JPH0448435B2 - - Google Patents
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- JPH0448435B2 JPH0448435B2 JP61101044A JP10104486A JPH0448435B2 JP H0448435 B2 JPH0448435 B2 JP H0448435B2 JP 61101044 A JP61101044 A JP 61101044A JP 10104486 A JP10104486 A JP 10104486A JP H0448435 B2 JPH0448435 B2 JP H0448435B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
発明の背景
本発明は、特定の微生物の産生するニトリラー
ゼに基づくニトリル水和活性の経時的な低下を防
止し、この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酵素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリラーゼは、ニトリル類を水和して対応す
るアミド類を生成せしめる酵素として知られてお
り、その具体的利用例としてニトリラーゼを産生
するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属
またはノカルジア（Nocardia）属の微生物を用
いて、（メタ）アクリロニトリルより（メタ）ア
クリルアミドを生成させる方法（特公昭56−
17918号広報参照）、ロドコツカス
（Rhodococcus）属の微生物を用いて、C2-4のニ
トリルより対応するアミドを生成させる方法（特
願昭60−452明細書参照）、バシラス（Bacillus）
属、バクテリジウム（Bacteridium）属、ミクロ
コツカス（Micrococcus）属またはブレビバクテ
リウム（Brevibacterium）属の微生物を用いて、
ニトリルより対応するアミドを生成させる方法
（特開昭51−86186号公報参照）を挙げることがで
きる。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において、上記ニトリルラーゼのニトリル水和活
性は不安定で、温度や精製度を上げるにしたがい
活性が低下することが判明した。この低下はこの
酵素を固定化した場合にも認められる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリラーゼ
のニトリル水和活性を効率的に利用することを目
的として、鋭意検討した結果、特定の物質、すな
わち、ニトリル類、アミド類および有機酸または
その塩類等の使用が該目的に極めて有効であるこ
とを見出し、この知見に基づいてなされたもので
ある。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るグラム陽性の微生物から分離、抽出した酵素ニ
トリラーゼまたはその固定化物の溶液または懸濁
液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、お
よび有機酸またはその塩類の中から選ばれた少な
くとも１種の化合物を添加して、該酵素活性を１
日以上安定に維持すること、を特徴とするニトリ
ル水和活性の保持方法、を要旨とするものであ
る。 発明の具体的な説明 微生物： 本発明における微生物は、ニトリルラーゼを産
生し、ニトリル特にアクリロニトリルを水和し
て、対応するアミド特にアクリルアミドを生成す
ることができる特定の微生物である。具体的に
は、例えば、前記特公昭56−17918号広報に記載
のコリネバクテリウム属のＮ−771菌株〔微工研
菌寄第4445〕およびＮ−774菌株〔微工研菌寄第
4446〕ならびにノカルジア属のＮ−775菌株〔微
工研菌寄第4447〕、前記特願昭60−452明細書記載
のロドコツカス属のsp.S−６〔微工研条寄第687
号〕および同じく前記特開昭51−86186号公報記
載のバシラス（Bacillus）属、バクテリジウム
（Bacteridium）属、ミクロコツカス
（Micrococcus）属およびブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属の菌株等を挙げることがで
きる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコース、
シユークロース、デキストリン、グリセリン等の
炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒素源、酵
母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン等の
窒素源、その他を適宜含有する培地に、それぞれ
の菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは５〜９程度、好ましくは６〜８程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜30
℃程度とし、培養時間は１〜３日程度で充分であ
る。培養により得た菌体は遠心分離等により集菌
することができる。 ニトリラーゼ： 本発明におけるニトリラーゼは前記微生物が産
生する酵素であり、その活性を充分に発現させる
には光照射を必要とする（特願昭60−2724号明細
書参照）。この酵素の分離、抽出は次のようにし
て行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体を
所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁し、
超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチプレス
等により菌体を破砕し、遠心分離等により未破砕
菌体および細胞璧、膜を除去し、可溶性画分（菌
体抽出液）を得る。さらに、この菌体抽出液は常
法に従い、適宜、硫安分画、DEAE−Sephacel
Phenyl−sepharose、sephadex等のカラムを用
いたり、さらには結晶化等により精製することに
より、部分精製酵素液または精製酵素（液）を得
ることができる。 本発明では、これら精製段階の如何によらず、
いずれの酵素も対象となる。 固定化酵素： 本発明における固定化酵素は、上記ニトリラー
ゼを常法に従い活性炭等へ吸着させる吸着法、イ
オン交換樹脂等に結合させるイオン結合法、ガラ
スビーズ等に共有結合させる共有結合法、および
アクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸等で
包括する包括法等により得ることができる。 安定化剤： 本発明において使用する安定化剤は、ニトリル
類、アミド類および有機酸類の中から選ばれた化
合物であり、これらはそれぞれ単独にまたは混合
して使用することができる。 具体的には、例えば次の化合物を挙げることが
できる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブ
チロニトリルのような脂肪族ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニト
リル、β−アミノプロピオニトリルのようなア
ミノニトリル類と対応するアミドおよび酸また
はその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのような
ヒドロキシニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルのよ
うな不飽和ニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシポ
ニトリルのようなジニトリル類と対応するジア
ミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモノ
シアノアミドおよびモノシアノ酸またはその塩
類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリルの
ような芳香族ニトリル類と対応するアミドおよ
び酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルの
ような複素環式ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピオ
ニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有す
る酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持： 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、前
記した化合物を、同じく前記したニトリルラーゼ
またはこれらの固定化物を各種バツフアー溶液、
生理食塩水などに溶解または分散させた溶液また
は懸濁液に添加することにより達成することがで
きる。安定化剤の添加量は通常0.01〜50ｇ／の
範囲であるが、長期保存、コスト等を考慮すると
0.1〜10ｇ／添加することが望ましい。 溶液または懸濁液のPHは５〜８、好ましくは
5.5〜７の範囲で、リン酸バツフアー、トリスバ
ツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用いられ
る。また、場合によつては、塩酸、硫酸等の酸、
カセイソーダ、カセイカリ等のアルカリを添加
し、PHをコントロールすることも有効である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、低
温、特に０℃付近で保存することが望ましい。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長時間、
例えば１日以上安定に保持することができる。そ
の効果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存
安定性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の
保持においても認められる。従つて、安定化剤は
各精製工程において使用する酵素液またはバツフ
アー溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液0.1mlを9.9mlのリン酸バツフアーを入れた50ml
ビーカーに採り、10℃のバス中で予め100Wアイ
ランプ（東芝製）にて50cmの距離から30分間光を
照射し充分に活性を発現させた後、アクリロニト
リル5.0重量％含むＭ／20リン酸バツフアー（PH
7.7）10mlに加えて、10℃、10分間反応させ、こ
の時生成したアクリルアミドをガスクロマトグラ
フイーにより定量することにより測定した。 また、酵素液について１分間に1μモルのアク
リルアミドを生成する能力を１単位(U)として表示
した。 実施例１および比較例１ グルコースス10ｇ／、ペプトン５ｇ／、酵
母エキス３ｇ／および麦芽エキス３ｇ／から
なる培地をPH7.2に調整後、それぞれ100mlを500
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。 冷却後、これに上記と同一培地で２日間予め培
養したコリネバクテリウム属のＮ−774菌株〔微
工研菌寄第4446号〕の培養液１mlを接種し、30℃
にて２日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離（３℃、10000rpm、
20分）により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液を得た。 次いで、この洗浄菌体懸濁液50mlと10ｇ／の
イソ酪酸アンモニウム塩を含有するＭ／10リン酸
バツフアー（PH6.5）50mlを混合した（2.5×
103U／ml）。 本菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所
製）にかけ、1000〜1500KgＧの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離（12000rpm、30分）にて未
破砕菌体および細胞璧等の不溶分を除去し、菌体
抽出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液（2.5×103U／ml）を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を20℃にて、２日間放置し、放置
開始前後のニトリ水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率（表中、活性残存率と略す。以下
同じ）を算出し表−１に示す結果を得た。
ゼに基づくニトリル水和活性の経時的な低下を防
止し、この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酵素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリラーゼは、ニトリル類を水和して対応す
るアミド類を生成せしめる酵素として知られてお
り、その具体的利用例としてニトリラーゼを産生
するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属
またはノカルジア（Nocardia）属の微生物を用
いて、（メタ）アクリロニトリルより（メタ）ア
クリルアミドを生成させる方法（特公昭56−
17918号広報参照）、ロドコツカス
（Rhodococcus）属の微生物を用いて、C2-4のニ
トリルより対応するアミドを生成させる方法（特
願昭60−452明細書参照）、バシラス（Bacillus）
属、バクテリジウム（Bacteridium）属、ミクロ
コツカス（Micrococcus）属またはブレビバクテ
リウム（Brevibacterium）属の微生物を用いて、
ニトリルより対応するアミドを生成させる方法
（特開昭51−86186号公報参照）を挙げることがで
きる。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において、上記ニトリルラーゼのニトリル水和活
性は不安定で、温度や精製度を上げるにしたがい
活性が低下することが判明した。この低下はこの
酵素を固定化した場合にも認められる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリラーゼ
のニトリル水和活性を効率的に利用することを目
的として、鋭意検討した結果、特定の物質、すな
わち、ニトリル類、アミド類および有機酸または
その塩類等の使用が該目的に極めて有効であるこ
とを見出し、この知見に基づいてなされたもので
ある。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るグラム陽性の微生物から分離、抽出した酵素ニ
トリラーゼまたはその固定化物の溶液または懸濁
液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、お
よび有機酸またはその塩類の中から選ばれた少な
くとも１種の化合物を添加して、該酵素活性を１
日以上安定に維持すること、を特徴とするニトリ
ル水和活性の保持方法、を要旨とするものであ
る。 発明の具体的な説明 微生物： 本発明における微生物は、ニトリルラーゼを産
生し、ニトリル特にアクリロニトリルを水和し
て、対応するアミド特にアクリルアミドを生成す
ることができる特定の微生物である。具体的に
は、例えば、前記特公昭56−17918号広報に記載
のコリネバクテリウム属のＮ−771菌株〔微工研
菌寄第4445〕およびＮ−774菌株〔微工研菌寄第
4446〕ならびにノカルジア属のＮ−775菌株〔微
工研菌寄第4447〕、前記特願昭60−452明細書記載
のロドコツカス属のsp.S−６〔微工研条寄第687
号〕および同じく前記特開昭51−86186号公報記
載のバシラス（Bacillus）属、バクテリジウム
（Bacteridium）属、ミクロコツカス
（Micrococcus）属およびブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属の菌株等を挙げることがで
きる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコース、
シユークロース、デキストリン、グリセリン等の
炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒素源、酵
母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン等の
窒素源、その他を適宜含有する培地に、それぞれ
の菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは５〜９程度、好ましくは６〜８程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜30
℃程度とし、培養時間は１〜３日程度で充分であ
る。培養により得た菌体は遠心分離等により集菌
することができる。 ニトリラーゼ： 本発明におけるニトリラーゼは前記微生物が産
生する酵素であり、その活性を充分に発現させる
には光照射を必要とする（特願昭60−2724号明細
書参照）。この酵素の分離、抽出は次のようにし
て行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体を
所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁し、
超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチプレス
等により菌体を破砕し、遠心分離等により未破砕
菌体および細胞璧、膜を除去し、可溶性画分（菌
体抽出液）を得る。さらに、この菌体抽出液は常
法に従い、適宜、硫安分画、DEAE−Sephacel
Phenyl−sepharose、sephadex等のカラムを用
いたり、さらには結晶化等により精製することに
より、部分精製酵素液または精製酵素（液）を得
ることができる。 本発明では、これら精製段階の如何によらず、
いずれの酵素も対象となる。 固定化酵素： 本発明における固定化酵素は、上記ニトリラー
ゼを常法に従い活性炭等へ吸着させる吸着法、イ
オン交換樹脂等に結合させるイオン結合法、ガラ
スビーズ等に共有結合させる共有結合法、および
アクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸等で
包括する包括法等により得ることができる。 安定化剤： 本発明において使用する安定化剤は、ニトリル
類、アミド類および有機酸類の中から選ばれた化
合物であり、これらはそれぞれ単独にまたは混合
して使用することができる。 具体的には、例えば次の化合物を挙げることが
できる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブ
チロニトリルのような脂肪族ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニト
リル、β−アミノプロピオニトリルのようなア
ミノニトリル類と対応するアミドおよび酸また
はその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのような
ヒドロキシニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルのよ
うな不飽和ニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシポ
ニトリルのようなジニトリル類と対応するジア
ミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモノ
シアノアミドおよびモノシアノ酸またはその塩
類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリルの
ような芳香族ニトリル類と対応するアミドおよ
び酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルの
ような複素環式ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピオ
ニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有す
る酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持： 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、前
記した化合物を、同じく前記したニトリルラーゼ
またはこれらの固定化物を各種バツフアー溶液、
生理食塩水などに溶解または分散させた溶液また
は懸濁液に添加することにより達成することがで
きる。安定化剤の添加量は通常0.01〜50ｇ／の
範囲であるが、長期保存、コスト等を考慮すると
0.1〜10ｇ／添加することが望ましい。 溶液または懸濁液のPHは５〜８、好ましくは
5.5〜７の範囲で、リン酸バツフアー、トリスバ
ツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用いられ
る。また、場合によつては、塩酸、硫酸等の酸、
カセイソーダ、カセイカリ等のアルカリを添加
し、PHをコントロールすることも有効である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、低
温、特に０℃付近で保存することが望ましい。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長時間、
例えば１日以上安定に保持することができる。そ
の効果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存
安定性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の
保持においても認められる。従つて、安定化剤は
各精製工程において使用する酵素液またはバツフ
アー溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液0.1mlを9.9mlのリン酸バツフアーを入れた50ml
ビーカーに採り、10℃のバス中で予め100Wアイ
ランプ（東芝製）にて50cmの距離から30分間光を
照射し充分に活性を発現させた後、アクリロニト
リル5.0重量％含むＭ／20リン酸バツフアー（PH
7.7）10mlに加えて、10℃、10分間反応させ、こ
の時生成したアクリルアミドをガスクロマトグラ
フイーにより定量することにより測定した。 また、酵素液について１分間に1μモルのアク
リルアミドを生成する能力を１単位(U)として表示
した。 実施例１および比較例１ グルコースス10ｇ／、ペプトン５ｇ／、酵
母エキス３ｇ／および麦芽エキス３ｇ／から
なる培地をPH7.2に調整後、それぞれ100mlを500
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。 冷却後、これに上記と同一培地で２日間予め培
養したコリネバクテリウム属のＮ−774菌株〔微
工研菌寄第4446号〕の培養液１mlを接種し、30℃
にて２日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離（３℃、10000rpm、
20分）により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液を得た。 次いで、この洗浄菌体懸濁液50mlと10ｇ／の
イソ酪酸アンモニウム塩を含有するＭ／10リン酸
バツフアー（PH6.5）50mlを混合した（2.5×
103U／ml）。 本菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所
製）にかけ、1000〜1500KgＧの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離（12000rpm、30分）にて未
破砕菌体および細胞璧等の不溶分を除去し、菌体
抽出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液（2.5×103U／ml）を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を20℃にて、２日間放置し、放置
開始前後のニトリ水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率（表中、活性残存率と略す。以下
同じ）を算出し表−１に示す結果を得た。
【表】
実施例２〜６および比較例２〜６
比較例１と同様にして調整した表−２に示す各
種の属の菌体懸濁液について、比較例１と同様に
してフレンチプレス処理および遠心分離を行い、
菌体抽出液を得た。 この菌体抽出液を２分し一方はその１mlを10
ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含有するＭ／
10リン酸バツフアー（PH6.5）１mlと混合し、他
方は比較例としてＭ／10リン酸バツフアー（PH
6.5）１mlと混合した。両溶液を20℃にて２日間
放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定値か
らニトリル水和活性の残存率を算出し、同表に示
す結果を得た。
種の属の菌体懸濁液について、比較例１と同様に
してフレンチプレス処理および遠心分離を行い、
菌体抽出液を得た。 この菌体抽出液を２分し一方はその１mlを10
ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含有するＭ／
10リン酸バツフアー（PH6.5）１mlと混合し、他
方は比較例としてＭ／10リン酸バツフアー（PH
6.5）１mlと混合した。両溶液を20℃にて２日間
放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定値か
らニトリル水和活性の残存率を算出し、同表に示
す結果を得た。
【表】
実施例７〜27および比較例７
比較例１と同様にして得た菌体抽出液（0.8×
103U／ml）2.5mlに表−３に示すニトリル類を10
mg含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加え、PH
6.5に調整後、20℃にて２日間放置し、前例と同
様にして活性残存率を算出した。結果を表−３に
示した。
103U／ml）2.5mlに表−３に示すニトリル類を10
mg含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加え、PH
6.5に調整後、20℃にて２日間放置し、前例と同
様にして活性残存率を算出した。結果を表−３に
示した。
【表】
【表】
実施例28〜45および比較例８
実施例７〜27において、ニトリル類に代えてア
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−４
に示す結果を得た。
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−４
に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例46〜62および比較例９
実施例７〜27においてニトリル類に代えて有機
酸類を添加し、さらにPHを6.5に調整した以外は
同例と同様にして表−５に示す結果を得た。
酸類を添加し、さらにPHを6.5に調整した以外は
同例と同様にして表−５に示す結果を得た。
【表】
実施例63〜75および比較例10〜13
比較例１と同様にして調製した菌体抽出液
（1.8×103U／ml）2.5mlに、表−６に示す安定化
剤25mgを含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、20℃にて２日間放置した。 それぞれの抽出液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
６に示す結果を得た。
（1.8×103U／ml）2.5mlに、表−６に示す安定化
剤25mgを含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、20℃にて２日間放置した。 それぞれの抽出液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
６に示す結果を得た。
【表】
実施例76〜92および比較例14
比較例１と同様にして調製した菌体抽出液
（0.7×103U／ml）2.5mlに表−７に示す安定化剤
を所定量含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0（無添加はPH6.5）に調整後、20℃にて２
日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定
値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に示
す結果を得た。
（0.7×103U／ml）2.5mlに表−７に示す安定化剤
を所定量含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0（無添加はPH6.5）に調整後、20℃にて２
日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定
値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に示
す結果を得た。
【表】
【表】
濃度：放置液中の安定化剤濃度
実施例93および比較例15 実施例１と同様にして調製した菌体抽出液40
ml、アクリルアミド4.5ｇ、Ｎ、N′−メチレンビ
スアクリルアミド0.5ｇおよびＭ／20リン酸バツ
フアー（イソ酪酸アンモニウム10ｇ／含有、PH
6.0）40mlを混合して、均一な懸濁液とした。こ
れに、５％ジメチルアミノプロピオニトリル水溶
液５mlおよび1.0％過硫酸カリウム水溶液10mlを
加えて、10℃に30分保つて重合させた。得られた
塊状の菌体含有ゲルを小粒子に破砕し５ｇ／の
イソ酪酸アンモニウム塩を含むPH7.0のＭ／20リ
ン酸バツフアーで充分洗浄した固定化酵素約90ｇ
を得た。 この洗浄固定化酵素を５ｇ／のイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、20℃にて３日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、20℃にて５日間放置した。 これら固定化酵素について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル１ｇとアクリロニトリル５ｇ、Ｍ／20
リン酸バツフアー（PH7.7）97mlを混合し、攪拌
下に０℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−８に示した。
実施例93および比較例15 実施例１と同様にして調製した菌体抽出液40
ml、アクリルアミド4.5ｇ、Ｎ、N′−メチレンビ
スアクリルアミド0.5ｇおよびＭ／20リン酸バツ
フアー（イソ酪酸アンモニウム10ｇ／含有、PH
6.0）40mlを混合して、均一な懸濁液とした。こ
れに、５％ジメチルアミノプロピオニトリル水溶
液５mlおよび1.0％過硫酸カリウム水溶液10mlを
加えて、10℃に30分保つて重合させた。得られた
塊状の菌体含有ゲルを小粒子に破砕し５ｇ／の
イソ酪酸アンモニウム塩を含むPH7.0のＭ／20リ
ン酸バツフアーで充分洗浄した固定化酵素約90ｇ
を得た。 この洗浄固定化酵素を５ｇ／のイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、20℃にて３日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、20℃にて５日間放置した。 これら固定化酵素について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル１ｇとアクリロニトリル５ｇ、Ｍ／20
リン酸バツフアー（PH7.7）97mlを混合し、攪拌
下に０℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−８に示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ニトリル水和活性を有するグラム陽性の微生
物から分離、抽出した酵素ニトリラーゼまたはそ
の固定化物の溶液または懸濁液に、安定化剤とし
てニトリル類、アミド類、および有機酸またはそ
の塩類の中から選ばれた少なくとも１種の化合物
を添加して、該酵素活性を１日以上安定に維持す
ること、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法。 ２ 溶液または懸濁液中のニトリル類、アミド
類、および有機酸またはその塩類の濃度が0.01〜
50ｇ／である特許請求の範囲第１項記載の保持
方法。 ３ 溶液または懸濁液のPHが５〜８である特許請
求の範囲第１〜２項記載の保持方法。 ４ 微生物が、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、ノカルジア
（Nocardia）属、ロドコツカス（Rhodococcus）
属、バシラス（Bacillus）属、バクテリジウム
（Bacteridium）属、ミクロコツカス
（Micrococcus）属およびブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属の中から選ばれた微生物で
ある特許請求の範囲第１〜３項記載の保持方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101044A JPS62259586A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
| EP87106286A EP0243967B1 (en) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Method for preservation of nitrile hydration activity |
| DE3788298T DE3788298T2 (de) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Verfahren zur Erhaltung der Nitrilhydrierungsaktivität. |
| US07/045,869 US4931391A (en) | 1986-05-02 | 1987-05-01 | Method for preservation of nitrile hydration activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101044A JPS62259586A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62259586A JPS62259586A (ja) | 1987-11-11 |
| JPH0448435B2 true JPH0448435B2 (ja) | 1992-08-06 |
Family
ID=14290136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61101044A Granted JPS62259586A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4931391A (ja) |
| EP (1) | EP0243967B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62259586A (ja) |
| DE (1) | DE3788298T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2731438B1 (fr) * | 1995-03-07 | 1997-05-16 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Hydrolise enzymatique des 4-methylthiobutyronitriles |
| JP3163224B2 (ja) * | 1994-10-14 | 2001-05-08 | 三菱レイヨン株式会社 | 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 |
| US5728556A (en) * | 1996-03-14 | 1998-03-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of ω-cyanocarboxamides from aliphatic α,ω-dinitriles using pseudomonas putida-derived biocatalysts |
| US5863750A (en) * | 1996-12-18 | 1999-01-26 | Cytec Tech Corp | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US6060265A (en) * | 1996-12-18 | 2000-05-09 | Cytec Technology Corporation | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| EA009075B1 (ru) * | 1997-07-22 | 2007-10-26 | Лонца Аг | Штаммы микроорганизма rhodococcus, способные превращать нитрил в амид, и способ получения амидов |
| US6368804B1 (en) | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| US6677149B2 (en) | 1999-07-12 | 2004-01-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells with carbamate salts |
| US6251646B1 (en) | 1999-07-12 | 2001-06-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| JP4551224B2 (ja) | 2003-01-08 | 2010-09-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | ニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞を保存及び／又は貯蔵する方法 |
| JP5085936B2 (ja) * | 2003-12-02 | 2012-11-28 | チバ スペシャルティ ケミカルズ ウォーター トリートメント リミテッド | アミドの製造 |
| KR101106943B1 (ko) | 2003-12-02 | 2012-01-19 | 시바 스페셜티 케미칼스 워터 트리트먼츠 리미티드 | 로도코커스 로도크로스 ｎｃｉｍｂ 41164의 균주 및 니트릴하이드라타제의 생산자로서의 이의 용도 |
| US7531344B2 (en) | 2006-01-30 | 2009-05-12 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms |
| US7943549B2 (en) | 2007-04-02 | 2011-05-17 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Biological-based catalyst to delay plant development processes |
| JP5648354B2 (ja) * | 2009-07-24 | 2015-01-07 | 三菱レイヨン株式会社 | 微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液 |
| US9993005B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-06-12 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Preventing or delaying chill injury response in plants |
| MX361278B (es) | 2013-03-14 | 2018-12-03 | Univ Georgia State Res Found | Inhibición o reducción del crecimiento de hongos. |
| JP2019176834A (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 三井化学株式会社 | 死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法 |
| CN112626056B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-05-24 | 浙江工业大学 | 一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2294999A1 (fr) * | 1974-12-18 | 1976-07-16 | Anvar | Procede de preparation d'amides par hydrolyse biologique |
| IT1162484B (it) * | 1978-03-29 | 1987-04-01 | Nitto Chemical Industry Co Ltd | Procedimento pe produrre acrilammide o metacrilammide impiegando microorganismi |
| JPS55108290A (en) * | 1979-02-13 | 1980-08-20 | Nitto Chem Ind Co Ltd | Production of stable aqueous solution of acrylamide or methacrylamide |
| JPS5651987A (en) * | 1979-10-04 | 1981-05-09 | Nitto Chem Ind Co Ltd | Preparation of acrylamide by bacterium |
| JPS594987B2 (ja) * | 1980-09-30 | 1984-02-02 | 日東化学工業株式会社 | ニトリラ−ゼ活性の高い細菌菌体の製造法 |
| JPS592693A (ja) * | 1982-06-29 | 1984-01-09 | Hideaki Yamada | アミドの生物学的製造法 |
| BR8400054A (pt) * | 1983-01-10 | 1984-08-14 | Nitto Chemical Industry Co Ltd | Processo para cultivar bacterias pseudomonas |
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| US4629700A (en) * | 1983-11-30 | 1986-12-16 | Standard Oil Company (Indiana) | Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids |
-
1986
- 1986-05-02 JP JP61101044A patent/JPS62259586A/ja active Granted
-
1987
- 1987-04-30 DE DE3788298T patent/DE3788298T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 EP EP87106286A patent/EP0243967B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 US US07/045,869 patent/US4931391A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0243967A2 (en) | 1987-11-04 |
| EP0243967B1 (en) | 1993-12-01 |
| DE3788298D1 (de) | 1994-01-13 |
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| JPS62259586A (ja) | 1987-11-11 |
| US4931391A (en) | 1990-06-05 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |