JPH0449999B2 - - Google Patents
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- JPH0449999B2 JPH0449999B2 JP58501024A JP50102483A JPH0449999B2 JP H0449999 B2 JPH0449999 B2 JP H0449999B2 JP 58501024 A JP58501024 A JP 58501024A JP 50102483 A JP50102483 A JP 50102483A JP H0449999 B2 JPH0449999 B2 JP H0449999B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
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Description
請求の範囲
１ 式
［式中Ｒは水素又はメチル］のアルコールである
ことを特徴とする抽出剤に、ヒトIFN−β含有水
性培地を接触させることからなる、適当な可溶化
剤で可溶化されたヒトIFN−βを水性培地から抽
出する方法。 ２ 可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であること
を特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ３ 可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はラウ
リン酸ナトリウムであることを特徴とする請求の
範囲第１項の方法。 ４ 水相と抽出剤相との相分離を容易にするよう
な条件下に接触が行なわれることを特徴とする請
求の範囲第１項の方法。 ５ 水性培地のイオン強度が約0.05ないし約0.15
であることを特徴とする請求の範囲第１項の方
法。 ６ イオン強度が塩化ナトリウムによつて提供さ
れることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ７ 抽出剤が２−ブタノールであることを特徴と
する請求の範囲第１，２，３又は４項の方法。 ８ 抽出剤からヒトIFN−βを単離する工程が更
に本方法に含まれることを特徴とする、請求の範
囲第１，２，３又は４項の方法。 ９ 次の工程を含むことを特徴とする、ヒトIFN
−βを含有する形質転換させた微生物からヒト
IFN−βを回収する方法： (a) 微生物の細胞膜を破裂させる、 (b) ヒトIFN−βと抽出可能な複合体
（Complex）を形成するような可溶化剤で、破
裂液中のヒロIFN−βを水性培地中へ可溶化す
る、 (c) 式 ［式中Ｒは水素又はメチル］の有機抽出剤で水
性培地から複合体（Complex）を抽出する、 (d) ヒトIFN−βを抽出剤から単離する。 １０ 微生物が細菌であることを特徴とする請求
の範囲第９項の方法。 １１ 微生物が大腸菌（E.Coli）であることを特
徴とする、請求の範囲第９又は１０項の方法。 １２ 微生物が発酵培地中に含まれ、工程(a)の前
に濃縮されることを特徴とする請求の範囲第９又
は第１１項の方法。 １３ 細胞膜を破裂させるために微生物を圧力循
環にかけることによつて破裂が行なわれることを
特徴とする請求の範囲第９又は第１１項の方法。 １４ 工程(b)の可溶化で、破裂液中の実質的に全
部の粒状物質を溶解することを特徴とする請求の
範囲第９項の方法。 １５ 水性培地のPHが可溶化剤を溶液中に保持す
るようなPHであることを特徴とする請求の範囲第
９又は１４項の方法。 １６ 可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であるこ
とを特徴とする請求の範囲第９項の方法 １７ 可溶化剤がアルカリ金属アルキル硫酸塩又
は脂肪酸のアルカリ金属塩であつて、この硫酸塩
又は塩が10個ないし14個の炭素原子を含有するこ
とを特徴とする請求の範囲第９項の方法。 １８ 陰イオン性表面活性剤がドデシル硫酸ナト
リウム又はラウリン酸ナトリウムであることを特
徴とする請求の範囲第１５項の方法。 １９ PHが約７ないし約８であることを特徴とす
る請求の範囲第１５項の方法。 ２０ 表面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
り、水性培地中におけるドデシル硫酸ナトリウム
とタンパク質との重量比が約１：１ないし約５：
１の範囲にあることを特徴とする請求の範囲第１
６項の方法。 ２１ 該重量比が約３：１であることを特徴とす
る請求の範囲第９項の方法。 ２２ 水相と抽出剤相との相分離が容易になるよ
うな条件下に抽出が行なわれることを特徴とする
請求の範囲第９項の方法。 ２３ 水性培地のイオン強度が約0.05ないし約
0.15であることを特徴とする請求の範囲第２２項
の方法。 ２４ イオン強度が水性培地中の塩化ナトリウム
によつて提供されることを特徴とする請求の範囲
第２３項の方法。 ２５ 有機抽出剤が２−ブタノールであることを
特徴とする請求の範囲第９，２２，２３又は２４
項の方法。 ２６ 単離には次の工程が含まれることを特徴と
する請求の範囲第９項の方法： () 抽出液を水性緩衝液と混合する、 () （）の混合物のPHを下げることによつて
ヒトIFN−βを混合物から沈殿させる、 () 沈殿したヒトIFN−βを上澄液から単離す
る。 ２７ PHが約５より下まで下げられることを特徴
とする請求の範囲第２６項の方法。 ２８ 可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウムである
ことを特徴とする請求の範囲第２６又は２７項の
方法。 ２９ ヒトIFN−βを含有する形質転換させた大
腸菌が発酵培地中に含まれており、この細菌から
ヒトIFN−βを回収するための、以下の工程を特
徴とする方法： (a) 発酵培地中の細菌を濃縮する、 (b) 細菌を圧力循環にかけることによつて、細菌
の細胞膜を破裂する、 (c) 固体細胞物質を破裂液の残りから分離する、 (d) ２ないし15mg／mlの範囲のタンパク質濃度及
び約７ないし約８の範囲のPHで、細胞物質を水
性培地に懸濁する、 (e) 細胞物質をドデシル硫酸ナトリウムにより、
約１：１ないし１：５のドデシル硫酸ナトリウ
ム／タンパク質の重量比で可溶化する、 (f) 水性培地からヒトIFN−βを２−ブタノール
で抽出する（その場合、水性培地のイオン強度
は水性培地と２−ブタノールを実質的に混ざら
ない状態に保持するのに十分なものとする）、 (g) ヒトIFN−βを含有する２−ブタノール相か
ら水相を分離する、 (h) ２−ブタノール相に水性緩衝液を混合し、混
合物PHを約５より下に低下させることによつ
て、２−ブタノール相からヒトIFN−βを沈殿
させる。 技術分野 本発明は生化学工学の分野にある。更に詳しく
は、本発明は、ヒトIFN−βをつくりだすように
形質転換させた微生物からヒトIFN−βを分離又
は回収するための生化学的分離回収法に関する。 背景技術 天然のヒトIFN−βは、分子量22000〜26000ダ
ルトンをもつと言われる糖タンパク質である。他
のインターフエロンと同様、IFN−βは抗ウイル
ス活性、細胞生長又は分化の調整、免疫反応の変
調、及び酵素調整を含めた複数の生物学的効果を
もつものとして報告されている。天然のヒトIFN
−βは、種々のウイルス性又は非ウイルス性誘発
要因による誘発下に、ヒト線維芽細胞、白血球は
リンパ芽球用細胞によつてつくられる。天然のヒ
トIFN−βをつくるのに現在用いられている主な
方法の一つは、ポリIC（ポリリボイノシン酸：ポ
リリボシチジル酸）でヒト線維芽細胞培養基を重
複誘発することである。IFN−βは細胞の分泌物
からゲルクロマトグラフイ又は電気泳動によつて
単離される。この方法は、大規模臨床試験及び商
業的流通に必要とされるような量のヒトIFN−β
をつくる実際的な方法とは、現在考えられていな
い。 遺伝子工学がIFN−β生産の代替え方法を提供
している。IFN−βとつくる一つの組換え法は次
のようなものである。(1)ポリアデニン酸（ポリ
Ａ）の豊富な12S mRNAを、ウイルスで誘発し
たヒト白血球から抽出する。(2)このmRNAを２
本鎖cDNA合成の鋳型として使用する。(3)cDNA
を適当なベクターの中へクローン化する。(4)この
ベクターで大腸菌（E.Coli）を形質転換させる。
ヒトIFN−β生産技術については、1981年５月６
日公開の欧州特許出願第28033号、1981年７月15
日公開の欧州特許出願第32134号、1981年８月26
日公開の欧州特許出願第34307号、及び1981年６
月１日付けベルギー特許第837397号も参照のこ
と。 スキヤンデラ（Scandella）及びコーンバーグ
（Kornberg）［Biochemistry（1971年）10巻4447
〜4456頁］は大腸菌からのホスホリパーゼの単離
を記述している。この場合、細胞膜をドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）で可溶化し、溶液に１−ブ
タノールを加えると、SDSで可溶化されたタンパ
ク質の一部が沈殿する。デリンク（Derynk）ら
［Nature（1980年）287巻193〜197頁］はIFN−β
遺伝子を含有するプラスミドで形質転換させた大
腸菌細胞を１％SDS、１％２−メルカプトエタノ
ール、5M尿素中で加熱することによる大腸菌の
溶菌を報告している。溶菌液のS100抽出液は、
インターフエロン活性をもつことが報告された。
SDSを含有する組成物は、インターフエロン類の
生物学的活性を安定化するためにも使用された。
米国特許第3981991号も参照のこと。 上記の技術は、臨床試験及びその後の商業的流
通に必要な量のヒトIFN−βの実用的生産に適合
できるような、形質転換微生物体からのヒトIFN
−β回収法を教示ないし示唆してはいない。本発
明の主な目的は、このような方法を提供するにあ
る。 発明の開示 本発明は、適当な可溶化剤で可溶化されたヒト
IFN−βを水性培地から抽出する方法であり、こ
の方法はヒトIFN−β含有性培地を抽出剤に接触
させることからなり、この抽出剤が式 ［式中Ｒは水素又はメチル］のアルコールである
ことを特徴としている。 本発明方法の好ましい態様は、ヒトIFN−βを
SDSで可溶化し、抽出液からそのPHを下げること
によつてヒトIFN−βを沈殿させ、それによつて
抽出液からヒトIFN−βを単離するものである。 好適な態様 本明細書で使用される用語「IFN−β」は、用
語「線維芽細胞インターフエロン」と同義であ
る。 本明細書で使用される用語「ヒトIFN−β」
は、ヒトIFN−β遺伝子又はヒトインターフエロ
ン遺伝子で形質転換させた微生物でつくられる
IFN−βを指しており、この遺伝子が発現させる
インターフエロンは、そのアミン酸配列が天然の
ヒトIFN−βと同じか、実質的に相同
（homologous）のものである。このようなイン
ターフエロン類は未グリコシル化インターフエロ
ン類、末端メチオニン基を欠いているインターフ
エロン類、及び非雑種IFN−β種と実質的に同様
な物理性状と化学性状（例えば疎水性、溶解度、
安定性）をもつた雑種性インターフエロン類を包
含する。 本明細書で使用される用語「形質転換させた微
生物」とは、ヒトIFN−βを生産するように遺伝
子操作された微生物を指す。形質転換させた微生
物の例は、前掲「背景技術」で言及された特許
（公開）文献や本出願の実施例に記述されている。
細胞は本発明での使用に好ましい微生物である。
大腸菌（E.Coli）が特に好ましい。 形質転換させた微生物を適当な生育培地中で、
典型的には680nｍで少なくとも約10、及び好ま
しくは680nｍで約50ないし約100の光学密度
（OD）まで生育させる。生育培地の組成は使用
の特定微生物によつて代わる。培地は微生物の栄
養要求を満たすような化合物類を含有する水性培
地である。成育培地は、典型的には同化できる炭
素源と窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カ
リウム及びナトリウムイオン類、及び任意にアミ
ノ酸類とプリン及びピリミジン塩基を含有する。
リヴユウ・オブ・メデイカル・マイクロバイオロ
ジー（Review of Medical Microbiology）、ラ
ング・メデイカル・パブリケーシヨンズ社、14
版、80〜85頁（1980年）。大腸菌用の生育培地は
この技術で周知である。本発明方法に使用される
特定可溶化剤にもよるが、水中で薬剤の可溶性を
減少させるような物質の量を生育培地中で最小限
度に抑えることが望ましい。例えばカリウムイオ
ンはSDSの溶解度に影響するため、本方法の可溶
化剤としてSDSを使用する時には、K+を最小限
に抑制すべきである。 培養基が望んでいる細胞密度に達したなら、任
意に、加熱するか、又はクロロホルムやトルエン
のように菌を殺した後に容易に除去できる細胞毒
剤を加えて殺菌するかする。その後、濾過、遠心
分離、又はその他の慣用方法によつて、必要に応
じて約20〜150mg／ml好ましくは80〜100mg／ml
（680nｍでOD40〜300、好ましくは160〜200）ま
で菌を濃縮する。濃縮工程もまた任意である。 濃縮後、微生物の細胞膜を破壊させる。破壊の
主目的は、次の濃縮中の粒状物質の可溶化を容易
にすることである。この点で、生物活性の検定か
ら、インターフエロンの多くは細胞膜に関連して
いる（すなわち膜の中に含まれているか膜に結合
されている）ことが示されている。従つて、細胞
膜の破壊は可溶化剤と膜との接触を強め、膜に結
びついたインターフエロンが溶液に入つていく速
度を高める。均質化、音波処理、又は圧力循環の
ような慣用の細胞破壊（ないし破裂）技術を本方
法のこの工程に使用できる。好ましい方法は、細
胞懸濁液を約3.4×104ないし１×105kPaまで圧力
循環させるものである。圧力の急低下のため細胞
が破裂する。破裂前又は破裂後、場合に応じて濃
縮液又は破裂液の液相PH、必要により濃縮液／破
裂液中の可溶化剤と粒状物質の溶解が容易になる
ように調整する。PH調整は、適当な緩衝液を加え
ることによつて行なう。大抵の場合、約７ないし
約８の範囲のPHが使用される。 細胞を破裂させた後、破裂液の液相から粒状物
質を分離し、可溶化のため最適PHまで緩衝された
水性培地へ再懸濁させる。いずれにしても、可溶
化にかける菌懸濁液のタンパク質濃度は、通常約
２ないし約15mg／ml、好ましくは６ないし８mg／
mlの範囲内にある。 ヒトIFN−β成分を含めた粒状細胞物質の可溶
化は、破裂と同時に、又は破裂のあとに続いて実
施でき、破裂後に別の段階として行なうのが好ま
しい。可溶化を完了させる。すなわち、破裂液中
の粒状物質（例えばタンパク質、脂質、核酸、燐
脂質）の実質的に全部を水性培地に溶解させるの
が好ましい。粒状物質のほぼ完全な溶解は、適当
な可溶化剤を水性懸濁液へ加えることによつて達
成される。ヒトIFN−βを可溶化するのに適した
疎水性−親水性平衡をもち、かつヒトIFN−βと
複合体（Complex）を形成して有機相へ抽出で
きるような表面活性剤（洗剤）を使用できる。脂
肪酸のアルカリ金属塩及びアルカリ金属アルキル
硫酸塩のような天然又は合成の強い陰イオン性表
面活性剤を使用できる。このような活性剤は通常
10〜14個の炭素原子を含有する。SDSとラウリン
酸ナトリウムが特に好ましい可溶化剤である。本
方法に使用できるその他の可溶化剤の例は、ドデ
シルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルス
ルホン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、
カプリン酸ナトリウム、ドデシルＮ−サルコシン
酸ナトリウム、及びテトラデシルＮ−サルコシン
酸ナトリウムである。 可溶化に用いられる可溶化剤の量は、特定可溶
化剤と可溶化されるタンパク質の量に左右されよ
う。ほとんどの場合、凡そ１：１ないし10：１の
範囲の可溶化剤：タンパク質重量比が十分であろ
う。SDS使用の場合、約１：１ないし約５：１、
好ましくは約３：１のSDS：タンパク質比が使用
される。15℃ないし60℃の範囲の温度が通常、可
溶化に使用されよう。溶液と粒状物質との接触を
強め、細胞物質を溶解するのに要する時間を短縮
するため、典型的には混合が使われるだろう。溶
液が実質的に透明な時は、可溶化が完了したもの
と考えられる。280nｍで約0.4未満のODが可溶化
終点の特徴である。 可溶化に続いて、溶液のイオン強度は、必要に
より、溶液と有機抽出液が実質的に混ざらない水
準まで調整される。イオン強度は、0.05ないし
0.15の範囲内にあるだろう。この目的には、
NaClのような無機塩類を溶液に添加できる。こ
のようなイオン強度によつて、抽出液の相分離が
可能となる。本方法に用いられる抽出剤は２−ブ
タノール、２−メチル−２−ブタノール又はこれ
らの混合物である。混合物は、約50容量％に満た
ない２−メチル−２−ブタノールを含有するのが
好ましい。２−ブタノールは好ましい抽出剤であ
る。可溶化質からヒトIFN−βを抽出するこれら
のアルコール類の抽出能力は特異的である。（他
の）同族アルコール類は無効な抽出剤であること
がわかつた。抽出剤は通常、ヒトIFN−β水溶液
と約0.8：１ないし約３：１、好ましくは約１：
１（抽出剤／水溶液）の範囲内の容量比で一緒に
される。抽出は、慣用の回分式又は連続式液−液
抽出技術及び設備を使用して行なうことができ
る。抽出は通常20℃ないし100℃で行なわれ、約
１分ないし１時間の接触時間を伴う。最適接触時
間は特定の可溶化剤：抽出剤の組合せによつて決
まる。SDSを使用する時は、上の範囲内の短い時
間を使用できる。ラウリン酸ナトリウムを使用す
る時は、この範囲内の長い時間を使わなければな
らない。抽出混合物のPHは約６ないし９の範囲に
あり、SDS使用ではPH約7.5、ラウリン酸ナトリ
ウム使用ではPH約8.5が好ましい。 抽出が完了したら、水相と抽出液相を分け、ヒ
トIFN−βを抽出液相から単離する。使用の特定
単離手順は使用可溶化剤と望んでいる純度の最終
生成物に応じて選択されよう。沈殿、分子ふるい
クロマトグラフイ、親和クロマトグラフイ、及び
電気泳動のような種々の単離技術を使用できる。
SDSを使用した場合には、約2.5：１ないし約
５：１の容量比で水性緩衝液と混合した抽出液か
ら、典型的には約５より下にPHを下げることによ
つて、IFN−βを他のタンパク質と一緒に沈殿さ
せることができる。上澄液から沈殿物を分離し、
沈殿物から残留抽出液を蒸発させると、約95％よ
り高い純度のタンパク質である生成物が得られ
る。この生成物は少量の核酸（＜１％ないし２重
量％）とSDS（＜1w／ｖ％）も含んでいる。SDS
は所望により、タスゼンスキー（Tuszenski）及
びウオーレン（Warren）〔Anal Biochem（1975
年）65巻〕の方法を使用する電気透析によつて除
去できる。可溶化剤としてラウリン酸ナトリウム
を使用する時には、これはPH低下によりタンパク
質と一緒に抽出液から沈殿する。ラウリン酸ナト
リウムは、アセトン又はメタノールのような溶媒
を使用してタンパク質から抽出できる。 こうして単離されたヒトIFN−βを使用時まで
凍結乾燥するか或は溶液にする。所望により、無
毒、非治療性、非免疫原の安定剤をIFN−βに添
加できる。溶液中に使用できる希釈剤は、注射薬
を処方するのに普通に使われる水性ベースのビー
スクルから選ばれる。希釈剤は当然ながらIFN−
βの生物学的活性に影響するものであつてはなら
ない。このような希釈剤の例は食塩水、リンゲル
液、ブドウ糖液、ハンク液である。凍結乾燥され
たヒトIFN−βを再構成するのに同じ希釈剤を使
用できる。 本発明方法を以下の実施例によつて更に説明す
る。これらの実施例は、いかなる形においても本
発明を限定するように意図されたものではない。 実施例 １ ヒトIFN−βを生産するために形質転換させた
大腸菌（E.Coli）からヒトIFN−βを回収した。
大腸菌を680mmで10〜11の細胞密度（OD）（乾燥
重量8.4ｇ／）まで、次の生育培地中で生育さ
せた。成 分 濃 度 NH4Cl 20μM K2SO4 16.1μM KH2PO4 7.8μM Na2HPO4 12.2μM MgSO4・7H2O 3μM Na3サイトレート・2H2O 1.5μM MnSO4・4H2O 30μM FeSO4・7H2O 30μM CuSO4・5H2O 3μM Ｌ−トリプトフアン 70mg／ｌ FeSO4・7H2O 72μM チアミンHCl 20mg／ｌ テトラサイクリン 10mg／１ グルコース 40ｇ／ｌ PHはNH4OHで調製。 形質転換させた大腸菌の収穫物9.9（9.9Kg）
を20℃に冷却し、8.8Kgの濾液重量まで平均圧力
損失1.12Kg／cm2（16psi）、定常状態濾液流量260
ml／分で収穫物をクロスフローフイルターに通し
て濃縮した。濃縮液（約１）を容器に抜き出
し、15℃に冷却した。濃縮液をマントン＝ゴーリ
ンホモジナイザーに５℃、700Kg／cm2（10000psi）
で通すことによつて、濃縮液中の細胞を破裂させ
た。燐酸緩衝された食塩水（PBS、PH7.4）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破裂液に加
え、最終容量２とした。この量を12000×ｇ、
流量毎分50mlで連続遠心分離にかけた。固形分を
上澄液から分離し、２重量％SDSを含有する燐酸
緩衝食塩水４に再懸濁した。この懸濁液を室温
で15分かきまぜた後、目に見える懸濁物質はなか
つた。次に溶液を２−ブタノールで、２−ブタノ
ール：溶液容量比１：１で抽出した。毎分200ml
の流量を使用する液−液分離装置で抽出を行なつ
た。次に有機相を分離し、乾固まで蒸発させる
と、タンパク質21.3ｇを生じた。これを蒸留水
へ、１：10の容量比で再懸濁した。 回収生成物は、ウイルスの細胞病理効果
（CPE）に対する防護に基づく検定を使用して、
ヒトIFN−βについて検定された。この検定を微
量滴定プレート中で行なつた。各容器に最少基本
培地50μを仕込み、第一容器に試料25μを入
れ、以降の容器には１：３容量の希釈を連続的に
行なつた。ウイルス（水泡性口内炎）、細胞（ヒ
ト線維芽細胞系GM−2504）及び標準IFN−β対
照を各プレートに含めている。標準IFN−βはml
当り100単位である。次にプレートに紫外線光を
10分照射する。照射後、各容器に細胞懸濁液（ml
当り1.2×105細胞）100μを加え、トレーを18〜
24時間培養する。細胞当り１プラーク形成単位の
ウイルス液を細胞対照以外の各容器に加える。次
にウイルス対照が100％のウイルス細胞病理効果
（CPE）を示すまでトレーを培養する。これは、
ウイルス液を加えてから18〜24時間に通常起る。
検定結果は、標準IFN−β対照の50％細胞病理効
果の位置に関連して解釈される。この点から、プ
レート上の全試料に対するインターフエロンの滴
定値が決定される。回収された生成物の活性は
2.9×106U／mgと決定された。 実施例 ２ 可溶化剤としてSDS、抽出剤として２−ブタノ
ール、２−メチル−２−ブタノール又はその種々
の混合物を使用して、ヒトINF−βの部分的精製
を行なつた。その他のアルコール類を使用する精
製も試みた。これらの精製に用いた手順は次のと
おりである。 大腸菌の細胞1.3ｇ（湿量）を0.1M燐酸緩衝食
塩水（PBS、PH7.4）中の1w／ｖ％SDS10ml中に
懸濁した。懸濁液を透明になるまで超音波処理し
た。超音波処理液に同量の抽出剤を加えて混合
し、周囲温度で10分間、7000×ｇで遠心分離し
た。抽出剤相と水相とを分離し、抽出剤相は実施
例１に言及された検定法を用いてIFN−βの検定
にかけた。下表はこれらの検定の結果を提示して
いる。
ことを特徴とする抽出剤に、ヒトIFN−β含有水
性培地を接触させることからなる、適当な可溶化
剤で可溶化されたヒトIFN−βを水性培地から抽
出する方法。 ２ 可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であること
を特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ３ 可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はラウ
リン酸ナトリウムであることを特徴とする請求の
範囲第１項の方法。 ４ 水相と抽出剤相との相分離を容易にするよう
な条件下に接触が行なわれることを特徴とする請
求の範囲第１項の方法。 ５ 水性培地のイオン強度が約0.05ないし約0.15
であることを特徴とする請求の範囲第１項の方
法。 ６ イオン強度が塩化ナトリウムによつて提供さ
れることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ７ 抽出剤が２−ブタノールであることを特徴と
する請求の範囲第１，２，３又は４項の方法。 ８ 抽出剤からヒトIFN−βを単離する工程が更
に本方法に含まれることを特徴とする、請求の範
囲第１，２，３又は４項の方法。 ９ 次の工程を含むことを特徴とする、ヒトIFN
−βを含有する形質転換させた微生物からヒト
IFN−βを回収する方法： (a) 微生物の細胞膜を破裂させる、 (b) ヒトIFN−βと抽出可能な複合体
（Complex）を形成するような可溶化剤で、破
裂液中のヒロIFN−βを水性培地中へ可溶化す
る、 (c) 式 ［式中Ｒは水素又はメチル］の有機抽出剤で水
性培地から複合体（Complex）を抽出する、 (d) ヒトIFN−βを抽出剤から単離する。 １０ 微生物が細菌であることを特徴とする請求
の範囲第９項の方法。 １１ 微生物が大腸菌（E.Coli）であることを特
徴とする、請求の範囲第９又は１０項の方法。 １２ 微生物が発酵培地中に含まれ、工程(a)の前
に濃縮されることを特徴とする請求の範囲第９又
は第１１項の方法。 １３ 細胞膜を破裂させるために微生物を圧力循
環にかけることによつて破裂が行なわれることを
特徴とする請求の範囲第９又は第１１項の方法。 １４ 工程(b)の可溶化で、破裂液中の実質的に全
部の粒状物質を溶解することを特徴とする請求の
範囲第９項の方法。 １５ 水性培地のPHが可溶化剤を溶液中に保持す
るようなPHであることを特徴とする請求の範囲第
９又は１４項の方法。 １６ 可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であるこ
とを特徴とする請求の範囲第９項の方法 １７ 可溶化剤がアルカリ金属アルキル硫酸塩又
は脂肪酸のアルカリ金属塩であつて、この硫酸塩
又は塩が10個ないし14個の炭素原子を含有するこ
とを特徴とする請求の範囲第９項の方法。 １８ 陰イオン性表面活性剤がドデシル硫酸ナト
リウム又はラウリン酸ナトリウムであることを特
徴とする請求の範囲第１５項の方法。 １９ PHが約７ないし約８であることを特徴とす
る請求の範囲第１５項の方法。 ２０ 表面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
り、水性培地中におけるドデシル硫酸ナトリウム
とタンパク質との重量比が約１：１ないし約５：
１の範囲にあることを特徴とする請求の範囲第１
６項の方法。 ２１ 該重量比が約３：１であることを特徴とす
る請求の範囲第９項の方法。 ２２ 水相と抽出剤相との相分離が容易になるよ
うな条件下に抽出が行なわれることを特徴とする
請求の範囲第９項の方法。 ２３ 水性培地のイオン強度が約0.05ないし約
0.15であることを特徴とする請求の範囲第２２項
の方法。 ２４ イオン強度が水性培地中の塩化ナトリウム
によつて提供されることを特徴とする請求の範囲
第２３項の方法。 ２５ 有機抽出剤が２−ブタノールであることを
特徴とする請求の範囲第９，２２，２３又は２４
項の方法。 ２６ 単離には次の工程が含まれることを特徴と
する請求の範囲第９項の方法： () 抽出液を水性緩衝液と混合する、 () （）の混合物のPHを下げることによつて
ヒトIFN−βを混合物から沈殿させる、 () 沈殿したヒトIFN−βを上澄液から単離す
る。 ２７ PHが約５より下まで下げられることを特徴
とする請求の範囲第２６項の方法。 ２８ 可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウムである
ことを特徴とする請求の範囲第２６又は２７項の
方法。 ２９ ヒトIFN−βを含有する形質転換させた大
腸菌が発酵培地中に含まれており、この細菌から
ヒトIFN−βを回収するための、以下の工程を特
徴とする方法： (a) 発酵培地中の細菌を濃縮する、 (b) 細菌を圧力循環にかけることによつて、細菌
の細胞膜を破裂する、 (c) 固体細胞物質を破裂液の残りから分離する、 (d) ２ないし15mg／mlの範囲のタンパク質濃度及
び約７ないし約８の範囲のPHで、細胞物質を水
性培地に懸濁する、 (e) 細胞物質をドデシル硫酸ナトリウムにより、
約１：１ないし１：５のドデシル硫酸ナトリウ
ム／タンパク質の重量比で可溶化する、 (f) 水性培地からヒトIFN−βを２−ブタノール
で抽出する（その場合、水性培地のイオン強度
は水性培地と２−ブタノールを実質的に混ざら
ない状態に保持するのに十分なものとする）、 (g) ヒトIFN−βを含有する２−ブタノール相か
ら水相を分離する、 (h) ２−ブタノール相に水性緩衝液を混合し、混
合物PHを約５より下に低下させることによつ
て、２−ブタノール相からヒトIFN−βを沈殿
させる。 技術分野 本発明は生化学工学の分野にある。更に詳しく
は、本発明は、ヒトIFN−βをつくりだすように
形質転換させた微生物からヒトIFN−βを分離又
は回収するための生化学的分離回収法に関する。 背景技術 天然のヒトIFN−βは、分子量22000〜26000ダ
ルトンをもつと言われる糖タンパク質である。他
のインターフエロンと同様、IFN−βは抗ウイル
ス活性、細胞生長又は分化の調整、免疫反応の変
調、及び酵素調整を含めた複数の生物学的効果を
もつものとして報告されている。天然のヒトIFN
−βは、種々のウイルス性又は非ウイルス性誘発
要因による誘発下に、ヒト線維芽細胞、白血球は
リンパ芽球用細胞によつてつくられる。天然のヒ
トIFN−βをつくるのに現在用いられている主な
方法の一つは、ポリIC（ポリリボイノシン酸：ポ
リリボシチジル酸）でヒト線維芽細胞培養基を重
複誘発することである。IFN−βは細胞の分泌物
からゲルクロマトグラフイ又は電気泳動によつて
単離される。この方法は、大規模臨床試験及び商
業的流通に必要とされるような量のヒトIFN−β
をつくる実際的な方法とは、現在考えられていな
い。 遺伝子工学がIFN−β生産の代替え方法を提供
している。IFN−βとつくる一つの組換え法は次
のようなものである。(1)ポリアデニン酸（ポリ
Ａ）の豊富な12S mRNAを、ウイルスで誘発し
たヒト白血球から抽出する。(2)このmRNAを２
本鎖cDNA合成の鋳型として使用する。(3)cDNA
を適当なベクターの中へクローン化する。(4)この
ベクターで大腸菌（E.Coli）を形質転換させる。
ヒトIFN−β生産技術については、1981年５月６
日公開の欧州特許出願第28033号、1981年７月15
日公開の欧州特許出願第32134号、1981年８月26
日公開の欧州特許出願第34307号、及び1981年６
月１日付けベルギー特許第837397号も参照のこ
と。 スキヤンデラ（Scandella）及びコーンバーグ
（Kornberg）［Biochemistry（1971年）10巻4447
〜4456頁］は大腸菌からのホスホリパーゼの単離
を記述している。この場合、細胞膜をドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）で可溶化し、溶液に１−ブ
タノールを加えると、SDSで可溶化されたタンパ
ク質の一部が沈殿する。デリンク（Derynk）ら
［Nature（1980年）287巻193〜197頁］はIFN−β
遺伝子を含有するプラスミドで形質転換させた大
腸菌細胞を１％SDS、１％２−メルカプトエタノ
ール、5M尿素中で加熱することによる大腸菌の
溶菌を報告している。溶菌液のS100抽出液は、
インターフエロン活性をもつことが報告された。
SDSを含有する組成物は、インターフエロン類の
生物学的活性を安定化するためにも使用された。
米国特許第3981991号も参照のこと。 上記の技術は、臨床試験及びその後の商業的流
通に必要な量のヒトIFN−βの実用的生産に適合
できるような、形質転換微生物体からのヒトIFN
−β回収法を教示ないし示唆してはいない。本発
明の主な目的は、このような方法を提供するにあ
る。 発明の開示 本発明は、適当な可溶化剤で可溶化されたヒト
IFN−βを水性培地から抽出する方法であり、こ
の方法はヒトIFN−β含有性培地を抽出剤に接触
させることからなり、この抽出剤が式 ［式中Ｒは水素又はメチル］のアルコールである
ことを特徴としている。 本発明方法の好ましい態様は、ヒトIFN−βを
SDSで可溶化し、抽出液からそのPHを下げること
によつてヒトIFN−βを沈殿させ、それによつて
抽出液からヒトIFN−βを単離するものである。 好適な態様 本明細書で使用される用語「IFN−β」は、用
語「線維芽細胞インターフエロン」と同義であ
る。 本明細書で使用される用語「ヒトIFN−β」
は、ヒトIFN−β遺伝子又はヒトインターフエロ
ン遺伝子で形質転換させた微生物でつくられる
IFN−βを指しており、この遺伝子が発現させる
インターフエロンは、そのアミン酸配列が天然の
ヒトIFN−βと同じか、実質的に相同
（homologous）のものである。このようなイン
ターフエロン類は未グリコシル化インターフエロ
ン類、末端メチオニン基を欠いているインターフ
エロン類、及び非雑種IFN−β種と実質的に同様
な物理性状と化学性状（例えば疎水性、溶解度、
安定性）をもつた雑種性インターフエロン類を包
含する。 本明細書で使用される用語「形質転換させた微
生物」とは、ヒトIFN−βを生産するように遺伝
子操作された微生物を指す。形質転換させた微生
物の例は、前掲「背景技術」で言及された特許
（公開）文献や本出願の実施例に記述されている。
細胞は本発明での使用に好ましい微生物である。
大腸菌（E.Coli）が特に好ましい。 形質転換させた微生物を適当な生育培地中で、
典型的には680nｍで少なくとも約10、及び好ま
しくは680nｍで約50ないし約100の光学密度
（OD）まで生育させる。生育培地の組成は使用
の特定微生物によつて代わる。培地は微生物の栄
養要求を満たすような化合物類を含有する水性培
地である。成育培地は、典型的には同化できる炭
素源と窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カ
リウム及びナトリウムイオン類、及び任意にアミ
ノ酸類とプリン及びピリミジン塩基を含有する。
リヴユウ・オブ・メデイカル・マイクロバイオロ
ジー（Review of Medical Microbiology）、ラ
ング・メデイカル・パブリケーシヨンズ社、14
版、80〜85頁（1980年）。大腸菌用の生育培地は
この技術で周知である。本発明方法に使用される
特定可溶化剤にもよるが、水中で薬剤の可溶性を
減少させるような物質の量を生育培地中で最小限
度に抑えることが望ましい。例えばカリウムイオ
ンはSDSの溶解度に影響するため、本方法の可溶
化剤としてSDSを使用する時には、K+を最小限
に抑制すべきである。 培養基が望んでいる細胞密度に達したなら、任
意に、加熱するか、又はクロロホルムやトルエン
のように菌を殺した後に容易に除去できる細胞毒
剤を加えて殺菌するかする。その後、濾過、遠心
分離、又はその他の慣用方法によつて、必要に応
じて約20〜150mg／ml好ましくは80〜100mg／ml
（680nｍでOD40〜300、好ましくは160〜200）ま
で菌を濃縮する。濃縮工程もまた任意である。 濃縮後、微生物の細胞膜を破壊させる。破壊の
主目的は、次の濃縮中の粒状物質の可溶化を容易
にすることである。この点で、生物活性の検定か
ら、インターフエロンの多くは細胞膜に関連して
いる（すなわち膜の中に含まれているか膜に結合
されている）ことが示されている。従つて、細胞
膜の破壊は可溶化剤と膜との接触を強め、膜に結
びついたインターフエロンが溶液に入つていく速
度を高める。均質化、音波処理、又は圧力循環の
ような慣用の細胞破壊（ないし破裂）技術を本方
法のこの工程に使用できる。好ましい方法は、細
胞懸濁液を約3.4×104ないし１×105kPaまで圧力
循環させるものである。圧力の急低下のため細胞
が破裂する。破裂前又は破裂後、場合に応じて濃
縮液又は破裂液の液相PH、必要により濃縮液／破
裂液中の可溶化剤と粒状物質の溶解が容易になる
ように調整する。PH調整は、適当な緩衝液を加え
ることによつて行なう。大抵の場合、約７ないし
約８の範囲のPHが使用される。 細胞を破裂させた後、破裂液の液相から粒状物
質を分離し、可溶化のため最適PHまで緩衝された
水性培地へ再懸濁させる。いずれにしても、可溶
化にかける菌懸濁液のタンパク質濃度は、通常約
２ないし約15mg／ml、好ましくは６ないし８mg／
mlの範囲内にある。 ヒトIFN−β成分を含めた粒状細胞物質の可溶
化は、破裂と同時に、又は破裂のあとに続いて実
施でき、破裂後に別の段階として行なうのが好ま
しい。可溶化を完了させる。すなわち、破裂液中
の粒状物質（例えばタンパク質、脂質、核酸、燐
脂質）の実質的に全部を水性培地に溶解させるの
が好ましい。粒状物質のほぼ完全な溶解は、適当
な可溶化剤を水性懸濁液へ加えることによつて達
成される。ヒトIFN−βを可溶化するのに適した
疎水性−親水性平衡をもち、かつヒトIFN−βと
複合体（Complex）を形成して有機相へ抽出で
きるような表面活性剤（洗剤）を使用できる。脂
肪酸のアルカリ金属塩及びアルカリ金属アルキル
硫酸塩のような天然又は合成の強い陰イオン性表
面活性剤を使用できる。このような活性剤は通常
10〜14個の炭素原子を含有する。SDSとラウリン
酸ナトリウムが特に好ましい可溶化剤である。本
方法に使用できるその他の可溶化剤の例は、ドデ
シルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルス
ルホン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、
カプリン酸ナトリウム、ドデシルＮ−サルコシン
酸ナトリウム、及びテトラデシルＮ−サルコシン
酸ナトリウムである。 可溶化に用いられる可溶化剤の量は、特定可溶
化剤と可溶化されるタンパク質の量に左右されよ
う。ほとんどの場合、凡そ１：１ないし10：１の
範囲の可溶化剤：タンパク質重量比が十分であろ
う。SDS使用の場合、約１：１ないし約５：１、
好ましくは約３：１のSDS：タンパク質比が使用
される。15℃ないし60℃の範囲の温度が通常、可
溶化に使用されよう。溶液と粒状物質との接触を
強め、細胞物質を溶解するのに要する時間を短縮
するため、典型的には混合が使われるだろう。溶
液が実質的に透明な時は、可溶化が完了したもの
と考えられる。280nｍで約0.4未満のODが可溶化
終点の特徴である。 可溶化に続いて、溶液のイオン強度は、必要に
より、溶液と有機抽出液が実質的に混ざらない水
準まで調整される。イオン強度は、0.05ないし
0.15の範囲内にあるだろう。この目的には、
NaClのような無機塩類を溶液に添加できる。こ
のようなイオン強度によつて、抽出液の相分離が
可能となる。本方法に用いられる抽出剤は２−ブ
タノール、２−メチル−２−ブタノール又はこれ
らの混合物である。混合物は、約50容量％に満た
ない２−メチル−２−ブタノールを含有するのが
好ましい。２−ブタノールは好ましい抽出剤であ
る。可溶化質からヒトIFN−βを抽出するこれら
のアルコール類の抽出能力は特異的である。（他
の）同族アルコール類は無効な抽出剤であること
がわかつた。抽出剤は通常、ヒトIFN−β水溶液
と約0.8：１ないし約３：１、好ましくは約１：
１（抽出剤／水溶液）の範囲内の容量比で一緒に
される。抽出は、慣用の回分式又は連続式液−液
抽出技術及び設備を使用して行なうことができ
る。抽出は通常20℃ないし100℃で行なわれ、約
１分ないし１時間の接触時間を伴う。最適接触時
間は特定の可溶化剤：抽出剤の組合せによつて決
まる。SDSを使用する時は、上の範囲内の短い時
間を使用できる。ラウリン酸ナトリウムを使用す
る時は、この範囲内の長い時間を使わなければな
らない。抽出混合物のPHは約６ないし９の範囲に
あり、SDS使用ではPH約7.5、ラウリン酸ナトリ
ウム使用ではPH約8.5が好ましい。 抽出が完了したら、水相と抽出液相を分け、ヒ
トIFN−βを抽出液相から単離する。使用の特定
単離手順は使用可溶化剤と望んでいる純度の最終
生成物に応じて選択されよう。沈殿、分子ふるい
クロマトグラフイ、親和クロマトグラフイ、及び
電気泳動のような種々の単離技術を使用できる。
SDSを使用した場合には、約2.5：１ないし約
５：１の容量比で水性緩衝液と混合した抽出液か
ら、典型的には約５より下にPHを下げることによ
つて、IFN−βを他のタンパク質と一緒に沈殿さ
せることができる。上澄液から沈殿物を分離し、
沈殿物から残留抽出液を蒸発させると、約95％よ
り高い純度のタンパク質である生成物が得られ
る。この生成物は少量の核酸（＜１％ないし２重
量％）とSDS（＜1w／ｖ％）も含んでいる。SDS
は所望により、タスゼンスキー（Tuszenski）及
びウオーレン（Warren）〔Anal Biochem（1975
年）65巻〕の方法を使用する電気透析によつて除
去できる。可溶化剤としてラウリン酸ナトリウム
を使用する時には、これはPH低下によりタンパク
質と一緒に抽出液から沈殿する。ラウリン酸ナト
リウムは、アセトン又はメタノールのような溶媒
を使用してタンパク質から抽出できる。 こうして単離されたヒトIFN−βを使用時まで
凍結乾燥するか或は溶液にする。所望により、無
毒、非治療性、非免疫原の安定剤をIFN−βに添
加できる。溶液中に使用できる希釈剤は、注射薬
を処方するのに普通に使われる水性ベースのビー
スクルから選ばれる。希釈剤は当然ながらIFN−
βの生物学的活性に影響するものであつてはなら
ない。このような希釈剤の例は食塩水、リンゲル
液、ブドウ糖液、ハンク液である。凍結乾燥され
たヒトIFN−βを再構成するのに同じ希釈剤を使
用できる。 本発明方法を以下の実施例によつて更に説明す
る。これらの実施例は、いかなる形においても本
発明を限定するように意図されたものではない。 実施例 １ ヒトIFN−βを生産するために形質転換させた
大腸菌（E.Coli）からヒトIFN−βを回収した。
大腸菌を680mmで10〜11の細胞密度（OD）（乾燥
重量8.4ｇ／）まで、次の生育培地中で生育さ
せた。成 分 濃 度 NH4Cl 20μM K2SO4 16.1μM KH2PO4 7.8μM Na2HPO4 12.2μM MgSO4・7H2O 3μM Na3サイトレート・2H2O 1.5μM MnSO4・4H2O 30μM FeSO4・7H2O 30μM CuSO4・5H2O 3μM Ｌ−トリプトフアン 70mg／ｌ FeSO4・7H2O 72μM チアミンHCl 20mg／ｌ テトラサイクリン 10mg／１ グルコース 40ｇ／ｌ PHはNH4OHで調製。 形質転換させた大腸菌の収穫物9.9（9.9Kg）
を20℃に冷却し、8.8Kgの濾液重量まで平均圧力
損失1.12Kg／cm2（16psi）、定常状態濾液流量260
ml／分で収穫物をクロスフローフイルターに通し
て濃縮した。濃縮液（約１）を容器に抜き出
し、15℃に冷却した。濃縮液をマントン＝ゴーリ
ンホモジナイザーに５℃、700Kg／cm2（10000psi）
で通すことによつて、濃縮液中の細胞を破裂させ
た。燐酸緩衝された食塩水（PBS、PH7.4）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破裂液に加
え、最終容量２とした。この量を12000×ｇ、
流量毎分50mlで連続遠心分離にかけた。固形分を
上澄液から分離し、２重量％SDSを含有する燐酸
緩衝食塩水４に再懸濁した。この懸濁液を室温
で15分かきまぜた後、目に見える懸濁物質はなか
つた。次に溶液を２−ブタノールで、２−ブタノ
ール：溶液容量比１：１で抽出した。毎分200ml
の流量を使用する液−液分離装置で抽出を行なつ
た。次に有機相を分離し、乾固まで蒸発させる
と、タンパク質21.3ｇを生じた。これを蒸留水
へ、１：10の容量比で再懸濁した。 回収生成物は、ウイルスの細胞病理効果
（CPE）に対する防護に基づく検定を使用して、
ヒトIFN−βについて検定された。この検定を微
量滴定プレート中で行なつた。各容器に最少基本
培地50μを仕込み、第一容器に試料25μを入
れ、以降の容器には１：３容量の希釈を連続的に
行なつた。ウイルス（水泡性口内炎）、細胞（ヒ
ト線維芽細胞系GM−2504）及び標準IFN−β対
照を各プレートに含めている。標準IFN−βはml
当り100単位である。次にプレートに紫外線光を
10分照射する。照射後、各容器に細胞懸濁液（ml
当り1.2×105細胞）100μを加え、トレーを18〜
24時間培養する。細胞当り１プラーク形成単位の
ウイルス液を細胞対照以外の各容器に加える。次
にウイルス対照が100％のウイルス細胞病理効果
（CPE）を示すまでトレーを培養する。これは、
ウイルス液を加えてから18〜24時間に通常起る。
検定結果は、標準IFN−β対照の50％細胞病理効
果の位置に関連して解釈される。この点から、プ
レート上の全試料に対するインターフエロンの滴
定値が決定される。回収された生成物の活性は
2.9×106U／mgと決定された。 実施例 ２ 可溶化剤としてSDS、抽出剤として２−ブタノ
ール、２−メチル−２−ブタノール又はその種々
の混合物を使用して、ヒトINF−βの部分的精製
を行なつた。その他のアルコール類を使用する精
製も試みた。これらの精製に用いた手順は次のと
おりである。 大腸菌の細胞1.3ｇ（湿量）を0.1M燐酸緩衝食
塩水（PBS、PH7.4）中の1w／ｖ％SDS10ml中に
懸濁した。懸濁液を透明になるまで超音波処理し
た。超音波処理液に同量の抽出剤を加えて混合
し、周囲温度で10分間、7000×ｇで遠心分離し
た。抽出剤相と水相とを分離し、抽出剤相は実施
例１に言及された検定法を用いてIFN−βの検定
にかけた。下表はこれらの検定の結果を提示して
いる。
【表】
【表】
第１表のデータは、本方法における２−ブタノ
ール及び２−メチル−２−ブタノールの特異性を
示している。また、１−ブタノール、２−メチル
−１−ブタノール及び１−ペンタノールのような
他の同族アルコール類が本方法で抽出剤として有
効でないことをデータを示している。 実施例 ３ 10タンクから収穫物（9.8Kg）を得て、クロ
スフロー濾過によつて2.2に濃縮した。スラリ
ーを凍結させ、34日間貯えてから解凍した。 解凍された濃縮液をマントン＝ゴウリン式ホモ
ジナイザーで７×104kPaで３回処理して細胞を
破砕させた。破砕液を集め、ラウリン酸塩1w／
ｖ％の最終濃度を与えるようにラウリン酸ナトリ
ウム溶液で全量を４にした。10％NaOHでPH
を8.5に調製した。溶液をスタテイツクミキサー
中で50容量％２−ブタノールと50重量％２−メチ
ル−２−ブタノールとの混合物に接触させた。エ
マルシヨンを保持タンクにポンプで送り、15分の
接触時間を取るべくかきまぜた。このエマルシヨ
ンを実施例１と同様に分離し、IFN−βを有機相
へ回収した。回収された生成物の活性は初期の16
％であり、タンパク質mg当たり3.7×105Uのスペ
シフイツク アクテイヴイテイ（実施例１のとお
りに決定）をもつていた。 実施例 ４ 実施例１の方法をくり返したが、但し抽出して
水相と有機相を分離し、有機相に燐酸緩衝食塩水
（PBS）を３：１の容量比で混合した後、氷酢酸
添加によつて混合物PHを約５に低下させた。生ず
る沈殿物を10000〜17000×ｇで15分の遠心分離に
よつて分離し、ペレツトを10w／ｖ％SDSに再溶
解した。 セパクリルＳ−200スーパーフアイン（ブアー
マシア）マトリツクスを入れた分子ふるいカラム
に沈殿物を通した。２ｍＭジチオスレイトール及
び0.1w／ｖ％SDSを含有する50ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH5.5）でカラムを平衡化した。同
じ緩衝液で毎時cm2当たり15.6mlの流量でカラムを
展開した。紫外線分光光度計でタンパク質分布を
280nｍでモニターした。集めた分画をローリー
（Lowry）の方法でタンパク質含量について検定
した。インターフエロン濃度は、実施例１に説明
されたウイルス細胞病理効果（CPE）検定法に
よつて決定された。インターフエロン純度の決定
をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔レム
レ（Laemmle）、Nature1970年〕によつて決定
した。最高のインターフエロン活性を含有する分
画をプールし、プールされたインターフエロン調
製剤のスペシフイツク アクテイヴイテイはタン
パク質mg当たり１〜２×107国際単位と決定され
た。
ール及び２−メチル−２−ブタノールの特異性を
示している。また、１−ブタノール、２−メチル
−１−ブタノール及び１−ペンタノールのような
他の同族アルコール類が本方法で抽出剤として有
効でないことをデータを示している。 実施例 ３ 10タンクから収穫物（9.8Kg）を得て、クロ
スフロー濾過によつて2.2に濃縮した。スラリ
ーを凍結させ、34日間貯えてから解凍した。 解凍された濃縮液をマントン＝ゴウリン式ホモ
ジナイザーで７×104kPaで３回処理して細胞を
破砕させた。破砕液を集め、ラウリン酸塩1w／
ｖ％の最終濃度を与えるようにラウリン酸ナトリ
ウム溶液で全量を４にした。10％NaOHでPH
を8.5に調製した。溶液をスタテイツクミキサー
中で50容量％２−ブタノールと50重量％２−メチ
ル−２−ブタノールとの混合物に接触させた。エ
マルシヨンを保持タンクにポンプで送り、15分の
接触時間を取るべくかきまぜた。このエマルシヨ
ンを実施例１と同様に分離し、IFN−βを有機相
へ回収した。回収された生成物の活性は初期の16
％であり、タンパク質mg当たり3.7×105Uのスペ
シフイツク アクテイヴイテイ（実施例１のとお
りに決定）をもつていた。 実施例 ４ 実施例１の方法をくり返したが、但し抽出して
水相と有機相を分離し、有機相に燐酸緩衝食塩水
（PBS）を３：１の容量比で混合した後、氷酢酸
添加によつて混合物PHを約５に低下させた。生ず
る沈殿物を10000〜17000×ｇで15分の遠心分離に
よつて分離し、ペレツトを10w／ｖ％SDSに再溶
解した。 セパクリルＳ−200スーパーフアイン（ブアー
マシア）マトリツクスを入れた分子ふるいカラム
に沈殿物を通した。２ｍＭジチオスレイトール及
び0.1w／ｖ％SDSを含有する50ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH5.5）でカラムを平衡化した。同
じ緩衝液で毎時cm2当たり15.6mlの流量でカラムを
展開した。紫外線分光光度計でタンパク質分布を
280nｍでモニターした。集めた分画をローリー
（Lowry）の方法でタンパク質含量について検定
した。インターフエロン濃度は、実施例１に説明
されたウイルス細胞病理効果（CPE）検定法に
よつて決定された。インターフエロン純度の決定
をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔レム
レ（Laemmle）、Nature1970年〕によつて決定
した。最高のインターフエロン活性を含有する分
画をプールし、プールされたインターフエロン調
製剤のスペシフイツク アクテイヴイテイはタン
パク質mg当たり１〜２×107国際単位と決定され
た。
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