JPH04500151A

JPH04500151A - 植物類用発現カセット

Info

Publication number: JPH04500151A
Application number: JP1508115A
Authority: JP
Inventors: スライトム，ジェリー・エル
Original assignee: アズグロウ・シード・カンパニー
Priority date: 1988-08-19
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1992-01-16
Also published as: EP0693555A1; CA1329561C; EP0429478A1; DK28191D0; DE68928445D1; ATE160173T1; AU634168B2; JPH04500152A; DK28191A; EP0429483A1; AU3970489A; DE68915282T2; AU639891B2; EP0429483B1; KR900702041A; EP0429478B1; DE68928445T2; KR900702036A; EP0699757A1; DE68915282D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】植物類用発現カセット発明の分野本発明は、形質転換体植物類において高レベルで遺伝子を発現させるのに宵月な発現カセットの改良に関する。

発明の背景植物種を改良するための遺伝子工学技術の適用により、病原に対して増大した抵抗性を呈し、厳しいまたは不規則な天候条件に対し増大した耐性を示し、および／または栄養価が高い植物種を得ることができる。病原耐性、耐候性および滋養組成物の特徴は植物体の遺伝子的創製によって生じることが確立されている。かくして、遺伝物質を植物体に導入すると、好ましい特性をもたらすことができ、従って、植物種の改良が達成できる。

これらの望ましい特徴を達成する遺伝因子は、その存在が所望の特性を付与し、ならびにそのヌクレオチド配列が望ましくない蛋白の産生を阻害するペプチド産物用遺伝子を包含する。細胞に存在する抗病原性蛋白を有する植物は病原の攻撃に対し増大した耐性を示す。耐候性は植物体におけるある種の蛋白の生産によって付与できる。植物の栄養価は、しばしば、蛋白の存在、特に植物体を作り上げている望ましいアミノ酸の存在に関係する。種々の特徴を達成するペプチド類をコード付けする遺伝子に加え、翻訳されないＲＮＡ分子の存在によって特性は影響され得る。かくして、遺伝情報の導入は植物において望ましい特性を提供したり補足するのに用いることができる。

遺伝情報は植物体に導入することができ、その結果、病原の攻撃に対し耐性が増加する。特に、抗病原性蛋白の存在は、ウィルス感染に対する耐性を増大させることができ、ならびに細菌および他の微生物に対する薬剤として作用できる。さらに、殺虫剤、殺菌剤および除草剤として作用するペプチド類を導入し、発現させることができる。かかる蛋白産物をコード付けする遺伝子配列の導入に加え、同病原剤に対する耐性は、植物細胞にて転写され得る遺伝情報を、病原攻撃で必要な蛋白をコード付けするＲＮＡの翻訳を抑制するＲＮＡに導入することによって付与することができる。

変化しかつ厳しい気候条件に対する耐性は遺伝情報の導入によって植物に付与できる。種々の蛋白の存在は最適下気候条件に適合させ当該条件下で生き残る能力をもった植物を提供できる。例えば、冷害、熱害、日照りまたは洪水に対し生き残るように適合させることができ、進化を通じて植物において進展してきた特性を付与できる遺伝子を単離することができる。これらの遺伝子はそれを欠く植物に導入でき、当該植物は遺伝子が付与する表現型を呈するであろう。

同様に、植物の栄養価は遺伝情報の導入を通じて変化、増大させることができる。望ましいアミノ酸よりなるペプチド類および蛋白類をコード付けする遺伝子を植物に導入することができる。該遺伝子は発現され、従って、当該植物は改良された組成を示す。

植物に導入されるべき遺伝子はいずれの源から由来するものであってもよい。ｌの植物種における特性を付与する多くの遺伝子を第２の異なる植物において該特性を付与するために移入することができる。抗病原性遺伝子は病原に由来するものであり得る。遺伝子は合成できる。別法として、該遺伝子は、遺伝子のマルチコピーによって当該特性を補足および増強するために導入される箇所の植物ゲノムに既に見い出されているものと同一であってよい。従って、異種ならびに内因性遺伝子を所望の特性を付与または補足するために植物に導入できる。

遺伝物質を植物に導入する方法は当業者に広く知られている。広範な研究がアグロバクテリウム・チニメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のベクターについてなされている。加えて、遺伝物質で被覆したマイクロプロジエクテイールで植物細胞を衝撃することによって遺伝物質が植物体のゲノムに導入されている。該遺伝物質を植物細胞に導入する場合、植物体のゲノムに導入でき、もし適当な遺伝子調節要素に結合しているならば、発現される。導入遺伝子の発現は宿主植物体に特性を付与することができる。

導入遺伝物質の発現を達成するためには、発現を希望すべき構造遺伝子が調節配列に連結されていなければなるない。こわらの調節配列はプロモーター、開始コドンおよびボリアテニル化付加シグナルを包含する。発現させるべき遺伝子に作動可能に結合したごわ、ｂの要素なくしては、発明が起こ：）戸い。発現は、導入すべき遺伝物質がプロモーターおよび開始コドンから下流にあって、開始コドンに関して適当な読み枠にあり、かつボリアテニル化付加シグナルの上流にあるようＩこ構築された場合に起こる。

高レベルの発現かしばしば望ましく、それは最小限必要な配列の外に遺伝子配列を加えることによって達成できる。プロモーターの画側にある非駐訳領域はしばしば高レベルの遺伝子発現に導き得る。

同様に、開始コドンの両側の非翻訳領域もまた高レベルの発現を生じ得る。さらに、ポリＡ付加シグナルの両側の配列は転写されたＲＮＡの効果的なプロセノ／ング、従って、効果的な遺伝子発現に導き得る。

トランスジエム・り植物体におけるタバコモザイクウィルス、アルファルファモザイクウィルス、キュウリモザ・イクウイルス、およびジャガイモウィルスＸの外皮蛋白の発現の結果、各ウィルスによる感染に対して耐性な植物が得られる。

かかるトランスジェニック植物体を生産するには、外皮蛋白遺伝子を植物のゲノムに挿入しなければならない。さろに、外皮蛋白遺伝子は、植物体ゲノムに組み込まれた後に、遺伝子の発現に必要なすべての遺伝子制御配列を含有していなｌすればならない。

本発明は、所望の遺伝子を植物に導入するための改良された発現カセットに関する。このカセノ１は１、プロモーター、ＡＴＩ富５゜非翻訳領域、配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりする開始領域、遺伝子および非翻訳フランキング領域を含有するポリ（Ａ）付加シグナルからなる。本発明により、植物に導入される遺伝子が高し・ベルで発現される。何故なうば、発現を制御する遺伝子調節配列によりかかる高発現が容易となるからである。

情報の開示欧州特許出願ＥＰＯ２２３４５２号は、ウィルス病に耐性の植物およびその生産方法を記載している。記載された該生産方法は、プロモーター、ウィルス歯末のＤＮＡ配列、およびポリ（Ａ）付加配列よりなるＤＮＡインサートで植物体を形質転換する工程からなる。

ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６１００５１４号は寄生虫の宿主に、該寄生虫に対する耐性を付与する方法に関する。

アンら（Ａｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８５）は、　「高等植物の形質転換用の新しいクローニング運搬体（Ｎｅｗ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒ−ｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）Ｊ、ＥＭＢＯＪ、、４　：　２７７〜２８５、イー・フリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）およびエイ・チニメファンエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓン双方で安定に複製される発現プラスミドの構築を記載している。

アン・シイ（Ａｎ、Ｇ、）　（１９８６）は、「植物プロモーター発現ベクターの開発および形質転換タバコ細胞におけるツバリンシンターゼプロモーターの区別活性の分析における使用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｒｐｌａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｉｅｒ　ｕｓｅ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ｄｉｆＴｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｂａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃｅｌｌｓ）Ｊ、プラント・フイジオロジ−（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、）、８１　：　８８〜９１、同−ｍａ内の移入された遺伝子のプロモーター活性な占びに独立して得られた細、砲系における広範な差異を報告し２ている。

コザノク・エム（Ｋｏｚａｋ、Ｍ、）　（１９８６）は、「点突然変異は原核生物リポソームによる翻訳を調節する。Ａ　Ｕ　Ｇ開始コドンの両側の配列を輪郭付ける（Ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｄｅｆｉｎｅ　ａ　５ｅｑｕｅｎｃｓ　ｆｌａｎｋｉｒ＋ｇｔｈｅ　ＡＵＧ　１ｎｉｔｉａｔｏｒ　ｃｏｄｏｎ　ｔｈａｔ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｕｋａ−ｒｙｏｔｉｃ　ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）Ｊ、セル（Ｃｅｌｌ）、４４°２８３〜２９２、原核生物リポソームによる開始用プレプロインシュリン遺伝子のＡＴＧ開始コドンの回りの最適配列を開示している。

ロッジニーフリニスら（Ｌｏｅｓｃｈ−Ｆｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８７）は。

「トランスジェニック植物におけるアルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４の発現は該ウィルスによる感染に対する耐性を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ　４　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）Ｊ、ＥＭＢＯＪ、、６　：　１．８４５〜１８５１、トランスジェニック植物におけるアルファルファモザイクウィルスの外皮蛋白遺伝子の発現は当該ウィルスによる感染に対して耐性を付与することを開示している。

マツール・ビイ・ジェイおよびチニーイ・シイ・エフ（Ｍａｚｕｒ、　Ｂ。

Ｊ、ａｎｄ　Ｃｈｕｉ、Ｃ，−Ｆ、）　（１９８５）は、　「タバコからのりブロースビスホスフェート・カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼの小さなサブユニットのためのゲノミックＤＭＡクローンの配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆａ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＮＡ　ａｌｏｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｏｂａｃｃｏ）　Ｊ　、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、　１３　：２３７３〜２３８８、タバコからのりブロースビスホスフェート・カルボ手シラーゼーオ牛シゲナーゼの小さなサブユニットのためのＤＮＡの配列を開示している。

オルソンーｚム・ケイら（Ｏｌｓｏｎ、Ｍ、に、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８９）は。

現の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｒ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｓｉｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　Ｊ、ジャーナル・オブ・バイオテクノロージー（Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、）　、９コ１７９〜１９０；ＡＴが豊富な５′非翻訳領域の存在による異種遺伝子のイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における異種遺伝子の遺伝子発現の増加を開示している。

ビニトルザクら（Ｐｉｅｔｒｚａｋ　ｅｔ　ａｌＸ　１９８８　）は、「新しい植物発現ベクターでのプロトプラスト形質転換後における２種の細菌抗生物質耐性遺伝子の植物での発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗ。

ｂａｃｔｅｒｔａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎ−ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ　ｖｅｃｔｏｒ）　Ｊ　％　ヌクリレイック・ア’ｉッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１４：５８５７〜５８６８、いくつかの唯一の制限部位を含有するポリリンカーによって分離したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターおよび転写ターミネータ−よりなる移動可能な発現カセ・７トを含有する発現ベクターを用いる、植物へ導入された外来性遺伝子の植物での発現を開示している。

ポウエルーアベルら（Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ　ａｔ　ａｌ）　（１９８６）は、「タバコモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子を発現するトランスジェニック植物における病気発生の遅延（Ｄｅｌａｙ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎ　ｔｒａｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ）Ｊ　、タバコモザイクウィルスからの外皮蛋白遺伝子を含有するトランスジェニック植物におけるタバコモザイクウィルスによる感染に対する耐性の増加を開示している。

トウメールら（Ｔｕｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８７）は、「アルファルファモザイクウィルス外皮蛋白の発現はトランスジェニックタバコおよびトマト植物体において交差保護を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆａＨａｌｆａ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏ−ｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ）Ｊ　、アルファルファモザイクウィルスの外皮蛋白遺伝子で形質転換したトランスジェニックタバコおよびトマト植物体はアルファルファモザイクウィルスによる感染に対し増大した耐性を示すことを開示している。

発明の要約本発明は所望の遺伝子を高レベルで発現できる発現力セントに関する。本発明は発現カセｙ）よりなる発現ベクターに関する。本発明の高レベル発現ベクターは：プロモーター；少なくとも６０％のＡおよびＴである５゛非翻訳領域；コザノク（Ｋｏｚａｋ）の要素よりなる開始コドン；所望の遺伝子を挿入して機能的発現ユニットを形成できるクローニング部位；および高レベル発現を実現するポリ（Ａ）付加シグナルおよびフランキング配列よりなる３′非翻訳領域よりなる。

本発明は該発現ベクターを含有する形質転換細菌および植物細胞に関する。本発明は該発現ベクターで形質転換した植物細胞から生産されたトランスジェニック植物に関する。本発明は、所望の特性を付与する遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した植物細胞から植物体を生産することによる当該特性をもつトランスジェニック植物の生産方法に関する。

発明の詳細な記載以下のごとく、プラスミドおよびＤＮＡ断片を説明するためにある種の約束をチャート１〜９で用いる：（１）単一線の図は環状および線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。

（２）星印（＊）は、表された分子が環状であることを示す。星印かないのは該分子が線状であることを示す。

（３）機能性成分の自然な境界間の結合は水平線に沿った垂直１線によって表す。

（４）遺伝子または機能性成分は水平線の下方に示す。

（５）制限部位は水平線の上方に示す。

（６）遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りではない。

図は特に断りのない限り相対的な位置を示す。

（７）以下の省略は機能および成分を示すために用いる。

ａ）Ｐｃａ＝ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターｂ）Ｊｃ＝ＣＭＶ遺伝子間領域、該遺伝子開領域は開始コドンおよびＡＴ豊富５′非翻訳領域よりなる。

Ｃ）Ｓｃａ＝ＣａＭＶ３５Ｓポリ（Ａ）付加シグナル；およびｄ）ＮＯ５＝ＮＯ５ｎｐｔ　ＩＩ遺伝子。

本発明を実施するの；こ用いるＤＮＡ刊換え法のほとんどは、当業者によく知られた標準的手法であって、例えば、ここにＶ照のために上げる】９８６年１１月２９日に公開された欧州特許８願２２３４５２号に詳細に記載されている。酵素は商業的源から得たものであり、販売業者の推奨法または当該分升で公知の他の変法に従って用いる。かかる標準的な技術を含有する一般的な文献は、すべて参照のために挙げる以下の・アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ）　編（１９７９）１、メンソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆｎｚｙ＋＋ｏｌｏｇｙ）、６８巻；ジェイ・エイチ・ミラー（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌ！ｅｒ）（１９７２）、分子遺伝学Ｉこおける実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉＦＩＭｏＩｅｃＡａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　；ティ゛マニアティスら（Ｔ、　Ｍａｒ＋１ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｉＸｌ　９８２）、モレキユラー・クローニングニア・ラボラトリ −・マニュアル（Ｍａｎｕａｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｌｃ＋ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　：ディーエム・グローバー（Ｄ、　Ｍ、　ＧＩｏｖｅｒ’）編（１９８５）、デー（ｘヌエイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｏｌｏｎｉｎｇ）、Ｕ巻。

工・イチ・シイ・ポリテスおよびケイ・アール・マロｔテ（（Ｈ，Ｇ、　Ｐｏ！１ｔｅｓ　ａｎｄ　Ｋ、Ｒ，Ｍａｒｏｔｔｉ）（１９８７）　ｒ　ｃ　ＤＮＡ合成についての段階的プロトフル（Ａ　ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆＯｒ　ｃＤＮ、Ａ、　５ｙｎｔｌ＋ｅｓｉｓ）−ｌ、バ１′オテクニノクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’）　４　：５１４〜５２０；ニス・ビイ・ゲルビンおよびアール・エイ・ンルベロールト（Ｓ、Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎａｎｄ　Ｒ，Ａ、　Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）ｊｉｇ、”植物における遺伝子産物の導入、発現および分析（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ４ｏｎ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ａｎｃｌ　、４ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ）を含む。

本発明の開示目的で、本明細書中で用いる用語の定義を適用する。

「発現カセット」は、遺伝子発現に必要な調節配列に作動可能に連結した遺伝子を含有するＤＮＡ断片を意味する。

「プロモーター」は宿主植物において機能的なプロモーターを意味する。

「開始領域」は開始コドンおよび該開始コドンの両側のヌクレオチドを包含する。

「作動可能に連結」とは、ヌクレオチド領域が近接し、該領域の機能性が維持され、かつ機能ユニ・７トの一部として他の領域に対して実行されるような特異的遺伝情報をコード付けするヌクレオチド領域の連結をいう。

ＦＡＴ豊富５゛」非翻訳領域は、ヌクレオチド配列が少なくとも６０％のアデニンまたはチミジンヌクレオチドよりなることである。

「非翻訳７ランキング領域」と１丈、停止コドンの３゛側であってポリ（Ａ）付加シグナルで終わるヌクレオチド配列をいう。

「ベクター」は、それによりＤ　Ｎ　Ａ断片を宿主生物に導入できる運指体である。

「発現ベクター」は、それにより、十分な遺伝情報を含有するＤ　Ｎ　Ａ断片を宿主生物に導入でき、かつ、従って、該宿主によって発現され寿る運搬体である。

「抗病原性遺伝子コは、病原遺伝子のアンチセンス配列または生物体におけるその存在により病原に対する増大した耐性を付与するペプチドをコード付けする抗病原遺伝子であるＤＮＡ配列をフード付けする遺伝子である。

本発明を実施するには、植物体遺伝物質に導入を希望する遺伝子は挿入遺伝子を発現するのに必要な遺伝子調節配列を含有するベクターに挿入しなければならない。よって、所望の遺伝子の挿入に際して調節配列が機能するように調節配列を供するためにベクターを構築しなければならない。発現ベクター／インサート構築体を組み立てる場合、植物を再生するのに用いる植物細胞を形質転換するのにそれを用いる。これらのトランスジェニック植物は発現ベクター／インサート構築体中に該遺伝子を担持する。該遺伝子は植物体で発現され、該遺伝子が影響を与える特性が植物体に付与される。

該遺伝子を発現させるためには、必要な遺伝子調節配列が供されなければならない。遺伝子が植物ゲノムに移入され、かつ組み込まれたならば、転写および翻訳シグナルが共に遺伝子発現に必要である。従って、植物発現可能プロモーター、翻訳停止コドン（ＡＴＧ）およびその翻訳停止コドンの３°側の植物機能的ポリ（Ａ）Ｎ加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含有するように設計されなければならない。

本発明では、高レベルの遺伝子発現を達成するために、さらに遺伝子調節配列が供される。前記したごとく、発現ベクターはプロモーター、開始コドンおよびポリＣＡ）付加シグナルを含有しなｉすればならない。高レベル発現を達成するためには、挿入遺伝子の５′および３°側非翻訳領域が供される。さらに、開始コドンの両側のある種の配列が発現を最適化する。用いるプロモーターは高レベル発現用に選択したものである。

挿入遺伝子の高レベル発現をもたらす５°非翻訳領域はプロモーターの下流であって開始コドンの上流に供される。この領域はアデニンおよびチミンとしての配列を少なくとも６０％含有する。かかるＡＴ豊富領域をプロモーターおよび開始コドン開Ｉこ位置させた場合、発現について統計的偏りがある。この選択は、プロモーターおよび開始コドンのＡＴ豊富５°非翻訳領域中間体を含めることによって、本発明の好ましい具体例で利用される。

また、本発明は該開始コドンの両側の特異的ヌクレオチド配列を含む。コザク（Ｋｏｚａｋ）要素と呼ばれるこの好ましい配列は、ＡＡＸＸＡＴＧＧであり、ここに、Ｘは４種のヌクレオチドのうちのいずれかである。コザク（Ｋｏｚａｋ）則による開始コドンの存在の結果、発現ベクターで用いると高レベル発現が得られる。本発明の好ましい具体例において、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼーオキシゲナーゼのスモールユニット（ＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ）はコザク（Ｋｏｚａｋ）要素を用いる開始コドンを含有する。

さろに、本発明は、り１反蛋白遺伝子が挿入されたクローニング部位から下流であって該ボ（Ａ）付加シグナルの上流の３′非關訳領域を含有する。この３゛非翻訳領域の配列の結果、蛋白産生についての統計的偏りが得られる。該配列は高レベル発現を促進する。該ポリ（Ａ）付加シグナルは該３′非翻訳領域の上流で直接見い出され、同−源から得られる。本発明の好ましい具体例において、該３゛非翻訳領域およびポリ（Ａ）付加シグナルはＣａＭＶ　３５Ｓ遺伝子またはファゼオリン種子貯蔵蛋白遺伝子から得られる。

Ｃ；ａ　ＭＶ、ツバリン／ンターゼ、オクトビンシンターゼ、ｍ類貯Ｒ蛋白、およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子からのポリ（Ａ）付加シグナルもまたこの構築に適する。植物体で機能するいくつかのプロモーターが入手可能であるが、最良のプロモーターはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ、植物ＤＮＡウィルス）およびａｓｓ　ＲＵＢ！ＳＣＯ遺伝子からの構成的プロモーターである。

当業者によく知られた方法を用い、植物細胞をベクタ・−構築体で形質転換し、該植物細胞の再生を誘導する。得られた植物体は外皮蛋白遺伝子を含有し、外皮蛋白を産生ずる。該蛋白の産生は該植物体に、該外皮蛋白遺伝子が由来するウィルスによる感染に対する増大した耐性を付与する。

加えて、本発明の発現ベクターは、プロモーター、ＡＴ豊富５゜非翻訳領域、開始領域、遺伝子および非翻訳フランキング領域を伴うポリアデニル化シグナルよりなり、該プロモーターが該ＡＴ豊富５゛非翻訳領域の上流ｌこあってそれに作動可能に連結し、該ＡＴ５゜非翻訳領域が、該ポリ（Ａ＞付加シグナルの上流にあったそれに作動可能に連結した抗病原性遺伝子の上流にあってそれに作動可能に連結した開始コドンの上流であってそれに作動可能に連結しているＤＮＡ分子からなる。

前記したＤＮＡ分子はカリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ′３５Ｓ遺伝子由来のプロモーターからなるものでよい。前記発現ベクターよりなる該ＤＮＡ分子はキュウリモザイクウィルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子またはＳＳ　Ｊ？ＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５゛非翻訳領域から由来するＡＴ豊富５′非關訳領域を含有しうる。

同様に、前記ＤＮＡ分子における開始領域は、キュウリモザイクウィルスＣＭ　ｖ外皮を白またはＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′非翻訳領域に由来するものであってよい。前記ＤＮＡ分子の開始領域はＤＮＡ配列ＡＡＸＸＡＴＧＧより１よる。さらに、前記ＤＮＡ分子は、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子：ファゼリン貯蔵蛋白遺伝子、ツバリンシンターゼ遺伝子、オクトビンシンターゼ遺伝子、豆類貯蔵蛋白遺伝子またはＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子いずれかに由来するポリ（Ａ）付加シグナルよりなるものであってよい。

前記発現ベクターは、抗病原性遺伝子がウィルス病原外皮蛋白遺伝子、ウィルス酵素遺伝子、宿主遺伝子由来の遺伝子または非類縁遺伝子であるＤＮＡ分子からなる。さらに、導入遺伝子は、植物体で発現された場合に、殺虫剤、殺菌剤または除草剤として作用するペプチド用であってよい。該遺伝子はその存在により厳しくかつ根絶的気候条件に対する耐性が付与されるペプチドをコード付けするものでよい。別法として、該遺伝子は、植物体におけるその存在により植物体の栄養価が高められる蛋白をコード付けするものでよい。

本発明は、形質転換植物体における高発現に必要な遺伝子８Ｂ要素に作動可能に連結したいずれかの所望の遺伝子よりなる組換体ＤＮＡ分子を提供する。さらに、該遺伝子はペプチドに転写される必要はない。該遺伝子は１訳の抑制が望ましいヌクレオチド配列に対するアンチセント鎖をコード付けするものでよい。

発現ベクターは、バイナリベクター由来のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であってよい。該発現ベクターは細胞を形質転換するのに使用でき、トランスジェニック植物体は形質転換細胞よりなるように生産される。

好ましい具体例の記載実施ｆｐＩＩＩ　ＷＭＶＩＩＲＮＡの単離スイカモザイクウイルスｌ）（ＷＭＶｆｌ）をス゛ツキーニスクワッシニ（ククルビタ・ベボ・エル（Ｃｕｅｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ　Ｌ）植物中で増殖させ、イエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａ、１ｖｅｓ）　（パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されている方法によって単離した。

実施例２　ＰＲＶ−ｐＲＮＡの単離パパヤリングスボノトウイルス（ｐａｐａｙａ　ｒｉｎｇｓｐｏｔ　ｖｉｒｕｓ）株ｐｒｖ　（ｐＲｖ−ｐ）をゼリーメロン、ククミス・メチウリフェルス（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｔｕｌｉｆｅｒｕｓ）　（Ｎａｎｄ、　）Ｍｅｙ、　Ａｃｅ、　２５４９植物体中で増殖させ、ＲＮＡをイエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）（バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されている方法によって単離した。

叉奥男３　ＺＹＭＶ　ＲＮＡの単離ズッ牛−ニイエローウィルス（ｚｕｃｃｈｉｎｉ　ｙｅｌｌｏｗ　ｖｉｒｕｓ）（Ｚ　ＹＭＶ）をズッキーニスクワッシニ（ククルビタ・ベポ・エル（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ　Ｌ）植物中で増殖させ、ＲＮＡをイエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）（パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されている方法によって単離した。

大晟男Ａ　二本鎖ｃＤＮＡの合成単離したウィルスＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作成する方法は前記単離ウィルスＲＮＡ以外は同一である。精製したＲＮＡをポリテスおよびマロッティ（Ｐｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄ＼Ｉａｒｏｔｔｉ）クバイオテクニノクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）４　：　５１　Ｃ１９８６）によって記載されているｃＤＮＡ合成プロトコルに付し、このＲＮＡは（多くの真核生物ｍＲＮＡについて見い出されているのと同様に）３′末端にＡ豊富領域を酢含有するので、該手法は直接的である。二本鎖ｃＤＮＡの合成を行った後、それをＧ−１００セフアデツクスカラムを通して精製し、エタノールで沈殿させ、１．０ＸＥｃｏＲＩメチラーゼ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ（１，１００ｍＭトリス−ＨＣ１２、ｐＨ８゜０゜１ｍＭ　ＥＤＴＡ、８０μＭＳ−アデノシルメチオニン、および１００μｇ／ｍ（ｌウシ血清アルブミン）２０μｌに懸濁した。Ｓ−アデノシルメチオニン（３２ｍＭ溶液１μｅ）をさらに反応混合物に添加し、続いてＥｃｏＲＩメチラーゼ１Ｉｉｅ（２０単位）を添加した。

反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃における１分間のインキユベーシヨンによって停止した。次いで、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片１μ（！（５単位）を添加Ｌ、３７℃で１０分間インキュベートシ、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。ベレットを７０％エタノール、次いで７０％エタノール１０．３Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄した。該ベレットを乾燥し、０．５μｇ／μｅリン酸化Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　’ ）ンヵー（コルラボラティブ・リサーチ・インコーホレイテッド（ＣｏＬ！ａｂｏｒａｔ　１ｖｅｔ？ｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）、　？サチコーセッッ０２１７３、し牛シントン、スプリング・ストリート（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｓｔ、）１２８）　８μｇに懸濁した。

１０Ｘリガーゼ緩衝液（８００ｍＭ）リス−ＭＣＩ２、ｐＨ８，０゜２００ｍＭ　ＭｇＣ（！、、１５０ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）１μｇおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４単位）を添加し、反応物を１５°Ｃで一晩インキユベートした。結び反応を６５℃における１゜分間のイ／キュベーンヨンによって停止した。水６０Ａｔｆｆ、１０ｘＥｃｏＲＩ塩（９００ｒｎＭトリスーＨＣ（１，ｐＨ８，０，ｌｏｏｍＭＭｇＣＴｏ、１００ｍＭ　ＮａＣ１２）　１０ｔｔ（１、およびＥｃｏＲＩ（１０単位／′μ（）１．０μρを添加し、反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートした。フェノール／り口Ｃロホルムおよびりａロホルム抽出によって反応を停止した。次いで、反応混合物をセファデックスＧ−１００カラムを通してサイズ分別し、最大二本１ｃＤＮＡ分子を含有する画分をブタノール抽出によって！Ｉ縮し、エタノールで沈殿させ、水１０μｇに再懸濁した。二本鎖ｃＤＮＡ５μｇを（予　。

めフォスファターゼで処理して５′　リン酸を除去した）ｐＵｃ１９ＤＮＡ０．５μｇ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液１μで、およびＴ４　リガーゼ１μｇに添加し、反応物を１５℃で１６時間インキュベートした。得られた結紮ｐＵｃ１９−外皮蛋白遺伝子二本鎖ｃＤＮＡ分子を製造業者（ベラスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）、メリーランド２０８７７、ガイセルスブルグ）によって記載されているごとくにイー・コリ宿主細胞に形質転換し、５０μ（１／ｍＱアンピシリン、０．０４ｍＭ　ＩＰＴＧ、および０．００４％Ｘ−Ｇａ１を含有する培地上で平板培養した。青色を示さない細菌コロニーをさらに分析用に選択した。３′領域および恐らく外皮蛋白遺伝子を３！Ｐ−標識オリゴ−ｄＴに対するハイブリダイゼーションによって同定した。

このプローブに対してハイブリダイゼーションを示す細菌コロニーは少なくとも特にポティウイルスゲ／ムのボυ（Ａ）　領域を含有するはずである。ハイブリダイズする細菌コロニーのいくつかを選択し、プラスミドＤ　Ｎ　Ａを当業者に公知の方法に従って単離した。

実施例５　ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子の同定マキサムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　（メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｃｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５　：　４９９゜１９８０）によって記載されている化学ＤＮＡ配列決定法によっＣ２ＰＶＰ−ｐ　ＲＮＡのクローン化ｃＤＮＡのいくつかを配列決定した。この情報および他のボティウイルスクローン数との比較分析に基づき、ｐＰＲＶ−１１’７はＰ　ＲＶ　−ｐ外皮蛋白遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。該外皮蛋白のＮ末端はジペプチド配列Ｇ１ｎ５ｅｒの位置によって同定し、た。該Ｐ　Ｒｔｉ“−ｐ外交蛋白遺伝子フーテ′イング領域の長さは約３３ｋＤａ　ｉの蛋白をコード付Ｉすする遺伝子に合致する。

実施例６　ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルおよびＣＭＶ５’　非翻訳領域および転写開始ＡＴＧを持つ植物発現可能ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子カセットの？ｉ築必要な植物調節シグナルをＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子に結合させるのは、クローンｐＵＣｌ　８１３／ＣＰ　１９を用いる本来ＣＭＶ外皮蛋白遺伝子用の発現用に設計したクローンとの關訳融合を構築することによって達成した。プラスミドｐ（ＪＣ１８１３／ＣＰＩ９はアグロバクテリウム媒介遺伝子移入に適したベクターである。

ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＤＨ５１／ＣＰ　１９から取り出し、（ロバート・ケイ＜Ｒｏｂｅｒｔ　Ｋ、）、ワシントン、フルマン、ワシントン州立大学、化学学部から入手可能な）プラスミドｐＵＣ１８１３のＥｃｏＲＴ部位に入れ、プラスミドｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９を得る。プラスミドｐＵＣ１８１３／ＣＰ　］、　９は１９８７年１２月２１日出願の米国特許出願０７／１３５５９１号に記載されており、ここに参照のために挙げる。この転写融合クローンは、まｒクローｚｐＵｃ　１８１３／Ｃｐ　１９内の２の制限酵素部位を同定することによっ“Ｃ構築した。１の部位（Ｔｔｈｌｌｌｌ）をアミノ酸１３〜１７間に位置し、一方、他の部位（ＢｓｔＸＩ）はＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の３°非翻訳領域の末端近くに位置する。

これらの特異的制限酵素部位をＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子への付加は、パーキン・エルマー−セタス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）　、！−メリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）　、カリフォルニア州から購入した装置およびＴａｑポリメラーゼを用い、ポリメラーゼ鎖反応技術によって達成した。特に、ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子に関し少なくとも２０ヌクレオチドを占める、２の各５ ′および３゛オリゴマー（ＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧ、　Ｔ　ｔ　ｈ　ｌ　Ｉ　＋　１部位含有、および、ＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＧＡＧＴＣＡＧ、　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｘ　ｆ部位含有）を用いて外皮蛋白遺伝子の合成および遺伝子増幅を開始させた。合成の後、増幅した断片をＴｔｈｌｌｌｌおよびＢｓｔＸ　Ｉで消化して部位を暴露させた。

チャート１に示すごとく、ｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９はＣＭＶ外皮蛋白遺伝子を含有する発現ベクターである。プラスミドｐＵＣ１８１３／ＣＰ１９はＴｔｈｌｌｌｌおよびＢｓｔＸ　Ｉ部位を含有する。

消化し増幅した断片をｐＵＣ１８１３／ＣＰ　１９の暴露部位に結び、当業者に公知の方法を用いて、予定された新しい構築を同定した。ポリメラーゼ鎖反応技術を用いてＴｔｈｌｌｌｌおよびＢｓｔＸＩ部位を含有するＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子を増幅した。プラスミドＩ）ＵＣ１８１３／ＣＰ１９およびＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子断片をＴｔｈｉ　ｉ　ｉ　ＩおよびＢｓｔＸｒで消化し、相互に結んだ。

ｐＵｃ１８１３／ＣＰ−ＰＲＶｅｘｐと命名した得られたクローンをヌクレオチド配列決定に付してクローニングおよび遺伝子増幅によりいずれの有害な人工島も導入されなかったことを確認した。配列は人工島を示さず、この植物発現カセットが、さらにそのＮ末端にＣＭＶ外皮蛋白の１６個のアミノ酸を含有するＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子を発現できるはずであることが示唆される。

実施例７　植物発現可能ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子構築を含有するミクロＴ−ＤＮＡプラスミドの構築チャート２に示すごとく、アグロバクテリウムからの移入および植物ゲノムへの組込み用の必要なアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ移入シグナル、および（アグロバクテリウムにおける複製用の）広い宿主範囲の複製始点を含有する適当なミクロＴ−ＤＮＡベクターニＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子用の植物発現カセットを移入した。プラスミドｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９−ＰＲＶｅｘｐをＨｉｎｄＩ［［で消化し、該植物発現可能カセットを含有する得られた２、２ｋｂのインサート断片を取り出し、修飾したアグロバクテリウム由来ミクロベクターｐＧＡ４８２（修飾はβ−グルクロニダーゼ遺伝子の付加を包含するものであった）のＨｉｎｄｌ［１部位に結んだ。該ミクロニーＤＮＡベクターｐＧＡ４Ｂ２はシイ・アン（Ｇ、Ａｎ）、インスティチュート・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ワシントン州立大学、プルマン、ワシントン州から入手できる。得られたプラスミドはｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰ１９−ＰＴＶｅｘｐと命名されたものであり、チャート２に示す。このプラスミド（またはその銹導体）をＡ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ５，Ａ４Ｒ５（ｐＲｉＢ２７８ｂ）等のごときアグロバクテリウム・チニメファシエンスまたはリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｇａｃｉｅｎｓ　ｏｒ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のビルレントまたはアビルレント株に移入した。株Ａ２０８、Ｃ５Ｂ、ＬＢＡ４４０４、およびＡ４Ｒ３はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＸＡ　Ｔ　ＣＣ）、メリーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ（ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ）　１２３０１から入手可能である。細菌Ａ　４　Ｒ５（Ｔ）ＲｉＢ２７８ｂ）はフランス国、ベルサイユ、Ｆ７８０００゜ルテドゥ・セーノ・シール（Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ、）、Ｃ，Ｎ、　Ｒ，Ａ、、エフ・カッセーデルバール（Ｐ、　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）博士から入手できる。

株Ｃ５８Ｚ７０７はイリノイ州、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ州立大学、農学部、エイ・シイ・ヘブバーン（Ａ、　Ｇ、　Ｈｅｐｂｕｒｎ）博士から入手できる。

設計したプラスミドｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰ　１９−ＰＲＶｅｘｐの前記掲載アグロバクテリウム株いずれかへの移入の後、これらのアグロバクテリウム株を用いて、そのＴ−ＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ｐＲｖ−ｐ外皮蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入しおよび組み込むことができる。この移入は当業者に公知であるＴ−ＤＮＡ移入についての襟準的な方法を用いて達成できるか、あるいはこの移入は、ここに参照のために挙げる［発芽植物種子のアグロバクテリウム媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄｓ）Ｊなる標題の１９８７年１２月２１日付は出願の米国特許出願１７／１３５６５５号４に記載されている方法を用いて達成できる。

実施例８　種々の遺伝子のトランスジェニック植物における発現のための植物発現カセットの構築本発明の好ましい具体例において、インサートの高レベル発現を達成するために、遺伝子インサートに（プロモーター、５′非翻訳領域、転写開始コドン、およびポリアデニル化シグナルの付加を包含する）必要な植物調節シグナルを供するのに以下の発現カセ・ノドを構築した。該発現カセットは挿入されたいずれの遺伝子を発現するのにも使用できる。従って、発現カセットの適用可能性は外皮蛋白遺伝子を発現するにおけるその使用を超える。むしろ、該発現カセットはトランスジェニ、り植物においていずれの所望の蛋白を発現するのにも使用できる。

該発現カセットはウィルス外皮蛋白遺伝子を植物で発現させるための好ましい発現系である。

好ましい具体例の発現カセットは；構成的プロモーター；遺伝子発現を促進する５゛非躬訳領域、コザク（Ｋｏｚａｋ）要素よりなる開始コドン；発現されるべき遺伝子が機能的発現ユニットを生じるように挿入できるクローニング部位；および高レベル発現を生じるポリ（Ａ）付加シグナルおよび非翻訳フランキング領域よりなる３″非翻訳領域を含有する。

特別には、本発明の好ましい具体例である発現カセットはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写プロモーター、キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）の５゛−非翻訳領域、ＣＭＶ転写開始コドン、およびＣａＭＶポリアデニル化シグナルよりなる。植物調整シグナルの正しい位置、ならびに外皮蛋白遺伝子の容易な付加および完成されたカセットの切り出しを可能とし、従って他のプラスミドに移入できる都合良い制限酵素部位の付加を達成するために、この発現カセットの構築ではポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用した。

この発現カセットの構築を達成するために、以下のオリゴマーを合成した：１、　５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣ−３ ’は、その５′末端にＨｔｎｄＩ［Ｉ部位を含有し、ＣａＭＶの５゛−フランキング領域における２１塩基に同一である２１塩基を含有する。

２、　５’−ＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＴＡＣＧＡＣ −３”は、コザク（Ｋｏｚａｋ）則に適合する翻訳開始コドンを含有するその５ ″末端にＮｃｏ１部位を含有し、ＣＭＶ　５’−非翻訳領域のアンチセンス鎖における２１塩基に同一である２１塩基を有する。

３．５′−ＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣ−３ ″は、（オリゴマー２と同一の翻訳開始コドンを含有する）その５゛末端にＮｃｏ１部位を含有し、ＣａＭＶの３′−非翻訳領域における２０塩基と同一である２０塩基を有する。

４、　５’−ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴ−３’ は、その３°末端にＨｉｎｄ１１１部位を含有し、（アンチセンス鎖上の）ＣａＭＶポリアデニル化部位の３′例のフランキングＤＮＡ、領域に対合する２０塩基を有する。

これらのオリゴマーを用いて、チャート１に示し前記で言及したｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９なるＣＭＶ発現）ｙ　ｏ−ン内ニ含有すｔ’Ｌｆ＝配列を増幅した。

チャート３に示したごとく、ＰＣＲ技術を用いてｐＵＣ１８１３／ＣＰ１９における遺伝子調節領域を増幅した。

５゛−フランキング、ＣＭＶ５’−非翻訳領域、および（コザク則ＡＡＸＸＡＴＧＧに適合させるべく修飾した）ＣＭＶ開始コドンの増幅の結果、長さ約４００塩基対の断片が得られ、ＣａＭＶ３−非翻訳およびフランキング領域の増幅の結果、長さ約２００塩基対の断片が得られた。これらの断片をＮｃｏＴおよびＨｉｎｄＩＩ［で消化し、ポリアクリルアミドゲルから単離し、次いで、Ｈｉ　ｎｄＤＩ消化し）ｊスファターゼ処理したｐＵｃ１８に結んだ。得られたクローンをｐ　１８　ＣａＭＶ／ＣＭＶ　−ｅ　ｘ　ｐといい、チャート３に示す。

叉旅ヨ遣　ＷＭＶＩ［外皮蛋白遺伝子の同定化学法（マキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、メソノス゛・オブーｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ）　６５　：　４９９．１９８０）および酵素法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　、　プロシーディングズ・オブ・ナシ目ナル・アカデミ−・オブ・サイユンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、）　ＵＳＡ７４　：　５４６３．　１９７７）双方を用いて、前記したごとくに生成したクローンｐＷＭＶ［−４１−３，２からのクローン化ＷＭＶＩＩＣＤＮＡインサートを配列決定した。この情報および他のボティウィルスとの比較分析に基づき、りｏ−ンｐＷＭＶＩＩ−４１３，２（ｆ）ヌ’７しｔｆＦ配列ｉｔＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。外皮蛋白のＮ−末端はジペプチド配列Ｇ１ｎ−５ｅｒの位置によって示唆された。ＷＭＶ１１外皮蛋白遺伝子コーディング領域（２８１アミノ酸）の長さは約３３ｋＤの蛋白をフード付けする遺伝子と矛盾しない。

実施例１０　ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルならびにＣＭＶ遺伝遺伝子間詰域び翻訳イニシェータ−ＡＴＧをもつ植物発現可能ＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子カセットの構築７　チャート４に示す如く、必要な植物調節シグナルをＷＭＶ］ｌ外皮蛋白遺伝子に結合させるのは、必要な部位をその５ ′および３°配列コ　に付加させるオリゴマーを用いてＷＭＶＱ外皮蛋白遺伝子を増幅すン　るＰＣＲ技術を使用することにより達成した。この増幅に続き、得テ　られた断片を適当な制限酵素で消化し、プラスミドｐ１８ｃａＭＶ／ＣＭＶ −ｅｘｐを含有する前記発現カセットのＮｃｏ１部位にクローン化した。該ＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子インサートを含有するクローンはＣａＭＶプロモーターに関して正しい同きであるが否かをチェックするのみでよい。しかしながら、ＰＣＲ増幅の間に加工物が取り込まれなかったことを確認するために、全外皮蛋白遺伝子をヌクレオチド分析によってチェックした。

両末端にＮｃｏｌ制限酵素部位をもつ増幅されたＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子を得るために、以下の２種のオリゴマーを合成した。

１、　５’　−ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧ、ＡＡＡＡＧ −３“これはＮｃｏＩ部位をＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子の５′末端に付加し、発現カセットｐｌ　８　Ｃａ　ＭＶ／ＣＭＶ　−ｅ　ｘ　ｐに存在する同一、Ａ、　Ｔ　Ｇ翻訳開始コドンを保持する。

２゜５°　−ＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＧＡＡＡＴＧＣＴＡＡＣＴＧＴＧ−３ ’これはＮｃｏ１部位をＷＭＶ［［外皮蛋白遺伝子の３′末端に付加し、この部位は発現カセットｐ　］　８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐに結ぶことができる。

これらの２種オリゴマーを用いるこのＰＣＲＷＭＶ１７外皮蛋白遺伝子のｐｌ　８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐへのクローニングにより、（ｐ　１８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐという）植物発現可能ｗＭｖＵ遺伝子が得られ、転写および翻訳の後、ＷＭＶ［外皮蛋白遺伝子ヌクレオチド配列に由来するのと同一のＷＭＶｌ外皮蛋白が生成する。

しかしながら、この外皮蛋白は、ＡＴＧ開始コドンを付加するための必要な遺伝子設計のため、および（Ｇｌｕ−Ｓｅｔプロテ了−ゼ切断部位に隣接する）　Ｄ　４　’ｋ　Ｄ核封入体蛋白の最後の４＠のアミノ酸を包含することにより異なり、付加されるアミノ酸はＶａｔ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ！ｕ−Ｎ末端　ＷＭＶｆｌである。これらの４個のアミノ酸残基の付加は、この外皮蛋白がＷＭＶＩＩ感染に耐性の植物体を生じる能力に影響しないはずである。何故なら、ボティウィルス外皮蛋白のＮ末端領域は長さまたはアミノ酸同一性いずれかについてよく保存されていないようだからである。しがしながら、これが問題であることが判明したら、その置き換えは、ＷＭｖ■外皮蛋白遺伝子のＮ末端変化を得るための異なるオリゴマーの使用を含むであろう。植物発現可能ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子のクローン化構築体はｐ　１８ＷＭＶ　ＩＩ　−ｅ　Ｘ　ｐといい、チャート４に示す。

轡り上　植物発現可能ＷＭＶｆｌ外皮蛋白遺伝子構築体を含有するミクロＴ−ＤＮＡプラスミドの構築チャート５に示すごとく、ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子用植物発現カセｌトを（アグロバクテリウムから植物ゲノムへの媒介移入および組み込みを行うのに）必要なアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ移入シグナルおよび（アグロバクテリウムにおｊする複製用の）広宿主Ｕ囲複製始点を含有する適当なミクロ−Ｔ−ＤＮＡに移入してプラスミドｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＶＩＩ−ｅｘｐを得た。コノプラスミドを構築するために、プラスミドｐ１８ＷＭＶＩＩ− ｅｘｐを（発現カセットの十分外部で、ｐＵｃ１８のポリクローニング部位内で切断する）Ｈｉｎｄｎｌで消化し、植物発現可能カセットを含有する１、８ｋｂ断片を取り出し、修飾したアグロバクテリウム由来ミクロベクターｐＧＡ４８２　（修飾はβ−グルクロニダーゼ遺伝子の付加を包含する）のＨｉｎｃｌｎ［部位に結んだ。該ミクロＴ−ＤＮＡベクターｐＧＡ４８２をチャート２に示すが、これはシイ・アン（Ｇ、。

Ａｎ）、ワシントン、フルマン（Ｆｕｌｌ＋＋ａｎ）、ワシントン州立大学、インスティチュート、オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）から入手できる。得られたプラスミドをりＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＶＩＩ−ｅｘｐと命名し、チャート５に示す。このプラスミド（またはその誘導体）をＡ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ２０７、Ａ４Ｒ３５Ａ４ＲＳ　（ｐＲｉＢ２８７　ｂ）等のごときアグロバクテリウム・チュメファ／エンスま　。

たはリゾゲネスのビルレントまたはアビルレント株に移入した。株Ａ２０Ｂ、Ｃ５８、Ｌ、ＢＡ４４０４、およびＡ４Ｒ５１ｔ７メｌ、Ｊカン−タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）　、メリーランド州、ｃ−７クビル、バークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｖｎ　ｄｒｉｖｅ）　１２３０１から入手できる。

細菌Ａ４Ｒ５（ｐＲｉＢ２７８ｂ）はエフ・力。

セーデルバール（Ｆ、　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）博士、フランス国、ベルサイユ、ルテイドウ”セーフ１シル（Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ、）、　Ｃ，Ｎ、Ｒ，Ａ、から入手できる。細菌Ｃ５８Ｚ２０７はエイ・シイ・ヘブ／　ｓＪ−ン（Ａ、　Ｇ。

Ｈｅｐｂｕｒｎ）博士、イリノイ州、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ州立大学、農学部から入手できる。

設計したプラスミドｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＩＩ−ｅｘｐの前記掲載アグロバクテリウム株のいずれかへの移入の後、これらのアグロバクテリウム株を用いて、そのＴ−ＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入し組み込むことができる。この移入は当業者に公知のＴ− ＤＮＡ移入用の標準的な方法を用いて達成できるか、あるいはこの移入は「発芽植物種子のアグロバクテリウム媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｅｄｉａｔ−ｅｄ　丁ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｒａｉｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄｓ）Ｊなる標題の１９８７年１２月２１日出願の米国特許出願や０７／１３５６５５号に記載されている方法によって達成できる。加えて、細菌、かかるアグロバクテリウムはそのＴ　ｐＮＡ領域を大豆植物のゲノムに移入し組み込むことができることが判明した。かくして、これらの株は植物発現可能ＷＭＶＩ［外皮蛋白遺伝子を大豆のゲノムに移入して大豆モザイクウィルス株からの感染に耐性である大豆植物系を開発するのに用いることができる。

最近、ＤＮＡの植物ゲノムへの移入および組み込みについて別の・手法が開発された。この技術はＤＮＡ　（プラスミド形態）を付着させたマイクロプロジェクティールの使用に拠る。このマイクロプロジェクティールを高速度まで加速し、そのモーメントを用いて植物細胞壁および膜を貫通させる。植物細胞への貫入の後、付着ＤＮＡがマイクロプロジェクティールから漉し取られ、ＤＮＡ修復酵素がｒｆｌｉＪＤＮＡを植物ゲノムに組み込む場所である核に移入される。

その現在の形態において、該プロセスは全くランダムではあるが、プラスミド（またはその部分）によって首尾よく形質転換されている植物組織は、（細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子ＮＰＴｎのごとき）選択可能なマーカー遺伝子、または（細菌ベーターグルクロニダーゼ遺伝子Ｇｕｓのごとき）レポーター遺伝子の使用によって同定でき、かつ均質に培養できる。植物を形質転換するための粒子加速の成功した使用は、最近、大豆について示されており、ｐ１８ＷＭＶ［−ｅｘｐのゲノムへの移入により、大豆モザイクウィルス株からの感染に耐性な大豆植物を得ることができる。

Ｔ）１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐのこのプロセスへの使用は、植物発現可能遺伝子ＮＰＴＵまたはＧｕｓ遺伝子いずれかあるいは双方の付加の後達成できる。ｐ　１８ＷＭＶｎ−ｅ　ｘ　ｐに対するｎｐｔＩ［およびＧｕｓ遺伝子を有するプラスミドをチャート６に示し、ｐｌ　８ＧＷＭＶＩ［−ｅｘｐおよびｐ１８ＮＧＷＭＶ］Ｉ−ｅｘｐと命名する。加えて、実施例１１に記載した構築体も、すでにｐ　ＷＭ　Ｖ　Ｕ　−ｅ　Ｘ　ｐに結合したｎｐｔＩＩおよびＧｕｓ遺伝子を共に有するゆえ（チャート５参照）、マイクロブロジェクティール移入で用いることができる。ｐＧＡ４８２ＧＧ／ｃｐＷＭＶｆ［−ｅｘｐの使用がマイクロプロジェクティール過程による移入の間に遭遇し得る唯一の困難はその大きなサイズ約１８ｋｂに拠るものであり、低効率移入となりかねず、かかる大きなプラスミドは一般に増殖の間にＤＮＡを少ししか生じない。

プラスミドＪ）１８ＧＷＭＶｉｉ−ｅｘｐを構築するには、プラスミドｐ　１８ＷＭＶｉｉ−ｅｘｐをＢａｍＨＩで消化し、Ｇｕｓ遺伝子を含有する３、０牛ロベースのＭａｎＨＩ単離断片に結ぶ。プラスミドｐ　ｌ　８ＮＧＷＭＶｉｉ−ｅｘｐを構築するためには、プラスミドｐ１８ＧＭＷＶｉｉ−ｅＸｐをＳｍａｌで消化し、Ｄｒａ　Ｉおよび５ｔｕｌでの消化によって生成したＮｏ５−ｎｐｔ［遺伝子を含有する２、４ｋｂ単離単離−結ぶ。

実施例１３　ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の同定前記方法を用いてクローン化したクローンｐＺＹＭＶ−１５からのクローン化ＺＹＭＶ　ｃＤＮＡインサートを化学法（マキサムおよびギルバート、メソソズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇの、６５：４９９．１９８０ンおよび酵素法（サンガーら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、ＮａｔＪ、Ａｃａｅｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７４　：　５４６３．２９７７）によって配列決定した。この情報および他のボティウィルスとの比較分析に基づき、クローンｐＺＹＭＶ−１５のヌクレオチド配列はＺＹＭＶ外皮蛋臼遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。該外皮蛋白のＮ−末端は、ボティウィルスにおける切断部位に特徴的な（ドウゲルティら（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ）、　ＥＭＢＯＪ、　７　：　］２８１．１９８８参照）ジペプチド配列Ｇ１ｎ−３ｅｔの位置によって示唆された。ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子暗号領域（２８０アミノ酸）の長さは約３１．３ｋＤの蛋白をコード付けする遺伝子に合致する。

実施例Ｌ４　Ｃａ、ＭＶ　３５Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルならびにＣＭＶ遺伝遺伝子板領域び翻訳イニシェータ−ＡＴＧを持つ植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の構築チャート７に示すごとく、必要な植物調節シグナルのＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子への結合は、必要な部位をその５゛および３′側配列に付加するであろうオリゴマーを用いてＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を増幅するためのＰＣＲ技術を用いることによって達成した。この増幅に続き、得られた断片を適当な制限酵素で消化し、プラスミドｐＵｃ１８ｃＰ−ｅＸｐを含有する前記発現力セントのＮｃｏ１部位にクローン化した。ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子インサートを含有するクローンはＣａＭＶプロモーターに関する正しい向きを決定するためのチェックだけでよい。しかしながら、ＰＣＲ増幅の間に加工物が取り込まれなかったことを確認するために、全外皮蛋白遺伝子領域をヌクレオチド配列決定によってチェックした。

両末端にＮｃｏｌ制限酵素部位をもつ増幅されたＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を得るために、以下の２種のオリゴマーをｅ成した。

１、５’　−Ａ丁ＣＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＡ／、ＣＴＧＴＧＧＣ−３’これはＮｃｏ１部位をＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の５゛末端へ付加し、発現カセットｐ　ｕ　Ｃ１８ｃｐ　ｅ　ｘ　ｐに存在するのと同一のＡＴＧ転写開始コドンを保持する。

２、　５°　−ＡＧＣＴＡＡＣＣＡ丁ＧＧＣＴＡ、’、、八Ｇへ１ＴＡＴＣＡＡＡ丁ＡＡＡＧＣ丁Ｇ−３”これはＮｃｏ１部位をＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の３゛末端に付加し、この部位は発現カセットｐｌＪｃ１８ｃｐｅｘｐに結ぶことができる。

これらの２種のオリゴマーを用いるこのＰＣＲＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子のｐＵｃ１８ｃｐｅＸｐへのクローニングにより、植物発現可能ＺＹＭＶ遺伝子（ｐＵｃ１８ｃｐＺＹＭＶという）が得られ、続いての転写および翻訳によりＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子ヌクレオチド配列に由来するのと同一のＺＹＭＶ外皮蛋白を生じる。し、かしながら、この外皮蛋白は、ＡＴＧ開始フドコド続いてのａｎｙ　（これはポリ蛋白切断部位のＳｅｒに隣接する３′側のアミノ酸である）を付加するための遺伝子工学が必要なため異なる。該Ｇ１ｙアミノ酸残基は可能なＮ−末端アミノ酸について選択した。何故ならば、多くのボティウイルス外皮蛋白はＳｅｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａいずれかをそのＮ−末端に有するからである。しかしながら、これが問題であることが判明したならば、その置き換えはＺ　Ｙ　Ｍ　Ｖ外皮蛋白に・ついての異なるＸ−末端アミノ酸を得るための異するオリゴマーの使用を含む・。植物発現可能ＺＹＭＶ外反蛋白遺伝子のり；−ン化構築体をｐＵＣ１８ｃｐＺＹＭＶと命名し、チャート７に示す、実施例１５　植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子構築体を含有するミクロＴ”　−１’　Ｎ　Ａプラスミドの構築適当に修飾した実施例１１の教示により、植物発現可能Ｚ　ＹＭＶ外皮蛋白を含有するミクＯＴ−Ｄ　Ｎ　Ａの構築体を構築し７こ。ブラスミ）’ｐＬＪｃ１８ｃｐＺＹＭＶ（＋＋−ｔ−７）を（発現ｈセット０’）　十分外部で、ｐ　’Ｕ　Ｃ１８の多重クローニング部位内を切断する）Ｈｉｎｄ■で消化し、植物発現可能カセットを含有する１　、　６　ｋ　ｂ断片を取り出し、ミクロ− −一′＼クターｐ　Ｇ　Ａ　４８２　（チャート２）のＨｉｎｄ１１１部位に結んだ。得られたブうスミドをｐＧＡ４８２ＧＧｚ”’ｃｐＺＹＬｉＶと命名し、チャート・８に示す。

設計したプラスミドｐＧＡ４８２ＧＧ／ｃｐＺＹＭ■の７グ／望りテリウム株への移入の後、該アグロバクテリウム株を用いて、そのＴＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ＺＹＮｉＶ外庚蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入［７組み込むことができる。

実施例１６　ＩＩ）じＣ１Ｃ１３ｃｐＺＹの植物組繊へのマイクロブロジエクティール移入実施例１２の教示により、該マイクロプロジエクテイール移入技術を用いて適当な遺伝子調節配列をもつＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を植物組織に導入することができる。

コノプロセスをｐＵｃ１８ｃｐＺＹ？ｖＩＶに用いるのは、植物発現可能遺伝子ＮＰＴＩＩまたはＧｕｓ遺伝子いずれかあるいは双方の付加の後に達成することができる。Ｉ）ＵＣ１８ｃｐＺＹＭＶに対するｎｐｔ［およびＧｕｓ遺伝子を有するプラスミドをチャート９に示し、ｐＵＣ１８ＧｃｐＺＹＭＶおよびｐＵｃ　１８ＮＧｃｐＺＹＭＶと命名する。加えて、実施例１５に記載した構築体も、それが既にｐＵＣ１８ＣｐＺＹＭＶカセットに結合［７たｎｐＬＩＩおよびＧｕｓ遺伝子を共に有するので（チャー１・８参照）、マイクロプロジエクティール移入に用いることができる。ｐＧＡ４８２ＧＧ／ｃｐＺＹＭＶの使用か７１′クロブロジエクテイール過程の間に遭遇する唯一の困難；よその大きな升イズ約１８ｋｂに拠るものであり、これ：丈低効宝移入となりか１コず、かかる大きいプラスミドは一般に増殖の間にＤ　Ｎ　Ａを生じるのが少ない。

プラスミドｐＵｃ　１８ＧＣＰＺＹＭＶを構築するには、プラスミドｐｕｃ　１８ＣＰＺＹＭＶをＢａｍＨｌで消化し、Ｇｕｓ遺伝子を含有する３、ＯＢａｍＨＩ単離断片に結ぶ。プラスミドｐＵｃ　１８ＧＣＰＺＹＭＶを構築するには、プラスミドｐＵＣｉ８ＧＣＰＺＹＭｙをＳｍａ　Ｉで消化し、Ｄｒａ　ＩおよびＳｔυ■での消化によって単離したＮｏｓ　ｎｐｔｌＩ遺伝子を含有する２、４ｋｂ単離断片で結ぶ。

テ’ｖ−ｉ・１ｐＵｃ１１１３／Ｃｐ１９−ＰＲＶａｘｐテで一ト２ｐＧＡ４８２ＨｉｎｄＩＩＩｐｃＡ４８２／ｆｌ；／ＣＰ１９−ＰＲＶａｘｐＨｌｎｄＩＩＩ　τｅｈｌｌｌ工　ＢｓｔＸＩ　ＨｉｎｄＩＩＩチイート３ｐ１８ｃａＭＶ／ＣＫＶ−ａｘｐテーート４ｐｖＭｖＩＩ−４１−３，２ｐｃ艮より生じた遺伝子ＮｅｏＩ　ＮｃｏＩｐ１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐＨｉｎｄｌＩＩ　ＮｃｏＩ　ＮｅｏＩ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＢａｍＨＩ　ＳｍａＩテで一ト５ｐＧＡ４８２／に／ＣＰ酷１ト１１ＸｐＨ１ｎｄ工ＩＩ　ＮｅｏＩ　ＮｃｏＩ　Ｈ１ｎｃｌＩＩＩチー−トロｐ１８ＧＷＭＶＩＩ−ｅｘｐｐ１８ＮＧＬ７ＭＶ工Ｔニーｅｘｐテづ一ドアｐＺＹＫＶ−１５ご四　外皮蛋白遺伝子ＮｃｏＩ　ＮｅｏＩｐＵｃ１８ｃｐＺＹＭＶＨｌｎｃｌＩＩＩ　ＮｃｏＩ　ＮｃｏＩ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＢａｍＨＩ　ＳｍａＩ千で一ト８ｐＧＡＡ８２／ＧＯ／ｃｐｎ”ＭＶＨｉｎｄ工ＩＩ　ＮｃｏＩ　ＮｃｏＩ　ＨｉｎｄＩＩＩチャート９ｐＬｌｃ１８ＧｃｐＺＹＭＶｐＵｃ１８ＮＧｃｐＺＹＫＶ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）渚平成３年２月１２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）プロモーター；ｂ）ＡＴ豊富５′非翻訳領域；ｃ）開始領域；ｄ）遺伝子；およびｅ）ポリ（Ａ）付加シグナルよりなり；該開始領域は配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりなり；該ポリ（Ａ）付加シグナルは非翻訳フランキング領域を含有し；ここに、該プロモーターは該ＡＴ豊富領域の上流にあり；該ＡＴ豊富領域は該開始領域の上流にあり；該開始領域は遺伝子をコード付けする該ＤＮＡ分子の上流にあってそれに作動可能に連結し、および該遺伝子は該ポリ（Ａ）付加シグナルの上流にあってそれに作動可能に連結していることを特徴とするＤＮＡ植物発現カセット。
２．該プロモーターがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
３．該ＡＴ−豊富５′非翻訳領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′非翻訳領域よりなる群から選択される５′非翻訳領域に由来する請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
４．該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′非翻訳領域よりなる群から選択される５′非翻訳領域に由来する請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
５．該ポリ（Ａ）付加シグナルが：カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ファゼオリン貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ノパリンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；オクトピンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；豆類貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯに由来するポリ（Ａ）シグナルよりなる群から選択される請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
６．ａ）該ＡＴ豊富５′非翻訳領域および該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来し；かつｂ）該ポリ（Ａ）付加シグナルがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に宙来する請求の範囲第２項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
７．該遺伝子が抗病因性遺伝子である請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
８．該遺伝子が抗病因性遺伝子である請求の範囲第６項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
９．該病因由来遺伝子が外皮蛋白遺伝子である請求の範囲第７項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
１０．該病因由来遺伝子が外皮蛋白遺伝子である請求の範囲第８項記載のＤＮＡ植物発現カセット。
１１．請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセットを含有する形質転換植物細胞。
１２．該ＤＮＡ植物発現カセットが；ａ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；ｂ）キュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来するＡＴ豊富５′非翻訳領域および開始；およびｃ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）付加シグナル；よりなる請求の範囲第１１項記載の形質転換植物細胞。
１３．請求の範囲第１１項記載の形質転換植物細胞よりなるトランスジェニック植物。
１４．該ＤＮＡ植物発現カセットが、ａ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；ｂ）キュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来するＡＴ豊富５′非翻訳領域および開始；およびｃ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）付加シグナル；よりなる請求の範囲第１３項記載のトランスジェニック植物。
１５．ウリ科、パパイヤ科、ナス科、およびマメ科植物よりなる群から選択される請求の範囲第１３項記載のトランスジェニック植物。
１６．該ＤＮＡ植物発現カセットが、ａ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；ｂ）キュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来するＡＴ豊富５′非翻訳領域および開始；およびｃ）カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）付加シグナル；よりなる請求の範囲第１５項記載のトランスジェニック植物。
１７．ａ）その植物における発現により特性が付与される遺伝子を単離し；ｂ）単離遺伝子と共に請求の範囲第１項記載のＤＮＡ植物発現カセットを構築し；ｃ）該ＤＮＡ植物発現カセットで植物細胞を形質転換し；次いでｄ）該形質転換植物細胞から植物を再生する工程よりなる該特性を植物に導入する方法。