JPS6356300A - 核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法 - Google Patents
核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、核酸またはエンドトキシンを含む系から核酸
またはエンドトキシンを除去するための薬剤および方法
、特に蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む系
から核酸またはエンドトキシンを除去するための薬剤お
よび方法に関するものである。
またはエンドトキシンを除去するための薬剤および方法
、特に蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む系
から核酸またはエンドトキシンを除去するための薬剤お
よび方法に関するものである。
微生物やヒト、動物または植物組織などの細胞を培養し
て、細胞中の生理活性物質や蛋白質、酵素などの有用物
質が採取、生産されている。また、近年バイオテクノロ
ジーの進歩に伴い生理活性物質や有用蛋白質、ホルモン
などの蛋白質類を産生ずる遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターを用いて形質転換した微生物を培養することにより
、−これら有用物質を効率的に大量生産する方法が広く
実用化されている。いずれの場合においても、一般的に
はまず培養後の細胞を機械的破砕法、超音波破！法など
を用いて細胞壁または細胞膜を破壊し、次いで遠心分離
法などによって無細胞抽出液を櫓る。そしてこの無細胞
抽出液中の核酸等の不純物を除去した後、クロマトグラ
フィなどの分離手段により、所望の精製有用物質を生産
している。
て、細胞中の生理活性物質や蛋白質、酵素などの有用物
質が採取、生産されている。また、近年バイオテクノロ
ジーの進歩に伴い生理活性物質や有用蛋白質、ホルモン
などの蛋白質類を産生ずる遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターを用いて形質転換した微生物を培養することにより
、−これら有用物質を効率的に大量生産する方法が広く
実用化されている。いずれの場合においても、一般的に
はまず培養後の細胞を機械的破砕法、超音波破！法など
を用いて細胞壁または細胞膜を破壊し、次いで遠心分離
法などによって無細胞抽出液を櫓る。そしてこの無細胞
抽出液中の核酸等の不純物を除去した後、クロマトグラ
フィなどの分離手段により、所望の精製有用物質を生産
している。
従来、このような無細胞抽圧液中に含まれる蛋白性有用
物質と核酸等の不純物の分離除去法としては、塩酸など
で抽出液のｐｉを酸性領域（４，１〜４．８）に調整す
ることにより主として蛋白性有用物質を沈殿する方法（
特開昭５３−１２４９６号）、硫酸アンモニウムを用い
て塩析する方法（特公昭４８−４３８４１号）、多価金
属塩などを用いて凝集する方法（特開昭５５−１１４２
９０号）、プロタミン硫酸あるいはストレプトマイシン
硫酸を用いて核酸を凝集する方法（特開昭５５−１１４
２９０号、生化学実験講座５巻、２００〜２０１頁）、
またポリエチレンイミンを用いて核酸を凝集する方法（
特開昭５７−１４６５７５号、特開昭５８−１５２４７
８号）などが知られている。
物質と核酸等の不純物の分離除去法としては、塩酸など
で抽出液のｐｉを酸性領域（４，１〜４．８）に調整す
ることにより主として蛋白性有用物質を沈殿する方法（
特開昭５３−１２４９６号）、硫酸アンモニウムを用い
て塩析する方法（特公昭４８−４３８４１号）、多価金
属塩などを用いて凝集する方法（特開昭５５−１１４２
９０号）、プロタミン硫酸あるいはストレプトマイシン
硫酸を用いて核酸を凝集する方法（特開昭５５−１１４
２９０号、生化学実験講座５巻、２００〜２０１頁）、
またポリエチレンイミンを用いて核酸を凝集する方法（
特開昭５７−１４６５７５号、特開昭５８−１５２４７
８号）などが知られている。
一方、前記抽出液中の所望の有用物質が医薬など直接人
体内に投与されるものである場合には特にエンドトキシ
ンの除去が問題となる。エンドトキシンは菌体内毒素と
も呼ばれ、特にダラム陰性菌例えば大腸菌由来のエンド
トキシンは強力な発熱性物質であり、注射などにより人
体内に運び込まれると悪寒や発熱を惹起する。従ってエ
ンドトキシンの効率の良い除去法が切望されている。
体内に投与されるものである場合には特にエンドトキシ
ンの除去が問題となる。エンドトキシンは菌体内毒素と
も呼ばれ、特にダラム陰性菌例えば大腸菌由来のエンド
トキシンは強力な発熱性物質であり、注射などにより人
体内に運び込まれると悪寒や発熱を惹起する。従ってエ
ンドトキシンの効率の良い除去法が切望されている。
従来、エンドトキシンを除去する方法として。
酸化剤（特開昭５６−６３９２４号）、加熱（特開昭５
４−５１２４５号）、活性炭（特開昭５２−３６８８７
号）、イオン交換樹脂（特開昭５２−５７３１４号）、
合成吸着体（特開昭５０−６９２２０号、特開昭５７−
１８３７１２号）、限外濾過膜（特公昭５６−２８１５
６号）、逆浸透膜（特開昭５３−６４９４８号）などに
よる除去方法が知られている。また蛋白質とエンドトキ
シンとを含む液にアルミニウム塩および亜鉛塩を添加し
て、蛋白質を沈殿させる一方、エンドトキシンを上澄液
側に残留させる方法も知られている（特開昭５７−３５
５２１号）。
４−５１２４５号）、活性炭（特開昭５２−３６８８７
号）、イオン交換樹脂（特開昭５２−５７３１４号）、
合成吸着体（特開昭５０−６９２２０号、特開昭５７−
１８３７１２号）、限外濾過膜（特公昭５６−２８１５
６号）、逆浸透膜（特開昭５３−６４９４８号）などに
よる除去方法が知られている。また蛋白質とエンドトキ
シンとを含む液にアルミニウム塩および亜鉛塩を添加し
て、蛋白質を沈殿させる一方、エンドトキシンを上澄液
側に残留させる方法も知られている（特開昭５７−３５
５２１号）。
しかしながら、前記核酸等の不純物の除去法において、
無細胞抽出液を低いｐＨ領域で処理する方法、硫酸アン
モニウムを用いる方法、あるいは多価金属塩を用いる方
法は蛋白性有用物質を一旦沈殿させる方法であり、有用
物質をさらに精製するためには沈殿物を再溶解させる必
要がある上、分離効果も十分に満足のいくものではない
。・さらに硫酸アンモニウムによる塩析法においてはそ
の後透析工程などを必要とし繁雑さを伴う、またプロタ
ミン硫酸やストレプトマイシン硫酸を用いる核酸除去法
は試薬が高価なため工業的スケールでの処理法としては
経済性の面で適当でなく、異種蛋白質の混入や抗生物質
の残留などの面でも問題が残る。一方、ポリエチレンイ
ミンを用いる核酸凝集法はかなりの核酸除去効果がみら
れるものの、有害なポリエチレンイミンの分解物の残留
の恐れがあり適切な方法ではない。
無細胞抽出液を低いｐＨ領域で処理する方法、硫酸アン
モニウムを用いる方法、あるいは多価金属塩を用いる方
法は蛋白性有用物質を一旦沈殿させる方法であり、有用
物質をさらに精製するためには沈殿物を再溶解させる必
要がある上、分離効果も十分に満足のいくものではない
。・さらに硫酸アンモニウムによる塩析法においてはそ
の後透析工程などを必要とし繁雑さを伴う、またプロタ
ミン硫酸やストレプトマイシン硫酸を用いる核酸除去法
は試薬が高価なため工業的スケールでの処理法としては
経済性の面で適当でなく、異種蛋白質の混入や抗生物質
の残留などの面でも問題が残る。一方、ポリエチレンイ
ミンを用いる核酸凝集法はかなりの核酸除去効果がみら
れるものの、有害なポリエチレンイミンの分解物の残留
の恐れがあり適切な方法ではない。
また、前記のエンドトキシンの除去法に関しては、例え
ば酸化剤や加熱による方法では液中のエンドトキシンは
除去されても共存している有用物質の変性失活を伴なう
。さらに、吸着法では有用物質とエンドトキシンとの分
離効率が十分ではない。一方膜法では有用物質が高分子
物質である場合に、分子景が１００万以上であるエンド
トキシンどの分離は不可能であり、また設備費や装置の
維持の面で難点がある。さらにアルミニウム塩と亜鉛塩
による方法は、蛋白質を沈殿させて発熱性物質と分離す
るものであり、得られた蛋白質をさらに精製する場合に
は再溶解する工程が必要となる。
ば酸化剤や加熱による方法では液中のエンドトキシンは
除去されても共存している有用物質の変性失活を伴なう
。さらに、吸着法では有用物質とエンドトキシンとの分
離効率が十分ではない。一方膜法では有用物質が高分子
物質である場合に、分子景が１００万以上であるエンド
トキシンどの分離は不可能であり、また設備費や装置の
維持の面で難点がある。さらにアルミニウム塩と亜鉛塩
による方法は、蛋白質を沈殿させて発熱性物質と分離す
るものであり、得られた蛋白質をさらに精製する場合に
は再溶解する工程が必要となる。
本発明は上記問題点を解決するためのもので。
核酸または（および）エンドトキシンを効率よく、簡便
かつ安全に分潴除去することが可能な核酸またはエンド
トキシンの除去剤および除去方法を堤供することを目的
としている。
かつ安全に分潴除去することが可能な核酸またはエンド
トキシンの除去剤および除去方法を堤供することを目的
としている。
本発明は次の核酸またはエンドトキシンの除去剤および
除去方法である。
除去方法である。
（１）低分子キトサンを有効成分として含有することを
特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。
特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。
（２）低分子キトサンを用いて核酸または壬ンドトキシ
ンを分離することを特徴とする核酸またはエンドトキシ
ンの除去方法。
ンを分離することを特徴とする核酸またはエンドトキシ
ンの除去方法。
本発明において用いられる低分子キトサンは天然のキチ
ンから得られるキトサンの低分子化物で、固有粘度０．
Ｏ１〜５ Ｃｄ０１ｇ）のもの、好ましくは０．０３〜
２（ｄΩ／ｇ）のもの、さらに好ましくは０．２〜１（
ｄ塁／ｇ）のものが適当である。固有粘度０．０１未満
の場合ならびに５を超える場合は核酸またはエンドトキ
シンの除去効率は低下する。また低分子キトサンはｐＨ
４におけるコロイド当Ｍｋ ２ ｍａｑ／ｇ−蒸発残分
以上、特に４ ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分以上のものが好ま
しい。２１！Ｉｅｑ１ｇ−蒸発残分未満では、大量添加
する必要があり好ましくない。従って本発明において用
いられる低分子キトサンとしては、固有粘度０．２〜Ｉ
Ｃｄ０１ｇ）、ｐＨ４におけるコロイド当量４Ｉｌｅ
９１ｇ−蒸発残分以上のものが特に好ましい。
ンから得られるキトサンの低分子化物で、固有粘度０．
Ｏ１〜５ Ｃｄ０１ｇ）のもの、好ましくは０．０３〜
２（ｄΩ／ｇ）のもの、さらに好ましくは０．２〜１（
ｄ塁／ｇ）のものが適当である。固有粘度０．０１未満
の場合ならびに５を超える場合は核酸またはエンドトキ
シンの除去効率は低下する。また低分子キトサンはｐＨ
４におけるコロイド当Ｍｋ ２ ｍａｑ／ｇ−蒸発残分
以上、特に４ ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分以上のものが好ま
しい。２１！Ｉｅｑ１ｇ−蒸発残分未満では、大量添加
する必要があり好ましくない。従って本発明において用
いられる低分子キトサンとしては、固有粘度０．２〜Ｉ
Ｃｄ０１ｇ）、ｐＨ４におけるコロイド当量４Ｉｌｅ
９１ｇ−蒸発残分以上のものが特に好ましい。
低分子キトサンの原料となるキトサンはカニやエビの甲
羅などからキチンをとりだし、アルカリで脱アセチル化
することにより得られる高分子−物質である。このキト
サンに過酸化水素、亜硝酸イオン、アルカリ、酸などを
加えてグルコシド結合を切断することにより、低分子キ
トサンを製造することができろ。特に過酸化水素による
切断方法はキトサンのコロイド当量をほとんど低″減す
ることなく行えるので好ましく、キトサンに対する過酸
化水素の添加濃度を適当に調節することにより、任意の
固有粘度の低分子キトサンが得られる。この方法では、
キトサンをアルカリ液中に＠濁させ、適量の過酸化水素
を添加して一定温度下に一定時間反応させ、濾過などに
より水分を除去して乾燥することにより低分子キトサン
の粉末を得ることができる。このときのキトサンの切断
条件はｐＨ６、〜１２．過酸化水素濃度０．００５〜ｌ
Ｏ重址％、液；ｉ ２０〜９０℃５反応時間３０〜５０
０分程度が好ましい。
羅などからキチンをとりだし、アルカリで脱アセチル化
することにより得られる高分子−物質である。このキト
サンに過酸化水素、亜硝酸イオン、アルカリ、酸などを
加えてグルコシド結合を切断することにより、低分子キ
トサンを製造することができろ。特に過酸化水素による
切断方法はキトサンのコロイド当量をほとんど低″減す
ることなく行えるので好ましく、キトサンに対する過酸
化水素の添加濃度を適当に調節することにより、任意の
固有粘度の低分子キトサンが得られる。この方法では、
キトサンをアルカリ液中に＠濁させ、適量の過酸化水素
を添加して一定温度下に一定時間反応させ、濾過などに
より水分を除去して乾燥することにより低分子キトサン
の粉末を得ることができる。このときのキトサンの切断
条件はｐＨ６、〜１２．過酸化水素濃度０．００５〜ｌ
Ｏ重址％、液；ｉ ２０〜９０℃５反応時間３０〜５０
０分程度が好ましい。
本発明の核酸またはエンドトキシン除去剤−は上記のよ
うな低分子キトサンを有効成分として含有するものであ
り、他の成分をさらに含有していてもよい。他の成分と
しては天然または合成の凝集剤、凝集助剤その他の添加
剤が配合可能である。
うな低分子キトサンを有効成分として含有するものであ
り、他の成分をさらに含有していてもよい。他の成分と
しては天然または合成の凝集剤、凝集助剤その他の添加
剤が配合可能である。
本発明において除去の対象となるのは核酸またはエンド
トキシンであり、核酸およびエンドトキシンを一緒に除
去する場合も含まれる。本発明において除去とは、被処
理系から核酸またはエンドトキシンを分離除去すること
を意味し、被処理系に核酸またはエンドトキシンが不純
物として含まれている場合のほか、有価物として含まれ
ている場合もある。核酸またはエンドトキシンが不純物
として含まれている場合は、不純物としての核酸または
エンドトキシンを分離除去することにより、有価物を精
製、回収する。逆に核酸またはエンドトキシンが有価物
として含まれている場合は、これらを有価物として分離
し、精製、回収する。
トキシンであり、核酸およびエンドトキシンを一緒に除
去する場合も含まれる。本発明において除去とは、被処
理系から核酸またはエンドトキシンを分離除去すること
を意味し、被処理系に核酸またはエンドトキシンが不純
物として含まれている場合のほか、有価物として含まれ
ている場合もある。核酸またはエンドトキシンが不純物
として含まれている場合は、不純物としての核酸または
エンドトキシンを分離除去することにより、有価物を精
製、回収する。逆に核酸またはエンドトキシンが有価物
として含まれている場合は、これらを有価物として分離
し、精製、回収する。
核酸またはエンドトキシンの除去を行うべき被処理系と
しては特に制限されず、核酸またはエンドトキシンを含
む液が広く処理対象となる。核酸またはエンドトキシン
を不純物として含む被処理液としては、有価物である特
定の蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む液が
あり、この場合被処理液から核酸またはエンドトキシン
を分゛離除去し、有価物としての蛋白質類を精製する。
しては特に制限されず、核酸またはエンドトキシンを含
む液が広く処理対象となる。核酸またはエンドトキシン
を不純物として含む被処理液としては、有価物である特
定の蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む液が
あり、この場合被処理液から核酸またはエンドトキシン
を分゛離除去し、有価物としての蛋白質類を精製する。
上記の分離除去において精製の対象とされる蛋白質類は
等電点３以上の可溶性の蛋白質または蛋白様物質を意味
し、例えばインターフェロン、癌壊死因子（ＴＮＦ）、
リンホトキシン、インターロイキンなどのヒト細胞由来
抗癌物質、コロニー活性化因子、マクロファージ活性化
因子などの免疫系調節因子、アルブミン、γ−グロブリ
ン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、
スーパーオキサイドデスムターゼ、エリスロポエチンな
どの血液組織由来蛋白質、インスリン、成長ホルモン、
ソマトスタチンなどのホルモン、その他菌体あるいは細
胞由来の各種酵素および生理活性ペプチドなどが挙げら
れる。このような蛋白質類には新しく単離される物質も
含まれる。
等電点３以上の可溶性の蛋白質または蛋白様物質を意味
し、例えばインターフェロン、癌壊死因子（ＴＮＦ）、
リンホトキシン、インターロイキンなどのヒト細胞由来
抗癌物質、コロニー活性化因子、マクロファージ活性化
因子などの免疫系調節因子、アルブミン、γ−グロブリ
ン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、
スーパーオキサイドデスムターゼ、エリスロポエチンな
どの血液組織由来蛋白質、インスリン、成長ホルモン、
ソマトスタチンなどのホルモン、その他菌体あるいは細
胞由来の各種酵素および生理活性ペプチドなどが挙げら
れる。このような蛋白質類には新しく単離される物質も
含まれる。
これらの蛋白質類を含む被処理液としては、微生物やヒ
ト、動物または植物組織などの細胞を破壊した無細胞抽
出液などの抽出液あるいは培養液などがある。このほか
被処理液としては医薬用などに用いられる用水があり、
このような用水からエンドトキシンなどの不純物を分離
除去して精製し、注射液などに利用される。
ト、動物または植物組織などの細胞を破壊した無細胞抽
出液などの抽出液あるいは培養液などがある。このほか
被処理液としては医薬用などに用いられる用水があり、
このような用水からエンドトキシンなどの不純物を分離
除去して精製し、注射液などに利用される。
本発明の核酸またはエンドトキシン除去剤は上記のよう
な被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離除去す
るために用いられる。核酸またはエンドトキシンの除去
方法は、被処理液に本発明の核酸またはエンドトキシン
除去剤を加え、生成する析出物を固液分離により除去す
る。この場合核酸およびエンドトキシンは低分子キトサ
ンと結合して不溶物となって沈殿するので、固液分離す
ることにより除去可能である。本発明の核酸またはエン
ドトキシン除去剤は低分子キトサン１〜ｌＯ重景％の水
溶液として被処理液に添加するのが好ましいが、粉末状
で添加してもよい。このほか低分子キトサンを担体に吸
着させてカラムに充填し。
な被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離除去す
るために用いられる。核酸またはエンドトキシンの除去
方法は、被処理液に本発明の核酸またはエンドトキシン
除去剤を加え、生成する析出物を固液分離により除去す
る。この場合核酸およびエンドトキシンは低分子キトサ
ンと結合して不溶物となって沈殿するので、固液分離す
ることにより除去可能である。本発明の核酸またはエン
ドトキシン除去剤は低分子キトサン１〜ｌＯ重景％の水
溶液として被処理液に添加するのが好ましいが、粉末状
で添加してもよい。このほか低分子キトサンを担体に吸
着させてカラムに充填し。
被処理液を通水して低分子キトサンを徐々に溶解させて
核酸またはエンドトキシンを沈殿させたり、あるいは低
分子キトサンを担体に固定し、被処理液を通水して核酸
、またはエンドトキシンを担体に吸着させて除去しても
よく、除去の具体的な方法は任意に選択可能である。
核酸またはエンドトキシンを沈殿させたり、あるいは低
分子キトサンを担体に固定し、被処理液を通水して核酸
、またはエンドトキシンを担体に吸着させて除去しても
よく、除去の具体的な方法は任意に選択可能である。
以下に特定の蛋白質類含有細胞抽出液から核酸およびエ
ンドトキシンを分離除去する方法を例にとって除去方法
を具体的に説明する。この方法では蛋白質類含有無細胞
抽出液に低分子キトサンを加えて攪拌すると、核酸およ
びエンドトキシンが低分子キトサンとともに沈殿するの
で、これを常法に従って固液分離し、蛋白質類から核酸
およびエンドトキシンを分離除去する。
ンドトキシンを分離除去する方法を例にとって除去方法
を具体的に説明する。この方法では蛋白質類含有無細胞
抽出液に低分子キトサンを加えて攪拌すると、核酸およ
びエンドトキシンが低分子キトサンとともに沈殿するの
で、これを常法に従って固液分離し、蛋白質類から核酸
およびエンドトキシンを分離除去する。
無細胞抽出液に低分子キトサンを添加した後の液のｐＨ
は等電点より若干高い値が好ましい。ｐ１４が８を超え
ると除去効果が低減するので好ましくない、被処理液の
塩濃度が高いと除去効果が低減するので、被処理液の塩
類濃度が高い場合には、予めできるだけ塩類濃度を低減
させて処理するのが望ましい０例えば塩化ナトリウムの
場合０．５Ｍ以上では除去効果が低減する。処理時の液
温は通常Ｏ〜５℃に調整するのが望ましいが、特に制限
されない、低分子キトサンの添加率は、通常核酸（ＤＮ
ＡおよびＲＮＡ）に対して５０〜２００重量％程度がよ
い。
は等電点より若干高い値が好ましい。ｐ１４が８を超え
ると除去効果が低減するので好ましくない、被処理液の
塩濃度が高いと除去効果が低減するので、被処理液の塩
類濃度が高い場合には、予めできるだけ塩類濃度を低減
させて処理するのが望ましい０例えば塩化ナトリウムの
場合０．５Ｍ以上では除去効果が低減する。処理時の液
温は通常Ｏ〜５℃に調整するのが望ましいが、特に制限
されない、低分子キトサンの添加率は、通常核酸（ＤＮ
ＡおよびＲＮＡ）に対して５０〜２００重量％程度がよ
い。
低分子キトサンを被処理系中に添加すると、核酸、エン
ドトキシンおよびその他の不純物が低分子キトサンと結
合し、不溶物を形成して沈殿する６精製の対象とされる
特定の蛋白質類は上清液に残存するので、上記の不純物
を容易に分離除去することができる。得られる特定の蛋
白質は、必要に応じさらに精製工程に付される。また低
分子キトサンに吸着された核酸またはエンドトキシンは
適当に処理することにより、有価物として回収すること
ができる。
ドトキシンおよびその他の不純物が低分子キトサンと結
合し、不溶物を形成して沈殿する６精製の対象とされる
特定の蛋白質類は上清液に残存するので、上記の不純物
を容易に分離除去することができる。得られる特定の蛋
白質は、必要に応じさらに精製工程に付される。また低
分子キトサンに吸着された核酸またはエンドトキシンは
適当に処理することにより、有価物として回収すること
ができる。
天然キチンから得られるキトサンは、そのまま希酸に溶
解すると、固有粘度１３（ｄＱ／ｇ）前後の粘稠なカチ
オン性コロイドが得られ、高濃度溶液の調製が不可能で
ある。またコロイド当量は５ ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分前
後で、十分な核酸またはエンドトキシン除去効果を得る
ためには、被処理液とほぼ等斌のキトサン溶液の添加を
必要とし、操作面および経済面から実用性に欠ける。
解すると、固有粘度１３（ｄＱ／ｇ）前後の粘稠なカチ
オン性コロイドが得られ、高濃度溶液の調製が不可能で
ある。またコロイド当量は５ ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分前
後で、十分な核酸またはエンドトキシン除去効果を得る
ためには、被処理液とほぼ等斌のキトサン溶液の添加を
必要とし、操作面および経済面から実用性に欠ける。
しかしながら、このようなキトサンを化学的処理して得
られる低分子キトサンは高濃度溶液の調製が可能である
とともに、核酸およびエンドトキシンの除去効率が高い
、このため極めて少容量で高い核酸およびエンドトキシ
ン除去効果が得られる。したがって細胞培養抽出液のよ
うな核酸およびエンドトキシンなどの不純物を大量に含
有する系から、これらの不純物を一緒に除去し、目的と
する特定の蛋白質類を効率よく、簡便に精製することが
可能である。
られる低分子キトサンは高濃度溶液の調製が可能である
とともに、核酸およびエンドトキシンの除去効率が高い
、このため極めて少容量で高い核酸およびエンドトキシ
ン除去効果が得られる。したがって細胞培養抽出液のよ
うな核酸およびエンドトキシンなどの不純物を大量に含
有する系から、これらの不純物を一緒に除去し、目的と
する特定の蛋白質類を効率よく、簡便に精製することが
可能である。
このように本発明では低分子キトサンを含有する除去剤
を用いることによって、極めて効率よく核酸またはエン
ドトキシンを被処理系から除去することができる。そし
て蛋白質類を含む被処理液に対して本発明の除去剤を用
いることにより、特定蛋白質類を溶液状態に保ったまま
核酸およびエンドトキシンを除去することができ、工程
的に極めて簡素化される。また無細胞抽出液中の蛋白質
類の精製において本発明の除去剤を用いることにより、
少容艦の添加で核酸またはエンドトキシンを効率よく除
去することができるので、後工程においてさらに精製す
る際にかかる負荷は最小限となる。このほか粘度の高い
核酸などを沈殿物として除去しうるので、その後の除菌
フィルターなどによる処理が可能となるばかりでなく、
クロマトグラフィなどによる精製も容易となる。また設
備費についても従来方法と比べるとはるかに低減され、
実用的価値は高い。
を用いることによって、極めて効率よく核酸またはエン
ドトキシンを被処理系から除去することができる。そし
て蛋白質類を含む被処理液に対して本発明の除去剤を用
いることにより、特定蛋白質類を溶液状態に保ったまま
核酸およびエンドトキシンを除去することができ、工程
的に極めて簡素化される。また無細胞抽出液中の蛋白質
類の精製において本発明の除去剤を用いることにより、
少容艦の添加で核酸またはエンドトキシンを効率よく除
去することができるので、後工程においてさらに精製す
る際にかかる負荷は最小限となる。このほか粘度の高い
核酸などを沈殿物として除去しうるので、その後の除菌
フィルターなどによる処理が可能となるばかりでなく、
クロマトグラフィなどによる精製も容易となる。また設
備費についても従来方法と比べるとはるかに低減され、
実用的価値は高い。
以上の通り１本発明によれば、低分子キトサンを有効成
分として除去剤に用いるので、被処理系から核酸または
エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全に分離除去す
ることができる。
分として除去剤に用いるので、被処理系から核酸または
エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全に分離除去す
ることができる。
以下１本発明の実施例について説明する。
（Ａ）低分子キトサン試料の製造：
まずカニの甲羅からキチンをとり出し、ＮａＯＨで脱ア
セチル化することによりキトサンを得た。次にこのキト
サンを３０または６７ｇ／（ｌをｐｕｔｔのＮａＯＨ溶
液中に懸濁させ、７０℃に維持した。次いで攪拌下ｏ、
ｏａａ〜１４ｇ／ΩのＨ２０□（純分）を添加し、１１
０〜３００分間反応させた後、粉末化した。得られた低
分子キトサン（Ｃ−１−Ｃ−９）の物性をキトサンの物
性とともに表−１に示す。
セチル化することによりキトサンを得た。次にこのキト
サンを３０または６７ｇ／（ｌをｐｕｔｔのＮａＯＨ溶
液中に懸濁させ、７０℃に維持した。次いで攪拌下ｏ、
ｏａａ〜１４ｇ／ΩのＨ２０□（純分）を添加し、１１
０〜３００分間反応させた後、粉末化した。得られた低
分子キトサン（Ｃ−１−Ｃ−９）の物性をキトサンの物
性とともに表−１に示す。
表−１中、Ｈ２Ｏ２は３５讐／Ｖ％水溶液である。固有
粘度〔η〕は試料に同量の酢酸を添加して０．２〜１０
ｇ／ｄＱの水溶液とし、この溶液を同容量の０．４Ｎ−
Ｃ１１３ＣＯＯＨ＋ ０ 、２Ｎ−Ｃ１１ＣＯＯＨａ
？Ｂ液と混合して〔η〕測定用の溶液を調製し、３０℃
でウベローデ粘度ａ［（希釈型）を用いて測定した値で
、希釈には０．２Ｎ−Ｃ）１．Ｃ００Ｈ＋０．ＩＮ−Ｃ
）ｌ、ＣＯＯＮａ溶液を用いた。またコロイド当量（Ｃ
，Ｅ、）はｐＨ４における値である。
粘度〔η〕は試料に同量の酢酸を添加して０．２〜１０
ｇ／ｄＱの水溶液とし、この溶液を同容量の０．４Ｎ−
Ｃ１１３ＣＯＯＨ＋ ０ 、２Ｎ−Ｃ１１ＣＯＯＨａ
？Ｂ液と混合して〔η〕測定用の溶液を調製し、３０℃
でウベローデ粘度ａ［（希釈型）を用いて測定した値で
、希釈には０．２Ｎ−Ｃ）１．Ｃ００Ｈ＋０．ＩＮ−Ｃ
）ｌ、ＣＯＯＮａ溶液を用いた。またコロイド当量（Ｃ
，Ｅ、）はｐＨ４における値である。
上記試料のうち、キトサンは非常に粘度が高く、その希
塩酸溶液の調ｉｐｉ度は０．５ｖ／ｖ％溶液（ｐＨ６）
であるが、Ｃ−１〜Ｃ−５については３ｖ／ｖ％溶液、
Ｃ−６〜Ｃ−８については５％ｒ／ｖ％溶液、Ｃ−９に
ついては１０ｗ／ｖ％溶液を調製することが可能である
。
塩酸溶液の調ｉｐｉ度は０．５ｖ／ｖ％溶液（ｐＨ６）
であるが、Ｃ−１〜Ｃ−５については３ｖ／ｖ％溶液、
Ｃ−６〜Ｃ−８については５％ｒ／ｖ％溶液、Ｃ−９に
ついては１０ｗ／ｖ％溶液を調製することが可能である
。
上記で得られたキトサンおよび低分子キトサン（Ｃ−１
−Ｃ−９）の所定量に同量の希塩酸を添加して溶解した
後、ＮａＯＨでＰＩ−１６，０〜７．０に調整して０．
５〜５ｗ／Ｖ％含有試料を製造し、以下の実験に供した
。
−Ｃ−９）の所定量に同量の希塩酸を添加して溶解した
後、ＮａＯＨでＰＩ−１６，０〜７．０に調整して０．
５〜５ｗ／Ｖ％含有試料を製造し、以下の実験に供した
。
（Ｂ）ヒト癌・壊死因子（ＴＮＦ）ポリペプチド含有細
胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開筒１５５，５４９号の実施例２（２
）に開示された方法に従って得たヒトＴＮＦポリペプチ
ド含有大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＴＲ
−９１）の培養液を用い、この培養液を遠心分離して集
菌し、菌体を破砕したのち遠心分離し、ヒト癌壊死因子
（ＴＮＦ）ポリペプチドを含有する上清液を得た。
胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開筒１５５，５４９号の実施例２（２
）に開示された方法に従って得たヒトＴＮＦポリペプチ
ド含有大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＴＲ
−９１）の培養液を用い、この培養液を遠心分離して集
菌し、菌体を破砕したのち遠心分離し、ヒト癌壊死因子
（ＴＮＦ）ポリペプチドを含有する上清液を得た。
これを以下の実験に供した。
（Ｃ）ヒトインターロイキン１ （ＩＬ−１）ポリペプ
チド含有細胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第１８８９２０号の実施例５（２）
に開示された方法に従って得たヒトインターロイキン１
（ＩＬ−１）ポリペプチド含有大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
１ＩＩ３１０１／ｐ）ＩＬＰ３８３）の培養液を用い
、この培養液を遠心分離して集菌し、菌体を破砕したの
ち遠心分歴しヒトインターロイキン１ （ＩＬ−１）ポ
リペプチドを含有する上清液を得た。これを除菌フィル
ター（Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ、フローラボラトリーズ社製
、商標。
チド含有細胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第１８８９２０号の実施例５（２）
に開示された方法に従って得たヒトインターロイキン１
（ＩＬ−１）ポリペプチド含有大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
１ＩＩ３１０１／ｐ）ＩＬＰ３８３）の培養液を用い
、この培養液を遠心分離して集菌し、菌体を破砕したの
ち遠心分歴しヒトインターロイキン１ （ＩＬ−１）ポ
リペプチドを含有する上清液を得た。これを除菌フィル
ター（Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ、フローラボラトリーズ社製
、商標。
孔径０．２μｍ）で濾過して後記（Ｖ）−（２）の実験
に供した。
に供した。
（１）キトサンの核酸分離効果：
前記（Ｂ）で得られた上清液（２ｍＱ）に対し、前記（
Ａ）で得られた固有粘度〔η） ＝ １３．５のキトサ
ンの０．５％＋７ｖ％溶液（ｐＨ３）を所定量添加攪拌
し、水冷下に１時間放置したのち、冷却遠心機を用いて
４℃、３０００回転１分で１０分間遠心分離し、上清液
を採取して上清液中に残存している核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ）および蛋白濃度を測定した。結果を表−２に示す。
Ａ）で得られた固有粘度〔η） ＝ １３．５のキトサ
ンの０．５％＋７ｖ％溶液（ｐＨ３）を所定量添加攪拌
し、水冷下に１時間放置したのち、冷却遠心機を用いて
４℃、３０００回転１分で１０分間遠心分離し、上清液
を採取して上清液中に残存している核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ）および蛋白濃度を測定した。結果を表−２に示す。
表−２
表−２の結果より、キトサン０．５ｗ／ｖ％溶液を上清
液とほぼ同量またはそれ以上添加することにより、核酸
除去効果が認められるが、溶液中に残存する蛋白質を回
収するには液量が多くなり、実用性に乏しい。また本試
料（キトサン）は通常の希塩酸による溶解法では、０．
５ｗ／ｖ％以上の濃度にすると粘度が高く調製が困難で
あった。
液とほぼ同量またはそれ以上添加することにより、核酸
除去効果が認められるが、溶液中に残存する蛋白質を回
収するには液量が多くなり、実用性に乏しい。また本試
料（キトサン）は通常の希塩酸による溶解法では、０．
５ｗ／ｖ％以上の濃度にすると粘度が高く調製が困難で
あった。
（ｎ）低分子キトサン（Ｃ−１−Ｃ−６）の核酸分離効
果：前記（Ｂ）で得られたロットの異なる上Ｉｎ液（２
ａ＋Ｑ）に対し、前記（Ａ）で製造した低分子キトサン
（Ｃ−１〜Ｃ−６）溶液（ｐＨ４）を前記（１）と同じ
条件で添加し、得られた結果を表−３および表−４に示
す。
果：前記（Ｂ）で得られたロットの異なる上Ｉｎ液（２
ａ＋Ｑ）に対し、前記（Ａ）で製造した低分子キトサン
（Ｃ−１〜Ｃ−６）溶液（ｐＨ４）を前記（１）と同じ
条件で添加し、得られた結果を表−３および表−４に示
す。
表−３
表−４
（ＩＩＩ）低分子キトサン（Ｃ−７〜Ｃ−９）の核酸お
よびエンドトキシン分離効果： 前記（Ａ）で製造した低分子キトサン（Ｃ−７〜Ｃ−９
）を希塩酸に７８ 薄したのち、６Ｎ水酸化ナトリウム
溶液でｐＨを６に調整し、低分子キトサンの最終濃度を
５ ｗ／ｖ％に調整した。
よびエンドトキシン分離効果： 前記（Ａ）で製造した低分子キトサン（Ｃ−７〜Ｃ−９
）を希塩酸に７８ 薄したのち、６Ｎ水酸化ナトリウム
溶液でｐＨを６に調整し、低分子キトサンの最終濃度を
５ ｗ／ｖ％に調整した。
前記（Ｂ）で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清
液（２ｎ＋Ｑ）に対して各低分子キトサン溶液を添加攪
拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて
４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し。
液（２ｎ＋Ｑ）に対して各低分子キトサン溶液を添加攪
拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて
４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し。
上清液を採取して核酸、エンドトキシンおよびＴＮＦの
定景を行った。結果を表−５に示す。
定景を行った。結果を表−５に示す。
（ＩＶ）低分子キトサン（Ｃ−９）による各種細胞培養
抽出液中の核酸除去効果： 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣ
Ｃ６６３３） 、パン酵母（Ｓａｃ、ｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２）凍結乾燥菌体２
．５ｇあるいはシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１３４３０）の
凍結乾燥菌体１．３ｇを２０１１ＩＭトリスー塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５） ５０ｍＭに懸濁し超音波処理（トミ
ー精工、モデルＵＲ−２００Ｐ） した。冷却遠心機を
用いて４°Ｃ１１ｏ、ｏｏｏ回転／分で１０分間遠心分
離した上清液をそれぞれ枯草菌、パン酵母、大腸菌、シ
ュードモナス菌抽出液として使用した。
抽出液中の核酸除去効果： 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣ
Ｃ６６３３） 、パン酵母（Ｓａｃ、ｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２）凍結乾燥菌体２
．５ｇあるいはシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１３４３０）の
凍結乾燥菌体１．３ｇを２０１１ＩＭトリスー塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５） ５０ｍＭに懸濁し超音波処理（トミ
ー精工、モデルＵＲ−２００Ｐ） した。冷却遠心機を
用いて４°Ｃ１１ｏ、ｏｏｏ回転／分で１０分間遠心分
離した上清液をそれぞれ枯草菌、パン酵母、大腸菌、シ
ュードモナス菌抽出液として使用した。
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣｌ２）に関しては、これを
１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・
エツセンシャル培地〔ポール著“セルアンドテイシュカ
ルチュア″；“Ｃｅ１ｌ ａｎｄ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅ”。
１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・
エツセンシャル培地〔ポール著“セルアンドテイシュカ
ルチュア″；“Ｃｅ１ｌ ａｎｄ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅ”。
Ｅ ＆ Ｓ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｌｔｄ、 （１
９７０）参照〕に植えつけ、５ ｖ／ｖ％の炭酸ガスを
含む空気中、３７℃で４８時間培養した。トリプシン処
理により細胞を剥離させ、遠心分離により細胞を集めた
のち生理食塩水に再懸濁した。そしてＨｅＬａ細胞＠濁
液１Ｏ−（約２Ｘ１０’個の細胞を含む）を超音波処理
（トミー精工。
９７０）参照〕に植えつけ、５ ｖ／ｖ％の炭酸ガスを
含む空気中、３７℃で４８時間培養した。トリプシン処
理により細胞を剥離させ、遠心分離により細胞を集めた
のち生理食塩水に再懸濁した。そしてＨｅＬａ細胞＠濁
液１Ｏ−（約２Ｘ１０’個の細胞を含む）を超音波処理
（トミー精工。
モデルＵＲ−２００Ｐ） したものをＨｅＬａ細胞抽出
液として使用した。
液として使用した。
枯草菌、パン酵母、Ｈｅ１ａ細胞に関しては、その抽出
液２１当りＴ Ｎ Ｆ溶液（７Ｘ１０’ＩＲＵ／ｍ１２
） ０．１ｍＮを加え、また大腸菌、シュードモナス菌
に関してハ、ソノ抽出液２Ｉｌｌｆｆｉ当すＴＮＦ溶ｆ
ｆ （ＩＸ１０’ＩＲＵ／＋ａ［）０．１ｍＱを加え５
ｗ／ｖ％低分子キトサン（Ｃ−！１１）溶液（ｐＨ６
）を所定量添加攪拌したのら、約１０分間水冷下に放置
した。
液２１当りＴ Ｎ Ｆ溶液（７Ｘ１０’ＩＲＵ／ｍ１２
） ０．１ｍＮを加え、また大腸菌、シュードモナス菌
に関してハ、ソノ抽出液２Ｉｌｌｆｆｉ当すＴＮＦ溶ｆ
ｆ （ＩＸ１０’ＩＲＵ／＋ａ［）０．１ｍＱを加え５
ｗ／ｖ％低分子キトサン（Ｃ−！１１）溶液（ｐＨ６
）を所定量添加攪拌したのら、約１０分間水冷下に放置
した。
冷却遠心機を用いて４℃、３０００回転／分で１０分間
遠心分離して上清液を採取し、核酸の濃度およびＴＮＦ
力価を測定した。結果を表−６に示す。
遠心分離して上清液を採取し、核酸の濃度およびＴＮＦ
力価を測定した。結果を表−６に示す。
低分子キトサンが各種細胞培養液中において、優れた核
酸除去効果を示すことが判る。
酸除去効果を示すことが判る。
なおＴＮＦ溶液は前記ヨーロッパ特許公開第１５５．５
４９号の実施例５に開示された方法で得たヒ）−ＴＮＦ
ポリペプチド溶液を用いた。
４９号の実施例５に開示された方法で得たヒ）−ＴＮＦ
ポリペプチド溶液を用いた。
表−６
（Ｖ）低分子キトサン（Ｃ−９）の核酸およびエンドト
キシン分離効果に対するＰＨの影響： 前記（Ｂ）で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清
液に１Ｍクエン酸を添加してｐｌ！７および６に調整し
、ＰＨ７および６に調整した５ ｖ／ｖ％低分子キトサ
ン（Ｃ−９）溶液を所定景添加攪拌し、水冷下に約ｌＯ
分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、３０００回転／
分で１０分間遠心分離し、上清液を採取して核酸、エン
ドトキシンおよびＴＮＦの定量を行った。結果を表−７
に示す。
キシン分離効果に対するＰＨの影響： 前記（Ｂ）で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清
液に１Ｍクエン酸を添加してｐｌ！７および６に調整し
、ＰＨ７および６に調整した５ ｖ／ｖ％低分子キトサ
ン（Ｃ−９）溶液を所定景添加攪拌し、水冷下に約ｌＯ
分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、３０００回転／
分で１０分間遠心分離し、上清液を採取して核酸、エン
ドトキシンおよびＴＮＦの定量を行った。結果を表−７
に示す。
低分子キトサン処理をｐＨ６で行うと、ｐＨ７で行った
場合に比較して核酸およびエンドトキシン除去効果が増
大した。処理ｐＨを５まで下げると除去効果はさらに高
められたが、ＴＮＦ力価も減少した。
場合に比較して核酸およびエンドトキシン除去効果が増
大した。処理ｐＨを５まで下げると除去効果はさらに高
められたが、ＴＮＦ力価も減少した。
（ＶＩ）低分子キトサン（Ｃ−９）のエンドトキシン分
離効果に対するｐｎの影ｉｐ： 前記（Ｃ）の方法で得られたヒト几−１ポリペプチド含
有濾液に１Ｍクエン酸を添加してｐ）１７および５に調
整し、ｐＨ７および５に調整した５ＩＩＩ／ｖ％低分子
キトサン（Ｃ−９）溶液を所定斌添加攪拌し、水冷下に
約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、３０００
回転／分で１０分間遠心分離し、上清液を採取してエン
ドトキシンおよびＩＬ−１の定量を行った。
離効果に対するｐｎの影ｉｐ： 前記（Ｃ）の方法で得られたヒト几−１ポリペプチド含
有濾液に１Ｍクエン酸を添加してｐ）１７および５に調
整し、ｐＨ７および５に調整した５ＩＩＩ／ｖ％低分子
キトサン（Ｃ−９）溶液を所定斌添加攪拌し、水冷下に
約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、３０００
回転／分で１０分間遠心分離し、上清液を採取してエン
ドトキシンおよびＩＬ−１の定量を行った。
結果を表−８に示す。
低分子キトサン処理をＰＨ５で行うと、ｐ１１７で行っ
た場合に比較してエンドトキシン除去効果が著しく向上
し、ＩＬ−１の残存率も８０％以上であった。
た場合に比較してエンドトキシン除去効果が著しく向上
し、ＩＬ−１の残存率も８０％以上であった。
表−８
（■）低分子キトサン（Ｃ−９）の核酸およびエンドト
キシン分離効果に対する塩濃度の影響：前記（Ｂ）で得
られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液２ｍＱに塩化
ナトリウムを添加溶解して各種塩濃度の試料とし、これ
に５％ｉ／ｖ％低分子キトサン（Ｃ−９）溶液（ｐＨ６
）を最終濃度０．３ｗ／ｖ％となるように添加攪拌し、
水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、
３０００回転／分で１０分間遠心分離し、上清液を採取
して核酸、エンドトキシンおよびＴ Ｎ Ｆの定電を行
った。
キシン分離効果に対する塩濃度の影響：前記（Ｂ）で得
られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液２ｍＱに塩化
ナトリウムを添加溶解して各種塩濃度の試料とし、これ
に５％ｉ／ｖ％低分子キトサン（Ｃ−９）溶液（ｐＨ６
）を最終濃度０．３ｗ／ｖ％となるように添加攪拌し、
水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、
３０００回転／分で１０分間遠心分離し、上清液を採取
して核酸、エンドトキシンおよびＴ Ｎ Ｆの定電を行
った。
結果を表−９に示す。塩化ナトリウム濃度が０．５Ｍ以
下の試料では、低分子キトサンによる核酸およびエンド
トキシンの除去効果が充分に発揮されたが、塩化ナトリ
ウム濃度が０．５Ｍ以上の試料ではその効果が低減する
傾向が見られた。
下の試料では、低分子キトサンによる核酸およびエンド
トキシンの除去効果が充分に発揮されたが、塩化ナトリ
ウム濃度が０．５Ｍ以上の試料ではその効果が低減する
傾向が見られた。
（■）等電点の異なる各種蛋白質含有溶液に対する低分
子キトサン（Ｃ−９）の添加効果：等電点の異なる蛋白
質類を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解し、水冷下に低分子キトサンＣ−９の５ ｗ／ｖ％
溶液（ｐＨ６）を所定量添加混合したのち、約１０分間
水冷下に放置した。
子キトサン（Ｃ−９）の添加効果：等電点の異なる蛋白
質類を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解し、水冷下に低分子キトサンＣ−９の５ ｗ／ｖ％
溶液（ｐＨ６）を所定量添加混合したのち、約１０分間
水冷下に放置した。
４℃、３０００回転／分で１０分間の遠心分離により得
られた上清液中の蛋白質濃度を測定した。
られた上清液中の蛋白質濃度を測定した。
結果を表−１０に示す。
（ＩＫ）各種蛋白質含有大腸菌Ｂ株培養抽出液における
低分子キトサン（Ｃ−９）の核酸およびエンドトキシン
除去効果： 大腸菌８株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ５ｔ
ｒａｉｎ Ｂ、 ＡＴＣＣ１１３０３）の凍結乾燥菌体
２．５ｇを２０１ｎＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
） ５０ｍＭにｉ濁し、超音波処理（トミー精工、モデ
ルＵＰ−２０ＯＲ） Ｌ、た。冷却遠心機を用いて４℃
、１０，０００回転／分で１０分間遠心分離した上清液
を大腸菌Ｂ株抽出液として使用した。
低分子キトサン（Ｃ−９）の核酸およびエンドトキシン
除去効果： 大腸菌８株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ５ｔ
ｒａｉｎ Ｂ、 ＡＴＣＣ１１３０３）の凍結乾燥菌体
２．５ｇを２０１ｎＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
） ５０ｍＭにｉ濁し、超音波処理（トミー精工、モデ
ルＵＰ−２０ＯＲ） Ｌ、た。冷却遠心機を用いて４℃
、１０，０００回転／分で１０分間遠心分離した上清液
を大腸菌Ｂ株抽出液として使用した。
上記の大腸菌Ｂ株抽出液２ｍｆｌに対し、ペプチドとし
てインスリンまたは成長ホルモン、酵素蛋白としてペプ
シンまたはトリプシン、蛋白質としてヒト血清アルブミ
ンをそれぞれ２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋７
．５）溶液として添加した。低分子キトサンＣ−９を希
酢酸に溶解し、６Ｎ水酸化ナトリウム液で２１１６に調
整したのち、キトサン最終濃度を５ｖ／ｖ％に調整した
。先に調整した各種ペプチドまたは蛋白質を含む大腸菌
Ｂ株抽出液２ｍｆｌに対し、ｐＨ６に調整した５％低分
子キトサンＣ−９溶液を０゜５０、７５または１００μ
Ｑ添加攪拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し
、上清液を採取して核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、エンドト
キシンおよび予め大腸菌Ｂ株抽出液に添加したペプチド
あるいは蛋白質の濃度または活性を測定した。結果を表
−１１に示す。
てインスリンまたは成長ホルモン、酵素蛋白としてペプ
シンまたはトリプシン、蛋白質としてヒト血清アルブミ
ンをそれぞれ２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋７
．５）溶液として添加した。低分子キトサンＣ−９を希
酢酸に溶解し、６Ｎ水酸化ナトリウム液で２１１６に調
整したのち、キトサン最終濃度を５ｖ／ｖ％に調整した
。先に調整した各種ペプチドまたは蛋白質を含む大腸菌
Ｂ株抽出液２ｍｆｌに対し、ｐＨ６に調整した５％低分
子キトサンＣ−９溶液を０゜５０、７５または１００μ
Ｑ添加攪拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し
、上清液を採取して核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、エンドト
キシンおよび予め大腸菌Ｂ株抽出液に添加したペプチド
あるいは蛋白質の濃度または活性を測定した。結果を表
−１１に示す。
表−１１の結果より、大腸菌Ｂ株抽出液に予め添加した
ペプチドあるいは蛋白質は、低い等電点を示すペプシン
を除きほとんど上清液中に残存していた。
ペプチドあるいは蛋白質は、低い等電点を示すペプシン
を除きほとんど上清液中に残存していた。
（Ｘ）低分子キトサン（Ｃ−９）処理沈殿から核酸の回
収： 前記ＣＢ）で調製したヒトＴＮＦポリペプチド含有大腸
′菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＴＲ−９１）培
養抽出液、前記（ＩＶ）で調製した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２）培養抽出液、シュードモナス菌（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１
３４３０）培養抽出液各２ｍＱに、５ ｗ／ｖ％低分子
キトサン（Ｃ−９）溶液（ｐｉ（６） １２０μＱを添
加攪拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用
いて４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し、低
分子キトサン処理上清液と沈殿に分けた。沈殿を２ｍＱ
の２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）にｌｌ
ｉ濁し、４℃。
収： 前記ＣＢ）で調製したヒトＴＮＦポリペプチド含有大腸
′菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＨＴＲ−９１）培
養抽出液、前記（ＩＶ）で調製した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２）培養抽出液、シュードモナス菌（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１
３４３０）培養抽出液各２ｍＱに、５ ｗ／ｖ％低分子
キトサン（Ｃ−９）溶液（ｐｉ（６） １２０μＱを添
加攪拌し、水冷下に約１０分間放置後、冷却遠心機を用
いて４℃、３０００回転／分で１０分間遠心分離し、低
分子キトサン処理上清液と沈殿に分けた。沈殿を２ｍＱ
の２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）にｌｌ
ｉ濁し、４℃。
３０００回転／分で１０分間遠心分離することによって
洗浄したのち、０．０ＩＮ水酸化ナトリウムまたは１Ｍ
塩化ナトリウムを含むＯ，ＯＩＮ水酸化ナトリウムの２
ｍＡに懸濁させて抽出した。遠心分離により不溶物を除
去し、抽出液中の核酸含量を測定した。
洗浄したのち、０．０ＩＮ水酸化ナトリウムまたは１Ｍ
塩化ナトリウムを含むＯ，ＯＩＮ水酸化ナトリウムの２
ｍＡに懸濁させて抽出した。遠心分離により不溶物を除
去し、抽出液中の核酸含量を測定した。
上記各菌体培養抽出液および各低分子キトサン処理上清
液中の核酸量も併せて測定した。結果を表−１２に示す
。
液中の核酸量も併せて測定した。結果を表−１２に示す
。
低分子キトサン処理することにより、菌体培養液中の核
酸成分を分離、これを効率よく回収できた。
酸成分を分離、これを効率よく回収できた。
以上の各実験例から明らかなように、低分子キトサンで
処理することによって、菌体抽出液、細胞抽出液などの
生物材料中に含まれる核酸またはエンドトキシンを効率
よく除去することが可能であり、特に目的とする蛋白質
、ペプチド等の蛋白質類が等を点３以上の場合には有用
な精製手段となることがわかる。また核酸またはエンド
トキシンを有価物として回収することが可能である。
処理することによって、菌体抽出液、細胞抽出液などの
生物材料中に含まれる核酸またはエンドトキシンを効率
よく除去することが可能であり、特に目的とする蛋白質
、ペプチド等の蛋白質類が等を点３以上の場合には有用
な精製手段となることがわかる。また核酸またはエンド
トキシンを有価物として回収することが可能である。
なお、以上の各側において、実験に用いた分析方法は以
下の方法により行った。
下の方法により行った。
（１）蛋白質の定量法はＵＶ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ３． ｐ４５１． （
１９５７） ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ）またはク
マシー・ブリリアント・ブルー６２５０を用いる比色法
（バイオランド社製、バイオランドプロティンアッセイ
キット、 ａ４！物質ウシ血清アルブミン）を用い
た。
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ３． ｐ４５１． （
１９５７） ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ）またはク
マシー・ブリリアント・ブルー６２５０を用いる比色法
（バイオランド社製、バイオランドプロティンアッセイ
キット、 ａ４！物質ウシ血清アルブミン）を用い
た。
（２）ＤＮＡの定量法は、ジアミノ安息香酸を用いる蛍
光法〔日本生化学会綱：生化学実験講座２核酸の化学■
分離精製Ｐ５（１９７５）東京化学同人）を用いた。
光法〔日本生化学会綱：生化学実験講座２核酸の化学■
分離精製Ｐ５（１９７５）東京化学同人）を用いた。
（３）ＲＮＡの定量法はオルシノール−鉄−塩酸による
ペントース定量法〔山川民夫ｇＩ：医化学実験法講座第
１巻Ａ ｐ、５５． （１９７１）中白書店〕を用いた
。
ペントース定量法〔山川民夫ｇＩ：医化学実験法講座第
１巻Ａ ｐ、５５． （１９７１）中白書店〕を用いた
。
（４）エンドトキシンの定量法はパイロディックキット
（生化学工業製品）を用いた。
（生化学工業製品）を用いた。
（５）ＴＮＦの力価測定法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでガン
細胞を殺す効果を測定する方法または酵素免疫測定法を
用いた。前者はヨーロッパ特許公開第１５５５４９号２
８〜２９頁に記載された方法に準じて行った。後者はβ
−ガラクトシダーゼ標ｍＴＮＦと検体ＴＮＦを抗ＴＮＦ
ウサギ血清に対して競合反応させ。
細胞を殺す効果を測定する方法または酵素免疫測定法を
用いた。前者はヨーロッパ特許公開第１５５５４９号２
８〜２９頁に記載された方法に準じて行った。後者はβ
−ガラクトシダーゼ標ｍＴＮＦと検体ＴＮＦを抗ＴＮＦ
ウサギ血清に対して競合反応させ。
第２抗体を用いてＢ（結合）／Ｆ（遊離）分離を行い、
８区分のβ−ガラクトシダーゼを発色基質に作用させて
発色させ、比色により検体中のＴＮＦ力価を測定する方
法である。力価表示はＩＲＵ （Ｉｍｍｕｎ。
８区分のβ−ガラクトシダーゼを発色基質に作用させて
発色させ、比色により検体中のＴＮＦ力価を測定する方
法である。力価表示はＩＲＵ （Ｉｍｍｕｎ。
ｒｅａｃｔｉｖｅ ｕｎｉｔ）／ｍＱで行った。
（６） ＩＬ−１の定量法は、サンドインチ方式による
酵素免疫測定法に従って行った。すなわち、プレートに
固定した抗体と抗原（ＩＬ−１）とを特異的に結合させ
、次に酵素標識抗体を固相化抗体結合抗原と反応させて
固相化抗体−抗原一酵索標識抗体からなるサンドイッチ
結合物をつくらせる。この結合物に基質液を加えて酵素
反応させると発色する。
酵素免疫測定法に従って行った。すなわち、プレートに
固定した抗体と抗原（ＩＬ−１）とを特異的に結合させ
、次に酵素標識抗体を固相化抗体結合抗原と反応させて
固相化抗体−抗原一酵索標識抗体からなるサンドイッチ
結合物をつくらせる。この結合物に基質液を加えて酵素
反応させると発色する。
発色の強さは結合抗原量と比例するので、吸光度を固定
することにより抗原量を測定することができる。力価表
示は、標準物質との比較によりμｇ／ｍＱで行った。
することにより抗原量を測定することができる。力価表
示は、標準物質との比較によりμｇ／ｍＱで行った。
（７）インスリン力価の測定はインスリンＲＩＡキット
（ダイナボット社製品）を用いて行った。
（ダイナボット社製品）を用いて行った。
（８）成長ホルモンの力価測定はヒト成長ホルモンＲＩ
Ａキット（ダイナボット社製品）を用いて行った。
Ａキット（ダイナボット社製品）を用いて行った。
（９）ペプシンの力価測定はり、リック（Ｗ、 Ｒｉｃ
ｋ）の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２ｎｄ ｅｄ。
ｋ）の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２ｎｄ ｅｄ。
ｂｙ Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、 Ｎ、Ｙ、（１９６５） ８２０〜８２３］に
従いウシ・ヘモグロビンを基質に用いて行った。
ｅｓｓ、 Ｎ、Ｙ、（１９６５） ８２０〜８２３］に
従いウシ・ヘモグロビンを基質に用いて行った。
（ｌＯ）トリプシンの力価測定はν、リンク（ＬＲｉｃ
ｋ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ２ｎｄ ｅｄ、 ｂｙ Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、
Ｙ。
ｋ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ２ｎｄ ｅｄ、 ｂｙ Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、
Ｙ。
（１９６５） ８０８〜８１１〕に従いウシ・ヘモグロ
ビンを基質に用いて行った。
ビンを基質に用いて行った。
（１１）ヒト血清アルブミンの定量はＦ、Ｌ、ロッドケ
イ（Ｆ、Ｌ、 Ｒｏｄｋｅｙ）の方法（Ｃ１ｉｎ、 Ｃ
ｈｅｍ、＋ １１．４７８〜４８７（１９６５））で行
った。
イ（Ｆ、Ｌ、 Ｒｏｄｋｅｙ）の方法（Ｃ１ｉｎ、 Ｃ
ｈｅｍ、＋ １１．４７８〜４８７（１９６５））で行
った。
Claims (18)
- （１）低分子キトサンを有効成分として含有することを
特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。 - （２）低分子キトサンが固有粘度０．０１〜５（ｄｌ／
ｇ）である特許請求の範囲第１項記載の除去剤。 - （３）低分子キトサンがｐＨ４におけるコロイド当量２
ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分以上である特許請求の範囲第１項
または第２項記載の除去剤。 - （４）低分子キトサンが固有粘度０．２〜１（ｄｌ／ｇ
）、ｐＨ４におけるコロイド当量４ｍｅｑ／ｇ−蒸発残
分以上である特許請求の範囲第１項ないし第３項のいず
れかに記載の除去剤。 - （５）除去剤が核酸またはエンドトキシンを含む被処理
液から核酸またはエンドトキシンを分離するものである
特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の
除去剤。 - （６）被処理液が等電点３以上の蛋白質類を含むもので
ある特許請求の範囲第５項記載の除去剤。 - （７）蛋白質類がヒト癌壊死因子である特許請求の範囲
第６項記載の除去剤。 - （８）蛋白質類がヒトインターロイキン１である特許請
求の範囲第６項記載の除去剤。 - （９）被処理液が無細胞抽出液である特許請求の範囲第
５項ないし第８項のいずれかに記載の除去剤。 - （１０）低分子キトサンを用いて核酸またはエンドトキ
シンを分離することを特徴とする核酸またはエンドトキ
シンの除去方法。 - （１１）低分子キトサンが固有粘度０．０１〜５（ｄｌ
／ｇ）である特許請求の範囲第１０項記載の除去方法。 - （１２）低分子キトサンがｐＨ４におけるコロイド当量
２ｍｅｑ／ｇ−蒸発残分以上である特許請求の範囲第１
０項または第１１項記載の除去方法。 - （１３）低分子キトサンが固有粘度０．２〜１（ｄｌ／
ｇ）、ｐＨ４におけるコロイド当量４ｍｅｑ／ｇ−蒸発
残分以上である特許請求の範囲第１０項ないし第１２項
のいずれかに記載の除去方法。 - （１４）分離が核酸またはエンドトキシンを含む被処理
液から核酸またはエンドトキシンを分離するものである
特許請求の範囲第１０項ないし第１３項のいずれかに記
載の除去方法。 - （１５）被処理液が等電点３以上の蛋白質類を含むもの
である特許請求の範囲第１４項記載の除去方法。 - （１６）蛋白質類がヒト癌壊死因子である特許請求の範
囲第１５項記載の除去方法。 - （１７）蛋白質類がヒトインターロイキン１である特許
請求の範囲第１５項記載の除去方法。 - （１８）被処理液が無細胞抽出液である特許請求の範囲
第１４項ないし第１７項のいずれかに記載の除去方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-75779 | 1986-04-02 | ||
| JP7577986 | 1986-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6356300A true JPS6356300A (ja) | 1988-03-10 |
| JPH0641479B2 JPH0641479B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=13586043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62077064A Expired - Lifetime JPH0641479B2 (ja) | 1986-04-02 | 1987-03-30 | 核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4885168A (ja) |
| EP (1) | EP0240348B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0641479B2 (ja) |
| KR (1) | KR940005589B1 (ja) |
| AT (1) | ATE96448T1 (ja) |
| AU (1) | AU596160B2 (ja) |
| CA (1) | CA1291594C (ja) |
| DE (1) | DE3787913T2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03109397A (ja) * | 1989-09-22 | 1991-05-09 | Kurita Water Ind Ltd | エンドトキシンの除去方法 |
| US5169535A (en) * | 1989-09-22 | 1992-12-08 | Kurita Water Industries Ltd. | Method of removing endotoxin |
| JPH0666806A (ja) * | 1991-01-26 | 1994-03-11 | Masashi Funayama | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
| WO2003055533A1 (fr) * | 2001-12-26 | 2003-07-10 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Composition pour l'elimination des endotoxines et procede d'elimination |
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| JPH0687974B2 (ja) * | 1990-03-27 | 1994-11-09 | 忠一 平山 | 発熱物質の吸着材料 |
| JPH06192296A (ja) * | 1992-10-28 | 1994-07-12 | Chiba Pref Gov | 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。 |
| US5972225A (en) * | 1996-05-07 | 1999-10-26 | Cook Imaging Corporation | Process for remediating endotoxin-contaminated bulk non-ionic contrast media |
| US7078224B1 (en) * | 1999-05-14 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| US6194562B1 (en) | 1998-04-22 | 2001-02-27 | Promega Corporation | Endotoxin reduction in nucleic acid purification |
| US6716970B2 (en) * | 2000-04-21 | 2004-04-06 | Adjuvant Pharmaceuticals, Llc | Water soluble, randomly substituted partial N-partial O-acetylated chitosan, preserving compositions containing chitosan, and processes for making thereof |
| AU2001253689A1 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-07 | Johns Hopkins University | Differential microbial test |
| SE0003958D0 (sv) * | 2000-10-31 | 2000-10-31 | Biogaia Fermentation Ab | Method for growth of microorganisms |
| US7125967B2 (en) * | 2003-10-08 | 2006-10-24 | Adjuvant Pharmaceuticals, Llc | Water-soluble chitosan having low endotoxin concentration and methods for making and using the same |
| WO2007070381A2 (en) | 2005-12-09 | 2007-06-21 | Promega Corporation | Nucleic acid purification with a binding matrix |
| US8222397B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
| CN102977392A (zh) * | 2012-12-17 | 2013-03-20 | 上海典范医疗科技有限公司 | 去除内毒素的细菌纤维素的制备方法 |
| US9598504B2 (en) | 2014-12-16 | 2017-03-21 | Chitogen Inc. | Process for the removal of endotoxins to produce medical quality chitosan and other polysaccharides |
| CN114341152B (zh) | 2019-09-06 | 2025-06-13 | 赛多利斯比亚分离有限责任公司 | 用于降低生物制品的染色质含量的组合物和方法 |
| CN112746065A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-05-04 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种胃蛋白酶内毒素的去除方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4474769A (en) * | 1983-05-13 | 1984-10-02 | Pfanstiehl Laboratories, Inc. | Chitosan as a contraceptive |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
-
1987
- 1987-03-21 KR KR1019870002578A patent/KR940005589B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-30 JP JP62077064A patent/JPH0641479B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-01 CA CA000533540A patent/CA1291594C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-01 AU AU70964/87A patent/AU596160B2/en not_active Ceased
- 1987-04-01 US US07/034,217 patent/US4885168A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-02 AT AT87302870T patent/ATE96448T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1987-04-02 EP EP87302870A patent/EP0240348B1/en not_active Expired - Lifetime
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| AU596160B2 (en) | 1990-04-26 |
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| DE3787913T2 (de) | 1994-03-24 |
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| EP0240348A3 (en) | 1989-10-04 |
| ATE96448T1 (de) | 1993-11-15 |
| JPH0641479B2 (ja) | 1994-06-01 |
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| US4885168A (en) | 1989-12-05 |
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