JPH066056B2 - 制限酵素の製造方法 - Google Patents
制限酵素の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は制限酵素の製造方法に関し、更に詳細には、ブ
レビバクテリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方
法に関する。
レビバクテリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方
法に関する。
［従来の技術］ 制限酵素とは、デオキシリボ核酸（DNA）上のある特定
の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌクレ
アーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、DN
Aが遺伝をつかさどる本体であることが明らかになって
以来、制限酵素は、遺伝病解明のための利用や遺伝子操
作による物質の大量生産への利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。制限酵素は、種々の微生物より
単離されており、その認識する塩素配列、切断様式によ
り現在まで約１５０種類が知られている。
の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌクレ
アーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、DN
Aが遺伝をつかさどる本体であることが明らかになって
以来、制限酵素は、遺伝病解明のための利用や遺伝子操
作による物質の大量生産への利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。制限酵素は、種々の微生物より
単離されており、その認識する塩素配列、切断様式によ
り現在まで約１５０種類が知られている。
これまでに、 （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す）という塩基配列を認識し、矢印
の位置で切断する制限酵素（以下本酵素と称する）とし
て、アナベナ バリアビリスUW（Anabaena variabilis
UW）の生産するAvr II〔ジーン（Gene）、第７巻、第２
１７頁〜第２７０頁、１９７９年）が知られている。
Ｇはグアノシンを示す）という塩基配列を認識し、矢印
の位置で切断する制限酵素（以下本酵素と称する）とし
て、アナベナ バリアビリスUW（Anabaena variabilis
UW）の生産するAvr II〔ジーン（Gene）、第７巻、第２
１７頁〜第２７０頁、１９７９年）が知られている。
［発明が解決しようとする課題］ Avr II生産菌は、藻類であり、培養が困難であり、又極
めて生産量が低いことなど、工業化には問題がある。
めて生産量が低いことなど、工業化には問題がある。
本の目的は、Avr IIと同様の塩基配列の認識部位、及び
切断位置を有する制限酵素の工業的生産に適した製造方
法を提供することにある。
切断位置を有する制限酵素の工業的生産に適した製造方
法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明は制限酵素の製造方法に関
し、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレチオド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より、下記ヌク
レオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
酵素を採取することを特徴とする。
し、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレチオド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より、下記ヌク
レオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
酵素を採取することを特徴とする。
（式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らは、AVR IIと同様の塩基配列の認識部位及び
切断部位を有する制限酵素が新たに、ブレビバクテリウ
ム属細菌によって、大量に生産されること、かつ該細菌
は、該制限酵素以外の制限酵素を生産しないことから、
精製を安易に行うことができることを見い出し、本発明
を完成した。
Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らは、AVR IIと同様の塩基配列の認識部位及び
切断部位を有する制限酵素が新たに、ブレビバクテリウ
ム属細菌によって、大量に生産されること、かつ該細菌
は、該制限酵素以外の制限酵素を生産しないことから、
精製を安易に行うことができることを見い出し、本発明
を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する微生物としては、ブレビバクテリウム
属に属する本酵素生産菌は、全て使用できるが、例えば
東京大学応用微生物研究所有用菌株保存施設保存菌ブレ
ビバクテリウム リネンス（Brevibacterium linens）I
AM １９０２があり、本菌株はBrevibacterium linens
IAM １９０２と表示にし、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２８７０号（FERM BP−２８７
０）として寄託されている。
属に属する本酵素生産菌は、全て使用できるが、例えば
東京大学応用微生物研究所有用菌株保存施設保存菌ブレ
ビバクテリウム リネンス（Brevibacterium linens）I
AM １９０２があり、本菌株はBrevibacterium linens
IAM １９０２と表示にし、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第２８７０号（FERM BP−２８７
０）として寄託されている。
培養を行う場合には、培地組成としては、使用微生物が
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩類等を適宜組み合わせて使用する。培地のpHは、
5.０〜9.０が好ましい。培養法としては、振盪培養、攪
拌培養、通気培養を用いることができるが、大量培養を
行うには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、酵素
を生産する範囲内で変更することができるが、特に好ま
しくは、２０℃〜３３℃である。培養時間は、培養条件
によって異なり、本酵素の生産量が最高に達するまで培
養を行う。
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩類等を適宜組み合わせて使用する。培地のpHは、
5.０〜9.０が好ましい。培養法としては、振盪培養、攪
拌培養、通気培養を用いることができるが、大量培養を
行うには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、酵素
を生産する範囲内で変更することができるが、特に好ま
しくは、２０℃〜３３℃である。培養時間は、培養条件
によって異なり、本酵素の生産量が最高に達するまで培
養を行う。
本酵素は主として菌体内に生産される。培養液からの菌
体分離は、たとえば遠心分離により行うことができる。
体分離は、たとえば遠心分離により行うことができる。
本酵素の抽出、精製は、一般の制限酵素精製方法に従っ
た方法で行える。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後、超
音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次
に、細胞残渣を超遠心分離にて除去後、抽出液を１％ス
トレプトマイシン処理し、除核酸処理を行う、更に、硫
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物をトリスーHCI緩衝
液（pH 7.5）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う。得ら
れる透析内液を、ホスホーセルロース、ハイドロキシア
パタイトのイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン−
セファロースのアフィニティークロマトグラフィーを用
いた精製方法で本制限酵素を得る。
た方法で行える。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後、超
音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次
に、細胞残渣を超遠心分離にて除去後、抽出液を１％ス
トレプトマイシン処理し、除核酸処理を行う、更に、硫
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物をトリスーHCI緩衝
液（pH 7.5）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う。得ら
れる透析内液を、ホスホーセルロース、ハイドロキシア
パタイトのイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン−
セファロースのアフィニティークロマトグラフィーを用
いた精製方法で本制限酵素を得る。
本酵素の活性測定法を以下に示す。下記表１に示す組成
の反応液５０μを予め３７℃で予熱した後、本酵素を
加え酵素反応を行う。６０分後に酵素反応停止液（１％
SDS、５０％グリセロール、0.02％プロモフェノールブ
ルー）を５μ添加にて反応を停止させる。
の反応液５０μを予め３７℃で予熱した後、本酵素を
加え酵素反応を行う。６０分後に酵素反応停止液（１％
SDS、５０％グリセロール、0.02％プロモフェノールブ
ルー）を５μ添加にて反応を停止させる。
表 １ １０mM トリスーHCI pH7.5 ７mM MgCl2 ７mM ２−メルカプトエタノール １００mM NaCl 1.0μｇ λ−DAN（宝酒造製品） 反応液を１％アカローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／
cmの定電圧下で約１〜２時間電気泳動を行う。電気泳動
用緩衝液は、９０mMトリスーほう酸緩衝液（pH8.3）2.5
mM EDTAを用いる。ゲルに前もって0.5μｇ／ｍのエチ
ジウムブロマイドを含ませておくことによりUV照射でDN
Aのバンドが検出可能である。DNAフラグメントのバンド
の数と量が変化しなくなった時を終点とする。
cmの定電圧下で約１〜２時間電気泳動を行う。電気泳動
用緩衝液は、９０mMトリスーほう酸緩衝液（pH8.3）2.5
mM EDTAを用いる。ゲルに前もって0.5μｇ／ｍのエチ
ジウムブロマイドを含ませておくことによりUV照射でDN
Aのバンドが検出可能である。DNAフラグメントのバンド
の数と量が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は、３７℃で１時間に１μｇのλ−DANを完
全に分解する酵素活性を１単位とする。
全に分解する酵素活性を１単位とする。
本発明により得られた本酵素は、以下のような理化学的
性質を持っている。
性質を持っている。
(1)作用及び基質特異性 本酵素は、二本鎖デオキシリボ核酸中の という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する酵素
で、公知の制限酵素Avr IIのイソシゾマーである。
で、公知の制限酵素Avr IIのイソシゾマーである。
本酵素の認識部位の決定は、λ−DNA、pBR ３２２ DN
A、φＸ１７４RFI DNA（以上宝酒造製品）とアデノバイ
ラス−２DNA（ベセスダ リサーチ ラボラトリー製
品）を基質に用いて行った。その結果、本酵素は、λ−
DNAを２カ所、アデノバイラス−２DNAを２カ所切断し
た。しかし、pBR 322DNA、φＸ１７４RFI DNAには作用
しなかった。さらに既知制限酵素Avr IIをそれら基質に
作用させ、本酵素のそれと切断パターンを比較したとこ
ろ、本酵素の切断パターンは、Avr IIの切断パターンと
一致した。以上の結果から本酵素の認識するDNA上のヌ
クレオチド配列は、５′-CCTAGG-３′であると結論され
た。
A、φＸ１７４RFI DNA（以上宝酒造製品）とアデノバイ
ラス−２DNA（ベセスダ リサーチ ラボラトリー製
品）を基質に用いて行った。その結果、本酵素は、λ−
DNAを２カ所、アデノバイラス−２DNAを２カ所切断し
た。しかし、pBR 322DNA、φＸ１７４RFI DNAには作用
しなかった。さらに既知制限酵素Avr IIをそれら基質に
作用させ、本酵素のそれと切断パターンを比較したとこ
ろ、本酵素の切断パターンは、Avr IIの切断パターンと
一致した。以上の結果から本酵素の認識するDNA上のヌ
クレオチド配列は、５′-CCTAGG-３′であると結論され
た。
本発明の制限酵素の切断部位の決定は、M１３mp１８RFI
DNA（宝酒造製品）に、本酵素の認識配列である５′-C
CTAGG-３′を含む５′-GCCTAGGC-３′を導入したベクタ
ーより、一本鎖DNAを回収し、５′末端塩基を放射性リ
ン酸化したプライマー（５′-GTTTTCCCAGTCACGAC-
３′）とアニール後大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー
断片により２本鎖を合成し、その２本鎖DNAを本酵素に
より切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、切断断片の鎖長を測定する方法を用い行った。この
時、生成物として得られた鎖長は の矢印のところで切断されたスポットが検出され、この
ことから本酵素は を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
DNA（宝酒造製品）に、本酵素の認識配列である５′-C
CTAGG-３′を含む５′-GCCTAGGC-３′を導入したベクタ
ーより、一本鎖DNAを回収し、５′末端塩基を放射性リ
ン酸化したプライマー（５′-GTTTTCCCAGTCACGAC-
３′）とアニール後大腸菌DNAポリメラーゼＩクレノー
断片により２本鎖を合成し、その２本鎖DNAを本酵素に
より切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、切断断片の鎖長を測定する方法を用い行った。この
時、生成物として得られた鎖長は の矢印のところで切断されたスポットが検出され、この
ことから本酵素は を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
(2)至適酵素活性条件 Ｉ）至適温度 至適温度は、約３７℃であった。
II）至適pH 至適pHは、pH7.0〜pH8.5の範囲にある。
III）塩部濃度 塩濃度は、NaClの場合５０〜１５０mMであった。
IV）MgCl2濃度 MgCl2濃度が、５mM〜２０mMの存在下で酵素反応が活性
化される。
化される。
(3)分子量 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−１００を用いた
ゲル過法により９６０００±４０００ダルトン、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により４２０００
±２０００ダルトンであり、これより、本酵素は分子量
約４５０００ダルトンのサブユニット２個よりなるダイ
マー酵素である。
ゲル過法により９６０００±４０００ダルトン、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により４２０００
±２０００ダルトンであり、これより、本酵素は分子量
約４５０００ダルトンのサブユニット２個よりなるダイ
マー酵素である。
〔実施例〕 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ ３０容ジャーファーメンターに下記表２に示す培地２
０を仕込み常法により培地を滅菌した。
０を仕込み常法により培地を滅菌した。
上記と同じ培地で３０℃で２４時間振盪培養した、ブレ
ビバクテリウム リネンスIAM１９０２の種培養液５０
０ｍを上記ジャーファーメンターに移植し、通気量１
vvm、攪拌数２５０rpm、３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
より湿重量にして約１４４ｇの菌体が得られた。
ビバクテリウム リネンスIAM１９０２の種培養液５０
０ｍを上記ジャーファーメンターに移植し、通気量１
vvm、攪拌数２５０rpm、３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
より湿重量にして約１４４ｇの菌体が得られた。
表 ２ グルコース １ｇ 酵母エキス ５ｇ ポリペプトン １０ｇ 食塩 ５ｇ 脱イオン水 １ pH7.2 得られた７２ｇの菌株を３６０ｍの緩衝液Ａ（２０mM
トリス−HCI（pH7.5）１０mM２−メルカプトエタノー
ル、５％グリセロール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、１０００００×ｇで１時間遠心分離を行い、
残渣を除去、抽出液４００ｍを得た。
トリス−HCI（pH7.5）１０mM２−メルカプトエタノー
ル、５％グリセロール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、１０００００×ｇで１時間遠心分離を行い、
残渣を除去、抽出液４００ｍを得た。
得られた抽出液に、４ｇのストレプトマイシンを添加
し、４℃、１時間放置後１００００×ｇで１０分遠心分
離を行い、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを８０％飽和になるよう加え、沈殿物を遠心分離
にて集め緩衝液Ａ＋0.2M KClに溶解後、同緩衝液で一晩
透析を行った。次に透析内液を予め0.2M KClを含む緩衝
液Ａで平衡化させたホスホーセルロース（ワットマン製
品）１００ｍのカラムに吸着させ、0.2MのKClを含む
緩衝液Ａで洗浄後、0.2〜１Ｍの直線濃度勾配をもつ緩
衝液Ａで溶出させた。得られた活性区分を合わせ、１０
mMのリン酸カリウム緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイト（バイオラド社製品）３０ｍのカラムに吸着
させ、１０〜５００mMの直線濃度勾配をもつリン酸カリ
ウム緩衝液で溶出させた。得られた活性区分を合わせ、
緩衝液Ａで４時間透析後、緩衝液Ａで平衡化したヘパリ
ン−セファロース（ファルマシア社製品）に吸着させ、
緩衝液Ａで十分洗浄後、0.8MのKClを含む緩衝液で溶出
し、本酵素の標品を得た。
し、４℃、１時間放置後１００００×ｇで１０分遠心分
離を行い、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを８０％飽和になるよう加え、沈殿物を遠心分離
にて集め緩衝液Ａ＋0.2M KClに溶解後、同緩衝液で一晩
透析を行った。次に透析内液を予め0.2M KClを含む緩衝
液Ａで平衡化させたホスホーセルロース（ワットマン製
品）１００ｍのカラムに吸着させ、0.2MのKClを含む
緩衝液Ａで洗浄後、0.2〜１Ｍの直線濃度勾配をもつ緩
衝液Ａで溶出させた。得られた活性区分を合わせ、１０
mMのリン酸カリウム緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイト（バイオラド社製品）３０ｍのカラムに吸着
させ、１０〜５００mMの直線濃度勾配をもつリン酸カリ
ウム緩衝液で溶出させた。得られた活性区分を合わせ、
緩衝液Ａで４時間透析後、緩衝液Ａで平衡化したヘパリ
ン−セファロース（ファルマシア社製品）に吸着させ、
緩衝液Ａで十分洗浄後、0.8MのKClを含む緩衝液で溶出
し、本酵素の標品を得た。
この酵素標品には、非特異的なDNA分解酵素およびホス
ファターゼは來雑していなかった。
ファターゼは來雑していなかった。
以上述べた方法により、７２ｇの湿菌体より８０万単位
の活性が得られた。
の活性が得られた。
以上詳細に説明したとおり、本発明によりAvr IIと同様
の塩基配列の認識部位及び切断部位を有する制限酵素の
工業的に有利な製造方法が提供された。
の塩基配列の認識部位及び切断部位を有する制限酵素の
工業的に有利な製造方法が提供された。
フロントページの続き (72)発明者 平岡 信次 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 中村 輝也 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造 株式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレ
チオド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵
素生産能を有する細菌を培養し、得られた培養物より下
記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断す
る制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造
方法。 （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す）
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2106231A JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
| GB9107589A GB2243153B (en) | 1990-04-20 | 1991-04-10 | Isoschizomer of avr ii extracted from brevibacterium sp |
| DE4112563A DE4112563A1 (de) | 1990-04-20 | 1991-04-17 | Neues restriktionsenzym |
| US07/688,426 US5470732A (en) | 1990-04-20 | 1991-04-22 | Restriction enzyme from Brevibacterium linens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2106231A JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH044875A JPH044875A (ja) | 1992-01-09 |
| JPH066056B2 true JPH066056B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=14428351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2106231A Expired - Fee Related JPH066056B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 制限酵素の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5470732A (ja) |
| JP (1) | JPH066056B2 (ja) |
| DE (1) | DE4112563A1 (ja) |
| GB (1) | GB2243153B (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58107172A (ja) * | 1981-12-18 | 1983-06-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異株 |
-
1990
- 1990-04-20 JP JP2106231A patent/JPH066056B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-04-10 GB GB9107589A patent/GB2243153B/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-17 DE DE4112563A patent/DE4112563A1/de active Granted
- 1991-04-22 US US07/688,426 patent/US5470732A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH044875A (ja) | 1992-01-09 |
| DE4112563C2 (ja) | 1992-08-20 |
| GB2243153B (en) | 1993-08-04 |
| DE4112563A1 (de) | 1991-10-24 |
| GB2243153A (en) | 1991-10-23 |
| GB9107589D0 (en) | 1991-05-29 |
| US5470732A (en) | 1995-11-28 |
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