JPH044875A - 制限酵素の製造方法 - Google Patents
制限酵素の製造方法Info
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- JPH044875A JPH044875A JP2106231A JP10623190A JPH044875A JP H044875 A JPH044875 A JP H044875A JP 2106231 A JP2106231 A JP 2106231A JP 10623190 A JP10623190 A JP 10623190A JP H044875 A JPH044875 A JP H044875A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は制限酵素の製造方法に関し、更に詳細には、ブ
レビバクテリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方
法に関する。
レビバクテリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方
法に関する。
［従来の技術］
制限酵素とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）上のある
特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌ
クレアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により
、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であることが明らかに
なって以来、制限酵素は、遺伝病解明のための利用や遺
伝子操作による物質の大量生産への利用等現在広く用い
られている有用な酵素である。制限酵素は、種々の微生
物より単離されており、その認識する塩素配列、切断様
式により現在まで約１５０種類が知られている。
特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌ
クレアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により
、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であることが明らかに
なって以来、制限酵素は、遺伝病解明のための利用や遺
伝子操作による物質の大量生産への利用等現在広く用い
られている有用な酵素である。制限酵素は、種々の微生
物より単離されており、その認識する塩素配列、切断様
式により現在まで約１５０種類が知られている。
これまでに、
↓
５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’
３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’
↑
（式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す）という塩基配列を認識し、矢印
の位置で切断する制限酵素（以下本酵素と称する）とし
て、アナベナ パリアビリスＵＷ （Ａｎａｂａｅｎａ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＵＷ）の生産するＡｖｒ Ｉ
Ｉ［シーン（Ｇｅｎｅ） 、第７巻、第２１７頁〜第２
７０頁、１９７９年）が知られている。
Ｇはグアノシンを示す）という塩基配列を認識し、矢印
の位置で切断する制限酵素（以下本酵素と称する）とし
て、アナベナ パリアビリスＵＷ （Ａｎａｂａｅｎａ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＵＷ）の生産するＡｖｒ Ｉ
Ｉ［シーン（Ｇｅｎｅ） 、第７巻、第２１７頁〜第２
７０頁、１９７９年）が知られている。
［発明が解決しようとする課題］
Ａｖｒ ＩＩ生産菌は、藻類であり、培養が困難であり
、又極めて生産量が低いことなど、工業化には問題があ
る。
、又極めて生産量が低いことなど、工業化には問題があ
る。
本発明の目的は、Ａｖｒ ＩＩと同様の塩基配列の認識
部位、及び切断位置を有する制限酵素の工業的生産に適
した製造方法を提供することにある。
部位、及び切断位置を有する制限酵素の工業的生産に適
した製造方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
本発明を概説すれば、本発明は制限酵素の製造方法に関
し、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレオチド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より、下記ヌク
レオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
酵素を採取することを特徴とする。
し、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレオチド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より、下記ヌク
レオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
酵素を採取することを特徴とする。
↓
５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’
３’−ＧＧＡＴＣ，Ｃ−５’
（式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らは、Ａｖｒ ＩＩと同様の塩基配列の認識部
位及び切断部位を有する制限酵素が新たに、ブレビバク
テリウム属細菌によって、大量に生産されること、かつ
該細菌は、該制限酵素以外の制限酵素を生産しないこと
から、精製を安易に行うことかできることを見い出し、
本発明を完成した。
Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らは、Ａｖｒ ＩＩと同様の塩基配列の認識部
位及び切断部位を有する制限酵素が新たに、ブレビバク
テリウム属細菌によって、大量に生産されること、かつ
該細菌は、該制限酵素以外の制限酵素を生産しないこと
から、精製を安易に行うことかできることを見い出し、
本発明を完成した。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明で使用する微生物としては、ブレビバクテリウム
属に属する本酵素生産菌は、全て使用できるが、例えば
東京大学応用微生物研究所有用菌株保存施設保存菌ブレ
ビバクテリウム リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ １ｉｎｅｎｓ ） ＩＡＭ Ｉ ９０２があり、
本菌株はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ １ｉｎｅｎｓ
ＪＡＭ １９０２と表示にし、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２８７０号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２８７０）として寄託されている。
属に属する本酵素生産菌は、全て使用できるが、例えば
東京大学応用微生物研究所有用菌株保存施設保存菌ブレ
ビバクテリウム リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ １ｉｎｅｎｓ ） ＩＡＭ Ｉ ９０２があり、
本菌株はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ １ｉｎｅｎｓ
ＪＡＭ １９０２と表示にし、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２８７０号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２８７０）として寄託されている。
培養を行う場合には、培地組成としては、使用微生物が
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩類等を適宜組合わせて使用する。培地のｐＨは、
５．０〜９，０が好ましい。培養法としては、振盪培養
、攪拌培養、通気培養を用いることができるが、大量培
養を行うには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、
酵素を生産する範囲内で変更することができるが、特に
好ましくは、２０℃〜３３℃である８培養時間は、培養
条件によって異なり、本酵素の生産量が最高に達するま
で培養を行う。
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩類等を適宜組合わせて使用する。培地のｐＨは、
５．０〜９，０が好ましい。培養法としては、振盪培養
、攪拌培養、通気培養を用いることができるが、大量培
養を行うには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、
酵素を生産する範囲内で変更することができるが、特に
好ましくは、２０℃〜３３℃である８培養時間は、培養
条件によって異なり、本酵素の生産量が最高に達するま
で培養を行う。
本酵素は主として菌体内に生産される。培養液からの菌
体分離は、たとえば遠心分離により行うことができる。
体分離は、たとえば遠心分離により行うことができる。
本酵素の抽出、精製は、一般の制限酵素精製方法に従っ
た方法で行える。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後、超
音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次に
、細胞残渣を超遠心分離にて除去後、抽出液を１％スト
レプトマイシン処理し、除核酸処理を行う、更に、硫酸
アンモニウムで塩析する。沈殿物をトリス−ＦＩＣＩ緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う
。得られる透析内液を、−ホスホ−セルロース、ハイド
ロキシアパタイトのイオン交換クロマトグラフィー、ヘ
パリン−セファロースのアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いた精製方法で本制限酵素を得る。
た方法で行える。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後、超
音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次に
、細胞残渣を超遠心分離にて除去後、抽出液を１％スト
レプトマイシン処理し、除核酸処理を行う、更に、硫酸
アンモニウムで塩析する。沈殿物をトリス−ＦＩＣＩ緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う
。得られる透析内液を、−ホスホ−セルロース、ハイド
ロキシアパタイトのイオン交換クロマトグラフィー、ヘ
パリン−セファロースのアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いた精製方法で本制限酵素を得る。
本酵素の活性測定法を以下に示す。下記表１に示す組成
の反応液５０μβを予め３７℃で予熱した後、本酵素を
加え酵素反応を行う。６０分後に酵素反応停止液（１％
ＳＯＳ、５０％グリセロール０．０２％ブロモフェノー
ルブルー）を５μ℃添加にて反応を停止させる。
の反応液５０μβを予め３７℃で予熱した後、本酵素を
加え酵素反応を行う。６０分後に酵素反応停止液（１％
ＳＯＳ、５０％グリセロール０．０２％ブロモフェノー
ルブルー）を５μ℃添加にて反応を停止させる。
表 １
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７，５７ｍＭ Ｍ
ｇＣ１ｚ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール１００ｍＭ
ＮａＣ１ １，０μｇ λ−ＤＡＮ （宝酒造製品）反応液を
１％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／ｃｍの定
電圧下で約１〜２時間電気泳動を行う。電気泳動用緩衝
液は、９０ｍＭトリス−はう酸緩衝液（ｐｔ（８，３）
２．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いる。ゲルに前もって０．
５μｓ／ｍβのエチジウムブロマイドを含ませておくこ
とによりＵＶ照射でＤＮＡのバンドが検出可能である。
ｇＣ１ｚ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール１００ｍＭ
ＮａＣ１ １，０μｇ λ−ＤＡＮ （宝酒造製品）反応液を
１％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／ｃｍの定
電圧下で約１〜２時間電気泳動を行う。電気泳動用緩衝
液は、９０ｍＭトリス−はう酸緩衝液（ｐｔ（８，３）
２．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いる。ゲルに前もって０．
５μｓ／ｍβのエチジウムブロマイドを含ませておくこ
とによりＵＶ照射でＤＮＡのバンドが検出可能である。
ＤＮＡフラグメントのバントの数と量が変化しなくなっ
た時を終点とする。
た時を終点とする。
活性の定義は、３７℃で１時間に１μｇのλ−ＤＡＮを
完全に分解する酵素活性を１単位とする。
完全に分解する酵素活性を１単位とする。
本発明により得られた本酵素は、以下のような理化学的
性質を持っている。
性質を持っている。
（１）作用及び基質特異性
本酵素は、二本鎖デオキシリボ核酸中の↓
５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’
３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’
↑
という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する酵素で
、公知の制限酵素Ａｖｒ ＩＩのイソシゾマーである。
、公知の制限酵素Ａｖｒ ＩＩのイソシゾマーである。
本酵素の認識部位の決定は、λ−ＤＮＡ 、 ｐＢＲ３
２２ＤＮＡ、φＸ １７４ＲＦＩ ＤＮＡ （以上宝
酒造製品）とアデノパイラス−２ＯＮＡＣベセスダ リ
サーチ ラボラトリ−製品）を基質に用いて行った。
２２ＤＮＡ、φＸ １７４ＲＦＩ ＤＮＡ （以上宝
酒造製品）とアデノパイラス−２ＯＮＡＣベセスダ リ
サーチ ラボラトリ−製品）を基質に用いて行った。
その結果、本酵素は、λ−ＤＡＮを２カ所、アデノパイ
ラス−２ＤＮＡを２カ所切断した。しかし、ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ、φＸ ｌ ７４ＲＦＩ ＤＮＡ １．’ニー
はイ乍用しなかった。さらに既知制限酵素Ａｖｒ ＩＩ
をそれら基質に作用させ、本酵素のそれと切断パターン
を比較したところ、本酵素の切断パターンは、Ａｖｒ
ＩＩの切断パターンと一致した。以上の結果から本酵素
の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配列は、５’ −Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’であると結論された。
ラス−２ＤＮＡを２カ所切断した。しかし、ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ、φＸ ｌ ７４ＲＦＩ ＤＮＡ １．’ニー
はイ乍用しなかった。さらに既知制限酵素Ａｖｒ ＩＩ
をそれら基質に作用させ、本酵素のそれと切断パターン
を比較したところ、本酵素の切断パターンは、Ａｖｒ
ＩＩの切断パターンと一致した。以上の結果から本酵素
の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配列は、５’ −Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’であると結論された。
本発明の制限酵素の切断部位の決定は、Ｍ１３ｍｐｌ
８ＲＦＩ ＤＮＡ （宝酒造製品）に、本酵素の認識
配列である５’ −ＣＣＴＡＧＧ−３’ を含む５’
−ＧＣＣＴＡＧＧＣ−３’ を導入したベクターより、
重鎖ＤＮＡを回収し、５′末端塩基を放射性リン酸化し
たプライマー（５’ −ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣ−３’）とアニール後大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノー断片により２本鎖を合成し、その２本鎖ＤＮ
Ａを本酵素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、切断断片の鎖長な測定する方法を用い
行った。この時、生成物として得られた鎖長は５’−Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’の矢印のところで切断されたスポット
が検出され、このことから本酵素は ↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’ ↑ を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
８ＲＦＩ ＤＮＡ （宝酒造製品）に、本酵素の認識
配列である５’ −ＣＣＴＡＧＧ−３’ を含む５’
−ＧＣＣＴＡＧＧＣ−３’ を導入したベクターより、
重鎖ＤＮＡを回収し、５′末端塩基を放射性リン酸化し
たプライマー（５’ −ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣ−３’）とアニール後大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノー断片により２本鎖を合成し、その２本鎖ＤＮ
Ａを本酵素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、切断断片の鎖長な測定する方法を用い
行った。この時、生成物として得られた鎖長は５’−Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’の矢印のところで切断されたスポット
が検出され、このことから本酵素は ↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’ ↑ を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
（２）至適酵素活性条件
■）至適温度
至適温度は、約３７℃であった。
ＩＩ ）至適ｐ）Ｉ
至適ｐＨは、ｐＨ７，０〜ｐＨ８，５の範囲にある■）
塩濃度 塩濃度は、ＮａＣｌの場合５０〜１５０ｍＭであった。
塩濃度 塩濃度は、ＮａＣｌの場合５０〜１５０ｍＭであった。
■） ＭｇＣ１ｚ濃度
ＭｇＣＩｚ濃度が、５ｍＭ〜２０ｍＭの存在下で酵素反
応が活性化される。
応が活性化される。
（３）分子量
本酵素の分子量は、セファデックスＧ−１００を用いた
ゲル濾過法により９６０００±４０００ダルトン、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により４２００
０±２０００ダルトンでありこれより、本酵素は分子量
約４５０００ダルトンのサブユニット２個よりなるダイ
マー酵素である。
ゲル濾過法により９６０００±４０００ダルトン、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により４２００
０±２０００ダルトンでありこれより、本酵素は分子量
約４５０００ダルトンのサブユニット２個よりなるダイ
マー酵素である。
［実施例１
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １
３０β容ジャーファーメンタ−に下記表２に示す培地２
０βを仕込み常法により培地を滅菌した上記と同じ培地
で３０℃で２４時間振盪培養した、ブレビバクテリウム
リネンスＩＡＭ１９０２の種培養液５００ ｍβを上
記ジャーファーメンタ−に移植し、通気量１ ｖｖｍ
、攪拌数２５ Ｏｒｐｍ、３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
℃より湿重量にして約１４４ｇの菌体が得られた。
０βを仕込み常法により培地を滅菌した上記と同じ培地
で３０℃で２４時間振盪培養した、ブレビバクテリウム
リネンスＩＡＭ１９０２の種培養液５００ ｍβを上
記ジャーファーメンタ−に移植し、通気量１ ｖｖｍ
、攪拌数２５ Ｏｒｐｍ、３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
℃より湿重量にして約１４４ｇの菌体が得られた。
表 ２
グルコース １ｇ
酵母エキス ５ｇ
ポリペプトン １０ｇ
食塩 ５ｇ
脱イオン水 １ｆ２
ｐＨ７，２
得られた７２ｇの菌株を３６０ｍｆ２の緩衝液Ａ（２０
ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） １０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に懸濁し
、超音波破砕機を用いて破砕後、１０００００ｘｇで１
時間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液４００ ｍβ
を得た。
ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） １０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に懸濁し
、超音波破砕機を用いて破砕後、１０００００ｘｇで１
時間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液４００ ｍβ
を得た。
得られた抽出液に、４ｇのストレプトマイシンを添加し
、４℃、１時間放置後１００００×ｇで１０分遠心分離
を行い、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニ
ウムを８０％飽和になるよう加え、沈殿物を遠心分離に
て集め緩衝液Ａ＋０２ＭにＣ１に溶解後、同緩衝液で一
晩透析を行った。
、４℃、１時間放置後１００００×ｇで１０分遠心分離
を行い、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニ
ウムを８０％飽和になるよう加え、沈殿物を遠心分離に
て集め緩衝液Ａ＋０２ＭにＣ１に溶解後、同緩衝液で一
晩透析を行った。
次に透析内液を予め０．２Ｍ ＫＣＩを含む緩衝液Ａて
平衡化させたホスホ−セルロース（ワットマン製品）１
００ｎ＋ｊｌ！のカラムに吸着させ、０．２ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液Ａで洗浄後、０．２〜ＩＭの直線濃度勾配
をもつ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性区分を合わ
せ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化したハイ
ドロキシアパタイト（バイオラド社製品）３０ｍ℃のカ
ラムに吸着させ、１０〜５００ｍＭの直線濃度勾配をも
つリン酸カリウム緩衝液で溶出させた。得られた活性区
分を合わせ、緩衝液Ａで４時間透析後、緩衝液Ａで平衡
化したヘパリン−セファロース（ファルマシア社製品）
に吸着させ、緩衝液Ａで十分洗浄後、０．８ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液で溶出し、本酵素の標品を得たこの酵素標
品には、非特異的なりＮＡ分解酵素およびホスファター
ゼは夾雑していなかった。
平衡化させたホスホ−セルロース（ワットマン製品）１
００ｎ＋ｊｌ！のカラムに吸着させ、０．２ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液Ａで洗浄後、０．２〜ＩＭの直線濃度勾配
をもつ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性区分を合わ
せ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化したハイ
ドロキシアパタイト（バイオラド社製品）３０ｍ℃のカ
ラムに吸着させ、１０〜５００ｍＭの直線濃度勾配をも
つリン酸カリウム緩衝液で溶出させた。得られた活性区
分を合わせ、緩衝液Ａで４時間透析後、緩衝液Ａで平衡
化したヘパリン−セファロース（ファルマシア社製品）
に吸着させ、緩衝液Ａで十分洗浄後、０．８ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液で溶出し、本酵素の標品を得たこの酵素標
品には、非特異的なりＮＡ分解酵素およびホスファター
ゼは夾雑していなかった。
以上述べた方法により、７２ｇの湿菌体より８０万単位
の活性が得られた。
の活性が得られた。
［発明の効果〕
以上詳細に説明したとおり、本発明によりＡｖｒ■と同
様の塩基配列の認識部位及び切断部位を有する制限酵素
の工業的に有利な製造方法が提供された。
様の塩基配列の認識部位及び切断部位を有する制限酵素
の工業的に有利な製造方法が提供された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレオチド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌクレ
オチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵
素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す）
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2106231A JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
| GB9107589A GB2243153B (en) | 1990-04-20 | 1991-04-10 | Isoschizomer of avr ii extracted from brevibacterium sp |
| DE4112563A DE4112563A1 (de) | 1990-04-20 | 1991-04-17 | Neues restriktionsenzym |
| US07/688,426 US5470732A (en) | 1990-04-20 | 1991-04-22 | Restriction enzyme from Brevibacterium linens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2106231A JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH044875A true JPH044875A (ja) | 1992-01-09 |
| JPH066056B2 JPH066056B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=14428351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2106231A Expired - Fee Related JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5470732A (ja) |
| JP (1) | JPH066056B2 (ja) |
| DE (1) | DE4112563A1 (ja) |
| GB (1) | GB2243153B (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58107172A (ja) * | 1981-12-18 | 1983-06-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異株 |
-
1990
- 1990-04-20 JP JP2106231A patent/JPH066056B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
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- 1991-04-17 DE DE4112563A patent/DE4112563A1/de active Granted
- 1991-04-22 US US07/688,426 patent/US5470732A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4112563C2 (ja) | 1992-08-20 |
| JPH066056B2 (ja) | 1994-01-26 |
| GB2243153B (en) | 1993-08-04 |
| DE4112563A1 (de) | 1991-10-24 |
| GB2243153A (en) | 1991-10-23 |
| GB9107589D0 (en) | 1991-05-29 |
| US5470732A (en) | 1995-11-28 |
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