JPH0448427B2 - - Google Patents
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- JPH0448427B2 JPH0448427B2 JP63027397A JP2739788A JPH0448427B2 JP H0448427 B2 JPH0448427 B2 JP H0448427B2 JP 63027397 A JP63027397 A JP 63027397A JP 2739788 A JP2739788 A JP 2739788A JP H0448427 B2 JPH0448427 B2 JP H0448427B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteriocin
- food
- spoilage
- pediococcus
- preventing
- Prior art date
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
- A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
- A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
- A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
微生物の寄託
この発明を実施するのに使用されるのに適した
バクテリオシンは、特許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づ
いてアメリカ合衆国、イリノイ州、ペオリアの
Northern Regional Reserch Laboratoryに寄託
されているPediococcus acidilactici NRRL−Ｂ
−18050によつて生産される。 産業上の利用分野 本発明は、グラム陽性菌、特に乳酸桿菌
（lactobacillii）による食品の変敗を防止する方
法に関するものである。本発明は、食品（特に冷
蔵されるサラダドレツシング）中にPediococcus
acidilactici NRRL−Ｂ−18050（PAC1.0）によ
つて生産されるバクテリオシンを添加する変敗防
止方法に係る。 従来の技術 Pediococcus属はグラム陽性でホモ醗酵乳酸菌
の一群であり、これらは乳酸生産菌に対する阻害
物質であるバクテリオシンを産生することが知ら
れている。該微生物は腐生的に野菜類において見
出される（Mundt、J.O.、W.G.Beattie、and F.
R.Weiland、J.Bacteriol.98：938−942（1969））。
産業上においてPediococcus属の細菌は野菜類の
醗酵（Pederson、C.S.、Bacteriol.Rev.13：225
−232（1949））及び肉類の醗酵（Diebel、R.H.、
G.D.Wilson、and C.F.Niven、Jr.、Appl.
Microbiol.9：239−243（1961）及びSmite、J.L.、
and S.A.Palunbo、J.Food Prot.46：997−1006
（1983））において重要である。 先行技術は、Pediococcus属の細菌中にはプラ
スミドDNAが存在することを示している
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89；及びGonzalez、
C.F.、and B.S.Kunka、Appl.Environ.
Microbiol.51：105−109（1986）；Daeschel、M.
and T.R.Klaenhammer、Appl.Environ.
Macrobiol.50：1538−1541（1985）；Graham、D.
C.and L.L.Mckay、Appl.Environ.
Microbiol.50：532−534（1985））。先行技術はま
た、バクテリオシンとプラスミドDNAとの共生
がPediococcus pentosaceus株及びPediococcus
cerevisae株においてそれぞれ見出されることを
示している（Daeschel、M.and T.R.
Klaenhammer、Appl.Environ.Microbiol.50：
1538−1541（1985）；及びGraham、D.C.and L.L.
Mckay、Appl.Environ.Microbiol.50：532−534
（1985））。これらの従来技術は、食品（特にサラ
ダドレツシング及び該ドレツシングを含む食品）
中でのバクテリオシンの使用について何も示唆し
ていない。 目 的 従つて本発明の目的は、グラム陽性菌、特に乳
酸桿菌による食品の変敗を阻止するために食品中
におけるバクテリオシンを提供することである。
また、該バクテリオシンを使用する、経済的で効
果的な食品の変敗防止方法を提供することを目的
とする。 一般的な説明 本発明は、グラム陽性菌による食品の変敗を防
止する方法に係り、該方法はバクテリオシン生産
性のPediococcus属の細菌由来のバクテリオシン
を、食品の変敗を防止する有効量で食品へ添加す
ることからなる。 本発明は、グラム陽性菌で汚染される食品及び
バクテリオシン生産性Pediococcus属細菌由来バ
クテリオシンからなる組成物を提供する。組成物
はグラム陽性菌による変敗を防止するのに充分な
ように食品１ｇ当たり10〜100000AUのバクテリ
オシンを含み、Pediococcus属の生存細菌を含ま
ない。 本発明において好ましいバクテリオシンは、ア
メリカ合衆国、イリノイ州、ペオリアの
Northern Regional Reserch Laboratoryに寄託
されているPediococcus acidilactici NRRL−Ｂ
−18050（PAC 1.0とも称する）によつて生産され
る。Pediococcus acidilacticiは、食肉の醗酵に
使用されている市販の菌株である。この菌株はバ
クテリオシンをコードする約6.2Mda（メガダルト
ン）のプラスミドを含む。 バクテリオシンを得るための最も簡単な方法
は、細胞増殖後に増殖培地を乾燥して粉にするこ
とである。バクテリオシンはタンパク質性の物質
であり、沈澱法或いは他の公知方法（例えば逆浸
透法）により増殖培地から分離可能である。 バクテリオシンは、好ましくは食品１グラム当
たり約10〜100000AU（任意単位）の量で食品に
使用される。1AUのバクテリオシンは、寒天プ
レート上のグラム陽性菌の指示株（かつては
Pediococcus cerevisiae FBB−63として知られ
ていたPediococcus pentosaceus FBB−63）の
菌叢（lawn）について明確な成長阻止領域を生
じさせる、培養液上澄液の最大希釈液5μと定
義された。 本明細書において「食品」とは、サラダドレツ
シング、及び該ドレツシングを添加したコールス
ローサラダ、マカロニサラダ、ポテトサラダ及び
他のベジタブルミツクスを含む。乳酸桿菌によつ
て変敗を受ける何れの食品も含む。このような食
品は通常２℃〜18℃で冷蔵される。「変敗」とは、 (1) 好ましい器官感覚受容性の減少（過剰の乳
酸、酢酸、ジアセチル等の不所望の異臭を発生
する化合物からなり得る）； (2) ガス（CO2）の発生； (3) タンパク分解；及び (4) 粘液化 を意味する。変敗により食品の外観及びにおいが
悪くなる。 本発明の詳細 以下の説明と実施例１は、好ましいバクテリオ
シンの製造及び試験、さらにサラダドレツシング
中のバクテリオシンの使用を示す。 菌株及び培地：菌株を第１表に挙げる。BM培地
を使用し、Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、
Appl.Environ.Microbiol.46：81−89（1983）の
ようにして炭水化物醗酵を決定した。
バクテリオシンは、特許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づ
いてアメリカ合衆国、イリノイ州、ペオリアの
Northern Regional Reserch Laboratoryに寄託
されているPediococcus acidilactici NRRL−Ｂ
−18050によつて生産される。 産業上の利用分野 本発明は、グラム陽性菌、特に乳酸桿菌
（lactobacillii）による食品の変敗を防止する方
法に関するものである。本発明は、食品（特に冷
蔵されるサラダドレツシング）中にPediococcus
acidilactici NRRL−Ｂ−18050（PAC1.0）によ
つて生産されるバクテリオシンを添加する変敗防
止方法に係る。 従来の技術 Pediococcus属はグラム陽性でホモ醗酵乳酸菌
の一群であり、これらは乳酸生産菌に対する阻害
物質であるバクテリオシンを産生することが知ら
れている。該微生物は腐生的に野菜類において見
出される（Mundt、J.O.、W.G.Beattie、and F.
R.Weiland、J.Bacteriol.98：938−942（1969））。
産業上においてPediococcus属の細菌は野菜類の
醗酵（Pederson、C.S.、Bacteriol.Rev.13：225
−232（1949））及び肉類の醗酵（Diebel、R.H.、
G.D.Wilson、and C.F.Niven、Jr.、Appl.
Microbiol.9：239−243（1961）及びSmite、J.L.、
and S.A.Palunbo、J.Food Prot.46：997−1006
（1983））において重要である。 先行技術は、Pediococcus属の細菌中にはプラ
スミドDNAが存在することを示している
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89；及びGonzalez、
C.F.、and B.S.Kunka、Appl.Environ.
Microbiol.51：105−109（1986）；Daeschel、M.
and T.R.Klaenhammer、Appl.Environ.
Macrobiol.50：1538−1541（1985）；Graham、D.
C.and L.L.Mckay、Appl.Environ.
Microbiol.50：532−534（1985））。先行技術はま
た、バクテリオシンとプラスミドDNAとの共生
がPediococcus pentosaceus株及びPediococcus
cerevisae株においてそれぞれ見出されることを
示している（Daeschel、M.and T.R.
Klaenhammer、Appl.Environ.Microbiol.50：
1538−1541（1985）；及びGraham、D.C.and L.L.
Mckay、Appl.Environ.Microbiol.50：532−534
（1985））。これらの従来技術は、食品（特にサラ
ダドレツシング及び該ドレツシングを含む食品）
中でのバクテリオシンの使用について何も示唆し
ていない。 目 的 従つて本発明の目的は、グラム陽性菌、特に乳
酸桿菌による食品の変敗を阻止するために食品中
におけるバクテリオシンを提供することである。
また、該バクテリオシンを使用する、経済的で効
果的な食品の変敗防止方法を提供することを目的
とする。 一般的な説明 本発明は、グラム陽性菌による食品の変敗を防
止する方法に係り、該方法はバクテリオシン生産
性のPediococcus属の細菌由来のバクテリオシン
を、食品の変敗を防止する有効量で食品へ添加す
ることからなる。 本発明は、グラム陽性菌で汚染される食品及び
バクテリオシン生産性Pediococcus属細菌由来バ
クテリオシンからなる組成物を提供する。組成物
はグラム陽性菌による変敗を防止するのに充分な
ように食品１ｇ当たり10〜100000AUのバクテリ
オシンを含み、Pediococcus属の生存細菌を含ま
ない。 本発明において好ましいバクテリオシンは、ア
メリカ合衆国、イリノイ州、ペオリアの
Northern Regional Reserch Laboratoryに寄託
されているPediococcus acidilactici NRRL−Ｂ
−18050（PAC 1.0とも称する）によつて生産され
る。Pediococcus acidilacticiは、食肉の醗酵に
使用されている市販の菌株である。この菌株はバ
クテリオシンをコードする約6.2Mda（メガダルト
ン）のプラスミドを含む。 バクテリオシンを得るための最も簡単な方法
は、細胞増殖後に増殖培地を乾燥して粉にするこ
とである。バクテリオシンはタンパク質性の物質
であり、沈澱法或いは他の公知方法（例えば逆浸
透法）により増殖培地から分離可能である。 バクテリオシンは、好ましくは食品１グラム当
たり約10〜100000AU（任意単位）の量で食品に
使用される。1AUのバクテリオシンは、寒天プ
レート上のグラム陽性菌の指示株（かつては
Pediococcus cerevisiae FBB−63として知られ
ていたPediococcus pentosaceus FBB−63）の
菌叢（lawn）について明確な成長阻止領域を生
じさせる、培養液上澄液の最大希釈液5μと定
義された。 本明細書において「食品」とは、サラダドレツ
シング、及び該ドレツシングを添加したコールス
ローサラダ、マカロニサラダ、ポテトサラダ及び
他のベジタブルミツクスを含む。乳酸桿菌によつ
て変敗を受ける何れの食品も含む。このような食
品は通常２℃〜18℃で冷蔵される。「変敗」とは、 (1) 好ましい器官感覚受容性の減少（過剰の乳
酸、酢酸、ジアセチル等の不所望の異臭を発生
する化合物からなり得る）； (2) ガス（CO2）の発生； (3) タンパク分解；及び (4) 粘液化 を意味する。変敗により食品の外観及びにおいが
悪くなる。 本発明の詳細 以下の説明と実施例１は、好ましいバクテリオ
シンの製造及び試験、さらにサラダドレツシング
中のバクテリオシンの使用を示す。 菌株及び培地：菌株を第１表に挙げる。BM培地
を使用し、Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、
Appl.Environ.Microbiol.46：81−89（1983）の
ようにして炭水化物醗酵を決定した。
【表】
プラスミドの分離と精製：既に記載のようにして
プラスミドDNAを分離し、DNA試料をアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。対照プラスミド
DNAをすでに記載のようにして製造した
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89（1983））。 プラスミドキユアリング（除去）試験：プラスミ
ドのコードされた特性の固定（stability）及び
昇温下での成長によるプラスミドDNAの除去
を、すでに記載のようにして行つた
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89（1983））。キユ
アリング試験で使用すべきPAC1.0をBM−シ
ヨ糖に線状に接種した。次いで、単一の酸産生
コロニーをキユアリング試験を使用するために
移した。バクテリオシン生産性表現型（Bac+）
のキユアリングのために、分離コロニーを線状
に接種したプレートから単一コロニーを取り、
二重プレート上に線状に接種した。アツセイプ
レートに線状に接種した分離コロニーを、以下
の方法を使用してBac+表現型をスクリーニン
グした。二重プレートをキユアリング試験の接
種材料源として使用した。キユアリングを45、
47及び50℃で18時間、細胞を成長させることに
より行つた。 バクテリオシンの検定：バクテリオシンの産生を
MRS寒天（Difco Detroit、Michigan）上に
細胞をスポツトし、35℃で18時間インキユベー
トすることにより検定した。アツセイプレート
をクロロホルム蒸気に30分間さらして細胞を殺
し、指示細胞を接種してあるソフトアガー
（0.75％）を上に重ねた。プレートを32℃で18
時間インキユベートした。明確な阻止領域を生
じる分離物をバクテリオシン生産性とみなし
た。 バクテリオシンの部分精製：４のMRSブロス
（Difco）に同じ培地で培養したPAC1.0株の８
時間培養物１％（600nｍにおける光学密度
0.60）を接種し、35℃で18時間、静置インキユ
ベートした。18時間後に培養物のPHを測定し、
PH6.0に調整した。遠心分離（16300ｇで15分、
５℃）により細胞を除去した。上澄液を0.45μ
ｍフイルター（Millipore Corp.、Bedford、
Mass.）でろ過した。ろ過された上澄液の、２
倍希釈法による一連の希釈物5μを、指示細
胞をまいたソフトアガーを上に重ねたMRSプ
レートの上にスポツトすることにより、バクテ
リオシン活性について検定した。アツセイプレ
ートを32℃でインキユベートした。指示菌株は
Pediococcus cerevisiae FBB63であつた
（Graham、D.C.and L.L.Mckay、Appl.
Environ.Microbiol.50：532−534（1985））が、
これはGravieが記載しているように炭水化物
利用パターンと温度成長特性からPediococcus
pentosaceusと再同定された（Garvie、E.、
Inh.J.Syst.Bacteriol.24：301−306（1974））。こ
の指示菌株もバクテリオシンの生産菌である
が、比較的有効でない。バクテリオシンの１任
意単位（AU）は前述した通り、指示菌株の菌
叢に明確な成長阻止領域をなお生じさせる培養
物上澄液の最大希釈液の5μと定義された。
抽出物タイター（titer）は、阻害を示す最大
希釈の逆数として表した。 硫酸アンモニウム（Sigma Chemical Co.、
St.Louis、Mo.）をろ過した上澄液に対し５℃
で60％ｗ／ｖ飽和濃度まて加えた。穏やかに18
時間撹拌した後、沈澱を遠心分離で回収した
（16、300ｇで20分、５℃）。沈澱物を0.05M
Tris−マレエート緩衝液（Sigma）PH6.5に戻
し、検定した。沈澱物を戻した緩衝液を遠心分
離にかけ、粒状物を除去した。上澄液を検定
し、Spectrapor no.1メンブラン・チユービン
グ（Spectrum Medical Industries、Inc.、
Los Angeles、Calif.）を用い、0.05M Tris−
マレエート緩衝液に対し５℃で透析した。透析
した物質について活性回復をみるために活性を
検定した、部分精製したバクテリオシンを以後
の試験に用い、これをバクテリオシンPA−１
と命名した。 熱処理及び酵素の効果：部分精製したバクテリオ
シンPA−１の試料（６、400AU／ml）につい
て、熱安定性と酵素の効果を評価した。バクテ
リオシンを各酵素と共に60分間、500μｇ／ml
の最終濃度でインキユベートした。α−キモト
リプシン及びトリプシンの存在下でのインキユ
ーベシヨンは25℃で行い、その他の全ての酵素
−バクテリオシン混合物は37℃でインキユベー
トした。酵素の不活化は３分の煮沸によつて達
成された。 バクテリオシンの温度安定性は、バクテリオ
シン溶液を60分間で80℃まで、３分間及び10分
間で100℃まで、そして15分間で121℃まで、加
熱することによつて調べた。各処理後にバクテ
リオシン試料についてバクテリオシンのタイタ
ーを検定した。 酵素：全ての酵素は、前述のSigma Chemical
Co.から入手した。α−キモトリプシン（タイ
プ、47U／mg）及びリパーゼ（タイプ、
8.6U／mg）は0.01M CaCl2を含む0.05M Tris
−ハイドロクロライド緩衝液（PH8.0）中に溶
解し、プロテアーゼ（タイプ、1U／mg）、リ
ゾチーム（グレード、41、400U／mg）、パパ
イン（タイプ、109U／mg）及びトリプシン
（タイプ、15000U／mg）は0.05M Tris−ハ
イドロクロライド緩衝液（PH8.0）中に溶解し、
ペプシン（3200U／mg）は0.2Mクエン酸緩衝
液（PH6.0）中に溶解し、ホリスホリパーゼＣ
（タイプ、10U／mg）は0.01M CaCl2を含む
0.05M Tris−ハイドロクロライド緩衝液（PH
7.10）中に溶解した。 活性のPH安定性：部分精製PA−１の１mlを種々
のPHの緩衝液に対し透析した。このバクテリオ
シン溶液（6400AU／ml）を18時間、0.05Mグ
リシン−ハイドロクロライド緩衝液（PH2.0）、
0.05M クエン酸緩衝液（PH３〜６）、0.05M
Tris−ハイドロクロライド緩衝液（PH７〜
９）、及び0.05M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液
（PH10〜11）に対し、緩衝液を２回交換して透
析した。透析後に透析管（チユービング）の内
容物について活性を検定した。 吸収試験：感受性及び耐性の細胞に対するバクテ
リオシンPA−１の吸収について、Barefoot及
びKlaenhammerが述べている方法に準じた方
法で試験した（Barefoot、S.F.、and T.R.
Klaenhammer、Appl.Environ.Microbiol.45：
1808−1815（1983））。MRSブロス培地（Difco）
中に一晩置いた培養物からの細胞を25mlの新鮮
なブロス培地で継代培養し、108CFU／mlの濃
度まで増殖させた。細胞を遠心分離法で採取
し、0.05M Tris−マレエート緩衝液（PH6.5）
で２回洗浄し、バクテリオシンを含む同じ緩衝
液の0.5mlに200AU／mlで再懸濁させた。混合
物を氷上で１時間、インキユベートした。遠心
分離、次いで0.22ミクロポアフイルター
（Millipore Corp.）を通すろ過によつて細胞を
除去した。細胞を含まないろ液のタイターを測
定した。コントロールとしては細胞なしでのバ
クテリオシンPA−１をインキユベートしたも
の及びバクテリオシンPA−１を加えない細胞
を用いた。 プラスミド関連表現型：第１図はCsCl−臭化エ
チジウム−精製プラスミドDNA（Pediococcus
acidilactici PAC1.0及びその誘導株由来）に
ついてのアガロースゲル電気泳動試験の結果を
示している。DNAの電気泳動は0.7％アガロー
ス、100Vで２時間行つた。(A)Escherichia coli
V517（図上で上から下にかけてのバンド）
35.8、4.8、3.7、3.4、2.6、2.0、1.8及び1.4Mda
の共有結合で（covalently）閉じた環状DNA。
(B)PAC1.0 Suc+、Bac+。(C)PAC1.14 Suc+、
Bac-。(D)PAC1.17 Suc-、Bac+。Pediococcus
acidilactici由来のプラスミドDNAの分子量
は、第１表に示されている。標準的なプラスミ
ドDNAの分子量を示してある。 Pediococcus acidilactici PAC1.0は以前に
それぞれpSRQ10及びpSRQ11と名付けられた
23Mda及び6.2Mdaの２つのプラスミドを含む
と報告されている（Gonzalez、C.F.、and B.
S.Kunka、Appl.Environ.Microbiol.46：81−
89（1983））（第１図のＢ列）。菌株PAC1.0はシ
ヨ糖醗酵（Suc+）表現型を示し、バクテリオ
シンを生産する。Suc+表現型の安定性に対す
る昇温下での成長の影響を、PAC1.0を45、47
及び50℃でインキユベートすることによつて調
べた。各々の処理から得られた個別的なコロニ
ーにつき、Suc+表現型を定量した。シヨ糖非
醗酵型（Sac-）の分離体が45、47及び50℃で
インキユベートしたものからそれぞれ、1.1±
0.1、1.4±0.1及び4.7±0.02％の頻度で検出され
た。各処理から得られた代表的なSuc+及び
Suc-分離体についてプラスミド含有量を調べ
た。Suc+のバクテリオシン生産性のもの
（Bac+）は23Mda及び6.2Mdaの両者のプラス
ミドが存在することを示した（第１図のＢ列）。
Suc-、Bac+の表現型を示す分離物は、23Mda
のプラスミドの不在を示した。代表的なSuc-、
Ba+株はPAC1.17と命名された（第１図のＤ
列）。 残留するプラスミドがBac+の表現型をコー
ドするかどうかについて確認するために、株
PAC1.17を45℃で培養した。PAC1.17のバクテ
リオシン非生産性（Bac-）分離体は3.7％の頻
度で得られた。PAC1.17の代表的なBac-株は
PAC1.19と命名された。さらにBac-表現型の
ものがプラスミドpSRQ11と共生しうるかどう
かについて確かめるために、株PAC1.0を45、
47及び50℃で培養した。PAC1.0のSuc+、Bac-
の分離体がそれぞれ2.4、2.1及び2.7％の頻度で
得られた。代表的なSuc+、Bac-の単離物の抽
出標本（Survey）溶解はプラスミドpSRQ10
（23Mda）の存在を、プラスミドpSRQ11の不
在を示した（第１図のＣ列）。代表的なSuc+、
Bac-分離体はPAC1.14と命名された。 PA−１の阻止スペクトル：Bac+株として
PAC1.0を、そしてコントロールBac-株として
PAC1.14を有するプレートアツセイ系をバクテ
リオシン活性のスペクトルを調べるために用い
た。PAC1.14は、乳酸のような代謝副産物から
指示株に対する阻止を検出するために含ませた
ものである。株PAC1.0は、Pediococcus
acidilactici、Pediococcus pentosacens、
Lactobacillus plantarum、Lactobacillus
casei、Leuconostoc dextranicumに対して活
性を示した。Streptococcus lactis、その亜種
diacetylactis、Streptococcus cremoris、或い
はStreptococcus thermophilusに対しては、
非活性であることが観察された。Bac-株であ
るPAC1.14はPA−１に対し感受性を示さなか
つた。 Staphylococcus aureus株は親及びキユアーし
た株に対し等しい感受性を示し、阻止がおそら
く乳酸の阻止効果に基づくものであることを示
した。部分精製したPA−１（32000AU／ml）
を用いてMicrococcus varians、Micrococcus
sondonensis、Staphylococcus xylosus、
Staphylococcus carnosus、Lactobacillus
acidophilus、Lactobacillus lactis及び
Lactobacillus bulgaricusについてバクテリオ
シンに対する感受性を試験した。これらの菌株
の何れも、PA−１に対し感受性を示さなかつ
た。 酵素、熱処理及びPHの効果：部分精製したバクテ
リオシンを種々の酵素、熱及びPHにさらして感
受性を調べた。PA−１はプロテアーゼ、パパ
イン及びα−キモトリプシンに対して感受性で
あつた。バクテリオシンの活性はリパーゼ、ホ
スホリパーゼＣ、リゾチーム、DNアーゼ及び
RNアーゼによつても、また80及び100℃への
加熱によつても影響されなかつた。121℃にさ
らすと活性が一部破壊された（第３表）。バク
テリオシンの活性はPH４〜７で最も安定であ
り、PH２、３、９及び10では活性がいくらか損
なわれることを見出した。PH11では活性が殆ど
失われた。 実施例 １ 以上に述べる実施例１はサラダドレツシング中
でのバクテリオシンPA−１の使用に係る。
プラスミドDNAを分離し、DNA試料をアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。対照プラスミド
DNAをすでに記載のようにして製造した
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89（1983））。 プラスミドキユアリング（除去）試験：プラスミ
ドのコードされた特性の固定（stability）及び
昇温下での成長によるプラスミドDNAの除去
を、すでに記載のようにして行つた
（Gonzalez、C.F.、and B.S.Kunka、Appl.
Environ.Microbiol.46：81−89（1983））。キユ
アリング試験で使用すべきPAC1.0をBM−シ
ヨ糖に線状に接種した。次いで、単一の酸産生
コロニーをキユアリング試験を使用するために
移した。バクテリオシン生産性表現型（Bac+）
のキユアリングのために、分離コロニーを線状
に接種したプレートから単一コロニーを取り、
二重プレート上に線状に接種した。アツセイプ
レートに線状に接種した分離コロニーを、以下
の方法を使用してBac+表現型をスクリーニン
グした。二重プレートをキユアリング試験の接
種材料源として使用した。キユアリングを45、
47及び50℃で18時間、細胞を成長させることに
より行つた。 バクテリオシンの検定：バクテリオシンの産生を
MRS寒天（Difco Detroit、Michigan）上に
細胞をスポツトし、35℃で18時間インキユベー
トすることにより検定した。アツセイプレート
をクロロホルム蒸気に30分間さらして細胞を殺
し、指示細胞を接種してあるソフトアガー
（0.75％）を上に重ねた。プレートを32℃で18
時間インキユベートした。明確な阻止領域を生
じる分離物をバクテリオシン生産性とみなし
た。 バクテリオシンの部分精製：４のMRSブロス
（Difco）に同じ培地で培養したPAC1.0株の８
時間培養物１％（600nｍにおける光学密度
0.60）を接種し、35℃で18時間、静置インキユ
ベートした。18時間後に培養物のPHを測定し、
PH6.0に調整した。遠心分離（16300ｇで15分、
５℃）により細胞を除去した。上澄液を0.45μ
ｍフイルター（Millipore Corp.、Bedford、
Mass.）でろ過した。ろ過された上澄液の、２
倍希釈法による一連の希釈物5μを、指示細
胞をまいたソフトアガーを上に重ねたMRSプ
レートの上にスポツトすることにより、バクテ
リオシン活性について検定した。アツセイプレ
ートを32℃でインキユベートした。指示菌株は
Pediococcus cerevisiae FBB63であつた
（Graham、D.C.and L.L.Mckay、Appl.
Environ.Microbiol.50：532−534（1985））が、
これはGravieが記載しているように炭水化物
利用パターンと温度成長特性からPediococcus
pentosaceusと再同定された（Garvie、E.、
Inh.J.Syst.Bacteriol.24：301−306（1974））。こ
の指示菌株もバクテリオシンの生産菌である
が、比較的有効でない。バクテリオシンの１任
意単位（AU）は前述した通り、指示菌株の菌
叢に明確な成長阻止領域をなお生じさせる培養
物上澄液の最大希釈液の5μと定義された。
抽出物タイター（titer）は、阻害を示す最大
希釈の逆数として表した。 硫酸アンモニウム（Sigma Chemical Co.、
St.Louis、Mo.）をろ過した上澄液に対し５℃
で60％ｗ／ｖ飽和濃度まて加えた。穏やかに18
時間撹拌した後、沈澱を遠心分離で回収した
（16、300ｇで20分、５℃）。沈澱物を0.05M
Tris−マレエート緩衝液（Sigma）PH6.5に戻
し、検定した。沈澱物を戻した緩衝液を遠心分
離にかけ、粒状物を除去した。上澄液を検定
し、Spectrapor no.1メンブラン・チユービン
グ（Spectrum Medical Industries、Inc.、
Los Angeles、Calif.）を用い、0.05M Tris−
マレエート緩衝液に対し５℃で透析した。透析
した物質について活性回復をみるために活性を
検定した、部分精製したバクテリオシンを以後
の試験に用い、これをバクテリオシンPA−１
と命名した。 熱処理及び酵素の効果：部分精製したバクテリオ
シンPA−１の試料（６、400AU／ml）につい
て、熱安定性と酵素の効果を評価した。バクテ
リオシンを各酵素と共に60分間、500μｇ／ml
の最終濃度でインキユベートした。α−キモト
リプシン及びトリプシンの存在下でのインキユ
ーベシヨンは25℃で行い、その他の全ての酵素
−バクテリオシン混合物は37℃でインキユベー
トした。酵素の不活化は３分の煮沸によつて達
成された。 バクテリオシンの温度安定性は、バクテリオ
シン溶液を60分間で80℃まで、３分間及び10分
間で100℃まで、そして15分間で121℃まで、加
熱することによつて調べた。各処理後にバクテ
リオシン試料についてバクテリオシンのタイタ
ーを検定した。 酵素：全ての酵素は、前述のSigma Chemical
Co.から入手した。α−キモトリプシン（タイ
プ、47U／mg）及びリパーゼ（タイプ、
8.6U／mg）は0.01M CaCl2を含む0.05M Tris
−ハイドロクロライド緩衝液（PH8.0）中に溶
解し、プロテアーゼ（タイプ、1U／mg）、リ
ゾチーム（グレード、41、400U／mg）、パパ
イン（タイプ、109U／mg）及びトリプシン
（タイプ、15000U／mg）は0.05M Tris−ハ
イドロクロライド緩衝液（PH8.0）中に溶解し、
ペプシン（3200U／mg）は0.2Mクエン酸緩衝
液（PH6.0）中に溶解し、ホリスホリパーゼＣ
（タイプ、10U／mg）は0.01M CaCl2を含む
0.05M Tris−ハイドロクロライド緩衝液（PH
7.10）中に溶解した。 活性のPH安定性：部分精製PA−１の１mlを種々
のPHの緩衝液に対し透析した。このバクテリオ
シン溶液（6400AU／ml）を18時間、0.05Mグ
リシン−ハイドロクロライド緩衝液（PH2.0）、
0.05M クエン酸緩衝液（PH３〜６）、0.05M
Tris−ハイドロクロライド緩衝液（PH７〜
９）、及び0.05M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液
（PH10〜11）に対し、緩衝液を２回交換して透
析した。透析後に透析管（チユービング）の内
容物について活性を検定した。 吸収試験：感受性及び耐性の細胞に対するバクテ
リオシンPA−１の吸収について、Barefoot及
びKlaenhammerが述べている方法に準じた方
法で試験した（Barefoot、S.F.、and T.R.
Klaenhammer、Appl.Environ.Microbiol.45：
1808−1815（1983））。MRSブロス培地（Difco）
中に一晩置いた培養物からの細胞を25mlの新鮮
なブロス培地で継代培養し、108CFU／mlの濃
度まで増殖させた。細胞を遠心分離法で採取
し、0.05M Tris−マレエート緩衝液（PH6.5）
で２回洗浄し、バクテリオシンを含む同じ緩衝
液の0.5mlに200AU／mlで再懸濁させた。混合
物を氷上で１時間、インキユベートした。遠心
分離、次いで0.22ミクロポアフイルター
（Millipore Corp.）を通すろ過によつて細胞を
除去した。細胞を含まないろ液のタイターを測
定した。コントロールとしては細胞なしでのバ
クテリオシンPA−１をインキユベートしたも
の及びバクテリオシンPA−１を加えない細胞
を用いた。 プラスミド関連表現型：第１図はCsCl−臭化エ
チジウム−精製プラスミドDNA（Pediococcus
acidilactici PAC1.0及びその誘導株由来）に
ついてのアガロースゲル電気泳動試験の結果を
示している。DNAの電気泳動は0.7％アガロー
ス、100Vで２時間行つた。(A)Escherichia coli
V517（図上で上から下にかけてのバンド）
35.8、4.8、3.7、3.4、2.6、2.0、1.8及び1.4Mda
の共有結合で（covalently）閉じた環状DNA。
(B)PAC1.0 Suc+、Bac+。(C)PAC1.14 Suc+、
Bac-。(D)PAC1.17 Suc-、Bac+。Pediococcus
acidilactici由来のプラスミドDNAの分子量
は、第１表に示されている。標準的なプラスミ
ドDNAの分子量を示してある。 Pediococcus acidilactici PAC1.0は以前に
それぞれpSRQ10及びpSRQ11と名付けられた
23Mda及び6.2Mdaの２つのプラスミドを含む
と報告されている（Gonzalez、C.F.、and B.
S.Kunka、Appl.Environ.Microbiol.46：81−
89（1983））（第１図のＢ列）。菌株PAC1.0はシ
ヨ糖醗酵（Suc+）表現型を示し、バクテリオ
シンを生産する。Suc+表現型の安定性に対す
る昇温下での成長の影響を、PAC1.0を45、47
及び50℃でインキユベートすることによつて調
べた。各々の処理から得られた個別的なコロニ
ーにつき、Suc+表現型を定量した。シヨ糖非
醗酵型（Sac-）の分離体が45、47及び50℃で
インキユベートしたものからそれぞれ、1.1±
0.1、1.4±0.1及び4.7±0.02％の頻度で検出され
た。各処理から得られた代表的なSuc+及び
Suc-分離体についてプラスミド含有量を調べ
た。Suc+のバクテリオシン生産性のもの
（Bac+）は23Mda及び6.2Mdaの両者のプラス
ミドが存在することを示した（第１図のＢ列）。
Suc-、Bac+の表現型を示す分離物は、23Mda
のプラスミドの不在を示した。代表的なSuc-、
Ba+株はPAC1.17と命名された（第１図のＤ
列）。 残留するプラスミドがBac+の表現型をコー
ドするかどうかについて確認するために、株
PAC1.17を45℃で培養した。PAC1.17のバクテ
リオシン非生産性（Bac-）分離体は3.7％の頻
度で得られた。PAC1.17の代表的なBac-株は
PAC1.19と命名された。さらにBac-表現型の
ものがプラスミドpSRQ11と共生しうるかどう
かについて確かめるために、株PAC1.0を45、
47及び50℃で培養した。PAC1.0のSuc+、Bac-
の分離体がそれぞれ2.4、2.1及び2.7％の頻度で
得られた。代表的なSuc+、Bac-の単離物の抽
出標本（Survey）溶解はプラスミドpSRQ10
（23Mda）の存在を、プラスミドpSRQ11の不
在を示した（第１図のＣ列）。代表的なSuc+、
Bac-分離体はPAC1.14と命名された。 PA−１の阻止スペクトル：Bac+株として
PAC1.0を、そしてコントロールBac-株として
PAC1.14を有するプレートアツセイ系をバクテ
リオシン活性のスペクトルを調べるために用い
た。PAC1.14は、乳酸のような代謝副産物から
指示株に対する阻止を検出するために含ませた
ものである。株PAC1.0は、Pediococcus
acidilactici、Pediococcus pentosacens、
Lactobacillus plantarum、Lactobacillus
casei、Leuconostoc dextranicumに対して活
性を示した。Streptococcus lactis、その亜種
diacetylactis、Streptococcus cremoris、或い
はStreptococcus thermophilusに対しては、
非活性であることが観察された。Bac-株であ
るPAC1.14はPA−１に対し感受性を示さなか
つた。 Staphylococcus aureus株は親及びキユアーし
た株に対し等しい感受性を示し、阻止がおそら
く乳酸の阻止効果に基づくものであることを示
した。部分精製したPA−１（32000AU／ml）
を用いてMicrococcus varians、Micrococcus
sondonensis、Staphylococcus xylosus、
Staphylococcus carnosus、Lactobacillus
acidophilus、Lactobacillus lactis及び
Lactobacillus bulgaricusについてバクテリオ
シンに対する感受性を試験した。これらの菌株
の何れも、PA−１に対し感受性を示さなかつ
た。 酵素、熱処理及びPHの効果：部分精製したバクテ
リオシンを種々の酵素、熱及びPHにさらして感
受性を調べた。PA−１はプロテアーゼ、パパ
イン及びα−キモトリプシンに対して感受性で
あつた。バクテリオシンの活性はリパーゼ、ホ
スホリパーゼＣ、リゾチーム、DNアーゼ及び
RNアーゼによつても、また80及び100℃への
加熱によつても影響されなかつた。121℃にさ
らすと活性が一部破壊された（第３表）。バク
テリオシンの活性はPH４〜７で最も安定であ
り、PH２、３、９及び10では活性がいくらか損
なわれることを見出した。PH11では活性が殆ど
失われた。 実施例 １ 以上に述べる実施例１はサラダドレツシング中
でのバクテリオシンPA−１の使用に係る。
【表】
第２表中(1)〜(3)の説明：
(1) 使用したドレツシングはMarie（登録商標）
のButtermilk Spice Ranch Dressingであつ
た。このサラダドレツシングの一般的な組成
は、大豆油、新鮮なバターミルク、新鮮なサワ
ーミルク、全卵、蒸留酢、糖、塩、固形バター
ミルク、グルタミン酸１ナトリウム、脱水ニン
ニク、脱水タマネギ、キサンタンガム、スパイ
ス類、レモンジユース濃縮物、パセリ及び天然
賦香材であつた。 (2) 変敗性細菌としては、Lactobacillus
bifermentans ATCC35409を、ドレツシング
に対し約１×103CFU／ｇ添加した（試料Ａに
は添加せず）。 (3) バクテリオシンPA−１としては、60％の硫
酸アンモニウムで調製したものを0.05MTris−
マレエート（PH6.8）に対し透析し、次いでろ
過滅菌して用いた（濃度：20000AU／ml）。 上記条件(1)、(2)、(3)下で、25℃（室温）で７日
間試験した。第２表で「接種」、「非接種」とは変
敗性細菌（指示菌株）を指す。 これらの表から明らかであるように
Pediococcus acidilactici由来のバクテリオシン
は、普通にみられる変敗性細菌である
Lactobacillus bifermentansの成長を阻止するの
に極めて有効である。 試験結果を第３表、第４表及び第５表に示す。
のButtermilk Spice Ranch Dressingであつ
た。このサラダドレツシングの一般的な組成
は、大豆油、新鮮なバターミルク、新鮮なサワ
ーミルク、全卵、蒸留酢、糖、塩、固形バター
ミルク、グルタミン酸１ナトリウム、脱水ニン
ニク、脱水タマネギ、キサンタンガム、スパイ
ス類、レモンジユース濃縮物、パセリ及び天然
賦香材であつた。 (2) 変敗性細菌としては、Lactobacillus
bifermentans ATCC35409を、ドレツシング
に対し約１×103CFU／ｇ添加した（試料Ａに
は添加せず）。 (3) バクテリオシンPA−１としては、60％の硫
酸アンモニウムで調製したものを0.05MTris−
マレエート（PH6.8）に対し透析し、次いでろ
過滅菌して用いた（濃度：20000AU／ml）。 上記条件(1)、(2)、(3)下で、25℃（室温）で７日
間試験した。第２表で「接種」、「非接種」とは変
敗性細菌（指示菌株）を指す。 これらの表から明らかであるように
Pediococcus acidilactici由来のバクテリオシン
は、普通にみられる変敗性細菌である
Lactobacillus bifermentansの成長を阻止するの
に極めて有効である。 試験結果を第３表、第４表及び第５表に示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
バクテリオシンPA−１は、サラダドレツシン
グが置かれる環境下で安定である。このバクテリ
オシンは変敗性細菌の初期濃度を減少させ、この
保護効果を数日間にわたり維持する。同様の結果
はコールスローサラダ、マカロニサラダ及びポテ
トサラダのような他の食品でも達成でき、特に未
加工食品素材中に天然に存在するグラム陽性菌の
成長を促進する他の成分が未加工食品素材に混入
されて食品が製造される場合に有効である。
グが置かれる環境下で安定である。このバクテリ
オシンは変敗性細菌の初期濃度を減少させ、この
保護効果を数日間にわたり維持する。同様の結果
はコールスローサラダ、マカロニサラダ及びポテ
トサラダのような他の食品でも達成でき、特に未
加工食品素材中に天然に存在するグラム陽性菌の
成長を促進する他の成分が未加工食品素材に混入
されて食品が製造される場合に有効である。
第１図は、Pediococcus acidilacticiの選択さ
れた菌株より得たプラスミドについてのアガロー
スゲル電気泳動試験の結果を示す線図である。
れた菌株より得たプラスミドについてのアガロー
スゲル電気泳動試験の結果を示す線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ グラム陽性菌による食品の変敗を防止する方
法であつて、バクテリオシン生産性の
Pediococcus属の細菌由来の変敗防止性のバクテ
リオシンを食品中に有効量だけ添加することを特
徴とする、食品の変敗防止法。 ２ 前記バクテリオシンがPediococcus
acidilactici NRRL−Ｂ−18050由来である、請
求項１に記載の食品の変敗防止法。 ３ 前記バクテリオシンがPediococcus属の細菌
を増殖培地中で増殖して誘導されたものであり、
該バクテリオシンと共に増殖培地を乾燥させ粉体
として食品中に添加する、請求項１に記載の食品
の変敗防止法。 ４ 前記バクテリオシンがプロテアーゼ、パパイ
ン及びα−キモトリプシンによつて不活化され、
100℃までの水溶液中で10分間、熱不感性を示す
ものである、請求項１に記載の食品の変敗防止
法。 ５ 前記バクテリオシンが食品素材中に天然に存
在するグラム陽性菌を抑制するものである、請求
項１に記載の食品の変敗防止法。 ６ 前記グラム陽性菌がLactobacillus
bifermentansである、請求項５に記載の食品の
変敗防止法。 ７ 食品１グラム当たり約10〜100000AUのバク
テリオシンを添加する、請求項１に記載の食品の
変敗防止法。 ８ 前記バクテリオシンが、Pediococcus属の細
菌を増殖培地中で増殖させ、増殖培地から固形分
を分離してバクテリオシンの水溶液を作製し、こ
の水溶液に過剰量の塩を加えてバクテリオシンを
沈澱させ、沈澱物からバクテリオシンを単離して
得られたものである、請求項１に記載の食品の変
敗防止法。 ９ 前記した塩が硫酸アンモニウムである、請求
項８に記載の食品の変敗防止法。 １０ 前記したPediococcus属の細菌が、バクテ
リオシン生産をコードする分子量約6.2Mdaのプ
ラスミドを含むPediococcus acidilacticiである、
請求項１に記載の食品の変敗防止法。 １１ 前記食品がサラダドレツシングである、請
求項１に記載の食品の変敗防止法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US012,619 | 1987-02-09 | ||
| US07/012,619 US4883673A (en) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Method for inhibiting bacterial spoilage and resulting compositions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01202277A JPH01202277A (ja) | 1989-08-15 |
| JPH0448427B2 true JPH0448427B2 (ja) | 1992-08-06 |
Family
ID=21755842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63027397A Granted JPH01202277A (ja) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | 食品の変敗防止方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4883673A (ja) |
| EP (1) | EP0293547B1 (ja) |
| JP (1) | JPH01202277A (ja) |
| AT (1) | ATE84683T1 (ja) |
| AU (1) | AU599451B2 (ja) |
| CA (1) | CA1297719C (ja) |
| DE (1) | DE3877625T2 (ja) |
| ES (1) | ES2053592T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ223419A (ja) |
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| US5260212A (en) * | 1987-02-09 | 1993-11-09 | Quest International Flavors & Food Ingredients Co., Division Of Indopco | Cloned gene encoding for bacteriocin from Pediococcus acidilactici |
| US4929445A (en) * | 1988-01-25 | 1990-05-29 | Microlife Technics, Inc. | Method for inhibiting Listeria monocytogenes using a bacteriocin |
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