JPS5970620A - 均質なヒトインタ−ロイキン２及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイギン２　（Ｉ　Ｌ　−２）は、リン・ｗｇ
の反応性を調整することができる可溶性蛋白質であって
、従来−、マウス、ラット又はヒトのリンパ球Ｘ１１１
１胞を、たとえば植物性血球？ｉ？（県木（１）１１，
４）及びコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｌ）のような分裂促
進剤によって刺激することにより製造されている：たと
えばギリス（Ｇｉｔｌｉｓ　）ら〔Ｎａｔｕｒｅ２６８
＋１５４（１９７７）；Ｊ、　　Ｉｒｒｔｍｕｎｏｌ。

１２０．２０２７（１９７８）Ｂｚｂｊｄ、１２４゜１
９５４　（１９８０）　；　１ｂｉｄ、　　１２５　、
２５７０（１９８０）：１参照。

マウス、ラット及びヒトの正常なＴ−リン・９球から精
製しだＩＬ−２は、（１）胸腺、Ｙｌｌｌ胞有糸分裂誘
発の顕著な増進１（２）抗原特異性ヘル・ぐ−又はキラ
ー７゛λ、［１誹・Ｌ系り］］の長期試、＜：ｉ管内増
殖の助長：及び（３）無毛マウスｌｌ’ｊ！　Ｉｔ、°
す、１！Ｉ胞の培養物中のダ１ｌｌｌ　ｔｉｆ’Ｊ毒性
Ｉ゛リンパ球（ＣＴＬ）反応性及ｄ　フ６ラク（ｐｌａ
、ｑｕｅ　）形成性細胞応ｒ°の誘発、を包含する神々
のタイプの生物学的活性を４．Ｊ続することが認められ
ている。

それ故、１Ｌ−２のこれらの確認された生物学的活性は
、ＩＬ−２が免疫応考を高め且つ免疫欠損Ｔ細）ｊ［］
母集団（無毛マウス肝臓π１ｌｌｌｉｌ）を細胞及び体
液性免疫の正常な水準まで回復させるために有用である
ことを示しでいる。その上、これらの結果はＩＬ−２生
産及び応答が達人性免疫の臨床的な診断において不用と
思われる免疫学的機能の重要なノぐラメータであること
を示唆している。更にまだ、ヒトＩＬ−２が抗原船異性
ヒト、マウス及びラットキラーＴ細胞の試験管内増殖を
可能とするという事実は、研究試薬としてのし）　Ｉ　
Ｌ　−２のπΣ費性を強調するものである。

しかしながら、レクチン刺激したヒトの肝臓及び末梢血
液リン・９球ｎ）、１整培地からのヒトＩＬ−２の生産
は多くの著者によって報告されているけれども、（これ
らの生産源及び方法は低濃度のＩＬ−２を与え、きわめ
で僅かな一鼠のヒト’１Ｌ−２活性しか取得できないた
めに、ＩＬ−２を含有する大量の調整培地の分別を伴な
う／　Ｌ　、＋　２の精製を必要とする。その結果とし
て、生体内実験のため又は最終的な分子のキャラクタリ
ゼーションを有効に研究するだめに十分な址の’６に縮
したヒトＩＬ−２を入手することはできなかった。Ｇ１
１ｌｉｓ及びＷａｔｓｏｎ　ＣＪ、　Ｅｚｐ、　Ｍｅｄ
、　　１５２　、１７０９〜１９（１９８０）］は、場
合によってはたとえばフォルポル（ｐｈｏｒｂｏｌ　）
　ミリスチン酸アセテ−）　（Ｐ、ＡｉＡ　）のような
フオルポルエステルの存在における、たとえばｐＪＩＡ
のようなＴ細胞分裂促進剤による、たとえばＪｕｒｋａ
ｔ　−Ｆ　ＨＣＲＣ系列のような悪性腫瘍細胞系列の誘
発によるヒトＩＬ−２の生産を報告している。Ｊ　Ｌ−
２の部分的な精製は、硫酸アンモニウム沈殿／湾析、ケ
゛ル濾過り（ｆｆ’？トグラフイ（’　５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−１００）、イオン交換クロマトグラフィ＝（１
）ＥＡＥセルロース）：平床等電集束法及び分析的ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドケ゛ル電気泳動
（５Ｄ５−ＰＡＧＥ）を包含する方法によって行なわれ
だ。ＩＬ−２の生物学的活性の大部分は、約１４．００
０ドルトンの分子量を有する蛋白質帯（ケ゛ル上に認め
られる９〜１６の分隙帯の中の一つ）から電気泳動的に
溶離された。相当する開示については、Ｆｒａｎｋ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｉｍｒｎ、ｊｌ、ｎｏｌ。

１２７．２３６１（１９８１）、及びＷａｔｓｏｎｅｔ
　ａＬ、、　Ｌｙｒｎ、ｐｈ、ｏｋｉｎｅｓ　６，９５
（１９８２）をも参照すべきである。

Ｍｉｅｔｒ及びＧａ１ｌｏ　〔Ｊ、　　Ｉｒｎ、ｍｕｎ
ｏｌ、　　１２８　＋１１２２　（１９８２）　；　Ｌ
ｙｍ、ｐｈｏｋｉｎｅｓ　　６　。

１３７（１９８２）１は、反復的な陰イオン交換クロマ
トグラフィーとり゛ルｐ過手順後の最後０段階としての
プレパラテ・イブＳ　Ｉ）　Ｓヶ・ルー気泳動を用いる
”はとんど均質なｌ物質”を与えるための、正常なリン
パ球からのＩＬ−２の鞘逼・ユについて報告している。

彼らの製品は１．５１）Ｓ−ＰＡＧＥにおいて１３．０
００．グル濾過において２０〜２５．０００の分子量と
６．８の等電点を有し°Ｃいた。この物質は一７０℃に
おいてすらきわめて不安定であって、活性を持続するた
めにはウシの血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　）又はぼり
エチレングリコールの添加を必要とした。

５ｔａｃｌｌｅｒ　と０ｐｐｔｔｎｈ、ｅｉｍ［Ｌｙｒ
ｎｐｈｏｋｉｎｅｓ□、１１７（１９８２）］は末梢血
液単核細胞、扁桃腺及び牌、臓細胞から精製したＩＬ−
２について幸１長告しているが、これはカラムクロマト
グラフィー、り゛ル濾過及び電気集束後に電荷の不均一
性を示した。６．５，７．２及びＦＬ　２の２ノＩを有
する３荷′屯種が認めら４したが、この不均一性は恐ら
くはグリコジル化の４１４度の相異に基づくものと考え
られた。

最後に、Ｒｏｂｂ及び５ｔｎｉ　ｔ　ｌｒ、　［Ｎｏ　
ｌ　、　　Ｉｒｎ、ｎｎｂｎｏ　ｌ。

１８．１０８１〜９４　（１９８１）−Ｊはヒトの１”
−白血病イｌｉｔ胞系列ジャーノノット（、ＩＵＲＫＡ
Ｔ）からＴ　Ｃ（’、　＃’　（＝、　Ｉ　Ｌ　−２）
を単１ｊｌｌ：　シたが、これは電荷と太きさが均一で
あった。同じ結果はＲｏｂｂらによつ−（Ｊ、Ｅｘｐ、
ｂｌｅｄ、　　１８４．１４５５〜７４（１９８１）に
おいても報告されている。

本発明は、多重拡相高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ｌ）　Ｌ　Ｃ）処理を用いて均質に精製される誘発した
ヒトの悪性細胞から誘導したヒトＩＬ−２に関する。本
発明の均質なＩＬ−２製品を製造するために用いる手順
は、ａｌ製のＩＬ−２調製物を逆相メチル又はオクチル
結合シリカ１ｌＰＬＣカラム中に通じ、緩衝液中のｎ−
プロパツール傾ボ（展開液（ｇｒａｄｉｅｎｔ　）を用
いて告白質を溶出し且つプールした活性画分を逆相ジフ
ェニル結合シリカＨＰＬＣカラム中に通じることから成
る。使用する粗製の調製物が比較的低力価のものである
場合には、均質とするオ゛ｎ製を達成するために１回り
、上のＪ’１ＰＬ（Ｊ’段階を繰返す必要があるかも知
れない。

和製のＩＬ−２調製物は、たとえば、ヒトの白血病及び
リン・ぐ腫細胞のような悪性のヒトの腫瘍細胞１を、試
験管内で、種々の添加剤で補った血清含有培地中で培養
することによって容易に調製することができる。培養物
を、たとえげｐ　ＩＩ　ＡのようｉＴ細胞分裂促進剤に
よって刺激し、それによってＩＬ−２を含有する上溌液
を生ぜしめる。培養後一定時間、すなわち約２４時間の
のちに、上澄液を集めて更にγｔ′％縮した状態とする
ためにＩＬ−２を精製する。だどえばｐ　Ａｆ’　Ａの
ようなフォルポルエステル６：、ｍ独で又はたとえばＰ
　、１１　、ＡあるいはコンＡ（Ｃ’ｏｎＡ）のような
１゛細胞裂促進剤と組合わせて、誘発剤として使用する
ことにより、ＩＬ−２の生産を増進することもまだ望ま
しいことである。これ以」−の詳細についてはＧ１１ｌ
ｉｓｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ａｆｅｄ、　　
１５２　、　１７０９（１９８０）を参照するとよい。

粗製のヒト、Ｉ　Ｌ　−２の生産において用いることが
できる細１１ｉ４系列には各種の１“及びＢ細胞系列並
びに各種のＴＩＪン・す１１１細胞系列を包含される。

これらの細胞系列は、自然発生、ウィルス感染の何れか
によって、又は化学的発ガン物質によって生ぜしめる。

そのために好適な細胞系列は、Ｇ１１ｌｉｓらによって
Ｊｗｒｋａｒｔ　−Ｆ　ＩＩ　ＣＲＣ白血病ヒトＴ細胞
系列として同定されており、ｌ１３３ＨＪ−ＩＡＩと命
名したこの系列のサブ−クローン（ｓｌＬｂ−ｃｏｏη
、ｅ）を用いることがもつとも好ましい。本発明の方法
は末梢血液リンパ球から誘導されるＩＬ−２の精製に使
用することもできる。

上記の細胞系列と組合わせてｉｌｌ　製のヒトＩＬ−２
を製造するために用いられる培地は、たとえばＪ）ｖ、
　Ｌ　ｂ　ｅ　ｃ　ｃ　ａの修飾Ｅａｇｌｅ培地、　Ｒ
Ｐ　Ｍ　Ｉ培地及びＣ１１ｃｋの培地のような、市販の
培地から成るものとすることができる。甲独で又は組合
わせて培地に添加することのできる添加剤には、ペニシ
リン、ストレプトマイシン、り９ンタマイシン、新鮮な
Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＩ’：Ｓ緩衝剤、ＮαＨＣＯ３
、生の胎児の血清（ｐｃｓ）又は正常なヒトの血清が包
含される。細胞の初期細胞密度は、特にＪｕｒｋ、ａｔ
　−Ｆ　ＩＩ　ＣＩ？　Ｃ＋ｊｌｌｌ胞を用いる場合に
は、５Ｘ１０”細胞／１ｎ／〜ｌＸｌ０’細胞／　ｍｅ
　−。

もつとも好ましくは約ｌＸｌ０’細胞／ｄの範囲にすべ
きである。

培、１（信性＆、１、約３５〜３Ｂ’Ｃの範囲の温度、
７．０〜７．４の軸回のｐ？！及び空気中の約５乃至１
０％の二酸化炭素の、湿った雰囲気である。０．５〜２
０容搦４％の範囲、好１しくは１容、１％のｐ　１１　
Ａ分裂促進剤？Ａｊｊ度を用いるとよい。

悪性のヒト細胞を植物分裂促進剤によって刺激すること
によって生産されるＩＬ−２の州は時間によって異なる
。ＩＬ−２の最高水準はＰ　７７　Ａによる刺部後２４
時間に到達する。細胞培養物生産過程をモニターするた
め又ｒｊ梢製過程をモニターするためのＩＬ−２の分析
には、Ｔ細胞系列増殖を誘発するための試別の能力の評
価が包含される。

Ｔ細胞増殖はトリチウム化チミゾンの結合を測定するこ
とによって決定される。１単位の活性を、５０％の最高
チミノン結合を誘発するＴ細胞培養中に存在するμｌ数
と定義する。この分析手順にツイテノ具体的詳細はＧ１
１ｌｉｓ　　ｅｔ　ａｌ、、　　、１゜Ｉ惧）１ｔ１Ｌ
ｔｂｏｊ、１２０．２０２７（１９７Ｂ）中に記載され
ている。

本発明の／／　７）　Ｌ　Ｃ精製段階を遂行するだめの
適当な出発利料の調製ｔ」１、取り入れた誘発イ１；１
助りを遠心分離することによつ１誇々ＩしだＩＬ−２含
不上澄液を８５％飽第１号でσ片痛うν゛アンモニウム
添加によって沈殿させることを包含する。このような添
加は穏やかにｔ切拌しガから上澄液に乾燥した硫酸アン
モニウムを徐々に添加することによって行なわれる。沈
ｊ般のだめの硫酸アンモニウムの添加は長時間、たとえ
ば１２時間か（弓て行なう。８５％飽和に達したら、冷
時の穏やかな攪拌を一定時間継続する。沈殿した４ｉ白
質を遠心分子ａｉｔに二よってペレット状とし、このベ
レットを２回蒸留した無菌の水中に再び懸濁させる。

一別法の局面において、再懸濁した［４製１．Ｌ−２を
イオン交換クロマトグラフィーにかける。そのだめの適
当なカラムはＣＭＩノ１ｏｑｅｌ　Ａ’（（°１・１脂
（ＬＫ　１３−１”ｒｏｄｖ、ｋｔｅｒ、　ＩＪｒｏｍ
ｍｒｙ、、　　Ｓｗｅｔｌｅｎ　）である。カラノ・は
ＩＬ−２含有試旧を加える前に樹脂上の非特ゲｒ、性Ｈ
３合部位を封鎖するためにウシ胎児血清溜液で前処理す
ることが〃１１しい。カラムからの溶ｒｉｆｅは緩衝し
た！九傾斜展開液を用いて行なわれる１、そのために適
当な傾斜展開液は、ｐｔｉ５、５　＋７’）　１１　Ｅ
　ｐム°Ｓ中（７）　ｓ　ｏ　ｍＡｆ−ｏ、　ｓ　Ａｆ
　ＮａＣ，１である。ｎ、５Ａ・（ＮａＣ１−１１ＥＰ
ＥＳ、　　ｐｌ！５５による最終洗浄は、全ＩＬ−２活
性の溶Ｎｉｌを確実にするために用いることができる。

上記のイオン交換クロマトグラフィ一段階から集めた活
性画分は、本発明の方法の局面を成す１１　ｐ　Ｌ　Ｃ
処理のだめの好、適出発材料を提供するものである。別
の実施態様においては、硫酸アンモニウム処理から十分
に高い力価の−Ｆ澄液を取得することかできる場合に、
この月利を最初の１１　ｐ　ＬＣカラ人工程で直接に使
用することが可能である。

しかしながら、このような局面においては、生成物ＩＬ
−２における本質的な均質性を達成するために、１又は
２回のｉｌ　Ｐ　Ｌ　Ｃ処理を繰返すことが必要であろ
う。

本発明の方法において使用するｉｔ　ｐ　Ｌｃ処理は、
少なくとも約１５ＯＡの細孔径を有する逆相メチル、オ
クチル又はジフェニル結きシリカカラムを使用する。本
発明の実施において使用するために適スル逆相１１　Ｐ
　Ｌ　Ｃ’カラムは市販製品である。そのために特に好
適なものＶ」、１１７）＋、ａｔｍａｎ　５ｅｐａｒａ
−１ｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　Ｎ、　
Ｊ、、　ＵＳＡから市販しているＰｒｏｔｅｓｉｌ系列
のカラムである。

かくシテ、たとえば、ＩＰ’ｈ、ａ　ｔｍａｎ　ｐｒ　
ｏ　ｔ　ｅ　ｓ　ｉ　１３００　　Ｍｅｔｈｙｌは、８
ミクロンの平均粒度に分別しである３００Ａ細孔径シリ
カケ゛ルの表面に珪素−酸累一珪累結台によって共有結
合したトリメチルシリル基から成るカラムである。同様
に、ＷＪｒ、ａｔｒｎ、ａｎ　　Ｊ’ｒａｔｅ　８ｉ！
　　Ａｉ＝ｇ＝ｕｍ　　９　０ｃｔｙｌ　　　カラムは
、１５０Ａ細孔径シリカケ°ルに共有結合したオクチル
基を有しており、一方、ｒ（’ｈａｔｍａｎＰｒｏｔｅ
ｓｉｌ　１）ｉｐｈｅｎｙｌ　カラムは、　３００Ａシ
リカゲルの表面に共有結合したソフェニル基を有してい
る。

ＨｐＬＣカラムからの蛋白質の溶離はこの分野で公知の
方式で行なうことができる。本発明の方法の最初の１１
　ｐ　Ｌ　Ｃ処理において用いたメチル又はオクチルカ
ラムからの結合蛋白質の除去のだめに適する溶離手順は
、水と混和性の低級アルカノール、好ましくはｎ−プロ
／−ｅノールの次第に濃度の増大する傾斜展開液の使用
を包含する。そのだめの好適な傾斜展開液は、ｐＨ４，
０のピリソンー酢酸中の０〜ｅｏ５１６容量／容量傾斜
液である。

アルカノール傾斜展開液が２０〜６０％容旦／容量であ
ることを除けば、カニ段階で用いるソフェニルカラムに
関しても、類似の溶１ｉｉＰ条件を用いることができる
。溶１’ＪＡ　Ｌだ、゛匠白質は、との分野で公知の検
出系によって、たとえば、Ｋｅｎｎｙ　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｒｌｓ　ｈ’ｎｚｙｍｏ１．　７
８　、４３５（１９８１）に記載された自動化螢光検出
装置６を使用して具合良くモニターすることができる。

２段階として、又は低力価和製物を用いる場合には、第
−及び／又は第二段階の１回収−ヒの繰返しによってＩ
Ｉ　Ｉ）　Ｌ　ＣＩＡ理を遂行したのちに、単一の対称
的な生物活性ぎ−クとしての均質性にまで精製されたＩ
Ｌ−２を良好なＩＩＶ率で取得することができる。

均質なＩＬ−２を調製することができれば、この分子の
アミノ酸組成の決定が始めて可能となる。

一方、この情報はアミノ酸配列の決定に帰因するが、そ
れもまた、ヒトＩＬ−２遺伝子のクローニング及び臨床
試１馳のため並びに究極的にこの物質の床几な医療使用
のための犬Ｉｔの純粋な組換えＩＬ−２の最終的な生産
を助けるために重要である。その上、均質なＩ　１．−
２の人手が可能となれば、誘発ニー族の間にＩＬ−２と
共に生じることが知られている多くのリンホカイン種の
汚染の恐れなしに、その活性についての正確な生物学的
研究が可能となる。従来から高度に精製した又はほとん
ど均質なＩＬ−２調製品の製造がｔ［１許請求されてい
るけれども、Ｓ　ｚ）、５−　ｐＡａ　ｒ：：分析的電
気泳動において単一帯材料であることが示された材料を
メチル又はオクチルカラムによる本発明のＩＩ　ｐＬＣ
工程における出発材料として用いるときは、帯がＩＬ−
２の活性に関係することがない多数の蛋白質ビーフレ乙
分割される。このよりな（視察に基づいて、このような
調製物は１０％以下の純度であり、場合によっでは１％
未／１３ｊの純度であることすらあるものと思われる。

Ｊｘｔｒｋａ　ｔ　−Ｆ　７／　Ｃ／Ｌ’　Ｃ細１−１
ｉ４系〃１１からｓｓｘ：ｒシた部分的に精製しだ１．
ｒ、−２調製物による試験によれば、部分的に精製した
リンホカインは、新鮮な末梢血液リンパ球の増殖を生じ
させないことを示したが；予めレクチン又は特異性抗原
によって刺激した１゛−リン・ぞ球集団における増殖は
誘発する。

その上、部分的に精製したヒトＩＬ−２はヒト抗原髄室
性効果Ｔ−細ｎ（（のみならず、ネズミ抗原Ｉ特異性効
果Ｔ細胞の増殖をも紐持することか認められた。かくし
て、ツヤ−カット−Ｆ　Ｉｆ　ＣＲＣ’生産しトＩＬ−
２は、部分的に精製したものすら、各種の抗原及び効果
温特異化を伴なうクローナルヒト及びネズミ１−細胞の
増殖における使用に対して有用であることが認められ、
且つ実際に現在このような用途のための商業製品となっ
ている。本発明の均質ＩＩ、−２は、いうまでもなく、
同様な方法で使用することができる。

本発明の方法及び製品を以下の実施例によって更に説明
する。

実施例 ＩＬ−２生産 １１３３１１１−ＩＡＩ細胞（ＡＴＣＣＮへＣＲＬ−８
１６，１９８２年８月２６日寄託）、すなわち親Ｊｕｒ
ｋａ　ｔ　−Ｐ’　１１　ＣＩｒ　Ｃ’細胞系列のクロ
ーン、を１θ％のウシ胎児血清、５０　Ｕ／ｍｅのペニ
シリン、５０μ！Ｆ　／　ｍｌ！のストレプトマイシン
、５０μ２／ｍｌのケ９ンタマイシン及び３００μｆ　
／　ｍｌの新鮮なＬ−グルタミンで補った８２Ｍ１１６
４０培地中で、３７℃で空気中の５％ＣＯ２の湿らした
雰囲気中で増殖さぜた。飽和密度における細胞（８〜１
０ＸＩＯ’細胞／ｆｎｅ）を収穫し、遠心分＾ｉ６Ｌ且
つ血清は含有しないが５０　Ｕ　／　ｍｌのペニシリン
、５０１ｔｆ／ｍのストレプトマイシン、５０μｆＩ／
ｍｐのり“ンタマイシン及び３００μｆ　／　ｍｌσ）
新鮮なＬ−グルタミンを含有する新鮮な／＜　ｐ　、Ａ
、ｆ　Ｉ　１６４０培地中に再懸濁させた。＃ｌｌｌ　
１ｉｔ（を２Ｘ１０’イＩＩＩ胞／ｍｅの濃度に再懸濁
して、容ｌで１％のｐ　１１　Ａと１０　ｎ　ｆ’　／
　ｍｅフォルポルミリスチン酸アーヒテート（ｐＭＡ）
の添加によって刺激した。空気中の５％ＣＯ７の湿らし
た雰囲気中で３７°Ｃで２４時間培養したのち、誘発し
だ卸１胞を収穫し、遠心分離し且つ上澄液を粗出発材料
として保存した。

それぞれ９００ｍ／、９００ｒｎｆ’及び１０５０ｍ／
！、すなわち全体で２８５０＋＋＋Ｚの上澄液から成る
３イ（１胞培養実験（実験番号１〜３）から集めた上澄
液、Ｇ１１ｌｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｉｒｎｍ５
ｎｏ１．１２０　。

２０２７（１９７８）の分析によって測定するときに７
．１２５Ｘ１０＠単位の全活性を有する集めた材料を、
穏やかな攪拌と共に８５％飽和までの乾燥硫酸アンモニ
ウムの段階的な添加によ”って処理した。沈殿のだめの
硫酸アンモニウムの添加は１２時間にわた′つて行なっ
た。Ｓ液が８５兆飽和に達しだとき、穏やかな（”龜拌
を４゛Ｃで更に２４時間継続した。上澄液中に存在する
４斤白質を１ｏｏｏ。

×Ｇにおける３０分の遠心分ト、１ｔによって−ξレッ
ト状とした。上ｌ重液を傾瀉して捨てた。ペレットを２
回蒸留した無菌の水４０ａ／に再懸濁すると、かくして
得られた溶液は２０５０００Ｕ／渭ｅのＩＬ−２すなわ
ち全体で８．２Ｘ１０６単位を含有していた。

更に下記第１表に要約するような実験を行なった。

ＣＭ　　１３ｉｏｇｅｌ　　Ａカラムトのイメン交換ク
ロマトグラフィー Ｃ／ｌ／　／ｊ　ｉ　ｏ　ｇ　ｅ　ｌイをｐ　ＩＩ　０
５の０．０５　、Ｍ　ＮａＣ１−ＩＩ　ｉ！“ｌ）ｌパ
Ｓ中で平衡化した。このカラム（１００ｍ（）を流し入
れ、次いで１０２６の１′’　ＣＳを含有する　０．０
　０　　ＳＭ　　ＮａＣ’ｌ　　　−１１Ｌ　Ｐ　　Ｅ
　Ｓ　　Ｘ　　　ｐ　　ノＩ　５．５．１００ｒｎζを
カラムに加えた。これはヒトＩＬ−２活性を拘束するお
それのある非特異性結合部位を封鎖するために行なった
。次いでカラムに結合した血清、眉白質を５００　ｔｎ
ｆ’の０．５　Ｍ　Ｎｏ、ＣＬ　−／ノＥＰ　Ｂ　Ｓ、
　　ｐ　／／　ｓ、　５、の添加によって溶出した。次
いでカラムを１０００ｍ１．の０．０５　Ａｆ　ＮａＣ
ｌによって百平侮化した。

前記のような実験１〜５を包含する硫酸アンモニウム沈
殿の合わせた再懸濁物をＣＭカラムに加えた。次いでカ
ラムを２００２．ｌ＋うの０．０５＆Ａ’αＣ１−／／
　ＥＰ　ｌζ５％　７’　”　ｓ、　５　、で洗浄した
。次いで、５０ｔｎ、ＡＩからｏ、　５．ＡＩに至るＮ
ａＣ１−１１ＥＰＥＳ。

ｐａｌ　５．５．５００ｍｅ塩頌斜展開液をカラムに加
えた。傾斜液の添加後にカラムを２００ｒｅの０．５　
ＡｉＮａＣ’ｌ　−ＩＩ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、　′ｐＨ５
，５、で洗浄して全部の結合ＩＬ−２を実際にカラムか
ら確実に溶出した。それぞれ５ｍｅの両分を取得した。

３両分おきにＩＬ−２活性について分析した。ピーク活
性を決定して活性画分を集めた。このようにして９８３
０４０　Ｕ　／　ｍｅの活性すなわち３５．３９　Ｘ１
０６単位の全活性を有する３６ｍｅのプール液を得だ。

上記のようにしてプールした実験６及び７からの再懸濁
した硫酸アンモニウムによる第二のＣＭカラム実験は、
２１５ｍｅ（７）容１１．８００００Ｕ／ｍｅの活性及
び１７．２Ｘ１０’Ｊ１位の全活性を有するゾールした
画分を与えた。この実験の１３０＋＋＋／の部分を第一
の実験から由来する３６ｍ／と合わせて、調製時に分析
するとき全体で１０．４Ｘ１０’単位を有する１６６＋
＋、ｅの粗製ＩＬ−２を１４だ。

オクチルカラムによる逆相１１　ｐ　／、　（、’上記
のようにして取得したロットＡを、Ｑ、４Ｘ２５０＋ｎ
ｍ　　Ｐｒｏｔｅｓｉｌ　Ｍａｇｎｕｍ　９０ｃｔｙｌ
　カラＪＡ　（１１”ｈａｔｒｎ、ａｎ　５ｅｐａｒａ
ｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃ１１ｆ−ｔｏｎ、　Ｎ、　
　Ｊ、　　）上に直接に送入した。次いでこのカラムを
５０　ｇｒｅの０．９Ｍ酢酸７０．２３１ピリジン、ｐ
　Ｈ４，ＯＢ？！Ｉｉ［テ洗浄シタ。４．、ｊ７　白質
）溶ｐｊｉｌｉ　ハ０．９ＡＩ酢酸１０．２　ＡＩビリ
ソンｐ１１４緩衝剤中でｎ−プロ・Ｐノール０〜６０％
（容量／容量）の傾斜展開Ｗｔヲ用いて８時間行なった
。フルオレスカミンを用いる自動化螢光検出装置によっ
てカラム流出液中のηて白質をモニターした。生物学的
活性の回収は７．１３Ｘ１０’単位（約７０％）であっ
た。

ジフェニルカラムによる逆相ＩＩ　ｐ　Ｌ　Ｃオクチル
カラムから取得した活性の主ピークを含有する両分を集
め、（１，９ＡＩ酢酢酸１０２Ｍソリジンｐ　Ｊ？　４
．　Ｏｌを用いて１：１（容量／′容量）に希釈したの
ち、４．６　Ｘ　２５０　ｖｎｎ　ｉ＃’ｈ、ａｔｍａ
ｎ　ｐｒｏ−ｔｅｓｉｌ　Ｊ）ｉｐｌｔｅｎｙｌ　カラ
ム上に送入した。０．９７％４酢ｆ’ｓ／　０．２　Ｍ
ビリソン、ｐ　、ｌＪ　４．０　、緩衝剤中の２０〜６
０％（容量／容量）ｎ−プロパ７ノール傾斜展開液を用
いて６．５時間にわたってｊｉ白質を溶出した。この手
順はＩＬ−２活性と一致する対称的ピーク（Ｃ−力えた
。この段階における活性の回収率は６０先を超えた。こ
の材料の本質的な均質性を分析用５ＤＳ−ｐＡＧＥ電気
泳動及び２次元ｒル亀気泳動によって確認したが、これ
らは、それぞれ、即−帯と学−のスポットを与えた。こ
のようにし−Ｃ取得した均質なヒト１Ｌ−２は約１，４
×１０９Ｕ／ｍｙ及び５．６８のｐＪという比活性を有
していた。

この材料の試別をフルオレスカミン検出（Ｓｔｅｉｎｅ
ｔ　　　ａｌ、、　　　Ａｒｃｈ、、　　　Ｂｉｏｃｌ
ｒ、ｅｍ、　　　Ｉ）ｉｏｐＨｙｓ。

］、　５５　、２０３　〔１９７３〕参照）によって行
なうアミノ酸分朽にかけた。ポリペプチドを０．１％の
チオグリコール酸を含有する定常的に沸とうしているＪ
ｉＣ１中で１０４°Ｃにおいて２４及び４８時間加水分
解した。

包　　　ト　　　ト　　　−〇　　　机　　　ｄ　　　
リ　　Ｎ４　　４ミ　　　　鳴　　　−ｈ　　　　　ｋ
　　　　−４−祷　　　　頴　　　ｄ３　　ト　　噴　
　（膓　　Ｏ−〇　　−ミ　　ト　　−ト　　叫　　鳴
　　−３配列分１ｉ’）、ｊ２、下記の内部部分的ブミ
ノ醇配列を力えた： Ｊｌｅ−Ｌｅｕ−Δｓｎ、−に１ｙ−１１ｅ−Ａｓｎ−
Ａｓｎ−Ｔ１１ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｔｖ−ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ この配列しよ、クローンＣυＮＪ１から、Ｔ　ＣＬ　？
＋、　ｉ　ｇ　ｕ、　ｃ　１Ｌｉｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３０２．　３０５〜３１０（１９８３）によ
って提案された、推定的なヒト／　Ｌ　−２配列の４４
〜５７位と一致する。

ゼルシャフト １１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約１．４　Ｘ　１０’　Ｕ／１ｙの比活性、約５．
   ６８のｐｌ及び下記 Ａｓｐ　　　１２　　　　Ａｌａ　　　７　　　　Ｔｙ
   ｒ　　３’１’ｈ、ｒ　　　１０　　　　Ｃｙｓ　　４
   −５　　　Ｐｈｅ　　５Ｓｅｒ　　　　　　　Ｂ　　　
   　　　　　Ｖａｌ　　　　　　６　　　　　　　ノ１ｉ
   ８　　４Ｇｉｎ　　１６−１７　　　Ｍｅｔ　　　４　
   　　　Ｌｙｓ　　８Ｐｒｏ　　　８−９　　　　ｌｉｅ
   　　　７　　　　Ａｒｇ　　４Ｇｌｙ　　　　８　　　
   　Ｌｅｕ　　１６の複合アミノ酸組成を有することを特
   徴とする均質な蛋白質としてのヒトインターロイキン２
   ゜を含有する逆相高性能力う人中に通し、それによって
   該ヒトインターロイキン２を該カラムにより保持させ、
   該カラムをＩＩ　ｐ　Ｌ　Ｃ条件下に緩衝したｎ−プロ
   ノぐノール０〜６０％（容量／容′＆Ｉｔ）傾斜展開液
   によって溶離しそしてヒトインターロイキン２活性を示
   す画分を集め；そして Ｂ、　　ｊ二記段階Ａから集めた活性画分をシリカケ゛
   ルに共有結合したソフェニル基を含有する逆相高性能カ
   ラム中に通し、それによって該ヒトインターロイキン２
   を該カラムによって保持させ、該カラムをＩＩ　Ｐ　Ｌ
   　Ｃ条件下に緩衝したｎ−プロパツール２０〜６０％（
   容址／容１１：）傾斜展開液によって溶ｔｉｌｌそして
   ヒトインターロイキン２活性を示す両分を集めそして場
   合によっては段階Ａ及び／又ＦＪ、Ｂを繰返す、 組合わせから成ることを特徴とする均質な形態のヒトイ
   ンターロイキン２の製造方法。 ３、段階Ａにおける該カラムがオクチルカラムである特
   Ｒ′Ｙ請求の範囲第２項記載の方法。 ４　該オクチルカラム中の該シリカタ゛ルカ約１５ＯＡ
   の、細孔径を有し、目、つ核ジフェニルカラ人中の該シ
   リカケ゛ルが約３００，４の細孔径を有する特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ５、段階Ａ及びＢにおける該緩衝剤がｏ、　ｔａ　Ａｌ
   酢酸／　０．２　Ａｉビビリン、ｐＨ４，ｏである特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 ６、　該粗製のヒトインターロイキン２を誘発し培養し
   たヒトの感性細胞から誘導する特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ７、　活性剤として均質なヒトインターロイキン２を含
   有する製薬学的組成物。 ８、　治療剤としての均質なヒトインターロイキン２の
   使用。 ９、特許請求の範囲第２〜６項記載の方法又はその明白
   な均′、！Ｔ−ｈ法によって製造し、た均質ンンヒトイ
   ンターロイギン２゜