスフアクター抗体とを反応せしめ、次いで
放射性同位元素標識トランスホーミンググロスフ
アクター−トランスホーミンググロスフアクター
抗体結合体と未反応放射性同位元素標識トランス
ホーミンググロスフアクターとを分離し、その後
分離したいずれか一方の放射性同位元素標識体を
定量する方法において、該トランスホーミンググ
ロスフアクターがニンヒドリン反応陽性、SDS−
電気泳動において単一であり、酸および熱に対し
て安定で、トリプシンおよびジチオスレイトール
処理により失活し、ゲル過により推定分子量
28000〜35000を示す理化学的特性を有するもので
あることを特徴とする被検液中のトランスホーミ
ンググロスフアクターの定量方法。 ２ トランスホーミンググロスフアクター抗体
が、不溶性担体に固定化されたトランスホーミン
ググロスフアクター抗体である特許請求の範囲第
１項記載の定量方法。 ３ トランスホーミンググロスフアクター抗体が
可溶性であり、分離においてトランスホーミング
グロスフアクター抗体に対する特異的抗体を用い
てなる特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 ４ トランスホーミンググロスフアクターが、ヒ
トトランスホーミンググロスフアクターである特
許請求の範囲第１項記載の定量方法。 ５ トランスホーミンググロスフアクター抗体
が、モノクロナール抗体である特許請求の範囲第
１項記載の定量方法。 ６ 放射性同位元素が 125I（及び 131I）である特
許請求の範囲第１項記載の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58122888A JPS6014171A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58122888A JPS6014171A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6014171A JPS6014171A (ja) | 1985-01-24 |
| JPH0441308B2 true JPH0441308B2 (ja) | 1992-07-07 |
Family
ID=14847114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58122888A Granted JPS6014171A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6014171A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02126157A (ja) * | 1988-11-04 | 1990-05-15 | Tosoh Corp | ヒトトランスフォーミンググロースファクターβの免疫学的測定方法 |
| AU736207B2 (en) * | 1997-05-12 | 2001-07-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Peptides which promote activation of latent TGF-beta and method of screening TGF-beta activity-regulating compounds |
-
1983
- 1983-07-05 JP JP58122888A patent/JPS6014171A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CANCER RESEARCH=1983 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI=1980US * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6014171A (ja) | 1985-01-24 |
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