JPH0811075B2

JPH0811075B2 - 単クローン性抗ｃｅａ抗体

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Publication number: JPH0811075B2
Application number: JP57113780A
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Inventors: 雄治松岡; 政秀黒木
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Filing date: 1982-06-30
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Description

【発明の詳細な説明】本発明は、癌胎児性抗原（以下CEAという）の抗原決
定基に対して特異性を有する単クローン性抗体、その製
造方法および用法に関する。

CEAは周知の癌特異的胎児性抗原であつて、分子量約20
万±８万、糖と蛋白質との比約1:1の、ある種の糖蛋白
質である。癌特異抗原としてCEAがヒトの消化器のアデ
ノカルシノーマに存在することは、GoldおよびFreedman
によつて報告された〔J.Exp.Med.,121,439（1965）;ibi
d.,122,467（1965）〕。たとえば血中のCEA濃度をラジ
オイムノアツセイによつて測定し、これを臨床的にヒト
の癌の診断治療用マーカーとする場合や各種の基礎医学
研究用にCEAが重要であることは周知である。しかし、
ある種のCEA関連正常抗原が存在しており、これらはCEA
と免疫学的交叉反応性を有しているので、CEAの癌特異
性が不明確になつている。

この種のCEA関連抗原の例は、非特異的交叉反応抗原
（以下NCAという）および正常糞便抗原（以下NFAとい
う）である。NCAは分子量約８万±３万、糖含量約20％
のある種の糖蛋白質で、たとえばヒトの肺や脾に存在し
ている〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,69,2492（197
2）〕。次にNFAはさらにNFA-1、NFA-2および正常糞便交
叉反応抗原（以下NFCAという）に分類される。NFA-2は
分子量20万±５万、糖と蛋白質との比約1:1のある種の
糖蛋白質で、その抗原性および理化学的性状はCEAと極
めて類似している。NFA-1およびNFCAはNFA-2の分解産物
であると思われる。NFA-1は分子量約２〜３万、糖含量
約13％の小分子抗原であり、NFCAは分子量約８万±３万
の１種の糖蛋白である。

他に、ヒトの正常糞便中に糞便非特異的交叉反応抗原
（以下f-NCAという）という抗原が存在している。f-NCA
の抗原性は前記のNCAのものと実質的に同一で、CEA、NF
CAおよびNFA-2と交叉反応性を示す。従つて、ヒトの正
常糞便中には、本発明の目的に関係のある４種のCEA関
連抗原が存在している。

癌マーカーとしてのCEAの利用を改良するために、CEA
関連抗原とCEAとを正確に識別しなければならない。こ
のために、CEAの抗原決定基に対して明確な特異性を有
する抗CEA抗体の提供が従来試みられている。しかし、
公知の各種の多クローン性抗体には、反応特異性が不明
確であるという共通の欠点がある。すなわち、これらの
多クローン性CEA抗体は、各種の抗体混合物であつて、C
EA分子上の多くの抗原決定基のほとんど全部と反応性を
有している。この欠点をなくするために、各種の単クロ
ーン性抗CEA抗体が重要視されている。その理由は次の
通りである。

（１）細胞融合という常法によつて得られる単クローン
性CEA抗体は、唯一つの抗原決定基に対してのみ特異性
を有しているから、抗原との反応性が均一であろう。

（２）単クローンの増殖によつて、所望の均一性をもつ
多量の抗体が得られるであろう。

（３）多種類の単クローンを得ることができる。これら
は全体として、公知の多クローン性抗CEA抗体と同様に
広範囲の特異性を持つであろう。このようにして、単ク
ローン性抗CEA抗体の製造が、たとえば次の文献にある
ように試みられている。

Accolla,R.S.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77,563
（1980）;Mitchell,K.F.,Cancer Immunol.Immunother.,
10,1（1980）;Rogers,G.T.et al,Br.J.Cancer,43,1（19
81）;Kupchik,H.Z.et al,Cancer Res.,41,3306（198
1）。

これら既報の単クローン性抗体の反応特異性は、次の
通りに要約される。

（１）Accollaら。２つのハイブリドーマから得られた
抗体はNGD（NCAと同様であると思われる）と微弱に反応
し、CEAと強く反応した。これらの２つの抗体とCEAとの
反応には競合的阻害がみられなかつた。各抗体はCEA分
子上の別の抗原決定基と反応するようである。

（２）Mitchell。１つの抗CEA抗体が得られた。これはC
EAと反応したがNCAと反応しなかつた。CEAとの反応を多
クローン性ヤギ抗CEA抗体で阻止できなかつた。

（３）Rogersら。１つの単クローン性抗CEA抗体が得ら
れた。これは腫瘍組織からのCEA標品と弱く反応した
が、患者の血清中のCEAと強く反応した。

（４）Kupchik。９個のクローンのうちの１個の単クロ
ーン性抗CEA抗体が検討された。その反応特異性と多ク
ローン性ヤギ抗CEA抗体と比較したところ単クローン性
抗CEA抗体は、多クローン性抗CEA抗体と反応するCEA分
子のうちの１部のCEA分子とのみ反応した。

これらの公知の単クローン性抗CEA抗体の反応特異性
についてのよりくわしい検索はなされていない。

この間に我々は、ある種のCEA関連抗原すなわち前記
のNFA-1、NFA-2およびNFCAがヒトの正常糞便に存在する
ことを見出し、これらの分離に成功した〔特開昭56-468
19号、Cancer Res.,41,713-720（1981）〕。さらにこれ
らのCEA関連正常抗原を用いてCEA分子の抗原構造を調べ
た結果、CEA分子上の多くの抗原決定基を、たとえば次
の通りに分類し得ることを提案した。

（１）個体特異的抗原決定基免疫抗原として用いた個々のCEA標品にのみ見出され
る特異的な抗原決定基で、他の個体から得られたCEA標
品には見出されないもの。

（２）CEA特異決定基癌組織から得られたCEA標品に共通して見出される抗
原決定基であるが、NFAやNCAなどCEA関連正常抗原には
見出されない。最も癌特異性の高い抗原決定基である。

（３）NFA-1共通決定基 CEA、NFA-2およびNFA-1の３者に共通して見出される
抗原決定基で、CEA分子上の主要抗原決定基の１つであ
る。

（４）NFCA共通決定基 CEA、NFA-2およびNFCAの３者に共通して見出される抗
原決定基で、これもCEA分子上の主要抗原決定基の１つ
である。

（５）NCA共通決定基 CEA、NFA-2、NFCAおよびNCAの４者に共通して見出さ
れる抗原決定基で、CEAおよび関連抗原に最も広く共通
して認められる抗原決定基である。

本発明は、我々がひとの正常糞便から分離した上記の
CEA関連抗原を用いることによつて、単クローン性抗CEA
抗体性産生能を有する単クローンを、抗原との反応性の
観点において選別し得るという知見に基いている。

本発明は、癌胎児性抗原に対して特異的な単クローン
抗体およびその製法を提供すること、ならびに癌胎児性
抗原および関連抗原の濃度をラジオイムノアッセイによ
って測定する方法を提供することを目的としている。

本発明により、第１哺乳動物を第１癌胎児性抗原で免
疫することによって同抗原に対する抗体産生能を有する
細胞を産生させ、生じた細胞をこの哺乳動物から採取
し、採取された細胞を第２哺乳動物由来のミエローマの
株化細胞と融合させ、こうして得られた融合細胞をクロ
ーニングに付し、得られた単クローン性ハイブリドーマ
を培養し、得られた培養液から所望の単クローン抗体を
回収する工程からなる、癌胎児性抗原に対して特異的な
単クローン抗体の製法が提供される。この方法は（イ）
前記第１癌胎児性抗原を第１マーカー抗原として用い、
前記単クローン性ハイブリドーマを、第１マーカー抗原
と反応する抗体の生産能を基準として選別すること、お
よび（ロ）前記回収工程において、前記第１癌胎児性抗
原以外の第２癌胎児性抗原、正常糞便抗原１、正常糞便
抗原２および非特異的交叉反応抗原からなる群から選ば
れた１種以上の抗原を第２マーカー抗原として用いて、
前記ハイブリドーマを第２マーカー抗原との反応性を基
準として選別することを特徴としている。

実用的な回収工程において、第１癌胎児性抗原、第２
癌胎児性抗原、正常糞便抗原１、正常糞便抗原２および
非特異的交叉反応抗原からなる群から選ばれた１種以上
の抗原を第２マーカー抗原として用いることによって、
前記ハイブリドーマによって産生された単クローン抗体
を、第２マーカー抗原との反応性に基づいて選別する。

好ましくは、前記の選別は、放射性物質で標識された
マーカーを用いるラジオイムノアッセイ法によって行な
われる。

次に本発明は、本発明の方法で得られた、特異的な単
クローン抗体を提供する。

さらに本発明は、放射性物質で標識された単クローン
抗体を用いるラジオイムノアッセイによって、癌胎児性
抗原および正常成人由来の関連抗原の濃度を測定する方
法を提供する。この方法は、ラジオアイソトープ標識抗
体として、本発明による癌胎児性抗原に対して特異性を
有する単クローン抗体を用いることを特徴としている。

本発明による単クローンから得られる単クローン性抗
体は、CEA分子上の対応する抗原決定基との反応性が均
一かつ明確であるから、たとえばヒトの癌の診断治療の
ような臨床応用や各種の基礎医学研究用に有利に用いる
ことができる。

本発明の単クローンを、たとえば次のように常法によ
つて得ることができる。免疫される哺乳動物は、たとえ
ばマウス、ラツト、モルモツトのような小動物でも、ウ
サギ、ヤギ、牛、馬のような大動物でもよい。動物を常
法により免疫する。たとえばマウスを、所与のCEA標品
すなわち第1CEA20μｇを含むフロイントの完全アジュバ
ントを用いた乳化液0.2mlの皮下注射によつて免疫し、
５週間後に食塩水0.2ml中の同量のCEAの静脈注射によつ
て免疫する。３日後に常法により動物の脾およびリンパ
節細胞を採取する。採取された抗体産生細胞と適当な腫
瘍細胞〔たとえばP3-X63-Ag8、６、５、３（たとえばP3
-X63-Ag8-u1）、Sp2/0-Ag14、210、RCY3、Ag1、２、３
など〕とを１×10⁸抗体産生細胞/ml対１−２×10⁷腫瘍
細胞/mlの比で、すなわち５対１から10対１の比で混合
し、常法により、たとえばHVJ（仙台ウイルス）またはP
EG（ポリエチレングリコール）を用いて融合する。HAT
培地を用いて選別すると、正常細胞は死滅し、融合細胞
が残存する。第1CEAと反応する抗体産生能の観点におい
て、融合細胞を選別する。選別された融合細胞は抗CEA
抗体産生能を有する融合細胞である。これを常法により
クローニングし、得られた単クローンを、単クローン由
来の抗体とCEAおよびCEA関連抗原との反応性の観点から
選別する。それ自体公知のラジオイムノアツセイ法によ
つて実用的に選別することができる。下記の実施例で用
いた選別法はFarrの硫安沈殿法〔Farr,R.S.,J.Inf.Di
s.,103、239（1958）〕である。CEA関連抗原の実用的な
例は正常成人糞便由来のNFA-1、NFA-2およびf-NCAで、
これらの性状は前記の通りである。これらのCEA関連抗
原の製造は後記参考例に記載されている。

後記実施例１において行なわれた選別の結果が第１表
に示されている。

本発明の方法によって得られる単クローン抗体を、第
１表に示すように分類することができる。

抗体１は、第１癌胎児性抗原との反応性を有するが、
第１癌胎児性抗原以外の癌胎児性抗原、正常糞便抗原
１、正常糞便抗原２および非特異的交叉反応抗原の中の
いずれの抗原とも反応性を有しない単クローン抗体であ
る。

抗体２は、２つ以上の癌胎児性抗原との反応性を有す
るが、正常糞便抗原１、正常糞便抗原２および非特異的
交叉反応抗原の中のいずれの抗原との反応性も有しない
単クローン抗体である。

抗体３は、２つ以上の癌胎児性抗原との反応性を有
し、正常糞便抗原１および正常糞便抗原２との反応性を
有するが、非特異的交叉反応抗原との反応性を有しない
単クローン抗体である。

抗体４は、２つ以上の癌胎児性抗原および正常糞便抗
原２との反応性を有するが、正常糞便抗原１および非特
異的交叉反応性抗原との反応性を有しない単クローン抗
体である。

抗体５は、２つ以上の癌胎児性抗原、正常糞便抗原２
および非特異的交叉反応抗原との反応性を有するが、正
常糞便抗原１との反応性を有しない単クローン抗体であ
る。

実用的に、これらの単クローン抗体は、抗血清の形状
である。第１表において、正常成人糞便由来のCEA関連
抗原NFA-2は放射性ヨード標識され、次に単クローン培
養上清に加えられ、ラジオイムノアツセイが行なわれ
る。その結果、単クローン（クローンＡ、実施例１では
約10株）と単クローン（クローンＢ、実施例１では約20
0株）が選別される。クローンＡの産生する抗体ＡはNFA
-2と反応しない。クローンＢの産生する抗体ＢはNFA-2
と反応する。抗体ＡはヒトのCEAと反応し、正常成人糞
便由来のCEA関連抗原と反応しない。

１つ以上の第2CEA（実施例では４種）を用いて、同様
の方法でラジオイムノアツセイを行なうと、クローンＡ
からクローンA1（実施例１では８株）の産生する抗体１
は第1CEAと反応する。第2CEAと反応せず、クローンA2の
産生する抗体２は第１および第2CEAと反応する。

同様の方法でNFA-1を用いて、NFA-2と反応する抗体を
産生するクローンＢを選別すると、クローンB1およびB2
が得られる。クローンB1（実施例１では約70株）の産生
する抗体３は、NFA-1およびNFA-2と反応する。クローン
B2（実施例１では約100株）の産生する抗体B2は、NFA-2
と反応し、NFA-1と反応しない。NFA-1の分子量は小さい
が、抗原活性は強いので、実施例１では約70株のクロー
ンB1が得られた。

f-NCAを用いて同様の方法でクローンB2から、クロー
ンB2-1（実施例では約60株）とB2-2（実施例１では約40
株）が選別される。クローンB2-1の産生する抗体４はf-
NCAと反応しないが、クローンB2-2の産生する抗体５はf
-NCAと反応する。

所望により、NFA-2以外の他の抗原をクローニングで
得られたクローンの最初の選別に用いることができる。
たとえば、NFA-1を最初に用いることにより、産生され
る抗体とのNFA-1との反応性の観点から単クローンを選
別することができる。

本発明によつて選別された５種類の単クローンから産
生される単クローン性抗CEA抗体は、全体として、約40
％がIgM、約50％がIgG、約10％がIgAに属することがわ
かつた。

本発明による単クローン性抗CEA抗体を各種の臨床的
用途および基礎医学研究用に有利に用いることができ
る。たとえば、抗体２は臨床用に最も有利であり、抗体
３は血中CEA濃度の測定に価値があると考えられる。な
お、本発明による単クローンを常法によつて工業的規模
で増殖することができる。

本発明による単クローン性抗CEA抗体の用法は抗体の
反応特異性および用途によつて異なるが、代表的な用法
を次に例示する。

I.組織学的検索法たとえば細胞の浮遊液または塗抹標本あるいは組織切
片のような細胞標品を本発明の単クローン性抗CEA抗体
で37℃で30分処理し、食塩水で十分に洗浄したのち、螢
光色素（tetra methylrhodamine isothiocyanateまたは
fluorescein isothiocyanate）で標識した抗マウス免疫
グロブリン抗体溶液で37℃で30分処理し、螢光顕微鏡を
用いて螢光陽性の細胞を検索する。所望により螢光色素
の代わりに抗マウス免疫グロブリン抗体に結合されたペ
ルオキシダーゼを用いる酵素抗体法による検索も可能で
ある。

II.血中CEA濃度測定法本発明の単クローン性抗CEA抗体による血中CEA濃度の
正確な測定は、次に例示するように、たとえば硫安沈殿
によるFarrの方法、抗マウス免疫グロブリン抗体を用い
る二抗体法、ジルコニウムゲルを用いるＺゲル法および
固相抗体サンドイツチ法などによつて行なうことができ
る。

（１）抗マウス免疫グロブリン抗体による二抗体法の
例。

ヒトの血清50μｌをプラスチツクチューブ（たとえば
栄研チューブNo.1:栄研化学社製；径9.8mm、長さ8cm）
に入れ、0.5％BSAを含む0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）200μ
ｌを加えて希釈する。0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）で50倍
に希釈した正常マウス血清を用いて、適当に希釈された
本発明の単クローン性抗CEA抗体液50μｌをとり、上記
チューブに入れて37℃で30分反応させる。後記参考例１
記載の方法で調製され¹²⁵Iで標識された適当なCEA標品
（1.5ng）の酢酸緩衝液溶液（50μｌ）をチューブに加
え37℃で１時間反応させる。次いで正常マウス血清（×
50;50μｌ）中の免疫グロブリンを充分に沈降させうる
量の抗マウス免疫グロブリン抗体を含むウサギまたはヤ
ギ抗マウス免疫グロブリン血清100μｌを反応混合液に
加え４℃で一夜反応させる。生じた沈降物を遠心操作
（3000r.p.m./30分）で落し、0.9％食塩溶液で沈降物を
洗浄したのち、沈降物の放射性をガンマー計測機で測定
する。CEAを1ng/mlから50ng/mlまでの各濃度で含有する
0.1M酢酸塩緩衝液（子牛ガンマグロブリン1.2％およびB
SA0.5％とを含み、pH6.0）を検体血清と同様に処理し、
標準検量線を作製する。検体血清中のCEAの測定値より
血中CEA濃度を算出する。

正常人血清の測定値（正常値）は用いる単クローン性
抗CEA抗体の種類により一般に異なるので、簡単には特
定できないが、平均正常値に標準偏差（S.D.）の２倍の
値を加えた値以上の値を病的高値として悪性腫瘍検出の
判断に用いることが実用的である。

（２）固相抗体サンドイツチ法の例。

この方法は最も高感度である。原理は、プラスチツク
製ビーズまたはチユーブに本発明で得られた単クローン
性抗CEA抗体の中の一種の抗体を固相一次抗体として吸
着結合させる。この固相一次抗体と検体中のCEAとを反
応させたのち、一次抗体とは対応する抗原決定基の異な
つた別の単クローン性抗CEA抗体を¹²⁵Iでヨード化した
標識二次抗体として反応させると、検体中のCEA量に応
じて標識二次抗体が結合する。既知量のCEAを同じ操作
で測定して得た検量線より検体中のCEA量を算出する。

（ａ）固相一次抗体の作製一次抗体としてどのような特性をもつた単クローン性
抗CEA抗体を選ぶかは測定系の目的により変わり得る
が、最も普遍的な目的には、CEA分子上の最も主な抗原
部位と考えられるNFA-1共通部分に向けられた抗体３を
選ぶとよいので、抗体３の例について次に説明する。抗
体３として分類された単クローン性抗CEA抗体の中からC
EAとの反応親和性（Ka）が強いもの（少なくともKa≧１
×10⁹M^-1）を選ぶ。Kaの測定は次の如く行なう。抗体３
標品の一定量（たとえば10μｇ）に最高200μｇまでの
いろいろな量の¹²⁵Iで標識されたCEA〔0.01M硼酸緩衝食
塩水（B.B.S.）pH8.0;正常ウサギ血清（１％）およびNa
N₃（0.05％）を含む〕を加える。各混合液を37℃、18時
間保温した後、それぞれ75％飽和硫安液（400μｌ）を
加え、４℃に１時間保ち、次に遠心処理（1800×g/30分
間）により上清を除去する。沈降物を50％飽和硫安溶液
で洗浄する。上清（200μｌ）および沈降物の放射活性
をガンマカウンターを用いて測定する。同様の方法をく
り返し、結合されたCEAと遊離CEAとの比を求め、これか
ら常法〔Steward M.W.＆ Petty R.E.,Immunol.,22,747
（1972）〕により反応親和性（Ka）を算出する。こうし
て得られた高親和性の抗体３標品をラウリル硫酸ナトリ
ウム（0.01％）、EDTA（0.05％）を含む0.001Mリン酸緩
衝液（pH6.0）でたとえば500倍に希釈し（抗体濃度とし
て５〜10μg/ml程度）、これをプラスチツクビーズまた
はチユーブのコーチングに用いる。

固相マトリツクスとしては各種のプラスチツク性チユ
ーブやビーズを用いうるが、たとえば直径約6mmのポリ
スチレンビーズ（たとえば米国、Precision Plastic Ba
ll社製）を十分洗浄したのち、上記単クローン性抗CEA
抗体（抗体３）溶液に浸し、室温に一夜静置する。ビー
ズを２回蒸留水で洗浄したのち、0.001Mグリシン塩酸緩
衝液pH2.3で処理し、さらに蒸留水で２回洗浄したの
ち、0.5Mの食塩と0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）とを
含む0.1Mリン酸緩衝液中に３時間浸し、最後は真空乾燥
して冷所に保存する。

（ｂ）標識二次抗体の作製標識二次抗体として何を用いるかにより、得られる結
果は著しく異なる。後記第２表からわかるように、たと
えば抗体２を二次抗体として用いることによつて得られ
るCEA測定系は、癌組織中のCEAとのみ反応するが、NFA
やNCAとは反応しない、最高の癌特異性をもつ系である
が、抗体５を二次抗体として用いることによつて得られ
る測定系は、CEAと共にNFA-1以外のすべての関連抗原を
も測定し得る系である。また抗体３として同定される各
種抗体のなかでもその抗体と反応する抗原決定基が一次
抗体の抗原決定基と同一のものは二次抗体に用い得ない
が、抗体３に属する抗体のなかでも、一次抗体の対応す
る抗原決定基以外の抗原決定基と反応するものであれ
ば、二次抗体として用いることができる。次の例は、抗
体２を用いた最高の癌特異性を有する測定系である。

抗体２として同定された各種抗体のなかから、CEAと
の反応親和恒数の最も高い（少なくともKa≧１×10
⁹M^-1）ものを選ぶ。CEAとセフアロース4Bを結合（10mg/
1.0gドライゲル）させたCEA吸着剤を用いて、上記単ク
ローン性抗CEA抗体を特異的に精製し（参考例２参
照）、得られた抗体標品を公知のクロラミンＴ法〔Hunt
er ＆ Greenwood,1962,Nature（London）194,495〕によ
り¹²⁵Iで標識し、放射活性の強さ約5nCi/ng抗体の標識
抗体を得る。

（ｃ）ラジオイムノアツセイ検体として得たヒト血清（または血漿）50μｌをプラ
スチツク製試験管（たとえば栄研チューブ9.8×80mm）
にとり、BSA（0.5％）を含む0.1M酢酸緩衝液pH6.0を200
μｌを加え、これに上記の抗CEA抗体を結合したビーズ
１個を入れ、室温で試験管を回転させながら４時間反応
させる。反応後反応液を吸引除去し、0.9％食塩水1mlで
１回洗浄し、抗体２をヨード化して得た標識二次抗体液
（１％BSAを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液で約600nCi/ml
に希釈した標識抗体）を200μｌ加え、室温で回転させ
ながら24時間反応させる。反応終了後0.9％食塩水で２
回洗浄したのち、ビーズの放射活性をガンマーカウンタ
ーで測定する。

検量線作製用として、精製CEAを1ng/ml、3ng/ml、10n
g/ml、30ng/mlおよび100ng/mlの濃度に、1.2％ウシガン
マグロブリンおよび0.5％BSAを含む0.1M酢酸緩衝液pH6.
0で調製した各標準溶液を用いる。各標準液50μｌをと
り、上記検体の処置と同様の操作によつて、抗体でコー
チングされたビーズおよび放射性ヨードで標識された二
次抗体とそれぞれ反応させる。このようにして、各標準
溶液の放射活性（Bcpm）得る。BcpmからCEAを含まない
コントロールの値Ｂ′を差し引いたB-B′を算出し、対
応するCEA濃度をプロツトして検量線を描き、これを用
いて検体中のCEA濃度を算出する。

抗体２を標識二次抗体と用いた本例では、正常人血清
または血漿との反応は弱い。さらに正常人のCEA濃度の
平均値は用いる抗CEA抗体標品の特性たとえばその親和
恒数Kaによつて著しく異なり、具体的数値を容易に特定
できない。しかし実用的には正常人の平均値に標準偏差
（S.D.）の２倍の値を加えた値以上の値を病的高値とし
て悪性腫瘍検出の判断に用いることができる。

（３）以上に述べたように本発明は、CEAおよびCEA関連
抗原の濃度測定法を提供する。この方法は、本発明によ
る単クローン性抗CEA抗体を放射性物質で標識してマー
カーとすることを特徴としている。この方法によつて、
従来の多クローン性および単クローン性抗CEA抗体を同
じ目的に用いる場合に比較して、所望の抗原の濃度を一
そう正確に測定することができる。

癌の診断治療のほかに、本発明による単クローン性抗
CEA抗体を、たとえば、細胞の悪性変化に伴なう遺伝子
発現の胎児期への先祖帰り現象としてのCEA産生やCEAの
生物活性および分子構造の解明に用いることができる。

下記の本発明の実施例において、Farrのラジオイムノ
アツセイ法は次の通り行なわれた。

¹²⁵Iで標識されたCEA標品（5-10ng;50μｌ）および単
クローンの培養上清（50μｌ）を96ウエルのマイクロタ
イタープレートの各ウエルに入れ、よく混合した。37℃
で１時間静置した後、飽和硫安溶液（100μｌ）を各ウ
エルに加え、さらに37℃で１時間静置した。次に反応混
合物を遠心処理（2000r.p.m./30分間）して上清を分離
し、その100μｌの放射活性をガンマカウンターで測定
した。抗体と共に沈降した放射性CEAの量から、単クロ
ーン性抗CEA抗体産生性能をもつ融合細胞が同定され
た。

実施例１約５週令のBALB/cマウス（SPFマウス；静岡県実験動
物農業協同組合より入手）２匹をCEA（参考例１の方法
で調製）で免疫した。すなわち各動物について、初回20
μｇのCEAをフロイントの完全アジユバンド（DIFCO社
製）を用いた乳化液0.2mlと共に腹腔内投与し、５週間
後に同量のCEA（食塩水0.2ml中CEA20μｇ）を各マウス
の静脈内に投与した。その３日後に動物を殺し、脾およ
びリンパ節より抗体産生細胞（類リンパ球）を採取し
た。約１×10⁸個の類リンパ球と１×10⁷個のアザグアニ
ン耐性マウス骨髄腫由来株化細胞P3-X63-Ag8-u1〔Yelto
n,D.E.et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,81,1（197
8）〕と混合した。45％（v/v）ポリエチレングリコール
4000（米国シグマ社製）1mlを混合物に滴下し、37℃に
７分間保ち、その後D-MEM（日水製薬製）15mlを混合物
に滴下することにより、ポリエチレングリコールを希釈
した。融合細胞をD-MEM（30ml）で洗い、10％ウシ胎児
血清（FCS）（米国Gibco製）、ペニシリン（100単位/m
l）とゲンタマイシン（50μg/ml）とを含むD-MEM（100m
l）中に浮遊させた。細胞浮遊液（各1ml）を96のウエル
に入れ（各24ウエルのミクロタイター板使用）、炭酸ガ
ス存在下で37℃に一夜放置した後、HAT培地（４×10^-7
Ｍのアミノプテリン、1.6×10^-5Ｍのチミジンおよび１
×10^-4Ｍのヒポキサンチンを含む培地、pH7）各1mlを各
ウエルに分注し、次に培地の半分を２日おきに新しいHA
T培地と取りかえた。11日目に培地の半分をHT培地（上
記HAT培地からアミノプテリンを除いたもの）と取りか
え、次に２日おきに培地の半分を10％FCSを含むD-MEMと
取りかえた。ほとんど全部（98％以上）の培地で融合細
胞の発育が認められた。培地の上清を各ウエルから採取
し、前記の第1CEAを用いるFarrの硫安沈殿法によつて抗
CEA抗体を産生する融合細胞（ハイブリツドーマ）を選
別した。次に抗CEA抗体産生能を有すると認められた融
合細胞を次のように限界希釈法によつて単クローン化し
た。

10％のFCS（ウシ胎児血清）を含むD-MEMで融合細胞を
３細胞/mlになるように希釈し、各0.2mlをミクロタイタ
ープレートの各ウエルに入れた。Ｘ線照射された若いBA
LB/cマウスの胸腺細胞（約５×10⁶細胞/ml）を含むD-ME
Mを用いて37℃で２週間培養後、ウエル中で増殖する細
胞を単クローン融合細胞として同定し、さらに限界希釈
法をくり返し行なうことにより、単クローン性を確実に
した。

こうして培養上清中に約10ng/ml以上の抗CEA抗体産生
能をもつ単クローン性融合細胞が得られた。

実施例１で用いられた第1CEAは後記参考例１記載の方
法で得られたものであるが、所望によりその他の適当な
CEA標品を同じ目的に用いることもできる。２匹のマウ
スより通常20-30個の単クローン性抗CEA抗体産生融合細
胞が得られる。

上記操作を十数回繰り返して得られた約300株の抗CEA
抗体産生融合細胞の培養上清と放射性ヨードで標識した
CEA、NFA-2、NFA-1およびf-NCAとの反応性をFarrの硫安
沈殿法によるラジオイムノアツセイによつて検索した。
結果を前記の第１表に示す。

実施例２実施例１の方法で得られた抗体１から５まで（第１表
参照）を別々に第1CEA、第2CEAおよび正常人糞便由来の
CEA関連抗原すなわちNFA-1、NFA-2およびf-NCAを用いた
Farrのラジオイムノアツセイ法によつて調べ、全抗体１
から５までと、上記全抗原との反応性を解明した。その
結果を示す第２表において、「＋」「−」は反応性の有
無を現わしている。

第２表から本発明の単クローン性抗CEA抗体が次の反
応特異性を有していることがわかる。

（１）全部の抗体1-5は第1CEAすなわち動物の免疫に用
いられたCEAと反応する。

（２）抗体１は第1CEAのみと反応する固体特異的抗体で
ある。本抗体は固体ごとの癌の診断治療に有用であると
考えられる。

（３）抗体２は第1CEAおよび第2CEAと反応するが、すべ
てのCEA関連正常糞便抗原すなわちNFA-1、NFA-2およびf
-NCAと反応しない。なお実施例１では別々の患者から得
られた４つのCEA標品を第2CEAとして用いた。本抗体は
抗CEA特異抗体であつて、最高の癌特異性を有するか
ら、各種の臨床用（たとえば癌の診断確定、放射性物質
や抗癌剤を癌組織に送るための担体など）や基礎医学研
究用等普遍的な用途に使用することができる。

（４）抗体３は第1CAEおよび第2CEAと反応するほか、NF
A-1およびNFA-2とも反応するので、実用的価値のある抗
体である。また抗体３産生能をもつ単クローンを他の抗
体産生能をもつ単クローンよりも簡単な方法で選別する
ことができる。

（５）他の抗体すなわち抗体４、５も、従来の多クロー
ン性および単クローン性抗CEA抗体とくらべて、より明
確な反応特異性と均一性とを有している。

実施例３抗CEA抗体産生融合細胞をBALB/cマウスの腹腔内に移
植して単クローン性抗CEA抗体を生産した例。

市販（静岡県実験動物農業協同組合より入手）BALB/c
マウス（５〜６週令、雌または雄）を試験動物として用
いた。各マウスの腹腔に0.5mlのプリスタンを投与し、
７−10日後に５×10⁶〜10⁷個/mlの単クローン性融合細
胞（実施例１の方法で得たもの）を含むD-MEM0.5mlを同
じく腹腔内に注射した。７〜10日のち十分に腹水が貯留
したマウスから腹腔穿刺にて腹水を採取し、以後２日お
きに５回復水を採取したのち、マウスを殺して全採血し
た。得られる復水量は融合細胞の性状により異なり、約
2mlから20mlであつたが、平均約10mlが得られた。各動
物の腹水および血清中に含まれる単クローン性抗CEA抗
体の濃度も融合細胞の性状により異なり約1mg/mlから約
10mg/mlであり、得られる抗体の量も２〜3mgから100mg
以上とかないの差が認められた。

参考例下記の参考例において、加圧風乾法による溶液の濃縮
は次の方法によつて行なわれた（以下風乾法という）。
風乾されるべき溶液を数本のセロフアンチユーブに入れ
た。たとえば溶液（3l）を８−９本のチユーブ（米国ビ
スキング社製、18/32、長さ150cm）に分注し、チユーブ
の上部を適当な導管を介して、たとえば送風機に連結し
た。チユーブを垂直に支え、下方約1/5を脱塩水または
適当な緩衝液を満たした容器に浸漬し、残りの部分に扇
風機からの風を当てた。

参考例１本明細書記載のCEA標品は、特記しない限り、次の方
法によつて作成された〔資料。特開昭56-47762号公
報〕。

ヒトの大腸癌肝転移巣120gに生理食塩水700mlを加え
てすりつぶし、遠心処理（9000r.p.m./40分間）により
上清を得た。上清710mlに60％過塩素酸溶液80ml（過塩
素酸濃度0.6M）を加え、生じた沈殿を遠心処理（9000r.
p.m./40分間）により除去し、得られた上清を一夜流水
で透析し、過塩素酸および透析性不純物を除去した。透
析内液をセロフアンチユーブ（ビスキング製、18/32、
長さ150cm）３本に分注し、前記の風乾法により合計8ml
に濃縮した。濃縮液を遠心処理（15000r.p.m./30分間）
することにより、CEA粗抽出液を得た。

セフアロース4B（スエーデン国、フアルマシア・フア
イン・ケミカルズAB製）のカラム（2.6×171cm）を0.05
Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）で洗浄し、上記のCE
A粗抽出液7.5mlを負荷し、上記と同様の緩衝液で溶出し
た。カラムの溶媒容量と同じ位置に溶出する分画4B-1ほ
か、それぞれ2.1、2.5および2.7倍の位置に溶出する分
画4B-2ないし4B-4が得られた。CEAの大部分を含む分画4
B-2を回収し、前記の風乾法により濃縮液（3.5ml）を得
た。セフアロース6B（スエーデン国、フアルマシア・フ
アイン・ケミカルズ製）のカラム（1.9×145cm）を上記
と同様の緩衝液で洗浄し、上記の濃縮液3.5mlを負荷
し、同様の緩衝液で溶出し、カラムの溶媒容量の1.6倍
の位置に非対称形のピークが出現した。溶出の初期に得
られる分画6B-1（約20ml）は高分子量の不純物を含み、
終りに得られる分画6B-3（約1/3）はNCA（非特異的交叉
反応抗原）を含んでいた。全体の約2/3に相当する中間
部（約60ml）を回収して集め、風乾法によつて分画6B-2
（3ml）を得た。セフアデツクスG-200（スエーデン国、
フアルマシア・フアイン・ケミカルズ製）のカラム（1.
9×145cm）を上記と同様のリン酸ナトリウム緩衝液で洗
浄した後、分画6B-2（3ml）を負荷して、同様の緩衝液
で溶出したところ、カラムの溶媒容量の約1.2倍の位置
に対称形のピークが出現した。このピークの中間3/4に
位置する分画（約45ml）を回収して集め、風乾法により
濃縮した。この濃縮液から精製されたCEA（50mg）が回
収された。その高純度であることが、たとえば免疫電気
泳動法（ウサギ抗体使用）によつて確認された。精製さ
れたCEAは一種の糖蛋白質であつて、分子量は約20万±
８万、糖と蛋白質との比は約1:1、紫外線吸収スペクト
ルにおける極大吸収は277nm、小さな肩部が283nmに見ら
れた。

参考例２本明細書記載のCEA関連正常抗原すなわちNFA-1、NFA-
2およびf-NCAは次の方法によつて得られた（資料。特開
昭56-46819号公報）。

成人の正常糞便250gを0.6M過塩素酸溶液2500mlに加
え、よくかくはんし、カーゼで過し、食物残渣などの
不溶解物を除いた。これを遠心処理（7000r.p.m./30分
間）して得た上清を流水で一夜透析して、過塩素酸およ
び透析性不純物を除いた。透析内液を９本のセロフアン
チユーブ（ビスキング製、18/32、長さ150cm）に分注
し、前記の風乾法で合計30mlまで濃縮した。同様の操作
を４回くり返すことにより、合計120mlの粗抽出液を得
た。このものは合計約10mgの所望のCEA関連正常抗原を
含有していた。

特異抗CEA抗体と結合された抗CEA抗体吸着剤（10mg、
後記の方法で製造された）を上記の粗抽出液に加え、４
℃で24時間反応させた。反応液を除去した後、冷硼酸緩
衝液（pH＝8.0;0.01M硼酸緩衝液;0.15MのNaClを含む）
で洗浄し、グリシン塩酸緩衝液（0.175M;pH＝2.3;200m
l）で溶出した後、グリシンNaOH緩衝液（1.0M;pH＝９）
で中和することにより、粗CEA関連抗原（乾燥重量9mg）
を含む溶液を得たこの溶液を上記の風乾法で1.2mlまで
濃縮し、セフアロース6B（スエーデン国、フアルマシア
・フアイン・ケミカルズ製）のカラム（1.3×80cm）に
負荷した。リン酸塩緩衝液（0.01M:pH5.0;0.15M NaClを
含む）で溶出し、各1mlの分画を試験管に分取した。試
験管番号60-75および81-95をそれぞれ集め分画１と分画
２とした。

分画１を約1mlに濃縮し、セフアデツクスG-200（100m
l）のカラムに負荷し、前記と同様のリン酸塩緩衝液で
溶出し、各1mlの分画を試験管に分取した。精製NFA-2を
含む試験管番号30-40を集め濃縮した。この濃縮液自体
を精製NFA-2の標品としそのまま用いることができる。
こうして得られたNFA-2は一種の糖蛋白質であつて、分
子量約20万±３万、糖と蛋白質との比約1:1、紫外線吸
収スペクトルにおいて極大吸収は277nmにある。本品の
アミノ酸組成はCEAのものと極めて類似し、NFA-2のNH₂
末端アミノ酸配列は少なくとも11位まではCEAのものと
同一である。

ジエチルアミノエチル・セルロース・クロマトグラフ
イーによつて、分画２から褐色色素を除き〔Cancer Re
s.,41,713,（1981）参照〕、残りの溶液に、後記の抗NC
A抗体吸着剤3.5mlを加えた。混合物を４℃で２日間反応
させた。吸着剤を回収し、よく洗浄し、次にグリシン塩
酸緩衝液（0.175M:pH＝2.3;20ml）で溶出し、次にグリ
シンNaOH緩衝液（1M:pH＝９）で中和し、その後B.B.S.
に対して透析し、透析内液を風乾法で濃縮した。この濃
縮液は精製NCA（乾燥重量1mg）を含み、それ以上精製し
なくても、本発明の目的に用いられる。こうして得られ
たF-NCAは一種の糖蛋白質で、分子量約８万±３万、糖
含量約20％である。本品のNH₂末端アミノ酸配列のう
ち、少なくとも20位まではCEAと同一である。f-NCAの理
化学的性状は、たとえば肺や脾に存在するNCAのものと
実質的に同一である。

上記の抗NCA抗体吸着剤に吸着されなかつた物質を含
む溶液を0.5mlに濃縮し、セフアデツクスG-100スーパー
フアイン（スエーデン国、フアルマシア・フアイン・ケ
ミカルズ製）のカラム（1.3×43.4cm）に負荷し、前記
と同様のリン酸塩緩衝液（0.01M;pH5.0;0.15M NaClを含
む）で溶出し、試験管に各1mlずつ分取した。試験管番
号45-55（分画ａ）および65-75（分画ｂ）をそれぞれ回
収して集めた。セフアデツクスG-100スーパーフアイン
の同じカラム（1.3×43.4cm）を用いて、分画ａおよび
ｂをそれぞれ再度クロマトグラフ処理した。このように
して、分画ａから精製NFCA、分画ｂから精製NFA-1（各
乾燥重量0.5mg）が得られた。これらはさらに精製する
ことなく、本発明の目的に用いることができた。こうし
て得られたNFA-1は一種の糖蛋白質で、分子量約２万な
いし３万、糖含量約13％である。NFA-1のアミノ酸組成
はCEAのものに類似であるが、しかしフエニルアラニ
ン、リジンおよびプロリンのようないくつかのアミノ酸
ではわずかではあるが有意な差違が見られた。しかし、
NFA-1のNH₂末端アミノ酸配列はCEA、NFA-2またはNCAの
ものと全く異なつている。

前述の抗CEA抗体吸収剤および抗NCA抗体吸着剤は次の
方法で得られたものである。

参考例１の方法で得られたCEA標品（乾燥重量10mg）
を常法によりCNBRセフアロース4B（乾燥ゲル1g;スエー
デン国、フアルマシア・フアイン・ケミカルズ製）と結
合させてCEA吸着剤を得た。これを抗CEA血清（50ml）と
４℃で３日間反応させた。この抗血清をつくるために、
任意のCEAを用いることができる。抗CEA抗体を結合した
CEA吸着剤を回収し、蛋白質の出現を認めなくなるまで
冷B.B.S.で洗浄し、次にグリシン塩酸緩衝液（各10ml;
0.175M;pH＝2.3）で５回溶出した。溶出された液を集め
てグリシンNaOH緩衝液（1M;pH＝９）で中和し、次にB.
B.S.に対して４℃で一夜透析した。透析内液を10mlまで
濃縮した。この液は特異的多クローン性抗CEA抗体50mg
を含んでいた。上記の方法を２回くり返すことによつて
得られた濃縮液20mlは、特異的に精製された多クローン
性抗CEA抗体100mgを含んでいた。こうして得られた多ク
ローン性抗CEA抗体100mgをCNBRセフアロース4B（10g;ス
エーデン国、フアルマシア・フアイン・ケミカルズ製）
と常法によつて結合した。これによつて、特異的に精製
された抗CEA抗体100mgと結合された所望の抗CEA抗体吸
着剤が返られた。

抗CEA抗体の代わりに抗NCA抗体を用いて、上記の方法
をくり返すことによつて、セフアロース4Bと結合された
抗NCA抗体吸着剤が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者黒木政秀福岡県福岡市早良区四箇田団地22番401号 (56)参考文献特開昭56−46819（ＪＰ，Ａ) 特表昭57−500195（ＪＰ，Ａ) 国際公開81／1469（ＷＯ，Ａ) Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，43，１−４（1981) Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，44，371−380 （1981) Ｓｃｉｅｎｃｅ，212，53−55（1981) ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，41，3306− 3310（1981) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，77，563−566（1980) ＣａｎｃｅｒＩｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，10，１−５（1980)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１哺乳動物を第１癌胎児性抗原で免疫す
ることによって前記抗原に対する抗体産生能を有する細
胞を産生させ、生じた細胞をこの哺乳動物から採取し、
採取された細胞を第２哺乳動物由来のミエローマの株化
細胞と融合させ、こうして得られた融合細胞をクローニ
ングに付し、得られた単クローン性ハイブリドーマを培
養し、培養液から所望の単クローン抗体を回収する工程
からなり、（イ）前記第１癌胎児性抗原を第１マーカー
抗原として用い、前記単クローン性ハイブリドーマを前
記第１マーカーと反応する抗体の産生能を基準として選
別すること、および（ロ）前記回収工程において、前記
第１癌胎児性抗原以外の第２癌胎児性抗原、正常糞便抗
原１、正常糞便抗原２および非特異的交叉反応抗原を選
別用マーカー抗原として用いて、前記ハイブリドーマを
前記マーカー抗原との反応性を基準として選別する工程
において、（ハ）正常糞便抗原２を第２マーカー抗原と
して用い、正常糞便抗原２と反応しない抗体（抗体Ａ）
産生能をもつ単クローン群（クローンＡ）と反応する抗
体（抗体Ｂ）産生能をもつ単クローン群（クローンＢ）
に分離し、（ニ）１種以上の第２癌胎児性抗原を第３マ
ーカー抗原として用い、前記クローンＡを第２癌胎児性
抗原と反応しない抗体（抗体１）産生能をもつ単クロー
ン群（クローンA1）と反応する抗体（抗体２）産生能を
もつ単クローン群（クローンA2）に分離し、さらに
（ホ）正常糞便抗原１を第４マーカー抗原として用い、
前記クローンＢを正常糞便抗原１と反応する抗体（抗体
３）産生能をもつ単クローン群（クローンB1）と反応し
ない抗体産生能をもつ単クローン群（クローンB2）に分
離し、さらに（ヘ）非特異的交叉反応抗原を第５マーカ
ー抗原として用い、前記クローンB2を非特異的交叉反応
抗原と反応しない抗体（抗体４）産生能をもつ単クロー
ン群（クローンB2-1）と非特異的交叉反応抗原と反応す
る抗体（抗体５）産生能をもつ単クローン群（クローン
B2-2）に分離することを特徴とする癌胎児性抗原に特異
的に反応する単クローン性抗体の製法。