JPH04500004A - 真核細胞におけるポリシストロン性メッセージの高率翻訳 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １５、多細胞生物由来の培養細胞において蛋白質の発現を増強する方法であって 、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリシストロン性転写ユニットを多細 胞生物由来の培養宿主細胞に導入し、そしてこの培養宿主細胞を適切な培地中で 増殖せしめる、ことを含んで成る方法。

明　細　書 真核細胞におけるポリシストロン性メツセージの高率翻訳 孜歪立団 本発明は一般に蛋白質の発現に関し、そしてさらに詳しくは多細胞生物由来の培 養細胞におけるポリシストロンメツセージの高率翻訳に関する。

光■皇室■ 細胞培養及び組換ＤＮＡ技法の発展は、遺伝子操作された細胞を用いての療法的 価値又は他の経済的価値を有する種々の蛋白質の発現を促進した。高等真核源に 由来する多くの生物学的に活性な療法的蛋白質の発現はしばしば、下等真核細胞 又は原核細胞においては自然には起こらない翻訳後修飾を必要とし、そのため高 等真核源に由来する細胞の使用が必要となる。例えば、哺乳類細胞における糖蛋 白質の発現は天然グリコジル化を含む蛋白質を提供するという利点を有する。

哺乳類により生産される糖蛋白質は、下等真核生物から生産される糖蛋白質上に 存在する外鎖（ｏｕｔｅｒ　ｃｈａｉｎ）炭水化物は非常に異る外鎖炭水化物を 含有する。分泌される蛋白質の生産のための宿主としての哺乳類細胞の使用は次 の点において下等真核細胞からの分泌に優る有意な利点を有する。すなわち、哺 乳類細胞は、分泌に向けられる蛋白質を容易に認識し　４、そして適切にプロセ シングする分泌系を有し、このことは下等真核生物においては必ずしもそうでは ない。

種々の高等真核細胞におけるクローン化ＤＮＡ配列の発現の方法が当業界におい て知られている。クローン化されたＤＮＡ配列が、文献（ＴｈｉｌｌｙＷ集、Ｍ ａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｂ−Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　 Ｐｕｈｌｉｓｈｅｒｓ、　５ｔｏｎｅｈａａ＋、　ＭＡを参照のこと）に広く報 告されている方法を用いて哺乳類細胞に導入される。鳥類（Ｋｒｅｔｓｏｖａｌ 　ｉらＧｅｎｅ、　５８　：　１６７−１７６、１９８７）、昆虫（Ｍｉｙａｊ 　ｉｍａら、Ｇｅｎｅ、　５８　：　２７３−２８２．１９８７）及び魚類（Ｉ ｓａ及びＳｈｉｍａ、ムＣｅ１１．Ｓｃｉ、、　８８　：　２１９−２２４．１ ９８７）のセルラインを含めて、他の生物由来のセルラインも使用することがで きる。哺乳類細胞においては、クローン化ＤＮＡ配列の発現が、プロモーター配 列、エンハンサ−配列、リーダー配列、スプライスシグナル及びポリアゾニレ− ジョンシグナルを含めて転写制御シグナルを含有する発現ユニットに注目の蛋白 質のコード配列を挿入することにより、増強されている。トランスフェクトされ たＤＮＡ配列を含有するクローンの同定は、発現ユニットと共に選択マーカーを 同時導入することにより促進される。

例えば、増幅可能な選択マーカーの選択を用いての増幅により発現レベルを最適 化することができる。しかしながら、発現ユニットの同時増幅は、特に選択マー カーが独立のＤＮＡ配列として導入される場合には、すべてのクローンにおいて 保証されているわけではない。

発現ユニットへのクローン化ＤＮＡ配列の挿入は、該発現ユニットが宿主細胞に 導入される場合、効果的な遺伝子の発現を保証しない。クローン化コード配列の 低い発現レベルは、コード配列の効率の低い転写もしくは翻訳、不安定なメツセ ンジャーＤ　Ｎ　Ａ　（ｍＲＮＡ）配列、蛋白質生産の不安定性、又は発現ベク ター中の毒性配列（ｔｏｘｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の存在により生ずるであろ う。組換蛋白質は宿主細胞により不正確に、不適切に又は非効率に、転写後プロ セシングされる可能性がある。

真核性宿主におけるコード配列の効率的な発現はまた関連蛋白質の発現を必要と し、この蛋白質は生物活性を達成するために該蛋白質のプロセシング、安定化又 は修飾を要求するであろう。生物学的に活性な組換蛋白質の最適な発現はまた、 翻訳及び／又は転写因子の存在に依存するであろう。これらの蛋白質は、組換蛋 白質の効率的な発現が制限される程低レベルで宿主細胞中に存在するであろう。

特異的な翻訳後修飾を必要とする蛋白質の例にはある種の凝固因子が含まれ、こ れらの因子は生物活性のために特定のグルタミン酸残基のＴ−カルボキシル化を 必要としそしてさらに生物活性のために特定のアスパラギン酸残基のβ−ヒドロ キシアスパラギン酸への転換を必要とする可能性がある。

活性形においてマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）として存在する幾つかの蛋白質 があり、その幾つかは別個のサブユニットから構成されている。ある種のマルチ マー蛋白質、例えばインシュリン、は同一のシストロン内にコードされており、 そして翻訳後に不均一ポリペプチドを含有するマルチマーにプロセシングされる 。他のマルチマー蛋白質は同一のシストロン内に位置しないＤＮＡ配列によりコ ードされている。この型の蛍白質の例には、ａ及びｂ鎖から作られたテトラマー である混同因子Ｘ■、Ａ−Ｂダイマーとして存在するＰＤＧＦ、免疫グロブリン 、ヘモグロビン、及び主要組織適合性抗原が包含される。同一のシストロン内に コードされていないマルチマー蛋白質の発現は、免疫グロブリンについて報告さ れている（Ｈｉｃｋｍａｎ及びＫｏｒｎｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 　１２１　：　９９０−９９６．１９７８；Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｂｒｉｄｏｍａｓ； Ｈａｍｍｅｒｒｉｎｇ、　Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ及びＫｅａｒｎｅｙｋＪａ集、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／　ＮｏｒｔｈｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ＋ 　３７９−３８７頁、１９８１　；　）Ｉｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、　１０４　：　４６１−７６７、１９８７）ように、分泌のために同 じ細胞内でのすべてのサブユニット同時発現、又は生物活性を保証するためにサ ブユニットの適切な配置への正しい集合を達成すること、を必要とするであろう 。

クローン化コード配列の発現に内在する問題点を補うため、クローン化ＤＮＡ配 列の発現を増強又は可能にするために機能する他の配列を細胞に導入することが しばしば有利である。

これらの他のＤＮＡ配列には、プロセシング酵素、転写因子、翻訳因子、蛋白質 の安定化及びプロテアーゼ阻害物物質のためのコード配列が含まれる。宿主細胞 における組換蛋白質の最適の発現は多くのコード配列の同時導入を必要とするで あろう。

宿主細胞に複数の発現ユニットを導入する方法には、複数の発現ベクターによる 同時トランスフェクション（Ｄｕｂｏｉｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ、７７　：　４５４９−４５５３＋　１９８０　；　Ｓｕｂｒ ａｍａｎｉ及びＢｅｒｇ、　Ｃｅ旦、　１６　：　７７７−７８５．１９７９） 、複数の発現ユニットを含有するベクタによるトランスフェクション（Ｓｔａｆ ｆｏｒｄ及びＱｕｅｅｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０６　：　７７−７９．１９８ ０　；　０ｃｈｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０　：　６３５１−６３５５．１９８３　；　 Ｋａｄｅｓｃｈ及びＢｅｒｇ＋Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　＋旦：　２５９ ３−２６０１．１９８６）、及びポリシストロン性転写ユニットを含有するベク ターによるトランスフェクション（Ｐｅａｂｏｄｙ及びＢｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、＋旦：　２６９５−２７０３゜１９８６　；　Ｋａｕｆｍａ ｎ　ら、ＥＭＢＯＪ、、　６　：　１８７−１９７．　１９８７　ＨＢｏｅｌら 、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　２１９　：　１８１−１８８．１９８７　；　Ｌｅ ｖｉｎｓｏｎ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ。

米国特許ｋ　４，７１３．３３９）が含まれる。しかしながら、実際には、これ らの方法は深刻な限界を有することが示されている。

複数の発現ベクターの同時形質転換に対する主たる限界は一般に使用される選択 マーカーの数が制限されていることである。これらの選択マーカーは優性マーカ ー及び非優性マーカー（選択マーカーにより補償される活性を欠くセルラインに 補償活性を付与するもの）に分けられる。最適選択マーカー系の選択は、関連す るＤＮＡ配列を同時増幅することが示されている選択マーカーが少ないことであ る。選択マーカーをＴｈ１ｌｌｙ　（前掲）により総説されている。

複数の発現ベクターの導入は、選択マーカーにより補償される活性が多重に欠損 しているか、又はそれに対して選択マーカーが耐性を付与する化合物に対して多 重に感受性であり、そして多くの組換蛋白質により要求される翻訳後プロセシン グを提供することが知られている有用なセルラインの数によっても制限される。

特定の選択及び発現系のために適当な宿主であると考えられるセルラインの同定 は、′該セルラインがマーカーの選択又は増幅に対して従順であることを保証し ない。下等真核細胞及び原核細胞において可能な遺伝子増幅を行うことが哺乳類 セルラインにおいては不可能であることが、多数マーカーの欠損又は感受性を有 するセルラインを同定するための広範なスクリーニングを要求する。従って、有 用な選択系の数が、多数発現ユニットによる細胞のトランスフェクションについ て制限定である。

宿主細胞への多数発現ベクターの同時導入の可能性は導入しようとするＤＮＡ配 列の数の増加と共に減少する。選択されたクローン中での発現ユニットの同時増 幅も予想外の現象である。同一の増幅された遺伝子量に対するすべての同時トラ ンスフェクトされたＤＮＡ配列の同時増幅の可能性は関与するＤＮＡ配列の数と 共に低下する。およそ同じ遺伝子量においてすべでのトランスフェクトされた発 現ベクターを含有する同時増幅し同時トランスフェクトされたクローンを同定す るために広範囲として高価なスクリーニング方法が必要であろう。

前記のように、複数の発現ユニットを含有する発現ベクターは文献に報告されて いる　（Ｓｔａｆｆｏｒｄ及びＱｕｅｅｎ　、前掲；Ｏｃｈ　ｉら、前掲；　Ｌ ａｕ及びＫａｎｓ前掲；　Ｋａｄｅｓｃｈ及びＢｅｒｇ、前掲）。しかしながら 、これらの構成物はわずか２個又は３個の発現ユニットを担持し、ベクター上の １つの発現ユニットは選択マーカーを含有している。３個より多くの発現ユニッ トを含有するベクターは理論的には可能であるが、しかしこの様なベクターは文 献中に報告されていない。実際にはこの様なベクターの作製は複雑であり、そし て時間の無駄である。

最適の発現がベクター上に存在する発現ユニットの方向に依存することを示唆す るＫａｄｅｓｃｈ及びＢｅｒｇ　（前掲）の結果は、転写干渉を回避するために 方向制限を要求することにより、複数の転写ユニットを含有するベクターの作製 を一層困難にする。この種のベクターを用するトランスフェクションが組換え（ ｒｅｃｏｎ＋ｂｉｎａｔｉｏｎ又はｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）現象をもた らすことがあり、この現象がベクター上に存在するある種の発現ユニットの除外 をもたらす場合がある。すべての発現ユニットが活性であるクローンの同定は広 範な且つ高価なスクリーニングを必要とするであろう。

遺伝子操作されたポリシストロン転写の最近の報告は、単一プロモーターからの 多数のコード配列（シストロン）の発現の可能性を提出した。しかしながら、こ れらの遺伝子操作されたポリシストロン中の下流シストロンの発現は限定された 成功のみをもたらした。プラスミドに担持されたポリシストロン性転写ユニット からの翻訳が示されている（Ｐｅａｂｏｄｙ及びＢｅｒｇｓ前掲；　Ｋａｕｆｍ ａｎら、前掲ＨＢｏｅｌら、前掲；　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ、 米国特許Ｎ０２４，７１３，３３９）が、しかしポリシストロン性ｍＲＮＡから の下流シストロンの翻訳のレベルは劇的に低下することが示された。

現在報告されているポリシストロン性転写ユニットにおいて示された下流シスト ロンの発現の激しい抑制はこの系を真核細胞での多数の蛋白質の高レベルの発現 のために機能しないものにしている。多数の蛋白質の発現のための多数の発現ベ クターによる同時形質転換は、利用可能な選択系及びそれに伴うセルラインの数 が制限されているので実行可能でない単一ベクターからの多数の蛋白質の発現は 、この様なベクターの作製の制約のために厄介であり且つ困難である。

従って、高等真核細胞中での多数の蛋白質の発現を増加させる手段が当業界にお いて必要である。

主ユ■皿玉 要約すれば、本発明は多細胞生物由来の培養細胞において蛋白質の発現を増強す る方法を開示する。この方法は一般に（ａ）次の式 ％式％） （式中、 Ｐは転写プロモーターであり； Ｃは蛋白質をコードするＤＮＡ配列であり；ＨＥＬは高効率リーダーであり； ｎは０より大きい正の整数であり；そしてｍは１〜８の整数である） で表わされるポリシストロン性転写ユニットを培養細胞に導入し；そして （ｂ）該培養細胞を適切な培地中で増殖せしめる；ことを含んで成る。

好ましい態様において、培養宿主細胞は哺乳類宿主細胞でＬ　ができる。ウィル スリーダニ、特に高効率ウィルスリーダーが好ましい。本発明の１つの観点にお いて、Ｃ７及びＣ７は、ファクターＸ■、血小板由来増殖因子、免疫グロブリン 又は組織適合性抗原のごとき多−サブユニット蛋白質のサブユニットであること ができる。

前記の方法において使用するためのポリシストロン性転写ユニット及びこの様な ポリシストロン性転写ユニットが導入されている多細胞生物由来培養細胞も開示 される。

本発明のこれらの及び他の観点は次の詳細な記載を、添付図面に言及することに より明らかとなろう。

２頁二呈単崖返貝 第１図は、ベクターｐＭＬ−１中にポリシストロン性転写ユニットを含有するプ ラスミドｐＢｏｅ１３６０の作製を示す。使用される記号は、Ａｄ５　ｏｒｉ　 ：アデノウィルス５のＯ−１マツプユニット；　Ｅ　：　ＳＶ４０エンハンサ− 配列、Ａｄ２　ＭＬＰ　：アデノウィルス２からの主要後期プロモーター；Ｌｌ −３：アデノウィルス２トリパルタイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列 ；５’ｓｓ：５′スプライシングシグナル；３’ｓｓ：３’スプライシングシグ ナル；及びｐＡ　：　ＳＶ４０からの後期ポリアゾニレ−ジョンシグナル、であ る。

第２図は、プラスミドｐＴＰ／Ｃ１ａの作製を示す。

第３図は、ニジストロン系ｍＲＮＡの生産を示す。第３図ＡはプラスミドｐＤ５ ＣＡＴ−ＤＨＰＲ’によりトランスフェクトされた細胞により生産されたｍＲＮ Ａ　（矢印）の分析を示す。右側の数値はサイズマーカーに関する。Ｂは２シス トロン性発現ユニット、２シストロン性ｍＲＮＡ及びプローブのダイアグラムを 示す。

点線は幾らかの転写物から切除（ａｐｌｉｃｅ　ｏｕｔ）されるｄＮＡを示す。

第４図は、プラスミドｐＴＰ／Ｆ９／Ｃ１ａの作製を示す。

第５図は、プラスミドｐＦＶ　ｎ　−Ｐ−ＢｉＰの作製を示す。

■　るための　のノ 本発明をさらに詳細に記載する前に、以下に使用される用語を定義するのが理解 の助けとなるであろう。

シストロン 蛋白質はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。このＤＮＡ配列は遺伝子、ｃＤ ＮＡ、又は合成りＮＡ断片、あるいはそのクローンの形であることができる。

ｆＡ」ジ願トジＺ 少なくとも２個のシストロンを含有するＤＮＡ配列であって、これらのシストロ ンが少なくとも上流シストロンの終止コドン及び下流シストロンの翻訳開始コド ンにより分離されているもの。ポリシストロンはシストロン間に機能的転写プロ モーターを含有しない。

之ス上二１皿皿基 ポリシストロン中の上流シストロンの翻訳終止コドンと下流シストロンの翻訳開 始コドンとの間のＤＮＡ配列。

ポリシストロン　−　ユニット 転写プロモーターに作用可能に連結されたポリシストロンを含有するＤＮＡ配列 。ポリシストロンの転写が構成シストロンに対応する配列を含有する単−ｍＲＮ Ａをもたらす。

ユニｌ二皿Ａ 転写されたメツセージの効率的な翻訳を行う５′−非翻訳領域。

工とエラΔノ」仁乙九土 ｍＲＮＡスプライシング現象（すなわち介在配列切除をもたらす切断及び連結反 応）に関与することが機能的に示されている、Ｍｏｕｎｔ（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、、　１０　：　４５９−４７２．１９８２）により報告された５′又 は３′配列に共通性を示す配列。

上に要約したように、本発明は、ポリシストロン性転写ユニット中の下流シスト ロンからの蛋白質の発現のレベルを上昇せしめるために有用な新規なりＮＡ構成 物を開示する。これらの新規なりＮＡ構成物はポリシストロンを含有し、このポ リシストロンにおいては注目の複数の蛋白質をコードする複数のＤＮＡ配列が縦 列的（ｔａｎｄｅｍ）に連結されており、リーダー配列をコードするＤＮＡ配列 により分離されている。これらのポリシストロンは適切な発現ベクター中で強力 な転写シグナル及び翻訳シグナル連結されており、そして多細胞生物由来の培養 細胞に導入される。驚くべきことに、これらの構成物は下流シストロンの発現の 増加をもたらすことが見出された。

本発明のポリシストロンは、リーダー配列がコード配列の間に存在するようにコ ード配列をリーダー配列に連結することにより形成することができる。各コード 配列はそれに関連する翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルを正しいリーディ ングフレーム内に有するであろう。好ましい態様においては、リーダー配列は、 制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結を用いてシストロン間領域に挿入される。

好ましいリーダー配列はウィルスリーダー配列であり、これにはアデノウィルス 第一リーダー及びアデノウィルスＬ、−ＩＸリーダー（Ｂｅｒｋｎｅｒ及び５ｈ ａｒｐ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３　：　８４１−８５７＋　１９ ８５）、５Ｖ４０１Ｊ−ダー及びバルボウイルス（ｐａｒνｏｖｉｒｕｓ）リー ダーが含まれる。

特に好ましいリーダー配列は高効率ウィルスリーダー、アデノウィルス・トリパ ルタイト（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）　リーダー（Ｌｌ− ３）である。適当な細胞性リーダーにはオバルプミンリーダーが含まれる。リー ダー配列を直接に翻訳開始配列に付加するのが有利である。本発明の１つの態様 においては、リーダー配列は、転写ユニット内でスプライスシグナルからのスプ ライシング現象の後に翻訳開始コドンに付加される。他の態様においては、リー ダー配列はイン−ビトロ変異誘発により翻訳開始配列に連結される。

ポリシストロン性転写ユニットのシストロン間領域中にこの強力な翻訳シグナル を含有する組換ウィルスにより感染された哺乳類細胞のごとき多細胞生物由来培 養細胞は、単シストロン性発現ユニットを用いて得られるレベルに匹敵するレベ ルで下流シストロンを発現させることが見出された。シストロン間リーダーの不 存在下では下流シストロンは感染細胞中で検出できる程には発現されない。シス トロン間リーダーを含むポリシストロン性発現ユニットを担持するプラスミドに よりトランスフェクトされた細胞は、シストロン間シグナルを欠く匹敵するプラ スミドを含有する細胞と比較した場合、蛋白質の発現の少なくとも２０倍の増加 を示す。

適当なリーダー配列は、ウィルス又はプラスミド試験系への５′−非コード配列 の挿入により同定することができる。

この様な系はアデノウィルスリーダー配列を研究するために用いられた、（例え ば、Ｂｅｒｋｎｅｒ及び５ｈａｒｐ＋　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋１３　 ：　８４１−８５７．１９８５　、並びにＫａｕｆｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

男祷、　８２　：　６８９−６９３．１９８５を参照のこと）。要約すれば、注 目の潜在的リーダー配列（５′−非コード配列）を、マーカーコード配列に作用 可能に連結された少なくとも転写プロモーターを含んで成る発現ユニットに挿入 して、前記潜在的リーダー配列がマーカーコード配列の転写開始部位の５′に直 接挿入されるようにする。マーカーコード配列は好ましくはそのための測定方法 が存在するものである。マーカーコード配列にはＤＨＰＲ及び肝炎８表面抗原（ Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２　：　７５６０−７５６４．１９８５）が包含される。

プラスミド系において潜在的リーダー配列を試験するため、注目のリーダー配列 を含有する発現ユニットを、高等真核細胞をトランスフェクトすることができる ベクターに挿入する。

哺乳類細胞をトランスフェクトするために適当なベクターには、ｐＢＲ３２２（ Ｂｏｌｉｖｅｒら、Ｇｅｎｅ、　２　：　９５−１１３．１９７７）の誘導体、 例えばｐＭＬ　Ｉ　（Ｌｕｓｋｙ及びＢｏｔｃｈａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９ ３　：　７９−８１＋１９８１）、及びｐｔｌ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　１０１　：　２０−７９．１９８３）ベクターの誘導体が 包含される。他の宿主細胞のトランスフェクトにおいて使用するために適当なベ クターは、例えば、Ｋｒｅｔｓｏｖａｌｉら（前掲）　、Ｍｉｙａｊｉｍａら（ 前掲）、並びにＩｓａ及びＳｈｉｍａ（前掲）により記載されている。生ずる発 現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、そしてマーカーの発現を、リーダ ー配列を有しない発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞により発現さ れるマーカーと比較する。リーダー配列を有しない発現ベクターによりトランス フェクトされた細胞に対する、リーダー配列を含有する発現ベクターによりトラ ンスフェクトされた細胞でのマーカー発現の少なくとも５倍の増加が適当なリー ダー配列を同定する。リーダー配列を有する発現ベクターによる発現の５倍より 大きな増加が高効率リーダーを同定する。リーダー配列はアデノウィルスのごと きウィルス系において、前記のプラスミド発現ユニットを用いて組換ウィルスを 作製することにより試験することができる。生ずるＭｉ換ウィルスを用いて宿主 細胞を感染せしめ、そしてマーカーの発現のレベルを測定する。リーダー配列を 有しない発現ユニットにより感染された細胞に対する、リーダー配列を含有する 発現ユニットにより感染された細胞におけるマーカーの発現の少なくとも５倍の 増加が適切なリーダー配列を同定する。リーダー配列を有する発現ユニットによ るマーカーの発現の５倍より大きな増加が高効率リーダー配列を同定する。適切 なリーダーが同定された後、前記のごとく、これらを用いてポリシストロン性発 現ベクターを作製する。この様なベクターは、注目の高レベル発現を促進する追 加の遺伝子要素を含有するであろう。

注目の蛋白質の製造のため、本発明のポリシストロン性発現ユニットをベクター に挿入する。適当なベクターには前記の組換プラスミドが含まれる。組換ウィル スベクターはＳＶ４０ウィルスベクター及びアデノウィルスベクターを包含する （概観のためＴｈ１ｌｌｙ、前掲）を参照のこと。特に好ましいベクターは組換 アデノウィルス（以後ｒＡｄＪと称する）ベクターである。Ａｄベクターを用い てのｃＤＮＡの発現は、例えばＢｅｒｋｎｅｒら（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、、　１３　：　８４１７８５７．１９８５）により達成されている。ポリシス トロン性転写ユニットを含有する組換アデノウィルスベクターは、あらゆる組織 又はセルラインの実質上すべての細胞に転写ユニットを導入するという利点を有 する。ポリシストロン性転写ユニットが遺伝子療法において使用されるべき場合 、これは特に有利である。

注目の蛋白質をコードするｌ又は複数のＤＮＡ配列を含有するポリシストロン性 転写ユニットの発現を得るため、ベクターは通常追加の要素を含有するであろう 。転写プロモーターは第一シストロンの翻訳開始シグナルの上流に位置する。

適当なプロモーターには、マウス・メタロチオネイン（ＭＴ　−１）プロモータ ー（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２　：　８０９−８１４゜１ ９８３）　、ＳＶ４０後期プロモーター（Ｐｉａｔａｋら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 　４８　：５０３−５２０．１９８３）、ＳＶ４０後期プロモーター（Ｂｅｎｏ ｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ。

ハＵ匹、　２９０　：　３０４−３１０．１９８１）、及びサイトメガロウィル ス（ＣＭＶ）プロモーターが包含される。ウィルスプロモーターは、転写を指令 するそれらの効率のために好ましい。開示された方法において任意の効果的なプ ロモーターを用いることができるが、特に好ましいプロモーターはアデノウィル スからの主要後期（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ）プロモーターである。発現ユニット に、プロモーターの下流であって第一シストロンの上流に位置するリーダー配列 を含有せしめるのが好ましいであろう。好ましいリーダー配列には、アデノウィ ルス第一リーダー、アデノウィルスＬ　１−ＩＸリーダー及びオバルブミンリー ダーが含まれる。特に好ましいリーダー配列はアデノウィルス・トリパルタイト ・リーダーである。適当なリーダー配列は前記のスクリーニング方法により同定 することができる。発現ユニットは５′−スプライスシグナル及び３′−スプラ イスシグナルから成るスプライスシグナルを含有することができる。

５′−スプライスシグナルは前記のいずれかのごときリーダー配列と関連するこ とができる。好ましい態様において、５′−スプライスシグナルはアデノウィル スト３リーダーに関連する配列である。３′−スプライスシグナルは、ラビット ・β−グロビン３′−スプライスシグナル（Ｒｕｓｋｉｎら、釦旦。

３８　：　３１７−３３１．１９８４）のごとき多数のスプライスシグナル（概 観のためＭｏｕｎｔ　、前掲を参照のこと）のいずれかであることができる。特 に好ましい３′−スプライスシグナルは免疫グロブリン遺伝子の可変領域からの ものである。さらに、発現ユニット中にはポリシストロンを含んで成るＤＮＡ配 列から下流に位置するポリアゾニレ−ジョンシグナルが含まれる。

ウィルスポリアゾニレ−ジョンシグナル、例えばＳＶ４０からの前期もしくは後 期ポリアデニレーシジンシグナル又はアデノウィルスＥ１ｂ６ｆｆ域からのポリ アゾニレ−ジョンシグナルが特に好ましい。ポリアゾニレ−ジョンシグナルはま た、ポリシストロン中に存在するコード配列によっても供給され得る。

好ましいベクターはさらに、好ましくはプロモーターの上流に位置するＳ■エン ハンサ−のごときエンハンサ−配列を含むことができる。

幾つかの場合、選択マーカーがポリシストロン性転写ユニットと共に細胞内に導 入されるのが好ましい０選択マーカーにはネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマ イシン遺伝子、Ｅｃｏｇｐ　を遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、アデニンホス ホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランス フェラーゼ遺伝子、及び多剤耐性因子（Ｒｏｎｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ、　８３　：　４５３８−４５４２．１９８６　 ；　Ｌｌｅｄａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、　２６２　：　５０５−５０８ ．１９８７）が含まれる。好ましくは、選択マーカーは増幅可能な選択マーカー である。好ましい増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。特に好まし い増幅可能な選択マーカーはＤＨＰＲ’　ｃＤＮＡ　（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ及びＬ ｅｖｉｎｓｏｎ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、旦０　： 　２４９５−２４９９．　１９８３）である。選択マーカーはＴｈ１ｌｌｙ　（ 前掲）により総説されており、そして選択マーカーの選択は当業者のレベルの範 囲内である。

選択マーカーは、ポリシストロン性転写ユニットと同時に別個のＤＮＡ配列とし て、ポリシストロン性転写ユニット中のシストロンとして、又は同一のベクター 上の独立の発現ユニットとして、細胞に導入することができる。増幅可能な選択 マーカーをポリシストロン性転写ユニット中に末端シストロンとして置き、この 選択マーカーと末端から２番号のシストロンとの間がリーダー配列によって分離 されないようにするのが特に好ましい。この様に置かれた選択マーカーは低下し た効率で翻訳′され、そして選択条件に対して補償するために該選択マーカー及 びそれに速なるＤＮＡ配列の増幅を強制する。

本発明において記載されるポリシストロン性転写ユニットは真核細胞での組換蛋 白質の製造において広い用途を有する。

これらの用途には、経済的量の療法的な又は経済的に重要な蛋白質を製造するた め又は遺伝子療法の適用において使用されるべきポリシストロン性メツセージの 使用が含まれる。ポリシストロン性メツセージは、注目の蛋白質をコードしそし て注目の生物学的に活性な蛋白質の発現を増強又は可能にする配列をコードする ように適合させることができる。組換蛋白質の発現を増強しそして可能にするた めに機能する蛋白質には、プロセシング酵素、プロテアーゼ阻害物質、安定化因 子、転写因子、翻訳因子及び選択マーカーが含まれる。

前記のごとく、ポリシストロン性転写ユニットは遺伝子療法においてアデノウィ ルスベクター系と組合わせて使用することができる。ここで用いる遺伝子療法と は、宿主生物における遺伝的欠陥を正すＤＮＡコード配列の生物体への挿入であ る。現在、遺伝子の移行のために用いられているヒト組織は骨髄及び皮膚細胞で ある。注目の蛋白質が天然には存在しない組織において該蛋白質の効果的な発現 を可能にするポリシストロン性転写ユニットを作製することができる。ヒトの遺 伝子療法に対する今日の研究は、レトロウィルスへの挿入によりヒト細胞に導入 されるヒト遺伝子の使用に集中している。アデノウィルスベクターにおいてはレ トロウィルスベクターで観察されるようなプロモーター又はボリアデニレーシタ ンシグナルによる阻害又はイントロン含有遺伝子の組換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅ ｍｅｎ　ｔ）が報告されていないので、遺伝子療法のための遺伝子の導入のため にアデノウィルスベクターはレトロウィルスベクターに比べて有利であろう。ア デノウィルスは種々のヒト及びネズミ細胞系を形質転換して安定な組込み体（イ ンチグランド；　ｉ　ｎ　ｔｅｇｒａｎ　ｔ）を形成することができ、そして感 染の間にすべての細胞に入る証明された能力を有する。

従って、高度に感染性の形質転換性組換アデノウィルスベクターは遺伝子療法の ためにレトロウィルスベクターに比べて有利であることが明らかであろう。

ポリシストロン性転写ユニットにおいて発現され得る療法的に有用な蛋白質及び 経済的に有用な蛋白質をコードするＤＮＡ配列には、血液凝固因子をコードする もの、種々のセリンプロテアーゼをコードするもの、成長因子をコードするもの 、プロティンＣをコードするもの、プロティンＳをコードするもの、組織プラス ミノーゲン活性化因子をコードするもの、免疫グロブリンをコードするもの、抗 −炎症蛋白質をコードするもの、抗凝固物質及び類僚体をコードするもの、並び にこれらの蛋白質の誘導体をコードするものが含まれるが、これらに限定されな い。

これらの蛋白質の多くは多−サブユニット蛋白質として存在し、これらのコード 配列は同一のシストロン内に位置しない。哺乳類細胞での多−サブユニット蛋白 質の発現はサブユニットのすべてについてコード配列の発現を必要とする。多− サブユニット蛋白質には、ファクターＸｍ、血小板由来成長因子、免疫グロブリ ン、主要組織適合性抗原及びヘモグロビンが含まれる。同じ宿主細胞内での成分 サブユニットの同時発現を必要とする多−サブユニット蛋白質の例としてファク ターＸＩ［Ｉ及び免疫グロブリンが挙げられる。ファクターＸ■はａ２ダイマー 及びｂ２ダイマーから成るテトラマーである（Ｃｈｕｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、、　２４９　：　９４０−９５０．１９７４）。ｂ２ダイマーはａ２ダ イマーを安定化するために機能することが示された。免疫グロブリンは機能的免 疫グロブリンの分泌のためにヘビー鎖及びライト鎖の両者の発現を必要とするこ とが知られている（Ｈｉｃｋｍａｎ、ｌびＫｏｒｎｆｉｅｌｄ　％前掲；　Ｋ６ ａｒｎｅｙら、前掲；　）ｔｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、前掲ン。

ポリシストロン性メソセージはまた、高レベルの生物学的に活性な蛋白質を効率 的に生産するために増強されたレベルで必要とされるプロセシング蛋白質をコー ドすることができる。プロセシング蛋白質には、前駆体蛋白質を特定の部位で開 裂して成μ）形及び／又は活性形の蛋白質又はプロ蛋右質をもたらすプロテアー ゼ、又は単鎖蛋白質を多−積形に開裂させるプロテアーゼが含まれる。プロセシ ング蛋白質の他の例は、蛋白質を修飾する蛋白質、例えばＴ−カルボキシラーゼ 、ある種の凝固因子及び他のカルシウム結合蛋白質の特定のグルタミン酸残基を 修飾する酵素；プロティンＣの生物学的活性のために必要な修飾であるアスパラ ギン酸のβ−ヒドロキシアスパラギン酸への転換を担当する酵素；並びにプリン 残基のヒドロキシル化を担当する酵素である。他のプロセシング蛋白質にはミリ ストイル化、Ｃ−末端アミノ酸の除去、硫酸化、Ｃ−末端アミド化、及び糖蛋白 質−・の炭水化物鎖の付加を担当する蛋白質類である。哺乳類細胞中には天然に 存在せずそしてポリシストロン性転写ユニットに導入され得るプロセシング酵素 の一例はＳ６セレビシエー（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）■１え遺伝子生成物 である。硅１え遺伝子生成物はＬｙｓ−Ａｒｇ残基において開裂エンドペプチダ ーゼである。例えば、硅１１コード配列及びプロティンＣコード配列はポリシス トロン性転写ユニット中にコードされる。ＫＥＸλ遺伝子生産物は前駆体形のプ ロティンＣのプロセシングを促進する。分泌を促進するために第１−シストロン の位置に分泌される蛋白質であるプロ゛ティンＣをコードする配列を置くのが好 ましい。

ポリシストロン性転換ユニットはまた、蛋白質を安定化するためのコード配列を 含むことができる。安定化蛋白質には、注目の蛋白質の加水分解的破壊をブロッ クするプロテアーゼ阻害物質、注目の蛋白質に結合してそれを分解酵素から保護 する蛋白質、補−因子として蛋白質に結合する蛋白質又は蛋白質により必要とさ れる他の分子、及び補−因子を不活性化する蛋白質が含まれる。ポリシストロン 中で他の蛍白質の活性化を安定化し又は促進するために機能するコード配列の例 はプロティンＳのそれである。プロティンＳはプロティンＣすなわち、プロティ ンＣ−プロティンＳポリシストロンは活性化されたプロティンＣの発現を改良す るであろう。安定化蛋白質の例はフォノ・ビルプラント（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂ ｒａｎｄ）因子（ｖ１４Ｆ）である。、　ｖＷＦ及び凝固因子■の両者をコード するポリシストロンは凝固因子■を安定化するために機能するｗＷＦを生産し、 そして細胞外媒体中でファクター■の半減期を延長するであろう。

ポリシストロン性転写ユニットは、転写及び翻訳因子（Ｄ）’ｎａｎ及びＴｒｊ ａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　轟：　７７４−７７７、１９８５　；　Ｂａｅｕｒｌ ｅ及びＢａｌｔｊｍｏｒｅ、　Ｃｅ旦、　５３　：　２１１−２１７．１９８８ 　；　）ｌａｔｔｍａｎら、釦用。

５５　：　３４５−３５Ｌ　１９８７　；　Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ １．Ｂｉｏｌ、、　７　：　３７５９−３７６６、１９８７）をコードするＤＮ Ａ配列を含、むことができる。

これらの因子の導入が、より効率的な遺伝子発現を提供するための内因性細胞機 構を補充することによりより良い発現をもたらすことができる。クローン化され た転写因子の例はプロモーター特異的３１）　１　（Ｄｙｎａｎ及びＴｉｊａｎ 、前掲）である。ｓｐｌ認識配列をコードしているか又はそれをコードするよう に修飾されている注目の遺伝子はｃＤＮＡにリンクしたｓｐｌのだめのコード領 域を含んで成るポリシストロン性転写ユニットは注目のコード配列のより多くの 転写を可能にするであろう。

他の蛋白質の分泌を促進する蛋白質をコードする配列をポリシストロン性転写ユ ニットに含有せしめるのが好ましい。

分泌される蛍白質及び他の蛋白質の分泌を助けることができる蛋白質をコードす るポリシストロン性転写ユニットの例は、ファクター■及びＢｉＰのコード配列 を含有するものである。

免疫グロブリン結合蛋白質ＢｉＰは小胞体（ＥＲ）の腔内に見出され、そしてＣ −末端アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕを有する（Ｍｕｎｒｏ及び Ｐｅｌｈａｍ＋　Ｃｅ１１．並：　２９１−３００．１９８’ａ）。Ｍｕｎｒ。

及びＰｅ１ｈａ’ｍ　（前掲）は、このテトラペプチドＫＤＥｊ、、がＥＲ中の 蛋白質の保持を生じさせるシグナルの一部分であることに注目している。ＢｉＰ のＣ−末端アミノ酸配列と幾らかの相同性のために妨害される可能性がある。フ ァクター“■と主としてＥＲ内に保持されるＢｉＰとの共存が宿主のＥＲ保持゛ 系を飽和し、それ故にファクター■がより効率的に分泌されることを可能にする であろう。

本発明の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム介在トランスフェクション （Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ、　１４　：　７２４．１９７５　寥Ｃｏｒｓａｒ ｏ及びＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　７ 　：　６０３＋　１９８１；Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、ν１ｒｏ １．．５２　：　４５６−４６７、１９７３）により、又はエレクトロポレーシ ョン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　（Ｎｅｕｏ＋ａｎｎ。

凹ム、　１　：　８４１−８４５．１９８２）により培養細胞に導入することが できる。ウィルス発現ベクターはまた、例えばＫａｕｆｍａｎ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、１ＪｓＡ、４ξｊ２　：　６８９−６９３．１９８５ ）により記載されている方法を用いて宿主細胞を感染させるために用いることが できる。細胞に導入される混合物に「キャリヤーＤＮＡ」として知られる追加の ＤＮＡを添加するのも好ましい。

種々の高等真核宿主細胞又は多細胞生物由来の培養細胞を本発明において使用す ることができる。培養において増殖することができそしてクローン化ＤＮＡ配列 を発現することができる細胞には哺乳類、昆虫（Ｍｉｙａｊ　１ｏｔａら、前掲 ）、両生類（Ｉｌｌｏｌｆ及び口ｕｉｍｂｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ＋　１４４　： 　１５７１Ｌ　１９６４　；並びにＦｒｅｅｄら、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａ＋ ｎｐｈｉｂｉａｎ　Ｔｕｍｏｒｓ、　Ｍｉｚｅｌｌｌｇ、１０１−１１１頁、Ｓ ｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｙ＋　１９６９）、は土類（Ｃ１ａｒｋ、　Ｊ、Ｎ ａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ１９６８　ｉ及びＫｒｅｔｓｏｖａｌｉら、Ｇｅｎｅ、　 ５８　：　１６７−１７６、１９８７）の細胞が含まれる。本発明における使用 のために好ましい哺乳類セルラインにはＣ０５（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、 　ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＬＬ　１０）、　ＣＩＯ及び２９３（ＡＴＣＣ１５７３） の各セルライン並びにこれらのセルラインの誘導体及び単離体（ｉｓｏｌａｔｅ ）が含まれるが、特定の蛋白質の製造のために他のセルラインが好ましいことが 当業者に明らかであろう。哺乳類組織もまた本発明において使用するのに適当で ある。一般に、宿主セルライン又は組織は、注目の蛋白質を高レベルで生産する その能力及び／又は望ましい選択マーカーと共に使用するためのその適切さに基 いて選択されるであろう。しかしながら、本発明は、生体外で増殖し得る実質的 にすべてのセルラインにおいて実質的にあらゆる蛋白質を生産することを可能に する。

発現ベクターを宿主細胞に導入した後、一般に細胞を一定期間、典型的には１〜 ２日間増殖させて注目の遺伝子の発現を開始する。本発明の発現ベクターを含有 する細胞を適当な培地中で増殖させる。培養真核細胞の増殖を促進する培地は炭 素源、アミノ酸及びビタミン類を、定義された成長因子及び血清が補充された平 衡塩溶液中に含有する。細胞増殖を最適化するための適切な培地の選択は当業者 のレベルの範囲であり、そして増殖すべき組織又はセルラインの特異的な特性に 依存する。培地の配合は当業界においてよく知られており（例えば、Ｍａｍｍａ ｌｉｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　：　Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　５ｅｒｕｒ ａ−ＦｒｅｅＨｏｒａ＋ｏｎｅ−Ｓｅｐｐｉｅｍａｎｔｅｄ　Ｍｅｄｉａ、　Ｍ ａｔｈｅｒ績集、Ｐ１ｅｎｕａ＋　Ｐｒｅｓｓ−、。

ニューヨーク、ＮＹ、　１９８４　；　Ｔｈ１ｌｌｙ、前掲；及びＡＴＣＣカタ ログを参照のこと）、そして公表された配合例に従って行うことができ又は商業 的に入手することができる（例えば、Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ　ＩｎｃｌＬａｗｒｅｎｃｅ、　ＭＡ　；＾ＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ。

間、）０選択マーカーを発現している増殖について選択するために選択圧を通用 することができる。例えば、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）選 択を用いる場合、段階的に増加する薬剤濃度がコード配列の増加したコピー数の 選択を可能にし、上昇した発現レベルをもたらす。この様な細胞のクローンを注 目の蛋白質の生産についてスクリーニングすることができる。細胞を増殖せしめ 、そして細胞溶解により細胞から蛋白質を単離する。有用なスクリーニング方法 には免疫測定法及び活性測定法が含まれる。

組換蛋白質の精製方法は一般に当業界において知られている。蒼白質が宿主細胞 内に保持される場合、まず細胞を破壊し、そして好ましくは遠心分離により細胞 破片を除去することにより清澄な細胞溶解物を得ることが必要である。分泌され る蛋白質の場合、蛋白質は培地から直接精製される。清澄な細胞溶解物又は培地 は常用の蛋白質精製法により分画される。一般に多段法が使用されよう。これに 関する典型的な方法には、沈澱（例えば、ポリエチレングリコール又は硫酸アン モニウムによる沈澱）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ トグラフィー、分取用ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、及びファス ト・プレッシャー・液体クロマトグラフィーが含まれる。ある場合には、段階の 間で、例えば硫酸アンモニウム沈澱及びこ゛れに続く透析による過剰な塩の除去 により注目の画分をＵするのが好ましい。

種々の段階の選択及び順序は注目の特定の蛋白質の特性に依存し、当業者のレベ ルの範囲であろう。

次の例は説明のためのものであり、限定的なものではない。

肛　飢主夏立Ｉ Ａｄ５　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ−１Ａｄ２主要後期プロモーター、Ａｄ ２）リバルタイトリーダー、５′及び３′スプライスシグナル、ＤＨＦＲｃＤＮ Ａ　５ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル及びｐｎｔ、−ｉベクター配列を 含んで成るプラスミドｐＤ３を作製し、ＤＨＰＲコード配列の５′にユニークＢ ｃｌ　１部位を導入した。プラスミドｐＤ３を作製するため、ｐＤＨＦＲＩ［［ 中の０ｆ（ＦＲコード配列からすぐ下流のＰｓｔ１部位をＢｃｌ　１部位に転換 した。ＰｓｔＩにより部分消化されたｐＤＨＦＲＩＩＩの付着末端をＴ、ＤＮＡ ポリメラーゼの存在下でｄＣＴＰを用いて除去した。次に、ＤＮＡをエタノール 沈澱し、そしてキナーゼ処理されたＢｃｌ　Ｉリンカ−に連結した。生ずる連結 混合物をＢｃｌ　Ｉにより消化し、そしてアガロースゲル中で電気泳動した。５ ．８ｋｂ断片をゲルから単離し、そして自己連結により再環化した。所望の修飾 を有するプラスミドを選択し、そしてｐＤＨＦＲ’　と命名した。プラスミドｐ ＤＨＦＲ’をｄＡＭ−大腸菌株に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し た。

次に、プラスミドｐＤ２’を形成するためｐＤＨＦＲ’及びｐｓＶ４０（ｐＭＬ −１のＢａａ＋８１部位にクローン化されたＢａｗｌ　Ｉ−消化５Ｖ４０ＤＮＡ を含んで成る）をＢａ１ｌ及びＢａ＋ｓＨＩで消化して０．２　ｋｂＳＶ４０ポ リアデニレーシッンシグナル及び４．９　ｋｂ　ｐＤＨＦＲ’断片を単離した０ 次に、０．２　ｋｂ　ｐｓＶ４０断片及び４．９　ｋｂ　ｐＤＨＦＲ’断片を連 結してプラスミドｐＤ２’を作製した。

ｐＢＲ３２２領域の「毒性Ｊ　（ｐｏｔｓｏｎ）配列（Ｌｕｓｋｙ及びＢｏｔｃ ｈａｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２９３　：　７９−８１．１９８１）を除去することによりプ ラスミドｐＤ２’を変形した。プラスミドｐＤ２’及びｐＭＬ−１をＥＣＯＲＩ 及びＮｒｕ　Ｉにより消化し、そして断片をアガロースゲル電気泳動により分離 した。１．９ｋｂ　Ｉ）Ｄ２　’断片及び１．８　ｋｂ　ｐＭＬ−１断片を単離 し、そして−緒に連結した。目的の構造を有するプラスミドを選択し、そしてｐ Ｄ２と命名した。次に、このプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌＩで消化し、 そして３′スプライスシグナル、ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル及びｐ ｌ’ｌＬ　−１ベクタ一配列を含んで成る２、８ｋｂ断片を単離し、そして断片 Ｃと称した。

ｐＤ３の作製において使用する残りの断片を生じさせるため、ｐＤＨＦＲＩ［［ を修飾して５ｓｔＩＩ部位を旧ｎｄｎ［部位又はＫｐｎ　１部位に転換した。プ ラスミドｐＤＨＦＲＩ［［を５ｓｔＩＩにより消化し、ｄＣＴＰ及びＴ、ＤＮＡ ポリメラーゼと共にインキュベートし、そしてキナーゼ処理された旧ｎｄＩＩ［ リンカ−又はＫｐｎ　Ｉリンカ−に連結した。生ずるプラスミドを適当であれば 旧ｎｄＩＩＩ又はＫｐｎ　Ｉで消化し、そして次にアガロースを通して電気泳動 した。次に、ゲル単離されたＤＮＡを連結し、そして大腸ＷＲＲＩを形質転換す るために用いた。生ずるプラスミドをｐＤＨＦＲＩＩ［（ＨｉｎｄＩ［ｌ）及び ｐＤＨＦＲｍ　（Ｋｐｎ　Ｉ　）と命名した。次に、７００ｋｂのＫｐｎ　■− Ｂｇｌ　ＩＩ断片（断片Ａ）をｐＤＨＦＲｍ　（Ｋｐｎ　Ｉ　）から、Ｂｇｌ　 Ｉｆ及びＫｐｎ　Ｉによる消化並びにそれに続くアガロースゲル電気泳動により 精製した。

ＳＶ４０エンハンサ−配列を次の様にしてｐＤＨＦＲＩ［Ｉ　（旧ｎｄｌｌＩ） に挿入した。５Ｖ４５　ＤＮＡを旧ｎｄｎｌで消化し、そして旧ｎｄＩ［ｃＳＶ ４０断片（５０８９−９６８ｂｐ）をゲル精製し、そしてｐＤＨＦＲＩＩ［（Ｈ ｉｎｄＩ［Ｉ）の旧ｎｄＩ［Ｉ部位に挿入した。次に、生ずるプラスミドｐＥ２ をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎ　Ｉで消化し、そしてＡｄ５　ｏｒｉ及びＳＶＯエンハ ンサ−を含有する７００ｂｌ）断片（断片Ｂと称する）を単離した。

ｐＤ３の最終作製段階のため、断片Ａ、Ｂ及びＣを三元連結により連結し、そし てその混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。陽性クローンを選択し、そ してこのベクターをｐＤ３と命名した。

ｆ！！！Ｌ２ＬＤ５　びＤｌｌの　ｊ Ａｄ５　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ−１Ａｄ２主要後期プロモーター、へｄ ２トリパルタイトリーダー（Ｌｌ−３）、５’及び３′スプライスシグナル、Ｓ Ｖ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル並びにｐＭＬ−１ベクタ一配列を含んで成 るプラスミドρＤ５及びＰＤＩＩを作製してユニークＢａｍＨ１部位を挿入した 。ｐＤ５及びｐｏｌｌを作製するため、Ｐｓｔｌにより部分消化されたｐＤＨＦ ＲＩＩＩをｄＣＴＰと共にＴ、Ｉ）ＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベート することによりＤＨＦＲ配列のすぐ上流のＰｓｔ１部位をＢａＩＩＩＢ　１部位 に転換することによりｐＤｔｌＦＲＩＩＩをまず変形した。次に、ＤＮＡをエタ ノール沈澱し、そしてキナーゼ処理されたＢａｍＨＩリンカ−に連結した。Ｂａ ａ＋ＨＩによる消化及びそれに続くゲル電気泳動及び４．９ｋｂ断片の単離によ り過剰のリンカ−を除去した。４．９ｋｂ断片を自己連結により再環化した。目 的とする修飾を有するプラスミドを選択し、そして９口１′と命名した。

次に、ｐＤ１’からプラスミドｐＤ１を形成するため、まずｐＶｓ４０　（ｐＭ Ｌ　−１のＢａｗｌｌ　１部位にクローニングされたＢａｍＨＩ消化ＳＶ４０　 ＤＮＡを含んで成る）をＢｃｌ　Ｉ及びＢａａ＋ＨＩにより消化して０．２　ｋ ｂ　ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルを単離した。

プラスミドｐＤ１’をＢａＩｌｌ　ｌで消化することにより線状化し、そして４ ．９ｋｂ断片を単離した。次にこれらの断片をＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン配 列と後方向で連結してプラスミドｐＤ１を作製した。

ｐＢＲ３２２ｓｆｆ域中の「毒性」（ｐｏｉｓｏｎ）配列（Ｌｕｓｋｙ及びＢｏ ｔｃｈａｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２９３　：　７９−８１．１９８１）を除去することによりプラ スミドｐＤ１を変形した。プラスミドｐＤ１及びｐＭＬ　−１（Ｌｕｓｋｙ及び Ｂｏｔｃｈａｎ　ｓ前掲）をＥｃｏＲＩ及びＮｒｕ　Ｉにより消化し、そして断 片をアガロースゲル電気泳動により分離した。１．９ｋｂのｐＤ１断片及び１． ８ｋｂのｐＭＬ−１断片を単離し、そして−緒に連結した。目的とする構造を有 するプラスミドを選択し、そしてｐｐＤ　１と命名した。次に、このプラスミド をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、そして３′スプライスシグナル、Ｓ Ｖ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル及びｐＭＬ−１ベクタ一配列を含んで成る ２、８ｋｂ断片を単離し、そして断片Ｃ′と命名した。

ＳＶ４０エンハンサ−配列を次の様にしてｐＤＨＦＲｎｌ　（ＢｉｎｄＩ［［） に挿入した。ＳＶ４０　ＤＮＡを旧ｎｄｌｌにより消化し、そしてＨｉｎｄｌｌ ［ＣＳＶ４０断片（５０８９−９６８ｂｐ）をゲル精製し、そして連結によりｐ ＤＨＦＲＩ［［（Ｈｉｎｄｕｌ）の旧ｎｄＩ［［部位に挿入した。連結混合物を 大腸菌ＲＲＩに挿入した。形質転換体から調製されたプラスミドＤＮＡを制限酵 素分析によりスクリーニングした。２個のプラスミドを単離した。その一方はｐ Ｈ１と称され、Ａｄ５　ｏｒｉから遠い方のＫｐｎ　Ｉで方向付けられたエンハ ンサ−を含有し、そして他方はｐＨ２と称され、Ａｄ５　ｏｒｉに近いＫｐｎ　 Ｉで方向付けられたエンハンサ−を含有していた。次に、プラスミドｐＨ１をＥ ｃｏＲＩ及びＫｐｎ　Ｉにより消化し、そしてＡｄ５　ｏｒｉ及びＳＶ４０エン ハンサ−を含有する７ｏｏｂｐの断片（断片Ｂ′と称する）を単離した。プラス ミドｐＥ２をＫｐｎ　Ｉ及びＢｇｌＩＩにより消化し、そして０．９ｋｂ断片（ 断片Ｄ’）を単離した。

ｐＤＩＩ及びｐＤ５を作製するために使用される残りの断片はｐＤＨＦＲｍ　（ Ｋｐｎ　Ｉ　）から得られた。プラスミドｐＤＨＦＲＩＩＩ　（Ｋｐｎ　Ｉ　） （例１）をＫｐｎ　Ｉ及びＢｇｌ　ＩＩにより消化して７００ｂｐのＫｐｎ　Ｉ −ＢｇｌＩＩ断片（断片Ａ′と称する）を単離し、そしてＥｃｏＲＩ及びＫｐｎ 　Ｉにより消化してＡｄ５　ｏｒｉを含有する０、　４　ｋｂｌｒ片（断片Ｅ’ ）を単離した。

ｐＤ５及びｐＤｌｌの最終作製段階のため、断片Ａ’、Ｂ’及びＣ′を三元連結 で連結し、そして断片Ｃ’、Ｄ’及びＥ′を三元連結で連結した。次に、混合物 を大腸菌ＲＲＩに形質転換した。断片Ａ’、Ｂ’及びＣ′の連結からのプラスミ ドをｐＤ５と称した（第１図）。断片Ｃ’、Ｄ’及びＥ′の連結からのプラスミ ドをｐＤｌｌと称した（第４図）。

氾Ｂｏｅ１３６０　びｄ５　（ＣＡＴ−ＤＨＰＲ）の　ｌ＋マウスＤＨＰＲ’　 ｃＤＮＡ及びＣＡＴ遺伝子を含有するポリシストロン性転写ユニットを含んで成 るプラスミドｐＢｏｅ１３６０を前駆体プラスミドｐＤＨＦＲＩ　（Ｂｅｒｋｎ ｅｔ及び５ｈａｒｐ＋　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋ＤＨＰＲ’　ｃＤＮＡ をＢｏｅｌら（ＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　２１９　：　１８１−１８８．１９８ ７）により記載されている野生型ＤＨＦＲｃＤＮＡから作製した。要約すれば、 プラスミドｐＤＨＦＲＩをＢｇｌ　Ｉ及びＢａＩｌｌ　Ｉで消化してＤＨＦＲｃ ＤＮＡを含む１０５０ｂｐ断片を単離した。このＢｇｌ　ＩＩ　−ＢａＩｌｌ　 １断片を、Ｂａ曽ＨＩによる消化によって線状化されたｐＥＭＢＬ　８（Ｄｅｎ ｔｅら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１　：　１６４５−１６５５．１ ９８３）に三元連結により連結した。正しい方向に挿入部を含有するプラスミド をｐＤＨＦＲ／　ｐＥＭＢＬ　８と称する。単鎖ｐＤＨＦＲ／ｐＥＭＢＬ　８　 ＤＮＡを調製し、そしてＺｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ（ＤＮＡ、　３　：　４７ ９−４８８．１９８４）の方向及び変異原オリゴヌクレオチドＺＣ１６５（５’ 　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＴ　ＣＴＣＣＧ　３　’　）を用いて部位特 定生体外変異誘発にかけた。ＺＣ１６５を用いる変異誘発がＤＨＦＲｃＤＮＡの 位置２２にＬｅｕからＡｒｇへの変異を導入し、Ｓｉｍｏｕｓｅｎ及びＬｅｖｉ ｎｓｏｎ　（旦ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０　：　２４９５−２４９９．１９ ８３）により記載されているＤＨＰＲ’変異体ｃＤＮＡをもたらした。ラベルさ れたＺＣ１６５とのコロニーハイブリダイゼーションにより陽性クローンを同定 し、そしてジデオキシ配列決定法により変異を確認した。

陽性プラークから複製形ＤＮＡを調製し、そしてＸｈｏ　Ｉ［で消化してＤＨＰ Ｒ’　ｃＤＮＡを含む断片を単離した。プラスミドｐＤＦＩＰＲをＢｇｌ　［及 びＢａｔｇＨｌで消化してベクター含有配列を単離したＸｈｏ　ＩＩ　ｐＤ）Ｉ ＦＲＩ断片を二元連結でＤＨＰＲ’　ｃＤＮＡ断片に連結した正しい方向にＤＨ ＦＲ’　ｃＤＮＡを含有するプラスミドをｐＤＨＰＪ？’　Ｉと命名した（第１ 表）。

プラスミドｐＤ５ＣＡＴはＣＡＴ−Ｄ）ＩＦＲ’ポリシストロン性転写ユニット のための先祖であり、そして先祖プラスミドｐＤ５から作製された。次の様にし て、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をｐＤ５のＢ ａｍＨ１部位に挿入してプラスミドｐＤ５ＣＡＴを作製した。プラスミドｐＤ５ をＢａｍＨＩによる消化によって線状化した。ＣＡＴ　ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ　 Ｘｈｏ　Ｕ断片として得、そして二元連結により線状化ρＤ５に連結した。正し い方向にＣＡＴ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドをｐＤ５ＣＡＴと命名した（第 １図）。

第１図に示すように、ポリシストロン性転写ユニットをｐＤＳＣＡＴ中に作製し た。プラスミドｐＤＨＦＲ’　ＩをＦｎｕ　４ＨＩにより消化し、そして付着末 端をＴ、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシリボヌクレオチドトリホスフ ェートでの処理により平滑化した。キナーゼ処理されたリンカ−を平滑化された 断片に付加し、そしてこのリンカ−を付加した断片をＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　Ｉ により消化した。ＤＨＰＲ’　ｃＤＮＡの一部分を含む０．６２ｋｂ断片をゲル 電気泳動及び電気溶出により単離した。プラスミドｐＤｌ（ＦＲ’　Ｉをさらに Ｘｂａ　Ｉにより消化し、そしてＮｃｏ　Ｉにより部分消化して、ＤＨＦＲ’　 ｃＤＮＡの３′−末端、ＳＶ４０ポリアデニｌ　レーションシグナル及び２７６ ｂｐ　ｆ７）　ｐＢＲ３２２ベクター配列を含んＩ　で成る断片を単離した。プ ラスミドｐＤ５ＣＡＴをＸｂａ　Ｉで消化し、そしてＢａｍＨＩで部分消化して ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル及び２７６ｂｐのｐＭＬベクター配列を 取ったＸｂａ　Ｉ　−ＢａｎＨＩベクター及びｐＤ５０ＡＴのＣＡＴ遺伝子をＮ ｃｏ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片及びＢａ１Ｉｌｌ　Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉ断片と三元連 結により連結した。生ずるプラスミドをｐＤ５ＣＡＴ−ＤＨＦＲ’　と命名した 。

第１図は、ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルの３′の’　ＢａｍＨ１部位 をＣ１ａ　１部位に変えるためのプラスミドｐＤ５ＣＡＴ−ＤＨＰＲ’ノ修飾を 図示する。プラスミドｐＤ５ＣＡＴ−ＤＨＦＲ’をＸｂａ　１１　及びＳｓｔ　 Ｉ　ニより消化シテ、ＤＨＦＲ’　ｃＤＮＡ（７）部分、ＳＶ４０ボＩ７７デニ レーシヨンシグナル及びｐＭＬ−１ベクタ一配列を含んで成る０、９ｋｂ断片を 単離した。この０．９ｋｂ断片を、Ｘｂａ４−５ｓｔｌにより線状化されたｐＵ Ｃ３にリガーゼ処理により連結した。ｐＢｏｅ１３６０ａと称する得られるプラ スミドをＢａ１ｌ　Ｉにより消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎ ｏ−断片）及び４種類のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートで処理する ことによりフィルインした。ＤＮＡを連結により再環化し、そしてｐＢｏｅ１３ ６０ａのＢａｍＨ１部位の代りにＣｌａｌ部位を含有する得られるプラスミドを ｐＢｏｅ１３６０ｂと命名した。次に、プラスミドｐＢｏｅ１３６０ｂをχｂａ Ｔ及び５ｓｔｌにより消化し、そして０．９ｋｂ挿入部を単離シタ。プラスミ） ’ｐＤ５ＣＡＴ−ＤＨＦＲ’をＸｂａ　１及び５ｓｔｌニより消化して、Ｄ）ｌ ＦＲ’、　ｃＤＮＡ（７）　３　’−一部分ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグ ナル及びｐＭＬベクター配列を含んで成る０、９ｋｂ断片を取った。ｐＤ５ＣＡ Ｔ−Ｄ）ＩＦＲ’からのＸｂａ　Ｉ　−５ｓｔｌベクタ一含有断片をｐＢｏｅ１ ３６０ｂからの０．９　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｔ−５ｓｔｌ断片に連結した。生ずるプ ラスミドをｐＢｏｅ１３６０と命名した（第１図）。

Ｓｔｏｗ　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３７’：　１７１−１’８０．１９８１）並び にＢｅｒｋｎｅｒ及び５ｈａｒｐ’（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ’、、　１１ 　：　６００’３−６０２０．１９８３）により実質的に記載されているように して、ｐＢｏｅ１３６０及び不完全なＡｄ５ウィルスＤＮＡにより２３９細胞を 同時トランスフ４クトすることにより組換アデノウィルスベクターを生じさせた 。Ａｄ５のｍｕ９．４のＢｇｌ　ＩＩ部位をＸｂａ　１部位で置換し、そしてＸ ｂａ　１９．４　１００ｍｕ断片を調製した。この断片をＸｂａ　Ｉ−消化ｐＢ ｏｅＬ３６０に連結し、そして１０■のＤＮＡを用いてリン酸カルシウム法によ り細胞をトランスフェクトした。組換ウィルスを回収し、そしてＡｄ５．（ＣＡ Ｔ−ＤＨＰＲ）　と命名した。

炎玉ＧＥＭｃＧＭ　Ｅｃｏ　１１００の　″ヒト顆粒球マクロファージコロニー 刺激因子コード配列（ｈＧＭ−ＣＳＦ）に融合したＬｌ−３リーダーの部分をコ ードするｃＤＮＡを、ｐＤｇ　ＧＭＵ　（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒ　、　２６　：　４８６１−４８６７、１９８７）からｈＧＭ−Ｃ ５Ｆを一時的に発現しているＣＯＳ細胞から単離されたｍＲＮＡからクローン化 した。要約すれば、ｈＧＭ−Ｃ５Ｆをコードする２、６ｋｂのＢｓｔＥ　ＩＩ　 −ＥｃｏＲＩゲノム断片をＢｓｔＥ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩで切断されたｐＤ３（ 例１）中にサブクローニングした。生ずるプラスミドｐＤｇＧＭＵをＸａｕｓｈ ａｎｓｋｙら（危見迂Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３　：　３１ ０１−３１０５．１９８６）により記載されているようにしてＣＯ３細胞にトラ ンスフェクトした。

Ｃｈｉｒｇｗｉｎら　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１８　：　５２９４−５ ２９９．１９７９）により記載されているのと実質的に同じ方法により調製した ＲＮＡを詩形として使用して、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ、　 ２５　：　２６３−２６９、１９８３）４こ記載されている方法を適合させても いてλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを調製した。

ラベルされたｈＧＭ−Ｃ３Ｆゲノムプローブへのハイブリダイゼーションにより 同定された陽性ｃＤＮＡクローンはｃａｐ部位からコード領域を通って３′−非 翻訳領域に入るＤＮ、Ａ配列を含有することが見出された。ｈＧＭ−ＣＳＦコー ド配列に融合したＬｌ−３の部分を含んで成る完全なｃＤＮＡクローンを、λフ ァージから、ＥＣＯＲＩによる消化により単離し、そしてｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏ ｍｅｇａ　Ｂｆｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　［）のユニークＥｃｏＲ１部位 に連結した。ｐＧＥＭｃＧＭ、Ｅｃｏ、１］、ｏＯと称する得られるプラスミド は、ｐＧＥＭ−１ベクター中にタンデムに方向付けられたｈＧＭ−Ｃ５Ｆ　ｃＤ ＮＡの２個のコピーを含有していた。

例５．ＴＰＣ１ａ　び＾ｄ　５　（ＴＰＣＩＪの　１１ポリシストロン性転写ユ ニツトのシストロン間領域中に使用されるＬｌ−３リーダー配列を、八ｄ５　ｏ ｒｉ、　Ａｄ２主要後期プロモーター（ＭＬＰ）　、Ａｄ２　Ｌｌ−３及びそれ に付随する５′スプライスシグナル、免疫グロブリン３′スプライスシグナル、 ＤＨＦＲｃＤＮＡＳＳＶ４０ポリアゾ＝Ｌｚ−’−シ５７シグナル及びｐＵｃ１ ３ベクター配列を含んで成る、プラスミドＤｓ／ＰＩＩＣ及びプラスミドｐＧＥ ＭｃＧＭＪｃｏ、１１００　（例４）から誘導した。第２図に示すように、プラ スミドｐＧＥＭｃＧＭ、Ｅｃｏ、　１１００をＢａ目で消化して、Ｌ１〜３リー ダー配列に融合したＣ３Ｆ　ｃＤＮＡを含んで成る０、　８ｋｂ断片を単離した 。オリゴヌクレオチドＺＣ５８２（５’　ＡＡＴ　ＴＣＣＣＧＧＧ３’）及びＺ Ｃ５８３（５’　ＧＴＡ　ＣＣＣＣにＧ　Ｇ　３　’　）をキナーゼ処理し、そ してＭａｎｉａｔｉｓ編集匙劫ｃｕｌａｒ工匡１皿Ａ　Ｌａｔ襄１迫狂Ｍａｎｕ ａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ＋　１９８２に一般的 に記載されている条件を用いてアニールした。キナーゼ処理されアニールされた オリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲｉアダプターを形成し、これを０ ．８　ｋｂ　ｐＧＥＭｃＧＭ、Ｅｃｏ、１１００断片に、リガーゼ処理により連 結した。この連結混合物をＥｃｏＲｌで消化してＬｌ−３リーダー配列を含んで 成る０、２ｋｂ断片を単離した。

プラスミドｐＵｃ１３をＥｃｏＲＩ消化により線状化し、そして次に再環化を防 止するためにウシ腸ホスファターゼで処理した。

０．２　ｋｂ　Ｌｌ−３断片を、線状化されたｐＵｃ１３にリガーゼ処理により 連結した。生ずるプラスミドをＣＳＦ　Ｌｌ−３１１２（１２６５）　と命名し た（第２図）。

Ｌｌ−３配列の５′一部分を、次のようにして作製されたｐＤ’／ＰＵＣから取 った。プラスミドｐＤｓ／ＰＵＣは、Ｂｅｒｋｎｅｒ及び５ｈａｒｐ　（前掲、 １９８５）により開示されているプラスミドｐＤＨＦＲｎＩに由来する。プラス ミドｐＤＨＦＲＩＩＩを修飾して＾ｄ５　ｏｒｉとＡｄ２　ＭＬＰの間の５ｓｔ １１部位にユニークＫｐｎ　１部位を置いた。

プラスミドｐＤ）ＩＦＲＩ［［を５ｓｔｌＩ消化により線状化し、そしてこの線 状断片をＴ、ＤＮＡポリメラーゼと適切なヌクレオチドとによる処理によって平 滑化した。線状断片をキナーゼ処理されたＫｐｎ　Ｉリンカ−に連結した。過剰 のリンカ−をＫｐｎ　Ｉ消化により除去し、そしてリンカ−断片を自己連結した 。生ずるプラスミドをｐＤＨＦＲＩ［［／Ｓｓｔ　４　Ｋｐｎ　Ｉと命名した。

プラスミドｐＤＨＦＲＩＩＩ　／　Ｓｓｔ　−＋　Ｋｐｎ　ＩをＥｃｏＲＩ及び Ｘｂａ　Ｉで消化して、Ａｄ５０ｒｌ＋　Ａｄ２　ＭＬＰ％　５　’スライスシ グナル、３′スプライスシグナル、ＤＨＦＲｃＤＮＡ、　ＳＶ４０ポリアゾニレ −ジョンシグナル及び約３００ｂｐのｐＢＲ３２２ベクター配列を含んで成る２ 、４ｋｂ断片を単離した。この２．４ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉに より消化して線状化したｐＵｃ１３に連結した。生ずるプラスミドをｐＤｓ／Ｐ ｔ１Ｃと命名した。

第２図に示すように、プラスミドｐＤ”／ＰＵＣをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで消 化することにより、Ａｄ５　ｏｒｉ、　Ａｄ２　ＭＬＰ及びＬｌ−３並びに５′ −及び３′−スプライスシグナルを含んで成る１、１ｋｂ断片を単離した。この １．１ｋｂ断片をＨｈａ　Ｉで消化することにより、Ｌｌ−３並びに関連する５ ′−及び３′−スプライスシグナルを含んで成る５００ｂｐ断片を単離した。次 に、５００ｂｐ断片をＴ、ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより付着末端を 平滑化した。この平滑末端化された断片をキナーゼ処理されたＢａ＋ｓＨＩリン カ−に連結した。ＢａｍＨＩで消化することにより過剰のリンカ−を除去し、そ してリンカ−が付加された断片をｐＵｃ１３のＢａｍＨ１部位に挿入した。生ず るプラスミドをＬｌ−３８ａｍ−Ｐｓｔ（＃３０１）と命名した（第２図）。

第２図はプラスミドｐＴＰ　（１１３２３）の作製を示す。プラスミドＣＳＦ　 Ｌｌ−３１１２（＃２６５）をＸｂａ　Ｉ及びＮｄｅ　Ｉで消化することにより 、Ｌｌ−３の３′一部分及びｐＵｃ１３ｓベクター配列を含んで成る２、５ｋｂ 断片を単離した。プラスミドＬｌ−３８ａｍ−Ｐｓｔ（＃３０１）をＢａｍＨＩ 及びＸｂａ　Ｉで消化することによりＬｌ−３の５′一部分を含んで成る０、１ ７ｋｂ断片を単離した。大腸菌ベクターｐＵｃ１３をＢａｍＨＩ及びＮｄｅ　Ｉ で消化することにより２００ｂｐベクタ一断片を単離した。Ｌｌ−３ＢａｍＨＩ 　−Ｐｓｔ　Ｉ　（＃３０１）からの０．１７ｋｂ　Ｌｌ−３断片をＣＳＦ　Ｌ ｌ−３１１１２（＃２６５）からの２．５ｋｂ断片及びｐＵｃ１３の２００ｂｐ 断片と三元連結により連結した。生ずるプラスミドをｐＴＰ　（１３２３）と命 名した（第２図）。

プラスミドｐＴＰ　（＃３２３）をＢａＩＩＩＨ■で消化することにより０．２ ｋｂのＬｌ−３断片を単離する。プラスミドｐＢｏｅ１３６０（Ｃ１ａ　Ｉ（＄ ２２１）としても知られており、そして例２に記載されている）をＢａｒｌｌＨ Ｉによる部分消化にかけてこのプラスミドを線状化した。線状化されたｐＢｏｅ １３６０を二元連結によりｐｉｐ　（＄１３２３）の０．２ｋｂのＢａｍＨＩ断 片に連結する。連結混合物を大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換した。プラスミドＤＮ Ａを形質転換体から単離し、そして制限酵素消化により分析して成分断片の正し い方向を証明した。ＣＡＴ及びＤＨＰＲの間のシストロン間に正しい方向で挿入 されたＬｌ−３断片を含有するプラスミドをｐＴＰ／Ｃ１ａ（！１４３１）と命 名した（第２図）。

プラスミドｐＴＰ／Ｃ１ａを用い、実質的に、例３に記載されているようにして ２９３細胞をトランスフェクトすることによりアデノウィルスベクターＡｄ　５ 　（ＴＰＣｌａ）を生成せしめた。

ｌ　Ｄ）ＩＦＨの　のレベルに・　るシストロン日り−゛−の威果 ＤＩｌＰＲ’コード配列の上流のシストロン間領域中にＬｌ−３を有するＤＨＰ Ｒ’の増加した転写効率を確立するため、Ａｄ５（ＣＡＴ−ＤＨＦＲ）又はＡｄ 　５　（ＴＰＣｌａ）組換ウィルスにより感染された細胞においてＤＨＰＲ蛋白 質のレベルを測定した。

コンフルエント状態に達しない２９３細胞をＡｄ　５　（ＣＡＴ−ＤＨＦＲ）又 はＡｄ　５　（ＴＰＣｌａ）組換ウィルスで感染させた。感染した細胞をインキ ュベートし、そして細胞ががなりの細胞変性効果を示した時収得した。収得され た細胞を遠心分離によりベレット化してスペント培地を廃棄した。リン酸緩衝液 （ＰＢＳ　；シグマ、セントルイス、ＭＯ）で１回すすぐことにより過剰の培地 を除去した。細胞を０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）中に再懸濁し た。細胞懸濁液を凍結しそして解凍し、これを３回反復することにより細胞を溶 解した。細胞破片を遠心分離により除去し、そして５０Ｉの上清を５０ｍのサン プル緩衝液（第１表）と混合し、そして１５％アクリルアミドゲル上で電気泳動 した。

裏−」−一表 ３６１ｄ０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８）１６ａｊ！　グリセロール １６＃！ｉ！　２０％ＳＤＳ すべての成分を混合する。使用の直前に、９００Δの色素混合物に１００４のβ −メルカプトエタノールを添加する。

ウェス　ン　°′Ａ ３０ｄ　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）２０Ｉｄ　０．２５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ（ｐＨ７，０）５ｄ　１０％ＮＰ−４０ ３７，５ＪＩ１１！　４　Ｍ　ＮａＣ１蒸留水を用いてＴｒｉｓ＋　ＥＤＴＡ＋ 　ＮＰ−４０及びＮａＣ１を１２の最終体積に希釈する。３００ｄのこの溶液に ゼラチンを加え、そしてゼラチンが溶解して溶液になるまでマイクロウェブ中で 加熱する。ゼラチン溶液を第一の溶液の残りに加えもどし、そして冷却するまで ４°Ｃにて撹拌する。

蛋白質をまた、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、　７６　：４３５０−４３５３．１９７９）により記載されている方法を用 いてニトロセルロースフィルターに移行させた。ニトロセルロースフィルターを ウェスタン緩衝液Ａ（第１表）に室温にて１時間浸漬した。緩衝液を除去し、そ してウェスタン緩衝液Ａに希釈した抗−ＤＨＰＲ抗体により室温にて１時間フィ ルターをプローブした。抗体溶液を除去し、そしてウェスタン緩衝液Ａにより３ 回洗浄することによりフィルターから過剰の抗体を除去した。抗体により結合さ れた蛍白質を、ウェスタン緩衝液Ａに希釈された１２５Ｉ−ラベル化プロティン Ａと共に室温にて１時間インキュベートすることにより可視化した。ラベルされ たプロティンＡ溶液を廃棄し、そしてウェスタン緩衝液Ａにより３回洗浄するこ とによって過剰のレベルを除去した。

ラベルされたフィルターを強化スクリーンを用いて一８０゛ｃにて４時間Ｘ−縁 フィルムに暴露した。この結果が示すところによれば、Ａｄ　５　（ＴＰＣｌａ ）組換ウィルスにより感染された細胞により生産されたｊｎｐｒ蛋白質は高レベ ルで存在したが、Ａｄ　５　（ＣＡＴ−ＤＨＦＲ）組換ウィルスにより感染され た細胞においては検出されなかった。

ポリシストロン性ｍＲＮＡの生産を確認するため、ＢＨＫ細胞をｐ０５ＣＡＴ− ＤＨＰＲ’により、又はモノシストロン性ＤＨＰＲ発現ユニットを含有する対照 プラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクトントにより生産され たｍＲＮＡを３２ｐ−ラベル化アンチセンスＩ）ＮＡプローブ（第３図−Ｂ）に ハイブリダイズさせ、そして混合物を３１ユクレアージにより消化してハイブリ ダイズしていないプローブを除去した。生成物の分析（第３図Ａ）が示すところ によれば、ｐＤ５ＣＡＴ−ＤＨＦＲ’はニジストロン性ｍＲＮＡの発現を指令し くレーン１及び２、矢印）、他方モノシストロン性プラスミドはより小さいｍＲ ＮＡの生産を指令した。ニジストロン性メツセージに観察されるダブレットは第 ３図Ｂに示すような転写物の部分におけるスプライシングによる。レーンエ及び ２の頂部のバンドは消化されていないプローブＤＮＡを示す。

シストロン間トリパルタイトリーダーを含有するポリシストロン性発現ユニット によりトランスフェクトされた細胞から生産されたｍＲＮＡをナサン（Ｎｏｒ　 ｔｈｅｒｎ）プロット（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、互、　５２０１．１９８０）により分析 した。°この結果が示すところによれば、ニジストロン性メツセージについて予 想されるサイズのｍＲＮＡが生産された。

ｆ１３．　ＴＰ　Ｆ９　Ｃ１ａの　７１フアクターＩＸ　ｃＤＮＡ　、ＣＡＴ遺 伝子及びＤＨＦＲ’　ｃＤＮＡを含んで成る三シストロン性転写ユニットを、第 ４図に示すようにして、ファクターＩＸ　ｃＤＮＡ及びｐＢｏｅ１３６Ｑから作 製した。プラスミドｐＢｏｅ１３６０　（例３）をＢａｍＨＩにより部分消化し て該プラスミドを線状化した。Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）に記載されているの と実質上同様にして、付着末端をウシアルカリ性ホスファターゼにより処理して 、自己連結を防止した。Ｋｕｒａｃｈ　ｉ及びＤａｖｉｅ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｌ、Ｓｃｉ、ＵＡＳ、　７９　：　６４６１−６４６４＋　１９８２’ ）によ　″り記載されているようにして、ファクター■のｃＤＮＡを１．４　ｋ ｂＢａｍＨ１断片として単離した。次に、この１．４　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を ｐＵｃ１３にサブクローニングしてプラスミドｐＦ９ｐＵｃを生成せしめた。プ ラスミドｐＦ９ｐＵＣをＢａｍＨＴで消化して１．４ｋｂフアクターＩＸ　ｃＤ ＮＡ断片を単離し、これを線状化されたｐＢｏｅ１３６０にリガーゼ処理により 連結した。連結混合物を大腸菌８８１０１株に形質転換した。プラスミドＤＮＡ を調製し、そして制限酵素消化によりスクリーニングした。正しい方向で且つＣ ＡＴ　ｃＤＮＡ配列の５′に挿入されたファクターＩＸ　ｃＤＮＡ断片を有する プラスミドをｐＦ９／Ｃ１ａ　と命名した（第４図）。

次のようにして、プラスミドｐＴｐ　（＃３２３）中に存在するトリパルタイト リーダー配列をファクターＩＸ　ｃＤＮＡの翻訳終止コドンとＣＡＴ　ｃＤＮＡ の翻訳開始コドンとの間に挿入した。プラスミドｐＦ９／Ｃ１ａをＢａｍＨＩ及 びＰｓｔｌにより消化してファクターＩＸ　ｃＤＮＡの５′−コード配列を含ん で成る断片（１，４ｋｂ）を単離した。プラスミドｐＴＰ　（＃３２３）　（例 ５）をＢａｍＨＩによる部分消化によって線状化し、そしてホスファターゼによ り処理した。線状化されたｐＴＰをＰｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩアダプターにより ファクター■断片に連続した。

オリゴヌクレオチドＺＣ２０２９（５’　ＧＡＴ　ＣＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡ ３′）及びＺＣ２０３０（５’　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡ　３　’　）から作製され たアダプターがＢａｍ１（Ｉ部位を破壊したがファクター■断片上のＰｓｔＩ部 位を保存した。生ずるプラスミドをＩＸ　（ＴＰ）　（１５１５）と命名した。

プラスミドｐＰ９　／Ｃ１ａ　’ｃ　Ａｖａ　Ｔ及びＨｉｎｄＩ［ｒで消化し、 そしてｐＭＬ−１配列を含有する４、９ｋｂ断片を回収した。

プラスミドｐＦ９／Ｃ１ａをさらに旧ｎｄｌＩ［及びＳｓｐ　Ｉにより消化し、 そしてＭＬＰ、　ＬＬ−３及び５′−ファクター■配列を含有する１、　５　ｋ ｂ断片を回収した。次に、上記２種類のｐＦ９７Ｃ１ａ由来断片をプラスミドＩ Ｘ　［ＴＰ）からのファクターＩＸ　−ＬＬ−３５ｓｐＩ−Ａｖａｌ断片に連結 した。得られるプラスミドをｐＴＰ／Ｆ９／Ｃ１ａと命名した（第４図）。

プラスミドｐ　Ｔ　Ｐ　／　Ｆ　９　／　Ｃｌ　ａ及びｐＦ９／Ｃ１ａをＢＨＫ 細胞にトランスフェクトし、そしてクロラムフェニコール・アセチル・トランス フェラーゼの一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）　発現レベルを測定した。ｐＴＰ　 ／　Ｆ９　／　Ｃ１ａ形質転換体におけるＣＡＴの発現はｐＦ９７Ｃ１ａ形質転 換体におけるより約２０倍亮かった。

氾　ｐ！Ｌ７　ＴＰ　Ｂｉ２　の　衛すＡ、上入至立製 ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルが後方向（ｌａｔｅ　ｏｒｉｅｎ−ｔａ ｔｉｏｎ）にある点を除きｐＨ３と同じであるベクタープラスミドｐＤ３’から プラスミドｐＤＸを作製した。従って、ｐＤ３’は遺伝子挿入部位としてＢａｔ ａＨ１部位を有する。

ｐｏχを形成するため、ｐＤ３’中のＥｃｏＲＩ部位を、ＥｃｏＲＩ開裂、Ｓ１ ヌクレアーゼとのインキュベーション及びこれに続＜Ｂｃｌｌリンカ−との連結 により、Ｂｃ１１部位に転換した。

陽性として同定されたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、そして変化した 制限部位を含有する１、９ｋｂのＸｈｏ　Ｉ−Ｐｓｔｌ断片をアガロースゲル電 気泳動により調製した。第二の修飾において、Ｂｃｌ　Ｉで開裂されたｐＤ３（ 例１）をキナーゼ処理されたＥｃｏＲＩ　−Ｂｃｌ　Ｉアダプター（オリゴヌク レオチドＺＣ５２５：　５　’　−ＧＧＡＡＴＴＣＴ−３’　；及びＺＣ５２６ ：　５　’　−ＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣ−３″から作製）に連結して、発現ベ クターにコード配列を挿入するための位置としてＥｃｏＲ１部位を生じさせた。

陽性コロニーを制限分析により同定し、そして陽性として同定されたコロニーか ら調製されたプラスミドＤＮＡを用いて変更された制限部位を含有する２、　３ 　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離した。ｐＤ３及びｐＤ３’断片を Ｔ、ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし、大腸菌１（ＢＩＯＩに形質転換し 、そして制限分析により陽性コロニーを同定した。目的とする発現ベクターを含 有するプラスミドをｐＤＸと命名した（第５図）。

Ｂ、の１勿作裂 Ａｄ５　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ−２へｄ２主要後期プロモーター及びト リパルタイトリーダー、５′−及び３′−スプライスシグナル、ファクター■ｃ ＤＮＡ並びにＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルを含んで成る発現ベクター を、プラスミドｐＤＸ。

ｐＤｌｌ、及びｐＦＶＩＩ　（５６５＋２４６３）／ｐＤＸ（ＡＴＣＣＮα４０ ２０５）　カラ作製する。

第５図に示すように、ｐＦＶ　Ｉｆ　（５６５＋２４６３）　ｐＤＸ中に存在す るファクター■ｃＤＮＡを変形して３′−非翻訳領域を除去する。

プラスミドｐＦＶ　Ｕ　（５６５−ｉ−２４６３）　／　ｐＤＸをＥｃｏＲＩで 消化して２．４ｋｂのファクター■ｃＤＮ＾断片を単離する。ＥｃｏＲＩ断片を Ｍｂｏ　ＩＩで消化することによりファクター■コード配列を含んで成る１、４ ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｍｂｏ　ＩＩ断片を単離する。Ｍｂｏ　ＩＩ　ＢａｍＨＩ アダプターを形成するように設計された合成オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理 しそしてアニールする。１．４ｋｂ断片をキナーゼ処理されたアダプター並びに ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる消化によって線状化されたｐＵｃ１３と連結し た。生ずるプラスミドｐＵｃＦ■をＥｃｏＲｌ及びＢａＩＩ）（Ｉで消化して１ ．４　ｋｂ断片（断片ａ）を単離した。

プラスミドｐＤＸをＥｃｏＲＩ及びにｂａｒにより消化することにより、Ａｄ５ 　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ−１Ａｄ２主要後期プロモーター及びトリパル タイトリーダー、５′−及び３′−スプライスシグナル並びにｐＢＲ３２２ベク ター配列を含んで成る４、　Ｏｋｂ断片を単離した。プラスミドｐＤ１１（例２ ）をＢａｎ＋ＨＩ及びＸｂａ　１により消化して、ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョ ンシグナル及びｐＭＬ　−１ベクタ一配列を含んで成る０、５ｋｂ断片（断片Ｃ ）を単離した。ｐＦＶ　ＩＩを作製するため、断片ａ、ｂ、及びＣを三元連結に より連結した。

Ｃ，ブースミドＤｌｌ−ＢＩＰの　１１Ａｄ５　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ −１Ａｄ２主要後期プロモーター及びトリパルタイトリーダー、５′−及び３′ −スプライスシグナル、ＢｉＰ　ｃＤＮＡ並びにＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン シグナルを含んで成る発現ベクターを、プラスミドｐＤ１１　（例２）、ｐＢｉ Ｐ（ｐＵｃ１２）及びｐＤＸ　（第５図）から作製した。

免疫クロア”　’）　ン”：：　１１　結合蛋白’ｌ　（Ｂ　１Ｐ）ｃＤＮＡを ｐＵｃ１２（Ｍｕｎｒｏ及びＰｅｌｈａｍ、　Ｃｅ旦、　４６　：　２９１−３ ００．１９８６）中の２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片として得、そしてＢｉＰ（ｐ Ｕｃ１２）と命名した。次の様にして、ＢｉＰ　ｃＤＮＡをｐＤｌｌ中に存在す る発現ユニットにサブクローニングした。　ＢｉＰ　ｃＤＮ＾をｐＵｃ１２ベク ター配列から２断片として単離した。ＢｉＰ（ｐＵｃ１２）を３ａｍＨＩ及びＫ ｐｎ　Ｉにより消化して１．６ｋｂ断片を単離し、そしてＫｐｎ　Ｉ及びＥｃｏ ＲＩにより消化し′Ｃ０，８６ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐＤｘをＥｃｏ ＲＩ及びＸｂａ　Ｉにより消化してＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル及び ｐＭＬ−１ベクタ一配列を含んで成る０、５ｋｂ断片を単離した。

プラスミドｐＤ１１をＢａｍＨＩ及びＸｂａ　Ｉで消化することにより、Ａｄ５ 　ｏｒｚ−、ＳＶ４０エンハンサ−２Ａｄ２主要後期プロモーター及びトリパル タイトリーダー、５′−及び３′−スプライスシグナル並びにｐＭＬ〜１ベクタ ー配列を含んで成る４、０ｋｂ断片を単離した。

上記４断片の連結によりプラスミドｐＤ１１−ＢＩＰを作製した。

このプラスミドはＡｄ５　ｏｒｉ、　ＳＶ４０エンハンサ−１Ａｄ２主要後期プ ロモーター及びトリパルタイトリーダー、５′−及び３′−スプライスシグナル 、ＢｉＰ　ｃＤＮＡ、　ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル並びにｐＭＬ− １ベクタ一配列を含んでなる。

Ｄ、ブースミド　ＦＶＩＩ−ＴＰ−ＢＩＰ　（７）　”第５図に示すようにして 、ファクター■ｃＤＮＡ及びＢｉＰ　ｃＤＮＡを含有するニジストロン性転写ユ ニットをプラスミドｐＦＶ　ＩＩ　。

ｐＤＩＩ−ＢＩＰ及びｐＴＰから作製する。

プラスミドｐＤ１１−ＲＩＰをＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化してＢｉＰ　ｃ ＤＮＡの５′一部分を含んで成る０、５ｋｂ断片を単離する。０．５ｋｂ断片を ＥｃｏＲＶ　−Ｘｂａ　Ｉ合成アダプター並びにＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉによ る消化によって線状化されたｐＵｃ１３に連結する。生ずるプラスミドを、翻訳 開始コドンから５′位５ｂｐのところでＢｉＰ断片を開裂せしめるＮａｅ　Ｉに よる消化により線状化する。この線状化されたプラスミドを合成りａｗｌ　Ｉリ ンカ−を用いる連結により再環化する。得られるプラスミドをＢａｌ１ｌ　Ｉを 用いる消化により線状化し、そしてＢａｍＨＩで消化されたｐＴＰ　（例５）か ら得られたトリパルタイトリーダーを含んで成る０、２ｋｂのＢａｍＨＩ断片と 連結する。得られるプラスミドをＢａｗｌ　Ｉで部分消化しそしてＥｃｏＲＶで 完全消化することにより、トリパルタイトリーダー及び５’　ＢｉＰコード配列 を含んで成る０、７ｋｂ断片を単離する。

残りの断片は次のようにして得る。プラスミドｐＦＶ　ＩＩをＨｉｎｄＩ［Ｉ及 びＢａｍ）ｌ　Ｉで消化することにより、Ａｄ２主要後期プロモーター及びトリ パルタイトリーダー、５′−及び３′−スプライスシグナル並びにファクター■ ｃＤＮＡを含んで成る２、１ｋｂ断片を単離する。プラスミドｐＤ１１−ＢＩＰ を旧ｎｄｌＩ［及びＥｃｏＲＶで単離することにより、ＳＶ４０エンハンサ−２ Ａｄ５　ｏｒｉ、ｐＭＬ　−１ベクタ一配列、ＳＶ４０ポリアデニレーションシ グナル並びにＢｉｐ　ｃＤＮＡの３’−１，９ｋｂを含んで成る５、５ｋｂ断片 を単離する。

３１！ｙｒ片（０，５ｋｂのトリパルタイトリーダー及び５’　−Ｂｉｐ、２、 １　ｋｂ（７）　ｐＦＶ　ＩＩ、並びニ５．５　ｋＭＤｐＤｌｌ−ＢＩＰ）を三 元連結により連結する。得られるプラスミドをｐＦＶ　ｎ　−ＴＰ−ＢＩＰ　と 称する。

ＦＩＧ、１ ＦＩＣ；、２ １麹１０＋１番・酊１ム１１中ＣＩ＋□０１１呵ｅＰＣてニア１Ｊ５３０ノ′つ ３２：さシ国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．次の式： Ｐ−Ｃ１−（ＨＥＬ−Ｃｎ）ｍ （式中、 Ｐは転写プロモーターであり； Ｃは蛋白質をコードするＤＮＡ配列であり；ＨＥＬは高効率リーダーであり； ｎは０より大きい正の整数であり；そしてｍは１〜８の整数である） で表わされ、少なくとも１個のシストロンの増強された発現を提供するポリシス トロン性転写ユニット。
2. ２．プロモーター（Ｐ）の下流であってＣ１の上流に位置するリーダー（Ｌ）を さらに含む、請求項１に記載のポリシストロン性転写ユニット。
3. ３．前記リーダーがＳＶ４０リーダー、アデノウイルス第一リーダー、アデノウ イルストリバルタイトリーダー、アデノウイルスＬ１−ＩＸリーダー及びオバル ブミンリーダーから成る群から選択されたものである、請求項２に記載のポリシ ストロン性転写ユニット。
4. ４．前記リーダーがウイルスリーダーである、請求項２に記載のポリシストロン 性転写ユニット。
5. ５．前記ウイルスリーダーがアデノウイルス第一リーダー、アデノウイルストリ バルタイトリーダー、アデノウイルスＬ１−ＩＸリーダー及びＳＶ４０リーダー から成る群から選択されたものである、請求項４に記載のポリシストロン性転写 ユニット。
6. ６．前記高効率リーダーが高効率ウイルスリーダーである、請求項１に記載のポ リシストロン性転写ユニット。
7. ７．Ｃ１及びＣｎが多数−サブユニット蛋白質のサブユニットである、請求項１ に記載のポリシストロン性転写ユニット。
8. ８．前記多数−サブユニット蛋白質がファクターＶＩＩＩ、血小板由来成長因子 、免疫グロブリン及び組織適合性抗原である、請求項７に記載のポリシストロン 性転写ユニット。
9. ９．Ｃ１がプロテインＣ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ 及びファクターＶＩＩＩから成る群から選択された蛋白質をコードしている、請 求項１に記載のポリシストロン性転写ユニット。
10. １０．Ｃｎが、ＢｉＰ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）ＫＥＸ２遺伝子産物、フロテインＳ及びフォ・ビルブラント（ｖｏｎＷｉ ｌｌｅｂｒａｎｄ）因子から成る群から選択された蛋白質をコードしている、請 求項１に記載のポリシストロン性転写ユニット。
11. １１．Ｃ１がプロテインＣをコードしており、そしてＣｎがプロテインＳ及びＳ ．セレビシエーＫＥＸ２遺伝子産物から成る群から選択された蛋白質をコードし ている、請求項１に記載のポリシストロン性転写ユニット。
12. １２．Ｃ１がファクターＶＩＩＩをコードしており、そしてＣｎがフォン・ビル ブラント因子をコードしている、請求項１に記載のポリシストロン性転写ユニッ ト。
13. １３．請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリシストロン性転写ユニットが 導入されている、多細胞生物由来の培養細胞。
14. １４．前記培養細胞が哺乳類細胞である、請求項１３に記載の培養細胞。
15. １５．多細胞生物由来の培養細胞において蛋白質の発現を増強する方法であって 、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリシストロン性転写ユニットを多細 胞生物由来の培養宿主細胞に導入し、そしてこの培養宿主細胞を適切な培地中で 増殖せしめる、ことを含んで成る方法。