JPH0443080B2

JPH0443080B2 -

Info

Publication number: JPH0443080B2
Application number: JP58127779A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hayashi; Junji Kuwajima
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1983-07-15
Filing date: 1983-07-15
Publication date: 1992-07-15
Also published as: DE3462506D1; JPS6019719A; US4529594A; EP0132125A2; EP0132125A3; EP0132125B1; EP0132125B2

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗腫瘍活性を有する新規生理活性物
質に関するものである。本明細書において、アミノ酸、ペプチドは
IUPAC−IUB生化学命名委員会（CBN）で採用
された略記法により表示され、例えば下記の略号
が使用される。なお、アミノ酸などに関し光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体
を示すものとする。 Ala：アラニン Arg：アルギニン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Gly：グリシン His：ヒスチジン Leu：ロイシン Lys：リジン Pro：プロリン Ser：セリン Val：バリン網内系賦活化作用を有する種々の物質、例え
ば、各種グラム陽性菌やエンドトキシンにより誘
導され、抗腫瘍細胞能力などの生理活性を有する
物質の存在は多数報告されている。例えば
Carswellらは、CD−１ SwissマウスにBacillus
Calmette−Gue′rin（BCG）を投与し、その２週
間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られる
該マウスの血清が、培養し細胞に対して殺細胞作
用を有すること、およびMeth Ａ sarcomaで担
癌させた（BALB／ｃ×C57BL／６）F1マウス
の腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、
TNF（Tumor Necrosis Fator）と名づけた
〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA 72巻（No.９）3666〜
3670頁（1975年）〕。その後、Ruffら〔J.
Immunol.125巻（No.４）1671〜1677頁（1980年）〕
およびMatthewsら〔Br.J.Cancer 42巻416〜422
頁（1980年）〕は、前記Carswellらの方法に準じ
て調製したウサギ血清からTNFの精製を試みて、
それぞれ原血清に比べて約2000倍および約1000倍
精製されたものを得ている。しかし、いずれの場
合にも精製されたものに関しては動物実験におい
て抗腫癌効果を確認していない。特開昭57−140725号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウ
ス、ウサギ、モルモツト等）に投与し、次いでグ
ラム陰性菌由来のエンドトキシンを注射すること
によつて、または哺乳動物由来の活性化マクロフ
アージを含む組織培養系にグラム陰性菌由来のエ
ンドトキシンを加えることによつて誘発される、
制癌作用を有する蛋白性生理活性物質を単離精製
した、と開示している。更に、その物質の分子量
は、ゲル過法およびSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法では39000±5000、等電点はPH3.9
±0.3（等電点電気泳動法）である、と開示してい
る。上記物質の制癌作用は極めて優れたものである
が、それを単離精製するためには、粗製溶液を煩
雑な精製工程に付さなければならないうえ、その
活性回収率が低い、という欠点を有する。本発明者らは、本明細書中に記載の方法により
調製したウサギ血清から上記物質を収率良く得る
精製法について鋭意研究を続けていたが、その過
程で、特開昭57−140725号の精製法とは異なる精
製法を採用することにより、意外にも上記物質と
は異なる、優れた抗腫瘍活性を有する新規蛋白質
が収率良く（すなわち全工程を通じての回収率が
約50〜70％）得られることを見いだし、更に研究
を続けた結果、本発明を完成するに至つた。本発明は、網内系賦活化作用を有する物質を１
種または２種以上、ウサギに投与し、次いでグラ
ム陰性菌由来のエンドトキシンを注射することに
よつて、またはウサギ由来のマクロフアージを含
む組織培養系にグラム陰性菌由来のエンドトキシ
ンを加えることによつて誘発される、アミノ末端
よりSer−Ala−Ser−Arg−Ala−Leu−Ser−
Asp−Lys−Pro−Leu−Ala−His−Val−Val−
Ala−Asn−Pro−Gln−Val−Glu−Gly−Gln−
Leu−Gln−X₁−Leu……（但し、式中X₁は１個
のアミノ酸残基を示す。）で表わされるアミノ酸
配列構造を有するポリペプチドのサブユニツトか
らなる構造を有し、かつ下記特性を有する蛋白質
に関するものである。ａ）分子量 40000±5000（ゲル過法）17500
±2000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）ｂ）等電点 5.0±0.3（等電点電気泳動法）ｃ）実験例３に記載のＬ−Ｍ細胞を用いる評価
における比活性が５×10⁶〜１×10⁷単位／mg蛋
白質ｄ） Meth Ａ sarcoma担癌F1マウスを用い
る生物評価系において癌を壊死させる性質上記ｄ）は、具体的には、実験例４に記載の
Meth Ａ sarcoma担癌BALB／ｃ系マウスを用
いる生物評価において、１匹当り3000〜5000単位
を静脈内に投与した場合の活性が（＋）以上であ
る。また、セルロースアセテート膜を用いる電気
泳動ではα−グロブリン領域に泳動され、各種レ
クチンカラム〔Con Ａ−セフアロース（フアル
マシア社製）、RCA−Ｉ−ゲル（E.Y.ラボラトリ
ー社製）、WGA−セフアロース6MB（フアルマシ
ア社製）、UEA−Ｉ−ゲル（E.Y.ラボラトリー社
製）、LPA−ゲル（E.Y.ラボラトリー社製）〕に
吸着しない性状を有している。本発明の新規生理活性物質の物性は、以下に記
載する実験例１〜８の各方法によつて測定したも
のである。実験例１）分子量測定法Ａ）セフアクリルＳ−200（フアルマシア社製ス
ウエーデン）のカラム（1.5×100cm）を用い、
0.1M塩化ナトリウム／50mMリン酸緩衝液
（PH7.4）にてゲル過を行つた。分子量測定用
標準蛋白質（フアルマシア社製、リボヌクレア
ーゼＡ、キモトリプシノーゲンＡ、オブアルブ
ミン、アルドラーゼ）を用いて分子量検量線を
作成し、Ｌ−Ｍ細胞を用いた活性評価により分
子量の測定をした。本発明になる生理活性物質
は、オブアルブミンとキモトリプシノーゲンＡ
の中間に溶出し、分子量は40000±5000であつ
た。Ｂ） Segrestらの方法〔Method in
Enzymology 28−Ｂ巻54−63頁（1972年）〕に
従い、トリス／グリシン／SDS（PH8.3）で
SDS／ポリアクリルアミドゲルに10μｇの試料
を付与し、電気泳動を行つた。標準分子量キツ
ト（フアルマシア社製）を用いて分子量検量線
を作成し、Ｌ−Ｍ細胞での活性評価と、染色
（クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−250）
により分子量を決定した。本発明になる生理活
性物質は、17500±2000の位置に、単一染色バ
ンドと活性を示した。２）等電点測定法アトー株式会社製の等電点電気泳動装置（SJ
−1071EC型）を用い、フアルマライト（フアル
マシア社製、PH４〜6.5）とグリセロールを含む
５％ポリアクリルアミド平板ゲル（厚み１mm、長
さ10cm、巾10cm）を作成した。陽極側に0.04M、
DL−グルタミン酸、陰極側に0.2M、Ｌ−ヒスチ
ジンを使用して、700Vで50分間の前泳動を行つ
た。続いて試料50μｇを付与し、700Vで１時間、
500Vで16時間泳動を行つた。泳動終了後ゲルを
2.5mm巾で切出し、次いで各ゲル片を0.15M塩化
ナトリウムを含む0.02Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.2）0.2mlで抽出し、各抽出液についてＬ−Ｍ細
胞を用いた活性評価を行つた。本発明になる生理
活性物質の等電点は5.0±0.3であつた。３）Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、Ruff
〔Lymphokine Reports2巻E.Pick編集、
Academic Press 235頁（1980年）〕あるいは〔J.
Immunol.126巻 235頁（1981年）〕の方法に準
じ、本発明者らが改良したものであり、本発明に
なる生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチヤー・コレクシヨン，CCL1.2）を
殺す効果を測定するものである。すなわち、順次
培地で希釈した試料0.1mlと10⁵コ／mlの濃度のＬ
−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1mlを96穴の組織培養用
マイクロプレート（フロー・ラボラトリー社）に
加えた。培地は1v／ｖ％のウシ胎児血清を含む
イーグルのミニマム・エツセンシヤル培地（その
組成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他編
集、朝倉書店、1967年に記載されている）を用い
た。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空
気中、37℃で48時間培養した。培養終了後、グル
タルアルデヒド20μを加え細胞を固定した。固
定後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、0.05
％メチレンブルー溶液を0.1ml加え、生き残つた
細胞を染色した。余分なメチレンブルーを洗い流
し乾燥した後、残つたメチレンブルーを0.36M塩
酸溶液で抽出し、その665nmにおける吸光度をタ
イターテツク・マルチスキヤン（フロー・ラボラ
トリー社）で測定した。この吸光度は、生き残つ
た細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の50％を殺すた
めに必要な生理活性量を１単位／mlと定義し、試
料を加えない対照の吸光度の50％の値に相当する
試料の希釈率を、グラフあるいは計算によつて求
め、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単
位／mlで表記する）とした。一方、蛋白質量は、Branfordらの方法〔Anal.
Biochem.72巻248〜254頁（1976年）〕により、ク
ーマシー・ブリリアント・ブルーG250を用いる
色素結合法から算出した。本発明になる生理活性物質の比活性は、５×
10⁶〜１×10⁷単位／mg蛋白質であつた。４） Meth Ａ sarcoma担癌マウスを用いる活
性評価 BALB／ｃマウスの腹部皮内に２×10⁵コの
Meth Ａ sarcoma細胞を移植し、７日後移植し
た腫瘍の大きさが直径７〜８mmとなり、出血性壊
死がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウ
スを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した0.2
mlの試料を注射し、24時間後に次の判定基準に則
り壊死反応の判定を行つた。（−）：変化なし（＋）：かすかな出血性壊死（）：中程度の出血性壊死（移植癌表面の真中から50％以上にわたつて
壊死）（）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度に壊死し、周囲の癌
組織がわずかに残つた状態）また、試料投与後20日目に癌が完全に退縮した
かどうかを観察し完治率を求めた。以上の方法により測定した本生理活性物質の活
性を下表に示す。

【表】塩水）

Claims

【特許請求の範囲】１網内系賦活化作用を有する物質を１種または
２種以上、ウサギに投与し、次いでグラム陰性菌
由来のエンドトキシンを注射することによつて、
またはウサギ由来のマクロフアージを含む組織培
養系にグラム陰性菌由来のエンドトキシンを加え
ることによつて誘発される、アミノ末端より Ser−Ala−Ser−Arg−Ala−Leu−Ser−Asp
−Lys−Pro−Leu−Ala−His−Val−Val−Ala
−Asn−Pro−Gln−Val−Glu−Gly−Gln−Leu
−Gln−X₁−Leu…… （但し、式中X₁は１個のアミノ酸残基を示
す。）で表わされるアミノ酸配列構造を有するポ
リペプチドのサブユニツトからなる構造を有し、
かつ下記特性を有する蛋白質。ａ）分子量 40000±5000（ゲル濾過法） 17500±2000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳
動法）ｂ）等電点 5.0±0.3（等電点電気泳動法）ｃ）本文定義のＬ−Ｍ細胞を用いる評価におけ
る比活性が５×10⁶〜１×10⁷単位／mg蛋白質。ｄ） Meth Ａ sarcoma担癌F1マウスを用い
る生物評価系において癌を壊死させる性質