JPH0441429A - 海産物由来腫瘍細胞増殖阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はキヒトデ等から採取される腫瘍細胞増殖阻害剤
に関するものである。

〔従来の技術〕

現在腫瘍細胞増殖作用を阻害する物質は種々知られてお
り、天然界からも数多の分離例が報告されている。しか
し、ヒトデから分離された例は未だ報告されていない。

一方、ヒトデからステロイドサポニン類を分離した例は
マルサステリアス・グラシアリスＭａｒｔｈａｓｔｅｒ
ｉａｓ　１ａｃｉａｌｉｓについてＴｕｒｎｅｒらが報
告している（Ｎａｔｕｒｅ、　２３３（５３１６）、　
２０９−２１０．１９７１）。

彼らはこの構成ステロイドの構造を決定し、マルサステ
ロン（Ｍａｒｔｈａｓｔｅｒｏｎｅ）と命名した。また
、ＫｉｔａｇａｗａらはオニヒトデＡｃａｎｔｈａｓｔ
ｅｒ　　１ａｎｃｉから２種のステロイドサポニンを分
離して構成ステロイドをツルナスチロールＡ、　Ｂ　（
ＴｈｏｒｎａｓｔｅｒｏｌＡ、Ｂ）と命名し構造決定し
た。本発明者もキヒトデ（＾５ｔｅｒｉａｓ　ａｍｕｒ
ｅｎｓｉｓ）の卵巣より数種のステロイドサポニンを分
離し、卵巣・アステロサポニン（Ｏｖａｒｉａｎ　Ａｓ
ｔｅｒｏｓａｐｏｎｉｎ）と命名した（Ａｇｒｉｃ、Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　４５　（３）、　　８０１−８０３．８
０５　８０７．１９８１．同。

４５（９Ｌ　２８２３−２８２６．　１９８５）。そし
て、その構成ステロイドの一部について薬理作用も報告
しており（Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ、＋　
ＥＬ　５−７６＋　１９８５）、そのなかには腫瘍細胞
の生育抑制効果も含まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

制癌剤には多種のものが開発されているか著効のあるも
のはまだ開発されていない。従って、腫瘍細胞の増殖を
抑制できる物質をさらに開拓することによって新たな制
癌剤を作製する手段を提供することができる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は上記目的を達成するべく、ヒトデ類のステロ
イドを中心にａｔ瘍細胞の増殖抑止作用を広く検討した
結果、増殖抑止作用の顕著なものの取得に成功し、この
知見に基づいて本発明を完成することができた。

すなわち、本発明は、下記のいずれがの構造式を有する
ステロイド又はその塩を含有してなる腫瘍細胞増殖阻害
剤に関するものである。

上記の各ステロイドのうち構造式（１）で表わされるス
テロイドサポニンはキヒトデ（Ａｓｔｅｒｉａｓａｓ＋
ｕｒｅｎｓｉｓ）から抽出され、オバリアン・アステロ
サポニンー４（ＯＡ−４）と命名されているものである
。

０Ａ−４の物性値としては、融点２０７〜２０９°Ｃ１
比旋光度〔α）　：”−ｘ、ｓ°（Ｃ＝１．８、Ｈ２Ｏ
）、元素分析Ｓ：２．４％、紫外部吸収（ＨｚＯ）　２
３０ｎｍ以上にはなし、である。薄層クロマトグラフィ
ーのＲｆ値は、シリカゲル６０プレートを用い、クロロ
ホルム−メタ／−ルー水（１０：５：１、ｖ／ｖ）で展
開した場合０．１６であり、シラン化したシリカゲル６
０プレートを用いて５０％メタノール水溶液で展開した
場合０．４７である。構造の決定方法はＡｇｒｉｃ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔａ、、　４７（９）。

２８２３−２８２６．１９８５に詳しく記載されており
、それに従って決定することができる。０Ａ−４はナト
リウム塩、カルシウム塩等の塩の形であってもよい。

構造式（Ｉ［）で表わされるステロイドサポニンは構造
式（１）のステロイドサポニンの脱硫酸化物であり、例
えば（１）のステロイドをビリ゛ジン塩に変えてジオキ
サン中で加熱することによって加溶媒分解させて得るこ
とができる。この０Ａ−４脱スルホン化物の物性値とし
ては、融点２３２〜２３３．５℃、比旋光度［、ｙ）ｐ
＋　７°（Ｃ＝０．９、メタノール）　、Ｋｉｅｓｅｌ
ｇｅｌ　６０ＦＺ５４５ｉｌａｎｉｓｉｅｌｔを用い７
０％メタノール水溶液で展開したときのＲｆ値が０．４
０である。

”Ｃ−ＮＭＲ（Ｃ，Ｄ、Ｎ−Ｈ，Ｏ１５：１）Ｃ−１３
６，２ ２３１，６ ３７０，８ ４３２，８ ５４９，３ ６７９，４ ７４１，４ ８３５，５ ９１４５，８ １０３８，５ １１１１６，７ １２４２，４ １３４１，５ １４５４，２ １５２３，２ １６２５，１ １７５８，７ １８１３，６ １９１９，４ ２０７４，３ ２１２５，８ ２３２３，５ ２４１２５，５ ２５１３１，１ ２６２５，９ ２７１７，７ ＦＤ−マススペクトル ｍ／ｚ　１１８７　（Ｍ”（ＣｓｂＨｑｚＯｚａ）＋　
Ｋ、１５％）１１７１　（Ｍ”＋　Ｎａ、　ｂａｓｅ　
ｐｅａｋ）１１５３　（Ｍ　”　＋　Ｎ　ａ　　Ｈｚ　
０１５６％）１０８７　（Ｍ’＋Ｎａ−Ｃ，Ｈ，！（側
鎖＋Ｈ）、１２％）１０２５　（Ｍ”＋　Ｎａ　　Ｃ６
Ｈ１００４（キノトス残基）、　２３％） １００７　（Ｍ”＋Ｎａ−Ｈ２Ｏ−Ｃ６Ｈ１００４，２
８％）８６３　　（Ｍ”＋Ｎａ　　　ＣｔｚＨｚｏＯｑ
（キノネース＋グルコース残基）、　１２％）８４５（
Ｍ’＋Ｎａ　　　ＨｚＯＣｔｚＨｚｏＯｑ、　６　％）
構造式（Ｉ［ｌ）で表わされるステロイドサポニンはや
はりキヒトデから抽出され、オバリアン・アステロサボ
ニン−１（ＯＡ４）と命名されているステロイドの脱硫
酸化物である。０Ａ−１の分離方法は例えば＾ｇｒｉｃ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　４５（３）、　８０１
−８０３．１９８１に、そして構造決定方法は同誌８０
５−８０７に記載されている。０Ａ−１の脱硫酸化物も
同様に０Ａ−１をピリジン塩に変えてジオキサン中で加
熱することによって加溶媒分解させて取得することがで
きる。

構造式（ＩＶ）で表わされるステロイドは０Ａ−１のア
グリコンであり、０Ａ−１に例えばグリコシダーゼを作
用させて糖部分を切除することによって取得することが
できる。このステロイドはツルナスチロールＡ　（Ｔｈ
ｏｒｎａｓｔｅｒｏｌ　Ａ）の別名で知られている（Ｔ
ｅｔｒａｉｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　Ｎｏ、１１
＋　ｐｐ９６７　９７０＋１９７５）。

物性値としては、Ｒｆ　Ｏ，５４（Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅ
ｌ　６０Ｆｚｓｎ、クロロホルム−メタノール−水、１
０：５：１、Ｖ／Ｖ）、Ｒｆ　Ｏ，５１（Ｋｉｅｓｅｌ
　ｇｅｌ　６０Ｆｚｓｎ、ｎ−ブタノール：酢酸−水、
１０：１：１、ｖ／ｖ）、Ｒｆ　Ｏ，５４（Ｋｉｅｓｅ
ｌ　ｇｅ１６０Ｆｚｓ４Ｓｉｌａｎｉｓｉｅｌｔ、５０
％メタノール）、（α）：”−７’　（Ｃ＝Ｉ、Ｏ、メ
タノール）そしてＣＤ：［θ〕！９＠ｎｌｌ　　１８０
０（Ｃ＝　０．６、メタノール）テある。

構造式（Ｖ）で表わされるステロイドはマルサステロン
（Ｎａｔｕｒｅ、　２３３（５３１６）、　２０９−２
１０．１９７１）であり、マルサステリアス・グラシリ
アスから抽出しうるちのである（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、
　Ｊ、　１９７０．１１７．５４３）。

紫外部吸収が２４０ｎ＋ｍに、そして赤外吸収が１６９
０ｃｍ−’にある。

構造式（ＶＩ）で表わされるステロイドは構造式（ＩＩ
）で表わされるステロイドサポニンのアグリコンであり
、このステロイドサポニンに例えばグリコシダーゼを作
用させて糖部分を切除することによって取得することが
できる。物性値としては、である。

１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ、０Ｄ） ３７．０ ３２．０ ７１．８ ３３．４ ５１．０ ６９．８ ４３．３ ３７．０ １４６．８ ３９．３ １１？、７ ４３．６ ４２．４ ５５．１ ２４．０ ２５．７ ５９．６ １３．７ １９．７ ７５．６ ２５．９ ４４．８ ２３．５ １２５．８ １３１．８ ２５．９ ２７　　　　　１７．７ Ｅｌ−マススペクトルを測定したところ、ｍ／ｚ　３９
８（Ｍ”−Ｈ，０１８０％）、ｍ／ｚ　３３３（Ｍ”　
　Ｃ６Ｈ１３，３０％）、ｍ／ｚ　３１５（Ｍ”−Ｃ，
Ｈ，、−Ｈ２Ｏ、ｂａｓｅ　ｐｅａｋ）−２１Ｈ）　、
１．６１・１．６８ｐｐｍ（それぞれ、３Ｈ，Ｓ、ｃＨ
ｓ）３、Ｃ−２６・２７Ｈ）　、３．５７・３．７０ｐ
ｐｍ（それぞれ、Ｉ　Ｈ，ｂｒＳＣ−３・６　Ｈ）、５
．０８ｐｐｎ＋（Ｉ　Ｈｌｂｒｏａｄ　ｔ、　Ｈ”’、
Ｃ−２４Ｈ）、５．３０ｐｐｍ（ｌ　Ｈ、ｂｒｏａｄｓ
、）（’−（、Ｃ−１１Ｈ）の吸収を示した。

構造式（■）で表わされるステロイドは構造式（Ｉ［［
）で表わされるステロイドサポニンのアグリコンであり
、１このステロイドサポニンに例えばグリコシダーゼを
作用させて糖部分を切除することによって取得すること
ができる。物性値としては、比旋光度が［α］　”＋６
２．３°（Ｃ＝０．９、メタノ−α ル）、ＣＯが〔θ）　２８７ｎｍ＋７２００　（Ｃ＝０
．０８、メタノール）、そしてＭＳがＭ″″３３２であ
る。

”Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ、０Ｄ） Ｃ−１３６，９ ２３１，９ ３７１，４ ４３３，４ ５５０，３ ６６９，６ ７４３，３ Ｂ　　　　　　　３７．０ ９　　　　　　１４７．５ １０　　　　　　３９．３ １１　　　　　１１７．１ １２　　　　　　４１．６ １３　　　　　　４３．７ １４　　　　　　５４．９ １５　　　　　　２３．８ １６　　　　　　２６．４ １７　　　　　　６４．４ １Ｂ　　　　　　　１３．４ １９　　　　　　１９．７ ２０　　　　　２１１．９ ２１　　　　　　３１．３ 本発明の腫瘍細胞増殖阻害剤は公知のものと同様にして
使用することができ、必要により賦形剤を加えて液剤、
ｉ剤等の形態で使用することができる。投与方法は注射
投与、経口投与等を利用できる。腫瘍の種類及び部位は
特に限定されるものではなく、人間以外にも各種哺乳動
物用としても使用できる。投与量は０．１〜１００■７
体重廟程度が適当である。

〔実施例〕

（１）アステロサボニン０Ａ−１〜５の調製まず、繁殖
期にあるキヒトデより卵巣を摘出して凍結乾燥した。こ
の乾燥粉末１００ｇをクロロホルム−メタノール（２：
１、ｖ／ｖ）の混合溶媒１１に浸しワーリングブレンダ
ーでホモゲナイズして抽・出した。残渣をクロロホルム
−メタノール−水（２０：４０：３、ｖ／ｖ）の混合溶
媒１１でざらに抽出した。抽出液を合わせ、クロロホル
ム−メタノール−水の比を１０　：　５　：　３　（ｖ
／ｖ）にして分層された。

上層を分取して減圧濃縮した。残った水溶液をｎ−ブタ
ノールと水（ｐＨ４，０）で分層させた。上層を分取し
て中和し、濃縮した。残渣を少量の水で溶解し、５２の
水に対して２回透析した。透析残渣を６０ｄのクロロホ
ルム−メタノール−水（３０：　６０　：８、■／ν）
に溶解し、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（酢酸塩
型）カラム（２，２Ｘ　１２．７＾ｍ　）に流した。二
〇カラムに３００ｄのクロロホルム−メタノール水（３
０：６０：８、ｖ／ｖ）を流して洗浄し、次いで、７５
０ｄのクロロホルム−メタノール−０，８Ａ酢Ｍナトリ
ウム（３０：６０：８、ｖ／ｖ）を流して溶出した。

溶出液を濃縮後、水に対して透析し、粗サポニン混合物
を得た。この粗サポニン混合物をシラン化したシリカゲ
ルカラム（４，２Ｘ３７ｃｍ）に入れ、３５％メタノー
ル水溶液で分配クロマトグラフィーを行なったところ、
フラクションａ、フラクションｂ、フラクションＣがこ
の順に流出してきた。フラクションａをキーゼルゲル（
Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｔ　Ｐ）カラム（１，４Ｘ　５０Ｃ
Ｉ＋　）に入れてクロロホルム−メタノール−水（１０
：５：１、ｖ／ｖ）を展開溶媒に用いて中圧カラムクロ
マトグラフィーを行ない、０Ａ−１と０Ａ−２のサポニ
ンのフラクションを得た。これらをそれぞれローバーカ
ラム（Ｌｏｂａｒ　Ｃｏｌｕｍｎ）ＲＰ−８（Ｓｉｚｅ
　Ｂ。

メルク）に入れ、５０％メタノール水溶液を展開溶媒と
してクロマトグラフィーを行なうことによってさらに糖
製して０Ａ−１純品３１０■と０Ａ−２純品１４０■を
得た。フラクションｂも上記と同じキーゼルゲルカラム
及びローバーカラムを用い同じ条件で分離精製して０Ａ
−３純品３０■と０Ａ−４純品１９０■を得た。

フラクションＣは上記と同じキーゼルゲルカラム及びロ
ーバーカラムを順序を逆にして同じ条件で精製して０Ａ
−５純品２１■を得た。上記の０Ａ−１〜５は薄層クロ
マトグラフィー、融点、比旋光度等によりそれぞれ確認
を行なった。

（２）アステロサポニン０Ａ−１と０Ａ−４の各脱硫酸
化物の調製 ０Ａ−１２２ｍｇをクロロホルム−メタノール−水（３
０：　６０　：　８、ｖ／ｖ）　２ｄに溶解し、旧ｏ−
Ｒａｄ　ＡＧ−５０（Ｈ”）の小カラム（０，６Ｘ１．
３ＣＩ）を通過させたのち、ピリジンを加え、濃縮乾個
し、ピリジン塩に変換した。

このピリジン塩をよく乾燥したのち、９５％ジオキサン
に溶解し、１時間加熱還流、脱硫酸して０Ａ−１の脱硫
酸化物１８■を得た。

次に、９５．５■の０Ａ−４をクロロホルム−メタノー
ル−水（３０：６０：８、ｖ／ｖ）に溶解し、Ｂｉｏ−
ｒａｄ　ＡＧ−５０（Ｈａ　の小カラム（０，６Ｘ２．
０Ｃ１１）を通過させた。

この脱カチオン液にピリジン０．１ｙｄを加え、濃縮乾
固して、０Ａ−４のピリジン塩を得た。このピリジン塩
を０．５　ａｔ！の水に溶解したのち、９．５　ｍのジ
オキサンを加え、１時間加熱還流した。溶媒を留去後１
ＭＮの９０％メタノールに溶解し、以下のカラムクロマ
トグラフィーで脱塩、精製した。

カラム：ローバーカラムＲＰ−８（Ｓｉｚｅ　Ｂ）溶　
媒：９０％メタノール 分画ニアｇ 流速：１６０Ｉｄ／ｍ フラクションＮα８〜９を濃縮乾固して、０Ａ−４の脱
硫酸化物２７．７ｍｇを得た。Ｒｆ　Ｏ，４０（Ｋｉｅ
ｓｅｌ　ｇｅ１６０ＦＺＳ４５ｉｌａｎｉｓｉｅｌｔ、
　７０％メタノール）ＦＤ−マススペクトル：日立Ｍ−
８０型二ｉＥ収束Ｇｃ−マススペクトルで測定。

（３）ツルナスチロールＡサルフェートの調製５３０ｍ
ｇの０＾−１、ホラ貝（Ｃ，Ｌａｎ＋ｐａｓ）グリコシ
ダーゼ（生化学工業）８００■、０．２Ｍ酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液６０ｄ、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液３０
ｄを混合し、３７°Ｃで６４時間、振盪した。反応液を
水２飽和ｎ−ブタノールで４回抽出し、そのｎ−ブタノ
ール層を１回水洗した。洗液は水飽和ｎ−ブタノールで
再抽出し、抽出された上層すべてを集めて濃縮乾固した
。この濃縮残渣について次に示す逆層分配カラムクロマ
トグラフィーを行った。

担　体：シラナイズドシリカゲル６０　（Ｍｅｒｃｋ）
　５０ｇカラム：２．３Ｘ３２Ｃ１１ 溶媒系：０２０％メタノール　　　　　５００ｄ■４５
％メタノール　　　　　　２５０ｄ■６０％メタノール
　　　　　　３００ｄ分画■を濃縮したのち、クロロホ
ルム−メタノール−水（７５：２５：３、ｖ／ｖ）　３
ｍに溶解して、次に示すカムクロマトグラフィーを行っ
た。

担体：　Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　ＰＦｚｓ４（ＴＬＣ用
）４０ｇカラム：セパコールカラム （生化学工業、１．４Ｘ５０ｃｍ） 流　速：４２ｄ／ｈｒ（圧力６気圧） 分画：１５ｄ 溶系：■クロロホルム−メタノール−水（７５：２５：
３、Ｖ／い ｆｒ、　　随１〜４２ ■クロロホルムーメタノールー水 （１０：５：１、ν／ｖ） ｆ　ｒ　、　Ｎａ　４３〜６０ その結果、フラクション隘９〜１３にツルナスチロール
サルフェート４２■ヲ得た。

Ｒｆ　Ｏ，５４（Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｔ　６０ＦＺ５４
、クロロホルムメタノール−水、１０　：　５　：　１
、ｖ／ｖ）、Ｒｆ　Ｏ，５１（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｔ　６
０Ｆ２ｓｎ、ｎ−ブタノール−酢酸−水、１０　：　１
　：　１、ｖ／ｖ）、Ｒｆ　０．５４（Ｋｉｅｓｅｌ　
ｇｅｌ　６０Ｆ２Ｓ４．５ｉｌａｎｉｓｉｅｌｔ　：５
０％メタノール）〔α〕：２−ｔ°（Ｃ＝１．０、メタ
ノール）、ＣＤ：（θ）　ｚｑｏａｌｌ　　１８００　
（Ｃ〜０．６、メタノール）、元素分析Ｓ：５％、Ｃａ
１ｃ６％（Ｃｚ、Ｈ４，０，ＳＮａとして）。

（４）ＯＡ−１と０Ａ−４の各ステロイド及び０Ａ−１
の４１１の調製 １００■の０Ａ−１を０．２５Ｎ水酸化ナトリウム５ｄ
に溶解し、室温で２０時間撹拌した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
ＡＧ−５０（Ｈ”）を加え中和、濾過して樹脂を除き、
濾液を減圧濃縮した。残渣は３ｄのクロロホルム−メタ
ノール−水（３０：６０：８、ｖ／ｖ）に溶解し、ＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−２５（酢酸型）カラムにかけ
た。クロロホルム−メタノール−水（３０：６０：８、
ｖ／ｖ）　３０ａｄ！で非吸着分画を洗いだし、クロロ
ホルム−メタノール０．８Ｍ酢酸ナトリウム（３０：６
０：８、ｖ／ｖ）で吸着分画を溶出した。吸着分画を濃
縮後、水に溶解し、水飽和ｎ−ブタノールで４回抽出し
た。ｎ−フタノール層はｎ−ブタノール飽和水で２回洗
浄し、洗液は水飽和ｎ−ブタノールで再抽出し、上層を
すべて集め濃縮乾個し、３３■の０＾−１サルフエート
を得た。〇へ−１サルフェートのピリジン塩（３０Ｌ１
ｇ）を９５％ジオキサン１０Ｈ１に溶解し、１時間加熱
還流した。

ロータリーエバポレーターで濃縮後、水と酢酸エチルで
分配し、酢酸エチル層を脱水、濃縮して２２■の０Ａ−
１ステロイドを得た。Ｒｆ　Ｏ，５９（Ｋｉｅｓｅ１ｇ
ｅ１６０Ｆ　ｚ　Ｓ　４、クロロホルム−メタノール−
水、５０　：　１０：１）、Ｒｆ　Ｏ，６１（Ｋｉｅｓ
ｅｌ　ｇｅｌ　６０Ｆ２Ｓ４５ｉｌａｎｉｓｉｅｌｔ。

７０％メタノール）　、Ｇ　Ｌ　Ｃ（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ
　０Ｖ−１２％、０、３　Ｘ２００ｃｍ、２８０°Ｃ定
温）の保持時間３．２分（１ＭＳ化物）、［α］　：”
＋６２．３°（Ｃ＝０．９、メタツノ　　　−　　ル）
、　ＭＳ　　：　ａａ／ｚ　　３３２、３１４、２９９
、２８１、２３０（ｂａｓｅ　ｐｅａｋ）　　、２２９
．２１１゜次に、上記のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−
２５カラムの非吸着分画（４９，９■）を次に示すシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。

担体：　Ｍａｌｌｉｎ　ｒｏｄｔ　ＣＣ−７１０ｇ（１
，６Ｘ１２．５ｃｍ）流速：９０戚／ｈｒ 溶媒系：クロロホルム−メタノール−水（７５：２５：
３、ν／ν） 分画：８ｇ フラクションＮｏ、１４〜２０を濃縮乾固し、０Ａ−１
の４ｔＪ！２６．０■を得た。Ｒｆ　Ｏ，２６（Ｋｉｅ
ｓｅｌ　ｇｅｌ　６０Ｆｔｓｎ、クロロホルム−メタノ
ール−水、１０　：　５　：　１、ｖ／ｖ）。

発色は硫酸で行った。加熱すると黄色のスポットを与え
た。

１９０■の０Ａ−４とＮａｒｉｎｇｉｎａｓｅ（大正製
薬）３２０■を酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
０）　４０ｍ１に溶解し、３８〜４０℃で８６時間振盪
した。反応終了後、反応液は４０ｄの水飽和ｎ−ブタノ
ールで４回抽出した。

このｎ−ブタノール抽出物を３ｄの水に溶解し、以−ル
）、ＣＤ：（θ：＋　２１１７　ｎａ＋＋７２００（Ｃ
〜０．０８、メタ下に示すカラムクロマトグラフィーを
行った。

カラム：２．３Ｘ１５Ｃ１１ 担体：　５ｉｌａｎｉｚｅｄ　５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ（
Ｍｅｒｃｋ）　３０ｇ溶媒系：０２５％メタノール　　
　　３５０ｄ■４５％メタノール　　　　　３５０ｄ■
１００％メタノール　　　　　３００ｄ■を濃縮乾固し
、９１．３ｄの酵素分解物を得た。

この酵素分解物を５ｄのクロロホルム−メタノール−水
（４０：１０：１）に溶解し、以下に示すカラムクロマ
トグラフィーを得た。

カラム：　１．７Ｘ３３ｃｍ 担　体：ワコーゲルＣ−２００３０ｇ 溶媒系：クロロホルム−メタノール−水（４０：１０：
１） 分画：２０ｇ 流速：１０９Ｉｌｌ／ｍ フラクション阻１２〜２１を濃縮乾固し、２７．２■の
０Ａ−４サルフエートを得た。この０Ａ−４サルフエー
ト１４■を１■のメタノールに溶解し、旧ｏ−Ｒａｄ　
ＡＧ−５０（Ｈ，”）の小カラム（０，５Ｘ１ｃｍ）を
通過させたノチ、０、５　ｄのピリジンを加え、ロータ
リーエバポレーターで濃縮乾固してピリジン塩に変換し
た。このピリジン塩を１０ｄの９５％ジオキサンに溶解
し、１時間加熱還流した。溶媒を情夫したのち、酢酸エ
チルに溶解し、３回水洗、芒硝で脱水後、濃縮乾固して
０Ａ−４ステロイド１０．５ｄを得た。Ｒｆ　Ｏ，５１
（Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　Ｆ２５４　、クロロホルム−
メタノール−水、５０：１０：１）、Ｒｆ　０．３１（
Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　６０ＦＺＳ４ｓｉｌａｎｉｓｉ
ｅｌｔ、　７０％メタノール）　、ａｓ　：　ｒｍ／ｚ
　３９８．３８３．３８０．３６５．３５５．３３３．
３１６．３１５．２９７．２８７．２８５゜ （５）０＾−４のプロサボゲニン１〜３の調製２１０■
の０Ａ−４とホラ貝グリコシダーゼ（生化学工業）４０
■、ナリンギナーゼ２２０■を０．１　Ｍ酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４，０）　１００−に溶解し、７
℃のロータリーシェーカーで８４時間反応させた。

反応液をｎ−ブタノール抽出し、その抽出物を２０％メ
タノール溶液として、次に示す条件でカラムクロマトグ
ラフィーを行った。

カラム：１．７Ｘ１７ｃｍ 担　体：シラナイズドシリカゲル（メルク）溶媒系：０
２０％メタノール　　　　　　１００ｄ■４５％メタノ
ール　　　　　　　２００ｄ■６０％メタノール　　　
　　　　２００ｄ■を濃縮乾固し、１１３．７■の酵素
分解物を得た。

この酵素分解物を全量、クロロホルム−メタノール−水
（１０：　１０　：　１、ｖ／ｖ）に溶解し、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ　ＡＧ５０（）Ｉ’）の小カラムを通過させた。

この脱カチオン液にピリジンを加えてピリジン塩とし、
９５％ジオキサン中、１時間加熱還流して脱硫酸した。

反応液を濃縮乾固後、３ｄのクロロホルム−メタノール
−水（５０：１０：１、ｖ／ｖ）に溶解し、次に示す条
件でカラムクロマトグラフィーを行った。

カラム：セパコールカラム （生化学工業、１．４Ｘ５０ｃｔａ） 担体：Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　ＰＦｚｓ＜　４０ｇ溶媒
系：クロロホルム−メタノール−水（５０：１０：１、
ｖ／ｖ） 流　速：　４２ｄ、／ｈｒｃ圧力６気圧）分　画：５ｇ その結果、プロサボゲニン１〜３　（Ｐ−１〜３）を次
に示すように単離した。

”　ＴＬＣ（１）　：　　Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　６０
Ｆ２Ｓ４、クロロホルムメタノール−水、５０：１０：
１ ”　ＴＬＣ（２）　：　　Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　６０
Ｆ２５４５ｉｌａｎｉｓｉｅｌｔ、７０％メタノール 尚、プロサポゲニン−Ｌ（Ｐ−１）は０Ａ−４のステロ
イドにキノボースが結合したものであり、プロサボゲニ
ン−２（Ｐ−２）は０Ａ−４のステロイドにキノボース
キシロースが結合したものであり、プロサボゲニン−３
（Ｐ−３）は０Ａ−４のステロイドにキノボースキシロ
ース−キノボースの３ＩＪ！が結合したものである。

（６）マルサステロンの調製 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１９７０．１１７．５４３記
載の方法によって調製した。

（７）ＩＩ瘍細胞増殖阻害作用の測定 上記（１）〜（６）で得られたステロイドサポニン等を
添加した培地で腫瘍細胞を培養し、腫瘍細胞の増殖阻害
作用（細胞融解作用）をしらべた。ステロイドサポニン
、そのソルボリシス生成物及びプロサポゲニンは水溶性
であるのでそのまま培地に添加したが、ステロイド、す
なわち、０Ａ−１ステロイド、０Ａ−４ステロイド及び
マルサステロンの３種はエタノール溶液とし最終エタノ
ール濃度が１％を越えないように加えた。溶液について
はいずれもオートクレーブ処理を行った。

２％牛脂児血清（Ａｒｍｏｕｒ）を含むＥＳ培地（田水
製薬）を０．４　ｄブフ２４ウェルプレー）　（Ｆａｌ
ｃｏｎ）の各ウェルに分注し、マウス乳ガン由来のＦＭ
３Ａ細胞を各ウェル１　：２．０Ｘ１０’個づ゛つ浮遊
させた。これを５％炭酸ガスを含む空気を送気しつつ３
７℃で４日間インキュベートした。その結果、各ウェル
の細胞数は３Ｘ１０６個に増殖していた。次いで、各ウ
ェルに（１）〜（６）で得られたステロイドサポニン等
をいずれも１１００ｐ／ａｔ！（７）濃度で加え、３７
°ｃでさらに１時間インキュベートした。各ウェルの細
胞数をトリバンプルー染色法で計測した結果を表１に示
す。

尚、比較のためにステロイドサポニン等の代りにエタノ
ールを１％添加した培地についても同様にインキュベー
トし細胞数を計測した結果も併せて同表に示す。

表１ 添　加　物　　　　　　細胞数（Ｘ　１０５個）ＯＡ−
１ ＯＡ−２ ＯＡ−３ ＯＡ−４ ＯＡ−５ ＯＡ−１脱硫酸化物 ０Ａ−４脱硫酸化物 ツルナスチロールＡサルフェート ０Ａ−１ステロイド ０Ａ−１の４１！ 〇へ−４ステロイド マルサステロン ７．５ ６．８ ８．３ ０．０９ ６．５ ２．９ ７．４ ７．２ ６．６ ６．３ ７．７ ０．５ エタノール ７．４ 実施例２ ツルナスチロールＡサルフェート、０Ａ−１ステロイド
、０Ａ−１の４ｍ及びマルサステロンを１μｇ／１ｔｄ
ｌ、３．１５！ｇ／戚、１０ａｇ／ａｆ及び３１　、５
　ｔｔｇ　／　Ｉｄの４水準で加えて各培地を実施例１
と同様にして４日間インキュベートした。各ウェルに残
存する細胞数を同様に計測した結果を表２に示す。

尚、比較のためにエタノールを０．０１〜１％添加した
培地についても同様にインキュベートし細胞数を計測し
た結果も併せて同表に示す。

表２ 実施例３ ＯＡ−４ステＯイＦをＯ，ＯＯ１ｐｇ／ａｆ、、０．０
１！ｇ／ａｆ、０．１ａｇｅｄ、　　Ｉ　ｔｔｇ／ｄ、
　ＩＯμｇ／ｄ（７）　５水準で実施例２と同様にして
４日間インキュベートした。各ウェルに残存する細胞数
を同様に計測した結果を表３に示す。尚、比較のために
エタノール０．０００１〜１％を添加した培地について
も同様にインキュベートし細胞数を計測した結果も併せ
て同表に示す。

表３ ＯＡ−４ステロイド ５．３　　３．９　　４．２　　１．６　０．３ツルナ
スチロールＡ サルフェート ０Ａ−１ステロイド ０Ａ−１の４糖 マルサステロン １１．０　１１．０　　７．５　２．３０．６　　０．
９　　０　　０ ５．６　１４．０　　１２．０　７．０４．２　　５．
１　　１．１　０ 〔発明の効果〕 各種の抗腫瘍剤が開発されているがヒトデからの腫瘍細
胞増殖阻害物質分離例が報告されたことはな（、本発明
は抗癌剤を開発する範囲をさらに拡大させるものである
。特↓こステロイドサポニンの抗癌剤はまだ商品化され
たものがなく新たな抗瘍剤の商品化を期待させるもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記のいずれかの構造式を有するステロイド又はその塩
   を含有してなる腫瘍細胞増殖阻害剤▲数式、化学式、表
   等があります▼〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔IV〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔Ｖ〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔VI〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔VII〕