BRPI9706706B1 - Dna, proteína de barstar, e, uso do dna - Google Patents

Description

“DNA, PROTEÍNA DE BARSTAR, E, USO DO DNA” A presente invenção refere-se a um melhorado gene barstar e melhorada proteína barstar que pode ser usada para neutralizar a atividade de uma bamase em células eucarióticas, particularmente em células de plantas. Assim, o melhorado gene barstar pode ser usado para produzir plantas restauradoras da fertilidade para restaurar a fertilidade a uma linhagem de plantas estéreis masculinas que contém no genoma nuclear de suas células um gene quimérico compreendendo um promotor seletivo para estame e um DNA codificando para um bamase. A presente invenção também se refere a plantas restauradoras que contém no genoma nuclear de suas células o melhorado gene barstar. Antecedentes da invenção Em muitas, se não todas as espécies de plantas, o desenvolvimento de cultivares híbridos é altamente desejado devido a sua produtividade geralmente aumentada devido a heterose: a superioridade de desempenho de indivíduos híbridos comparados com seus originários (ver por exemplo, Fehr, 1987, Principies of cultivar development, Volume 1: Theory and Technique, MacMillan Publishing Company, New York; Allard, 1960, Principies of Plant Breeding, John Wiley and Sons, Inc.). O desenvolvimento de cultivares híbridos de várias espécies de plantas depende da capacidade de obter uma polinização cruzada quase completa entre os originários. Isto é mais simplesmente obtido ao se tomar uma das linhagens originárias estéreis masculino (isto é, levando as mesmas a uma condição de modo que o pólen está ausente ou não funcional), seja manualmente, seja por remoção de anteros, ou geneticamente por uso, em um originário, de genes citoplásmicos ou nucleares que evitam o desenvolvimento de anteros e/ou pólen (para um estudo de genética de esterilidade masculina em plantas ver Kaul, 1988, 'Male Sterility in Higher Plants', Springer Verlag).

Para plantas híbridas onde a semente é o produto coletado (por exemplo milho, colza de semente oleígena), e na maior parte dos casos também necessário assegurar que a fertilidade das plantas híbridas é completamente restaurada. Em sistemas em que a esterilidade masculina está sob controle genético, isto requer a existência e uso de genes que podem restaurar a fertilidade masculina. O desenvolvimento de cultivares híbridos é principalmente dependente da disponibilidade de esterilidade apropriado e eficaz e genes restauradores.

Os locais nucleares endógenos são conhecidos para a maior parte das espécies de plantas que podem conter genótipos que afetam a esterilidade masculina, e geralmente locais necessários a serem homogizóticos para alelos recessivos particulares a fim de resultar em um fenótipo estéril masculino. A presença de alelo "fértil masculino" dominante em tais locais resulta em fertilidade masculina.

Recentemente, foi mostrado que a esterilidade masculina pode ser induzida em uma planta ao prover o genoma da planta com gene de esterilidade masculina quimérico compreendendo uma sequência de DNA (ou DNA de esterilidade masculina) codificando, por exemplo, para um produto citotóxico (como RNase), e sob o controle de um promotor que é predominantemente ativo em células selecionadas dos órgãos reprodutivos masculinos. Neste aspecto, promotores seletivos para estame, como o promotor do gene TA29 de Nicotiana tabacum foi demonstrado como sendo particularmente utilizável para este fim (Mariani et al., 1990, Nature 347: 737, publicação da patente Européia ("EP") 0.344.029). Ao prover o genoma nuclear da planta em tal gene de esterilidade masculina, um local de esterilidade masculina artificial é criado contendo o genótipo de esterilidade masculina artificial que resulta em uma planta estéril masculina.

Além disso, foi mostrado que a fertilidade masculina pode ser restaurada na planta com um gene restaurador da fertilidade quimérico compreendendo outra sequência de DNA (ou DNA restaurador da fertilidade) que codifica, por exemplo, para uma proteína que inibe a atividade do produto citotóxico ou de outra forma evita o produto citotóxico para ser ativo nas células de planta (publicação da patente Européia "EP" 0.412.911). Por exemplo, o gene barstar de Bacillus amvloliquefaciens codifica para RNase,, a bamase, que pode ser inibida por uma proteína, barstar, que é codificada pelo gene barstar de Bacillus amvloliquefaciens. O gene bamase pode ser usado para a construção de um gene de esterilidade enquanto o gene barstar pode ser usado para a construção de um gene restaurador da fertilidade. As experiências em diferentes espécies de plantas, por exemplo colza de semente oleígena, demonstraram que um gene barstar quimérico pode completamente restaurar da fertilidade masculina de linhagens estéreis masculinas em que a esterilidade masculina foi devido à presença de um gene barstar quimérico (EP 0.412.911, Mariani et al., 1991, Proceedings of the CCIRC Rapeseed Congress, 9 de julho de 1991, Saskatoon, Saskatchewan, Canada; Mariani et al., 1992, Nature 357:384). Por copulação de um gene marcador, como um gene de resistência a herbicida dominante (por exemplo o gene Bar codificando para transferase de acetil fosfinotricina (PAT) que converte fosfinotricina herbicida em um composto não tóxico [De Block et al., 1987, EMBO J. 6:2513]), para o gene restaurador da fertilidade e/ou da esterilidade masculina quimérico, sistemas de criação podem ser implementados para selecionar populações uniformes de plantas estéreis masculinas (EP 0.344.029; EP 0.412.911). A produção de semente híbrida de qualquer cultivar particular de uma espécie de planta requer: 1) manutenção de quantidades pequenas de semente pura de cada originário endogâmico, e 2) a preparação de maiores quantidades de semente de cada originário endogâmico. Estas maiores quantidades de semente devem ser normalmente obtidas por vários ciclos de multiplicação de semente (geralmente dois), partindo de uma pequena quantidade de semente pura ("semente básica) e deixando, em cada ciclo de multiplicação, em uma maior quantidade de semente pura do originário endogâmico e então fmalmente a uma carga de semente de originário endogâmico ("a semente originária" ou "semente fundamental"), que é de quantidade suficiente a ser plantada para produzir as desejadas quantidades de semente híbrida. Como é evidente, em cada ciclo de multiplicação de semente, maiores áreas de planta (campos) são requeridos.

Bamase é uma ribonuclease que é secretada por Bacillus amvloliquefaciens e barstar é o inibidor de bamase que é produzido pelo mesmo microorganismo (Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202: 913-915). Várias proteínas de barstar e bamase mutantes foram descritas (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978-5984; Schreiber e Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145-5150; Guillet et al, 1993, Current Biology 1: 165-177; Hartley, 1989, TIBS 14: 450-454; Axe et al, 1996, PNAS 93: 5590-5594; Serrano, 1993, J. Mol. Biol. 233: 305-312).

Alguns destes mutantes demonstraram reter essencialmente a atividade biológica da bamase e barstar como produzidos por Bacillus amvloliquefaciens. No entanto, pelo menos dois barstars mutantes foram descritos que não tem atividade barstar detectável (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978-5984; Guillet et al, 1993, Current Biology 1: 165-177).

Também outros microorganismos relacionados são conhecidos para produzir proteínas que são altamente similares a bamase e barstar. Assim, Bacillus intermedius produz binase e binstar ((Schulga et al, 1992, NAR 20: 2375; Guillet et al, 1993, supra).

Sumário da Invenção. A presente invenção provê melhorados DNAs de barstar que codificam um barstar com uma sequência de aminoácidos que parte com Met-Xaa em que Xaa é alanina, valina, glicina, ácido aspártico ou ácido glutâmico. Preferivelmente os DNAs de barstar codificam barstar tendo uma sequência de aminoácidos que é 1) a sequência de aminoácido de SEQ ID. NO.: 2 em que o segundo aminoácido não é lisina mas é Alanina, Valina Glicina, ácido Aspártico ou ácido Glutâmico; 2) a sequência de aminoácido da SEQ ID No. 4; ou a sequência de aminoácido da SEQ ID No 4 em que a segunda sequência de aminoácido não é Alanina, mas é Valina, Glicina, ácido Aspártico ou ácido Glutâmico. A presente invenção ainda provê melhorados DNAs de barstar sintéticos que contém menos que 40% A e nucleotídeos T e/ou que tem um uso de códon que é otimizado para colza de semente oleígena, algodão, milho, arroz e trigo, preferivelmente para colza de semente oleígena, milho e arroz. Preferivelmente, os DNAs de barstar sintéticos não contém mais que 7% CG di-nucleotídeos e/ou não mais que 9,5% de tri-nucleotídeos de CNG. Um DNA de barstar sintético preferido codifica um barstar tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID No. 4. Um DNA de barstar sintético, particularmente preferido tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3. A presente invenção também provê genes quiméricos em que os melhorados DNAs de barstar são ligados de modo operativo a um promotor expressável em plantas, preferivelmente um promotor que dirige a expressão seletivamente em células de estame e que dirige a expressão pelo menos em células de tapeto; células de plantas e plantas compreendendo estes genes quiméricos. A presente invenção ainda provê usos de DNAs de barstar melhorados e melhoradas proteínas de barstar para neutralizar bamases em células de plantas, particularmente com relação a restauração de fertilidade masculina para linhagens estéreis masculinas. A presente invenção também provê melhorados barstars tendo uma sequência de aminoácidos que inicia com Met-Xaa onde Xaa é Alanina, Valina, Glicina, ácido aspártico ou ácido glutâmico.

Descricão detalhada da invenção Uma planta estéril masculina ("ms") como usada aqui é uma planta de uma dada espécie de planta que é esterilidade masculina devido à expressão de gene de esterilidade masculina quimérico (S), integrado no DNA nuclear desta planta e compreendendo os seguintes fragmentos de DNA ligados de modo operativo, 1) um "promotor da esterilidade" que dirige a expressão seletivamente em células de estame, e preferivelmente pelo menos em células de tapeto, e 2) um "DNA de esterilidade masculina" codificando para um bamase (o "DNA de bamase"). Um exemplo deste gene de esterilidade masculina é um gene compreendendo um DNA e bamase sob controle de promotor do gene TA29 de tabaco, como por exemplo contido no plasmídeo pVElOB (WO 92/29696).

Uma planta restauradora como usada aqui é uma planta fértil masculina da mesma espécie de planta que contém integrado no DNA nuclear de suas células um gene restaurador da fertilidade( R) compreendendo 1) "um promotor restaurador" que dirige expressão pelo menos em algumas células de estame em que o promotor de esterilidade dirige a expressão do DNA de bamase em planta ms, e, 2) um "DNA restaurador" codificando para um barstar (o "DNA de barstar").

Nas plantas restauradoras desta invenção, o DNA de barstar é o DNA de barstar melhorado, como descrito abaixo. A presença de gene restaurador da fertilidade nestas plantas de progênie de uma planta estéril masculina que contém o gene de esterilidade masculina, restaura a fertilidade masculina nestas plantas de progênie. As plantas de progênie são como evidente obtidas de um cruzamento entre uma planta estéril masculina e a planta restauradora.

Uma planta restaurada como usada aqui é uma planta (da mesma espécie que a planta estéril masculina e a planta restauradora) que é fértil masculina e que contém, em seu genoma,. o gene de esterilidade masculina e o gene restaurador da fertilidade, particularmente o gene restaurador da fertilidade compreendendo o DNA de barstar melhorado desta invenção.

Uma linhagem é a progênie de uma dada planta individual. As plantas de uma dada linhagem se parecem uma com a outra em uma ou mais características fenotípicas e/ou genéticas. Gomo usado aqui, uma linhagem estéril masculina (ms) é um grupo de plantas de uma espécie de planta, particularmente de uma variedade de planta, que são todas estéreis masculinas devido à presença de um gene de esterilidade masculina particular no mesmo local genético. Similarmente, uma linhagem restauradora é um grupo de plantas de uma espécie de planta que contém todas o gene restaurador da fertilidade em particular no mesmo local genético. Preferivelmente, todas as plantas de uma linhagem ms (respectivamente uma linhagem restauradora) tem o mesmo genótipo com relação ao local de esterilidade masculina (respectivamente o local restaurador da fertilidade). A fertilidade masculina é restaurada a uma linhagem estéril masculina por introdução do gene restaurador da fertilidade na linhagem ms, por exemplo por cruzamento das plantas da linhagem ms com plantas da linhagem restauradora de modo que pelo menos algumas das plantas de progênie serão plantas restauradas.

Os antecedentes genéticos de uma linhagem de uma variedade designa a totalidade de genes presentes na variedade que determinam as características fenotípica particulares desta variedade. Um gene estranho, como um gene de esterilidade masculina ou um gene restaurador, introduzido por engenharia genética para produzir uma linhagem particular de uma variedade pode assim ser introduzido em diferentes variedades (ou mesmo em diferentes espécies), cada tendo um diferente fundo genético.

Para a produção de uma semente híbrida, a linhagem de esterilidade masculina é também chamada a linhagem originária ou feminina e a linhagem fértil masculina (restauradora) é também chamada a segunda linhagem originária ou masculina.

Um gene como usado aqui é geralmente entendido para compreender pelo menos uma região codificando para um RNA, proteína ou polipeptídeo, que é ligado de modo operativo a promotor apropriado ou sequências regulatórias 3'.

Para fim da invenção, a expressão de um gene, como um gene quimérico, irá significar que o promotor do gene dirige transcrição de um DNA em um RNA que é biologicamente ativo, isto é que é ou capaz de interagir com outro RNA ou proteína, ou que é capaz de ser traduzido em uma proteína ou polipeptídeo biologicamente ativo. O fenótipo é a aparência externa da expressão (ou falta de expressão) de um genótipo (isto é de um gene ou conjunto de genes (por exemplo esterilidade masculina, presença de proteína ou RNA em tecidos de plantas específicos, etc).

Uma bamase como usada aqui é qualquer proteína que é capaz de degradar RNA de filamento único e que compreende a sequência de aminoácido de bamase (como secretada por Bacillus amvloliquefaciens (Hartley 1988, J. Mol. Biol. 202:913), ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85% de identidade de sequência com esta sequência. As bamases, como usadas aqui, são capazes de degradar RNA por uma reação que envolve a divagem inicial de ligação fosfodiéster entre 5'ribose de um nucleotídeo e o grupo fosfato ligado ao nucleotídeo 3’ vizinho. O produto inicial desta reação é intermediário 2', 3'- fosfato dclico que é subsequentemente hidrolisado no fosfato de nucleosídeo 3’ correspondente. As bamases são também capazes de hidrolisar fosfato de polietenoadenosina para dar um análogo de nucleotídeo altamente fluorogênico 1,N- etenoadenosína (Fitzgeral e Hartley, 1993, Anal. Biochem. 214- 544-547), e tem pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 50% , particularmente pelo menos 75% da atividade de bamase secretado como medido sob condições padrões (Fitzgeral e Hartley, 1993, Anal, Biochem. 214-544-547, Hartley 1993, Biochemistry 32:5978:5984), Bamases são ainda capazes de ligação específica para barstar de tipo selvagem (ver abaixo) com uma constante de dissolução de IO'12 M ou menos, preferivelmente com uma constante de dissociação da ordem de 10'13 a 10"14 (Schreiber e Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145-5150, Hartley 1993, Biochemistry, 32: 5978-5984). Binase é a ribonuclease extracelular por Bacillus intermedius (Shulga et al 1992, NAR 20:2375), e é também considerado como sendo uma bamase como usada nesta invenção.

Por conveniência, bamase , como usada na descrição ou nos exemplos abaixo, irá designar uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de bamase codificada por pVE108 (WO 92/09696).

Um barstar é qualquer proteína que é capaz de ligação específica para bamase secretada com uma constante de dissolução de IO12 M ou menos, preferivelmente com uma constante de dissociação da ordem de 10' 13 a 10'14 (Schreiber e Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145-5150, Hartley 1993, Biochemistry, 32: 5978-5984). Os barstars são capazes de inibir pelo menos 50%, particularmente pelo menos 75%, mais particularmente pelo menos 90% da atividade de bamase secretada em uma mistura equimolar de barstar e bamase secretada em condições padrões (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978-5984). Uma barstar é uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ. ID. NO.: 2, ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85% de identidade de sequência com esta sequência. O barstar de tipo selvagem é o barstar produzido por Bacillus amvloliquefaciens e tendo a sequência de aminoácido de SEQ. ID. NO.: 2 (ver também Hartley J. Mol. Biol. 1988, 202:913). É desnecessário disser que barstars como usados aqui incluem por exemplo os mutantes de barstar biologicamente ativos descritos por Hartley (1993, Biochemistry, 32: 5978-5984).

Um DNA de bamase (ou sequência de codificação de bamase) como usado aqui é qualquer fragmento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos codificando para uma bamase. Um DNA de bamase particularmente preferido é o DNA de bamase como presente em pVE108 (WO 92/09696). Um gene bamase é um gene quimérico expressável em planta compreendendo um DNA de bamase ligado de modo operativo regiões regulatórias 5’ e 3' apropriadas, isto é uma região de promotor compreendendo um promotor reconhecido pelas polimerases de uma célula de planta e uma região 3' compreendendo um sítio de poliadenilação de planta.

Um DNA de barstar (ou sequência de codificação de barstar) como usado aqui é qualquer fragmento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos codificando para um barstar. Um DNA de barstar de tipo selvagem é o DNA que codifica para barstar de tipo selvagem e que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ. ID. NO.: 1 (Hartley, J. Mol. biol. 1988: 202:913). Um gene barstar é um gene quimérico expressável em plantas compreendendo um DNA de barstar ligado de modo operativo a regiões regulatórias 5' e 3' apropriadas, isto é a região de promotor compreendendo um promotor reconhecido pelas polimerases de uma célula de planta e uma região 3' compreendendo um sítio de poliadenilação de plantas.

Como usado aqui, um local genético é a posição de um dado gene no genoma nuclear, isto é, no cromossomo particular, de uma planta. Dois locais podem estar em diferentes cromossomos e irão segregar independentemente. Dois locais podem estar localizados no mesmo cromossomo e são então geralmente considerados como sendo ligados (salvo se suficiente recombinação puder ocorrer entre os mesmos).

Um local endógeno é um local que está naturalmente presente em uma planta. Um local estranho é um local que é formado na planta devido à introdução, por meio de transformação genética, de um DNA estranho.

Em plantas diplóides, como em qualquer outro organismo diplóide, duas cópias de um gene estão presentes em qualquer local autossômico. Qualquer gene pode estar presente no genoma nuclear em vários estados variantes designados como alelos. Se dois alelos idênticos estiverem presentes em um local cujo local é designado como sendo homozigótico, se diferentes alelos estiverem presentes, o local é designado como sendo heterozigótico. A composição alélica de um local, ou um conjunto de locais, é o genótipo. Qualquer alelo em um local é geralmente representado por um símbolo separado (por exemplo R e -, S e -, representando a ausência do gene). Um local estranho é geralmente caracterizado pela presença e/ou ausência de um DNA estranho. Um alelo dominante é geralmente representado por uma letra maiúscula e é geralmente associada com a presença de um produto genético biologicamente ativo (por exemplo uma proteína), e um efeito fenotípico observável (por exemplo R indica a produção de uma proteína barstar ativa).

Uma planta pode ser geneticamente caracterizada por identificação de estado alélico de pelo menos um local genético. O genótipo de um dado local pode ser designado pelos símbolos para os dois alelos que estão presentes no local (por exemplo R/R ou S/-). O genótipo de dois locais não ligados pode ser representado como uma sequência de genótipo de cada local (por exemplo S/-, R/-).

Uma planta estéril masculina como usada aqui, contém um "local de esterilidade masculina" estranho que contém o gene de esterilidade masculina S quando expresso em células da planta tomam a planta estéril masculina sem de outra forma afetar substancialmente o crescimento e desenvolvimento da planta. O local de esterilidade masculina preferivelmente também compreende o mesmo local genético pelo menos um primeiro gene marcado do mesmo compreende pelo menos: 1) um primeiro DNA marcador codificando um primeiro RNA marcador, proteína ou polipeptídeo que, quando presente pelo menos em um tecido específico ou células específicas da planta, toma a planta facilmente separável de outras plantas que não contém o primeiro RNA marcador, proteína ou polipeptídeo codificado pelo primeiro DNA marcador pelo menos no tecido específico ou células específicas, e 2) um primeiro promotor marcador capaz de dirigir expressão do primeiro DNA marcador pelo menos no tecido específico ou células específicas, o primeiro DNA marcador estando na mesma unidade de transcrição e sob o controle do primeiro promotor marcador.

Este gene de esterilidade masculina é sempre um alelo dominante em tal local de esterilidade masculina estranho. O alelo recessivo corresponde à ausência de gene de esterilidade masculina no genoma nuclear da planta.

Os promotores de esterilidade que podem ser usados nos genes de esterilidade masculina na primeira linhagem originária da invenção foram descritos acima (EP 0 344 029 eEP 0412911). O promotor de esterilidade pode ser qualquer promotor que deve ser pelo menos ativo nas células de estame, particularmente células de tapeto. Os promotores de esterilidade particularmente apropriados são promotores que são seletivamente ativos em células de estame, como os promotores específicos para tapeto, de gene TA29 de Nicotiana tabacum (EP 0 344 029) que podem ser usados tabaco, colza de semente oleígena, alface, chicória, milho, arroz, trigo e outras espécies de plantas; os promotores PT72, PT42 e PE1 de arroz que podem ser usados em arroz, milho, trigo e outras espécies de plantas (WO 92/13956); o promotor PCA55 de milho que pode ser usado em milho, arroz, trigo e outras espécies de plantas (WO 92/13957), e o promotor A9 de um gene específico para tapeto de Arabidopsis thaliana (Wyatt et al, 1992, Plant. Mol. Biol. 19,611-922) A presente invenção é baseada na descoberta que a "capacidade restauradora" ( a capacidade e eficácia de uma linhagem restauradora para restaurar de modo eficaz a fertilidade masculina de uma ampla variedades de linhagens ms) está diretamente relacionada com a quantidade de barstar produzido no estame, particularmente nas células de tapeto, das plantas restauradoras (e por implicação no estame, particularmente as células de tapeto, das plantas restauradas). A capacidade restauradora é importante devido a uma linhagem restauradora eficaz poder ser usada para a restauração de fertilidade masculina em uma ampla variedade de linhagens estéreis masculinas, que podem diferir no nível em que bamase é produzida (por expressão de gene de esterilidade masculina) no estame, particularmente nas células de tapeto. Uma fonte desta variedade de produção de bamase dentre diferentes linhagens ms pode ser devido a efeitos de posição, isto é, a variação na expressão do gene do gene ms devido a diferentes locais de inserção no genoma nuclear dentre diferentes transformantes. Outra fonte de variação de produção de bamase dentre várias linhagens ms que contém o gene ms no mesmo local genético é de diferentes fundos genéticos de várias linhagens ms. Assim, quando o gene ms de uma linhagem de esterilidade masculina de uma variedade de espécie de planta é introduzido em outras variedades da mesma espécie de planta (ou de uma intimamente relacionada) por retro-cruzamento para gerar linhagens ms destas variedades, o gene ms é introduzido em um diferente fundo genético que pode influenciar o nível em que o gene ms é expresso. A variação observada na produção de bamase, e os problemas associados com a mesma com relação a restauração de fertilidade, é ainda aumentada quando a variação de expressão de gene restaurador dentre diferentes plantas restauradoras é levada em consideração - como variação pode se originar das mesmas fontes como indicado acima, isto é, os efeitos de posição do gene restaurador da fertilidade em diferentes linhagens restauradoras e/ou diferentes fundos genéticos de diferentes linhagens restauradoras. Assim, a fim de obter linhagens restauradoras com boa capacidade de restauração, é desejado ter os genes barstar quiméricos expressáveis em plantas que são expressados em altos níveis para produzir grandes quantidades de barstar nas células de estame, particularmente em células de antero, especialmente em células de tapeto de uma planta.

Esta invenção assim provê melhorados DNAs de barstar que, todas as outras coisas sendo iguais, são mais eficientemente expressos em células de plantas - assim produzindo nestas células maiores níveis de proteína barstar ativa, particularmente melhorada proteína barstar - do que DNAs de barstar de tipo selvagem. Assim, melhorados genes restauradores de fertilidade são expressos, em plantas de pelo menos uma espécie de planta (e preferivelmente em plantas de várias espécies de plantas, particularmente várias espécies de plantas monocotiledôneas), e um nível que é em média maior do que o nível observado com genes restauradores similares compreendendo DNA de barstar tipo selvagem. Um nível maior médio de expressão significa que a quantidade de barstar produzida em órgãos particulares (por exemplo anteros), de diferentes linhagens restauradoras contendo o gene restaurador da fertilidade desta invenção em diferentes locais genéticos e/ou dentro de fundos genéticos diferentes é significativamente maior do que a quantidade de barstar produzida no estame de diferentes linhagens restauradoras contendo similares genes restauradores da fertilidade compreendendo DNA de barstar tipo selvagem em diferentes locais genéticos e dentro de fundo genético específico.

Em geral, a invenção provê "melhoradas" regiões de codificação de barstar que tem uma sequência de nucleotídeos contendo como um segundo códon um códon que codifica para um aminoácido selecionado dentre o grupo consistindo do grupo de Valina (Vai), Alanina (Ala), ácido Aspártico (Asp), ácido Glutâmico (Glu) e Glicina (Gly) É particularmente preferido que este segundo códon codifique Alanina. Estes códons iniciam com um G que provê um contexto de iniciação de tradução ótimo em posição + 4 (isto é, o primeiro nucleotídeo do segundo códon da sequência de codificação de barstar). Assim, o N-término de barstar, codificado pelo DNA de barstar melhorado, consiste de Met-Xaa em que Xaa é Ala, Vai, Gly, Glu, ou Asp, e é preferivelmente Ala (mais preferivelmente um Ala codificado por um códon GCC). Preferivelmente, os DNAs de barstar melhorados codificam um barstar compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No. 2 entre os resíduos de aminoácidos 3 e 90. Exemplos de DNAs de barstars melhorados são 1) um DNA de barstar codificando um barstar tendo SEQ ID No. 2 em que o segundo aminoácido (Lys) é substituído por Xaa como definido acima, e 2) um DNA de barstar codificando um barstar tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No. 4. Verificou-se que a modificação de N-término de proteína de barstar em um modo não conservativo não afeta de modo negativo a atividade biológica específica de barstar. De fato, genes compreendendo estes DNAs de barstar melhorados, quando expressos em plantas, particularmente quando expressos em monocotiledôneas, (como milho, arroz e trigo), geralmente produziram mais proteína de barstar como avaliado por western blotting de tecidos de estame. Este aumento na produção de barstar em células de tapeto pode ser devido a melhorada tradução mas também para melhorada estabilidade da proteína de barstar.

Verificou-se também que a modificação de uma sequência de codificação de barstar para reduzir a % AT desta sequência abaixo de 40% resultou em melhorado DNA de barstar que podería ser usado para aumentar consideravelmente o nível de produção de proteína com atividade de barstar em células de plantas, particularmente em células de tapeto. Estas melhoradas sequências de codificação de barstar serão aqui geralmente designadas como sequências de codificação de barstar "sintéticas".

Prefere-se que os DNAs de barstar sintéticos tem um uso de códon que é preferido na maior parte das espécies de plantas em que se destina seja usado, por exemplo em linhagens restauradoras. Um uso de códon preferido de um DNA de barstar para a maior parte das espécies de plantas N XI, X2, ... XN significa que para cada aminoácido, para o qual mais de um códon existe, o códon mais frequente para este aminoácido no DNA de barstar sintético (o "códon de barstar" para este aminoácido) preferivelmente cada códon para este aminoácido, é um códon que em cada mais de N/2 espécies de plantas tem uma frequência global que é 1) pelo menos duas vezes a frequência global do códon menos usado e/ou 2), mais da metade da frequência global do códon mais usado.

Também prefere-se que pelo menos 17, preferivelmente pelo menos 18 dos 19 aminoácidos para os quais códons múltiplos existem, o códon usado com maior frequência, preferivelmente cada códon, no DNA de barstar sintético, é um códon que em cada uma das espécies de plantas N tem uma frequência global que é 1) pelo menos duas vezes a frequência global de pelo menos códon usado e/ou 2) mais da metade de frequência global do códon mais usado. O exemplo 2 descreve o desenho de um DNA de barstar sintético particular com uso de códon otimizado com relação a cinco espécies de plantas (N = 5), isto é, colza de semente oleígena , algodão, milho, trigo e arroz.

Para fins da invenção, as frequências de códon globais para várias espécies de plantas são publicadas por Ikemura são usadas (Ikemura, 1993, In "Plant Molecular Biology Labfax", Croy, ed., Bios Scientific Publishers Ltd., pp. 37-48). As espécies de plantas preferidas em que os DNAs de barstar sintéticos desta invenção são usados, por exemplo em linhagens restauradoras, são colza de semente oleígena, algodão, milho, arroz e trigo, particularmente colza de semente oleígena, milho e arroz, especialmente colza de semente oleígena e milho.

Os DNAs de barstar sintéticos são preferivelmente ainda caracterizados por terem di-nucleotídeos CG e tri-nucleotídeos CNG que são marcações para metilação em células de plantas, em baixas frequências. Assim, os DNAs de barstar sintéticos desta invenção são caracterizados por; não terem mais de 7% de di-nucleotídeos CG, preferivelmente não tendo mais de 6% de di-nucleotídeos CG, particularmente tendo entre 5,5 e 6% CG di-nucleotídeos (que é cerca de 15 a 16 CG nucleotídeos em uma sequência de codificação de 270-273 bp), e/ou não tendo mais de 9,5% CNG tri-nucleotídeos (onde N é qualquer nucleotídeo), preferivelmente não tendo mais de 9% de tri-nucleotídeos CNG, particularmente tendo entre 8,5 e 9% de tri-nucleotídeos CNG (que é cerca de 23-25 trinucleotídeos CNG em uma sequência codificando de 270-273 bp).

Os DNAs de barstar sintéticos desta invenção são ainda preferivelmente caracterizados por terem não mais que 7, preferivelmente não mais do 5, particularmente não mais do que 3 tetranucleotídeos consistindo de somente um tipo de nucleotídeo (isto é, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT) e tendo não mais do que 2, preferivelmente não mais do que 1 pentanucleotídeo consistindo de somente um tipo de nucleotídeo (isto é, AAAAA, CCCCC, GGGGG, TTTTT).

Os DNAs de barstar sintéticos desta invenção incluem os codificando para barstar de tipo selvagem (SEQ ID No. 2), por exemplo, um DNA de barstar tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID No. 3 entre as posições 7 e 273, precedidas por ATG. No entanto, os DNAs de barstar sintéticos desta invenção são sequências de codificação de barstar sintético que codificam um barstar tendo uma sequência de aminoácido partindo de Met-Xaa em que Xaa é Valina, Alanina, ácido Aspártico, ácido Glutâmico ou Glicina, e preferivelmente em que Xaa é Alanina. Os DNAs barstar sintéticos preferidos são os DNAs tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID No. 3 entre as posições 7 e 273, precedidos por ATGGNN, preferivelmente por ATGGCN (onde N é qualquer nucleotídeo). Um DNA de barstar sintético particularmente preferido é um DNA tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ IDNo.3.

Preferivelmente, a sequência de codificação de barstar sintético e a sequência de codificação de barstar tipo selvagem codificam para proteínas de barstar tendo pelo menos 80% de identidade de sequência.

Para fins desta invenção, a % de identidade de sequência de duas sequências de nucleotídeos relacionadas (por exemplo dois DNAs de barstar) ou sequências de aminoácidos (isto é dois barstars) se refere ao número de posições nas duas sequências otimamente alinhadas que tem resíduos idênticos (xlOO) divididos pelo número de posições comparadas. Um intervalo, isto é uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência mas não na outra é considerado como uma posição com resíduos não idênticos.

Os genes restauradores compreendendo os DNAs de barstar sintéticos da invenção podem ser usados para produzir linhagens restauradoras em diferentes espécies de plantas mas são particularmente utilizáveis para produzir linhagens restauradoras em cereais, especialmente em milho, arroz e trigo.

Esta invenção assim também provê melhoradas proteínas de barstar que tem um N-término que consiste de Met-Xaa (onde Xaa é como definido acima). Particularmente melhorados barstars preferidos desta invenção compreendem a sequência da SEQ ID No. 2 entre os resíduos 3 e 90, e são, por exemplo: 1) um barstar tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No. 4, e 2) um barstar tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No. 2 em que o segundo aminoácido (Lys) é substituído por Xaa como definido acima.

Além disso, é desnecessário dizer que a região destes barstars melhorados preferidos que corresponde à sequência entre os resíduos 3 e 90 da SEQ Π) No. 2 pode ser modificado, desde que a sequência de aminoácído global tenha pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90% de similaridade de sequência com SEQ ID No. 2, de desde que o barstar melhorado seja capaz de inibir pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 90% da atividade de barstar secretado sob condições padrões.

Como indicado acima, a modificação no N-término de proteína barstar (isto é a introdução de um N-término consistindo de Met-Xaa-...) é uma modificação não conservativa, que no entanto não afeta negativamente a atividade biológica específica de barstars melhorados desta invenção quando eles são produzidos em células de plantas. Isto é exemplificado pelo melhorado barstar da SEQ ID No. 4 no exemplo 6.

Esta invenção assim também provê genes restauradores da fertilidade que são caracterizados em que eles contém os melhorados e/ou sintéticos DNAs de barstar desta invenção e que podem ser usados para produzir melhoradas plantas restauradoras transgênicas de uma espécie de planta, isto é plantas restauradoras com boa capacidade restauradora. É desnecessário dizer que DNA de barstar no gene restaurador da fertilidade pode ser translacionalmente fundido para outras sequências de codificação de modo que serão expressas como parte de uma proteína de fusão.

Em princípio, qualquer promotor pode ser usado como um promotor restaurador no gene restaurador da fertilidade na planta restauradora da invenção. O único pré-requisito é que esta planta restauradora que contém o gene restaurador da fertilidade é capaz de restaurar A fertilidade de uma linhagem estéril masculina, isto é de produzir plantas restauradoras (compreendendo tanto o gene de esterilidade masculina como o gene restaurador da fertilidade) que são fenotipicamente normais e férteis masculinos. Isto requer que o promotor restaurador no gene restaurador da fertilidade deve ser pelo menos ativo nas células de estame de uma planta em que o promotor da fertilidade de gene de esterilidade masculina correspondente pode dirigir a expressão de DNA de bamase. Neste aspecto será preferido que o promotor de esterilidade e o promotor restaurador sejam iguais ( como o promotor TA29 ou CA55). No entanto, o promotor de esterilidade pode ser ativo somente em células de estame enquanto o promotor restaurador é também ativo em outras células. Por exemplo, o promotor da esterilidade pode ser um seletivo para estame (como o promotor CA55 ou TA29) enquanto o promotor restaurador é um promotor constitutivo como o promotor 35S-tap que é um promotor 35S que é modificado para ser ativo em células de tapeto (van der Meer et al, 1992, the Plant Cell 4: 253-262).

Como é evidente, os DNAs de restaurador melhorados desta invenção também podem ser usados para outros fins que a restauração de fertilidade masculina em plantas. Neste aspecto, os DNAs de barstar melhorados e/ou sintéticos da invenção podem ser usados em qualquer circunstância onde a neutralização de atividade de bamase em células de plantas pode ser utilizável como por exemplo descrito em EP 0.412.911, WO 93/19188, WO 92/21757, WO 93/25695 e WO 95/02157. Para estes usos, o DNA de barstar pode ser colocado sob o controle de transcrição de outros promotores que são mais apropriados, e promotores como o promotor 35S ou o promotor do gene sintase de nopalina de DNA -T de Agrobacterium pode ser usado. Promotores mínimos (isto é promotores de plantas essencialmente contendo somente uma caixa TATA sem qualquer outro elemento melhorador regulatório) pode ser também usado e os DNAs de barstar desta invenção podem mesmo ser usados sem qualquer promotor de todo (por exemplo quando se pretende que o DNA de barstar seja transcrito sob o controle de promotor endógeno em células de plantas transformadas). O gene restaurador da fertilidade R como usado na planta restauradora preferivelmente também compreende pelo menos um segundo gene marcador que compreende pelo menos 1) um segundo DNA marcador codificando um segundo RNA marcador, proteína ou polipeptídeo que, quando presente pelo menos em um tecido específico ou células específicas da planta, toma a planta facilmente separável de outras plantas que não contém o segundo RNA marcador, proteína ou polipeptídeo codificado pelo segundo DNA marcador, pelo menos no tecido específico ou células específicas, e 2) um segundo promotor marcador capaz de dirigir expressão do segundo DNA marcador pelo menos no tecido específico ou células específicas, o segundo DNA marcador estando na mesma unidade transcripcional como, e sob o controle de, o segundo promotor marcador.

Assim, uma planta restauradora da invenção contém um "local restaurador" estranho, que contém o gene R restaurador compreendendo o DNA restaurador melhorado desta invenção. O local restaurador preferivelmente também comprèende no mesmo local genético pelo menos um segundo gene marcador.

As plantas restauradoras preferidas desta invenção são plantas restauradoras monocotiledôneas, preferivelmente plantas de milho, arroz ou trigo, que produzem, em média, pelo menos 10 ng, preferivelmente pelo menos 20 ng, particularmente pelo menos 40 ng (e até 100 a 200 ng) barstar por mg de proteína total extraída de suas inflorescências isoladas (por exemplo panículos em arroz e trigo, pendão em milho, ver, por exemplo exemplo 4).

As plantas restauradoras especialmente preferidas desta invenção irão produzir os melhorados barstars desta invenção, particularmente barstar tendo a sequência de aminoácido de SEQ. ID. NO.: 4.

Os primeiro e segundo DNAs de marcador e primeiro e segundo promotores de marcador que podem ser usados no primeiro e segundo genes de marcador desta invenção são também bem conhecidos (EB 0.344.029; EP 0.412.911). Neste aspecto, prefere-se que o primeiro e segundo DNA marcador sejam diferentes, apesar do primeiro e segundo promotor de marcador poderem ser iguais. DNA estranho, como o gene restaurador da fertilidade, o gene de esterilidade masculina, ou o primeiro ou segundo gene marcador preferivelmente também são providos com sequências de regulagem de transcrição 3' apropriadas e sinais de poliadenilação, a jusante (isto é, 3') de sua sequência de codificação, isto é, respectivamente o DNA restaurador da fertilidade , o DNA de esterilidade masculina, ou o primeiro ou segundo DNA de marcador. Neste aspecto, a formação de terminação 3' de transcrição estranha e sinais de poliadenilação apropriados para obter expressão de gene quimérico podem ser usados. Por exemplo, as terminações não traduzidas 3' estranhas de genes, como gene 7 (Velten, e Shell, (1985), Nucl. Acids. Restauradora. 13: 6998), o gene sintase de octopina (De Greve et al, 1982, J. Mol. appl. Genet. 1:499, Gielen et al (1983), EMBO J. 3-835, Ingelbrecht et al 1989, The Plant Cell 1:671), e o gene sintase de nopalina de região T-DNA de Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmídeo (De Picker et al, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561), ou o gene sintase de calcona (Sommer e Saedler, 1986, Mol.. Genet. 202,429-434) ou o CaMV 19S/35S unidade de transcrição (Mogen et al 1990, The Plant Cell, 2-1261- 1272) podem ser usados. O gene restaurador da fertilidade , o gene de esterilidade masculina, ou o primeiro e segundo genes marcadores de acordo com a presente invenção são geralmente DNAs estranhos, preferivelmente DNA quimérico estranho. Neste aspecto "estranho" e "quimérico" com relação a estes DNAs tem os mesmos significados que descrito em EP 0 344 029 e EP 0 412911. A célula de uma planta, particularmente uma planta capaz de ser infectada com Aerobacterium como plantas dicotiledôneas (por exemplo Brassica napus^l e algumas plantas monocotiledôneas podem ser transformadas usando um vetor que é um plasmídeo Ti sem braços contendo o gene de esterilidade masculina ou o gene restaurador da fertilidade e transportado por Agrobacterium. Esta transformação pode ser realizada usando os procedimentos descritos, por exemplo em EP 0 116 718 e EP 0270 822. Os vetores de plasmídeo Ti preferidos contém o DNA estranho entre as sequências de borda, ou pelo menos localizado à esquerda da sequência de borda direita, de T-DNA de plasmídeos Ti. Como é evidente, outros tipos de vetores podem ser usados para transformar a célula de planta, usando procedimentos como transferência de gene direta (como descrito por exemplo em EP 0 233 247), transformação mediada por pólen, (como descrito por exemplo em EP 0270 356), publicação de patente PCT "WO" 85/01856, e patente US 4 684 611), transformação mediada por vírus de RNA de planta (como descrito por exemplo em EP 0 067 553 e patente US 4 407 956) e transformação mediada por lipossoma (como descrito por exemplo em patente US 4 536 475). As células de plantas monocotiledôneas como os cereais principais incluindo milho, arroz, trigo, cevada e centeio, podem ser transformadas (por exemplo por eletroporação) usando tecidos intactos degradados por enzima ou feridos capazes de formar calo embriogênico compacto (como embriões imaturos em milho), ou o calo embriogênico (como calo tipo 1 em milho), obtido do mesmo, como descrito em WO 92/09696. No caso da planta a ser transformada é milho, outros processos recentemente desenvolvidos também podem ser usados como por exemplo o processo descrito para algumas linhagens de milho por Fromm et al 1990, Bio/Technology, 8:833, Gordon-Kamm et al, 1990, Bio/Technology, 2:603 e Gould et al 1991, Plant Physiol. 95:426. No caso da planta a ser transformada ser arroz, processos recentemente desenvolvidos também podem ser usados como por exemplo o processo descrito para algumas linhagens por Shimamoto et al, 1989, Nature 338-274, Datta et al, 1990, Bio/Technology 8:736; e Hayashimoto et al, 1990, Plant Physiol.93: 857. A célula transformada pode ser regenerada em uma planta madura e a planta transformada resultante pode ser usada em um esquema de cruzamento convencional para produzir plantas mais transformadas com as mesmas características ou para introduzir o gene de esterilidade masculina, ou o gene restaurador da fertilidade em outras variedades da mesma espécie de planta relacionada. As sementes obtidas de plantas transformadas contém o (s) gene(s) quimérico(s) desta invenção como inserto genômico estável. Assim, o gene de esterilidade masculina , ou o gene restaurador da fertilidade, desta invenção quando introduzidos em uma linhagem particular ou variedade de uma espécie de planta pode sempre ser introduzido em qualquer outra linhagem ou variedade por retro-cruzamento. O processo acima descrito para reduzir o teor em AT de um DNA de codificação enquanto otimizando o uso de códon deste DNA de codificação para uma série de espécies de plantas, como usado para preparar os DNAs de barstar sintéticos desta invenção, pode como evidente também ser aplicado a qualquer sequência de codificação para a qual se deseja expressão ótima em um número de espécies de plantas. Neste aspecto, o processo pode por exemplo ser aplicado a genes de Bacillus thuringiensis. que codificam proteínas inseticidas, como os genes Cry9C e Crylab truncado e de comprimento completo, (EP 0 193 259, EP 0 654 075).

Salvo indicado em contrário, todos os procedimentos experimentais para manipulação de DNA recombinante foram realizados pelos procedimentos padronizados descritos em Sambrook et al, 1989 "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, NY, e Ausubel et al 1994 "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

As reações de cadeia polimerase (PCR) foram usados para clonar e/ou amplificar fragmentos de DNA. PCR com extensão de sobreposição foi usado a fim de construir genes quiméricos (Horton et al, 1989, Gene 77 61-68, Ho et al, 1989, Gene 77:51-59).

Todas as reações PCR foram realizadas sob condições convencionais usando polimerase Vent ™ (Cat. NO. 254L, Biolabs New England, Beverly, Μ A 01915, USA) isolado de Thermococcus litoralis (Neuner et al, 1990, Arch. Microbiol. 153-205-207). Os oligonucleotídeos foram projetados de acordo com regras conhecidos como descrito por exemplo por Kramer e Fritz (1987, Methods in Enzymology, 154-350) e sintetizados pelo processo fosforamidito (Beaucage e Caruthers, 1981, Tetrahedron letters, 22L: 1859), em um sintetizador de DNA da Applied Biosystems 380A (Applied Biosystems, BV, Maarssen, Holanda).

Na descrição e nos seguintes exemplos, faz-se referência à seguinte listagem de sequência e figuras: Listagem da sequência: SEQ. ID. NO.: 1 - DNA de barstar tipo selvagem SEQ. ID. NO.: 2 - barstar tipo selvagem ('SEQ. ID. NO.: 3 - DNA de barstar sintético SEQ. ID. NO.: 4 - barstar melhorado SEQ. ID. NO.: 5 - pMV71 de plasmídeo SEQ. ID. NO.: 6 - parte relevante de plasmídeo pLH43 SEQ. ID. NO.: 7 - T-DNA de plasmídeo pTTS24 SEQ. ID. NO.: 8 - CASOLX1 de oligonucleotídeo SEQ. ID. NO.: 9 - CASOLX2 de oligonucleotídeo SEQ. ID. NO.: 10 - plasmídeo pLH48 Quando fazendo referência a sequências de aminoácidos ou nucleotídeos, deve ser entendido que uma sequência entre posição X e Y (ou altemativamente uma sequência da posição X para posição Y) é uma sequência que inclui os resíduos na posição X e Y.

Os elementos de DNA funcionais são designados usando as abreviaturas como usadas na Listagem da Sequência.

EXEMPLOS

Exemplo 1 : Preparação de um DNA de barstar melhorada Um DNA de barstar melhorada foi preparado pela inserção através de mutagênese dirigida ao sítio do códon alanina GCC entre o primeiro códon (ATG) e o segundo códon (AAA) de barstar tipo selvagem. O DNA de barstar melhorado assim codifica um barstar melhorado, o qual, quando comparado ao barstar de tipo selvagem, tem um N-término alterado que consiste de Met-Ala-Lys (no lugar de Met-Lys em barstar tipo selvagem). Esta modificação não conservativa ao N-término não afeta a atividade biológica do barstar melhorado nas células da planta (ver Exemplo 6).

Exemplo 2 : Proieto e preparação de um DNA de barstar sintético Um DNA de barstar sintético codificando o barstar melhorado do Exemplo 1 foi designado de acordo com o seguinte critério: - os nucleotídeos A e T percentuais no barstar sintético devem estar abaixo de 40% (DNA de barstar tipo selvagem tem uma %AT de 51,6). Genes ricos em AT tem uma probabilidade mais elevada de incluir sinais de poliadenilação e sequências de reconhecimento de introns que podem prevenir ou diminuir a expressão de sequências de codificação especialmente longas (por exemplo, sequências de codificação Bt) nas células de planta. - apesar do aumento de nucleotídeos C e G, o número de dinucleotídeos CG e trinucleotídeos deve permanecer tão baixo quanto possível. Isto porque os dinucleotídeos CG e os trinucleotídeos CNG são marcações para metilação que podem inativar um gene nas células de planta. - o uso de códon deve ser tão ótimo como possível em uma ampla faixa de espécies de plantas, particularmente em colza de semente oleígena, algodão, milho, arroz, e trigo. Assim, para cada aminoácido, um códon (códons) foram selecionados para uso predominante no DNA de barstar que na maior parte das espécies de planta tem uma frequência que é pelo menos mais de duas vezes a frequência de pelo menos o códon usado e/ou são pelo menos mais da metade da frequência do códon mais usado. Assim, para cada espécie de planta e para cada aminoácido, uma lista de códons é feita que tem uma frequência que é pelo menos mais de duas vezes a frequência do códon menos usado em que as espécies de plantas e/ou são pelo menos mais da metade da frequência do códon mais usado nesta espécie de planta (códons de acordo com este critério são projetados como códons ótimos para esta espécie de planta). O códon que é um códon ótimo na maior parte das espécies de plantas é tomado como o códon predominante, preferivelmente o único códon, para este aminoácido no DNA de barstar sintético.

Convenientemente, as frequências de códons usadas nesta análise são as dadas em Ikemura (supra). - evitam extensões mais longas que 4 nucleotídeos idênticos.

Um DNA de barstar sintético com a sequência nucleotídeo da SEQ ID No. 3 foi assim obtida. Este DNA de barstar sintético tem um %AT de 38,4, e não obstante contém somente 16 dinucleotídeos CG e 24 CNG trinucleotídeos. O DNA de barstar sintético não contém sinais de poliadenilação de uma planta potencial ou emendas locais de introns. O uso do códon sintético do DNA de barstar sintético aparece para expressão apropriada em pelo menos colza de semente oleígena , algodão, milho, arroz e trigo (Tabela 1). Para os 18 aminoácidos em que múltiplos de códons existe 17 aminoácidos são predominantemente codificados (e 16 são exclusivamente codificados) no DNA de barstar sintético por um códon que é um códon ótimo em cada uma destas cinco espécies de planta. De fato todos os aminoácidos para os quais os códons múltiplos existem, são predominantemente codificadas no DNA de barstar sintético por um códon ótimo em pelo menos três das cinco espécies. O DNA de barstar sintético contém somente 1 extensão CCCCC e GGGG. O barstar sintético de SEQ ID No. 3 permite o uso dos seguintes locais de restrição única para propósitos de clonagem: Ncol, BspEl e Kasl.

Exemnlo 3 : Expressão de DNAs de harstars melhorados em células de milho Células de milho cultivado, Black Mexican Sweet (BMS) foram bombardeadas com a pistola de partícula Bio-Rad PDS-1000/HE (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, Califórnia, U.S.A.) usando microprojéteis (partículas de ouro) revestidos com ou plasmídeo pJH43 ou com o plasmídeo pMV71 como a seguir.

As células de suspensão BMS foram colocadas em filtros apropriados e bombardeadas por procedimentos convencionais (Kirihara, 1994, In “The Maize Handbook”, Freeling e Walbot, eds., Springer Verlag, pp 690-694), modificou pela inclusão um pré-tratamento osmótico (Russel et al, 1992, In Vitro 28:97-105). As partículas de ouro foram revestidas com uma mistura de plasmídeo DNA apropriado contendo o DNA de barstar e o plasmídeo pActl-D (McElroy et al, 1990, The Plant Cell 2:163-171) em uma relação 5:1 usando os procedimentos descritos no manual de provedores. pActl-D é um plasmídeo contendo o gene gus (que codifica beta-glucuronidase) sob o controle do promotor do gene de actina de arroz que tem essencialmente a sequência como descoberto na SEQ ID No.5 da posição 1999 a 3400.

Para cada plasmídeo dois a três filtros foram bombardeados. 24 horas após o bombardeio, as células de cada filtro foram coletadas e rompido para moer em nitrogênio líquido. As células rompidas para cada filtro foram divididas em duas quantidades iguais, uma para um teste barstar e uma para um teste GUS.

De uma metade de células rompidas de cada filtro bombardeado, a proteína celular solúvel total foi extraída no tampão de extração (50 mM Tris/HCl pH 7,5, 5% de glicerol, 100 mM KC1, 1 mM de benzamidin.HCl, 5mM de ácido e-amino-n-capróico, lOmM EDTA, 10 mM de EGTA, 1 pg/ml de antipaina, 1 pg/ml de leupeptina, 14 mM beta-mercaptoetanol, 1,5% de polivinilpolipirrolidona, 1 mM PMSF). A proteína de concentração foi medida pelo teste Bio-Rad Bradford. Por amostra 50 pg de proteínas foram carregadas em um gel SDS-poliacrilamida de 18% e separado pela eletroforese. 0,1, 0,5, 1, 2,5 e 5 ng do barstar purificado foram carregados no gel como controles positivos.

As proteínas foram então submetidas a eletroblot sobre Hynbond C usando tampão TGM (25 mM Tris pH 8,3, 192 mM de glicina, 20% v/v de metanol) durante 2 horas a 60 V. Os filtros foram então incubados primeiro durante 2 horas em 0,5% PBS-Tween 20 e então durante a noite em uma solução de anticorpos primários (1/1000 de diluição de anticorpo anti-barstar IgG policlonal em PBS- 0,5% Tween 20). Os filtros foram então lavados quatro vezes durante 5 minutos em PBS e então incubado durante 1 hora em uma solução de IgG anti-coelho de jumento, ligado a peroxidase de raiz forte (Amersham, Buckinghamshire, Grã-Bretanha) 1/1000 de diluição em PBS- 0,5% Tween 20). Os filtros foram então outra vez lavados quatro vezes durante 5 minutos em PBS e as proteínas foram então detectadas usando o sistema de detecção ECL. A quantidade de barstar foi medida por varredura de densitometria das autorradiografias.

Em paralelo, a atividade de beta-glucuronidase em proteínas extraídas de outros meios das células rompidas de cada filtro bombardeado foi medida por um teste fluorogênico (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Repórter 5:387-405). A produção de barstar de um plasmídeo particular foi determinada para comparar a quantidade de barstar por (arbitrária) atividade de unidade GUS. pMV71 é um plasmídeo tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No.5 e contém o DNA de barstar melhorado de Exemplo 1 - Esta variante DNA de barstar é operativamente ligada ao promotor actma de arroz e o final não traduzido 3’ do gene de síntese nopalina de Agrobacterium Τ'-DNA. pLH43 é um plasmídeo tendo a sequência nucleotídeo de SEQ ID No.5 que a sequência entre nucleotídeos 3399 e 40211 está colocado com a sequência nucleotídeo da SEQ ID No.6. pLH43 contém o DNA de barstar sintético de Exemplo 2 (SEQ ID No. 3) operativamente ligado ao promotor actina de arroz e o final não traduzido 3’ do gene de síntese nopalina de Agrobacterium T-DNA. pTS410 é um plasmídeo tendo a sequência nucleotídeo de SEQ ID No.5 em que os nucleotídeos 3404 e 3406 (isto é, o segundo códon de DNA de barstar em pMV71) foi deletada.

Os resultados da experiência acima está apresentada na Tabela 2 que mostram as medidas de bombardeios individuais. Pode ser facilmente visto que a introdução dos DNAs barstar de pMV71 e pLH43 resulta na média em uma produção significantemente mais elevada de (melhorado) proteína barstar quando comparada a uma produção de (tipo selvagem) proteína barstar após a introdução do DNA de barstar tipo selvagem de pTS410. Além disso, pode-se se ver que a introdução do DNA de barstar sintético melhorado de pLH43 em células de milho resulta em uma produção significantemente mais elevada de (melhorada) proteína barstar naquelas células quando comparadas a uma produção de (também melhorada) proteína barstar após a introdução do DNA de barstar melhorado de pMV71.

Exemplo 4 : Expressão de DNAs de barstar melhorado em plantas de arroz Quatro linhagens de arroz estéril masculino, transgênicas, de cultivar Kochihibiki foram obtidas, usando plasmídeo pTS172, essencialmente como descrito em WO 92/13956. O plasmídeo pTS172 contém os seguintes genes quiméricos: P35S-bar-3’g7 e PE 1 -baranse-3 ’nos e pode ser obtido de pTS173 (ver abaixo) através da ligação o fragmento largo de pTS173, digerido com BsEII e Mscl a um pequeno fragmento BsEII-MscI de pJVR2-El. Estas linhagens foram designadas com K104, K107, K109 e Klll.

Sete plantas de arroz restauradoras da fertilidade masculina, transgênicas, de cultivar Chiyonishiki foram obtidas essencialmente como descrito em WO 92/13956 usando o plasmídeo pTS173 que contém os seguintes genes quiméricos: P35S-bar-3’g7 e PE 1 -barstar-tioo-selvagem-3’nos. pTS173 é derivado de pJVR3-El (WO 92/13956) substituindo o promotor 35S e a finalização não traduzida 3’ do gene bar quimérico de pJVR3-El pelo promotor 35S e a finalização não traduzida 3’ de gene bar quimérico de PTTS24 como a seguir. Da inserção T-DNA do plasmídeo pTTS24 (SEQ ID No. 7) um fragmento DNA contendo a finalização 3’ de gene T-DNA 7 e a parte do gene bar é ampliado por PCR usando os iniciadores oligonucleotídeos CASOLX1 (SEQ ID No. 8), que sobrepõe o sítio Kpnl no gene bar, e CASOLX2 (SEQ ID No. 9). O produto PCR é clivado com Aatll e Kpnl, e ligado ao fragmento largo do plasmídeo pJVR3-E1 clivado com Aatll e Kpnl. Do plasmídeo obtido o fragmento Ncol+Notl, (contendo P35S) é substituído pelo fragmento Ncol-Notl de pTTS24 (posições 880 a 2281 na SEQ ID No. 7), resultando em pTS173. As linhagens resultantes foram designadas como Cl 11, C113, Cl 17, Cl 18, C120, C121 e Cl25. Todas estas plantas assim contém o DNA de barstar tipo selvagem de SEQ ID No. 1 sob o controle do promotor El (WO 92/13956). 32 plantas restauradoras adicionais foram obtidas usando transformação mediada por Agrobacterium de calo embriogênico compacto ferido (obtido de arroz de embriões imaturos de cultivar Kochihibiki)(Wo 92/09696). A cepa Agrobacterium usada para transformação foi a cepa Ach5 (Genetello et al, 1997, Nature 265:561-563) curada de Ti-plasmídeo tipo selvagem e contendo plasmídeos pGV4000 e pTTS24. pTTS24 é um vetor de clonagem intermediária que se assemelha a pGSC170G (Cornelissen and Vandewiele, 1989, NAR 17:19-29) em características essenciais mas principalmente difere do plasmídeo faltando o gene beta-lactamase e contendo um T-DNA tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 7. pGV4000 é um Ti-plasmídeo sem braços que é derivado de pMP90 (Koncz and Schell, 1986, Mol.Gen.Genet. 204:383:396) e que contém uma região que permite a recombinação homóloga com a região correspondente em pTTS24.

Estas plantas, que todas contém o DNA de barstar sintético de Exemplo 2 (SEQ ID No, 3) sob o controle do promotor El, foram designadas com os números “OSC” como usado na Tabela 3. A quantidade de proteína barstar foi determinada em todas as linhagens restauradoras. Por uma linhagem, um ou dois panículos imaturos (isto é panículos em que a maioria de salpicos são aproximadamente 3,5 a 4,5 mm muito longos) de uma planta única foram esmagadas em nitrogênio líquido. As proteínas foram extraídas e detectadas como descrito no Exemplo 3.

Os resultados são resumidos na Tabela 3. Pode-se ver que as linhagens restauradoras contendo o DNA de barstar da SEQ ID No. 3 produzem significantemente mais barstar do que as linhagens que contém o DNA de barstar de SEQ ID No. 1.

Foi confirmado que a quantidade do mRNA barstar foi diretamente relacionada a uma quantidade de proteína barstar nos panículos (dados não mostrados). Foi ainda confirmado que a produção de proteína barstar é efetivamente restringindo para as flores dos panículos (dados não mostrados).

As linhagens restauradoras selecionadas foram cruzadas com as quatro linhagens estéreis masculinas. Foi observado que a capacidade restauradora de linhagens restauradoras estava correlacionada com a quantidade de proteína barstar produzida nas flores. As linhagens produzindo entre 4 e 10 ng de barstar por mg de proteína extraída foram observadas como sendo capazes de restaurar parcialmente o desenvolvimento de microesporos para linhagens estéreis masculinas no sentido que as "plantas restauradas" produziram pólen não viável (plantas estéreis masculinas não produzem pólen de todo). Foi observado que as linhagens restauradoras produzindo 50 ng ou mais de barstar por mg de proteína extraída foram capazes de completamente restaurar a fertilidade de todas as linhagens estéreis masculinas testadas, isto é, todas as plantas de progênie restauradas produziram pólen completamente viável e funcional, e fixação da semente normal após auto-polinização.

As linhagens restauradoras selecionadas foram também auto-polinizadas e panículos imaturos foram coletados das plantas de progênie transgênica. O nível de expressão, como determinado pela quantidade de barstar produzido, foi pelo menos igual a, e em muitas plantas maior do que determinado nos transformantes primários. Em geral, estas observações confirmam que o nível de expressão de barstar é estavelmente transmitido para as plantas de progênie.

Exemplo 5: Expressão de DNAs de barstar melhorado em plantas de milho Uma linhagem de milho estéril masculina, transgênica, designada como MS3, foi obtida essencialmente como descrito em WO 92/13956 usando um plasmídeo pVE108.

Vários plantas de milho restauradoras da fertilidade masculina, transgênicas, contendo o DNA de barstar tipo selvagem da SEQ ID No. 1 sob o controle do promotor TA29 (EP 344.029) ou o promotor CA55 (WO 92/13957) foram obtidas essencialmente como descrito em WO 95/34634. Em particular setes linhagens restauradoras foram obtidas pela transformação de milho com os plasmídeos pCOLlOO e pDEllO (WO 92/34634) que contém inter alia o promotor TA29 operativamente ligado ao DNA de barstar como descrito na SEQ ID No. 1. Quando cruzado para plantas MS3, a restauração foi incompleta em que maximamente 75% dos anteros produziram linhagem de pólen viável sendo especialmente difícil restaurar como boa restauração como obtido com outras linhagens de esterilidade masculina - dados não mostrados).

Similarmente, seis linhagens de milho restauradoras transgênicas foram obtidas pela transformação de milho com plasmídeo pH48 (juntos com plasmídeos selecionados de pCOL9S ou PLH52 ou p35S-Bperu ou pCOLll (WO 92/34634)). Estas linhagens restauradoras todas contém pelo menos o DNA de barstar sintético de Exemplo 2 (SEQ ID No. 3) sob o controle do promotor TA29. As seis linhagens restauradoras foram cruzadas para plantas MS3 e as quatro restaurações completas de linhagens restauradoras foram observadas. Uma destas quatro linhagens restauradoras foi designada como RZM583-0101. A linhagem MS3 transgênica foi polinizada pela linhagem transgênica RZM583-0101, e as plantas progênies contendo tanto o gene bamase quimérico como o gene barstar quimérico pela PCR triagem. Essas plantas progênies restauradas em sua fertilidade foram usadas para usadas para polinizar seda de plantas MS3. Dentre 90 plantas de progênie deste último cruzamento, 15 plantas foram identificadas (blot Southern quantitativo) homozigótico para o gene bamase quimérico de MS3. Entre estes, as plantas que não contém o gene barstar quimérico de RZM583-0101 eram estéreis masculinas, enquanto as plantas que continham o gene barstar quimérico de RZM583-01010 eram completamente férteis masculinas. Isto demonstra que a fertilidade das plantas contendo um gene bamase quimérico na condição homozigótica pode ser completamente restaurado por um gene barstar quimérico compreendendo o DNA de barstar sintético melhorado.

Assim, pode ser concluído que as linhagens restauradoras contendo o DNA de barstar sintético melhorado tem uma capacidade restauradora significantemente melhor. A quantidade de barstar em pendões imaturos (compreendendo microesporos no estado uninuclear) de plantas restauradoras de progênie foi determinada essencialmente como descrito no exemplo 3. Foi observado que a quantidade de proteína barstar foi significativamente maior nos pendões de plantas restauradoras contendo o melhorado DNA de barstar sintético do que as contendo o DNA de barstar tipo selvagem. Por exemplo, em uma planta contendo o DNA de barstar tipo selvagem, a quantidade de proteína barstar foi determinada como abaixo de 20ng de barstar/mg proteína total. Em contraste em duas linhagens contendo o DNA de barstar sintético melhorado, a quantidade de proteína barstar em pendões imaturos foi determinada como sendo respectivamente 210 e 100 ng de barstar /mg proteína total.

Exemplo 6: Atividade de barstar tipo selvagem e o barstar melhorado quando produzido em células de estame de colza de semente oleígena.

Plantas de colza de semente oleígena (cv. Drakkar) foram transformadas usando a transformação Agrobacterium mediada, com plasmídeos pTHWl 18 ou pTTS139. O plasmídeo pTHWl 18 contém o DNA de barstar tipo selvagem (SEQ ID No. 1) sob o controle do promotor TA29. O plasmídeo pTTS139 contém um DNA de barstar melhorado contendo um códon alanina GCC adicional entre a primeiro e segundo códon do DNA de barstar tipo selvagem. Assim o DNA de barstar em pTTS139 codifica a proteína barstar melhorada da SEQ ID No. 4.

Duas linhagens colza de semente oleígena transformadas com pTHWl 18, respectivamente designadas como DBN366-0011 e DBN366-0029, e as duas linhagens colza de semente oleígena transformadas com pTTS139, respectivamente designadas como DBN342-1010 e DBN367-0035 foram selecionadas para análise quantitativa.

Brotos de colza de semente oleígena com um comprimento de cerca de 3 a 4 mm foram isolados das plantas e foram esmagados em nitrogênio líquido. As proteínas foram extraídas, e a quantidade da proteína total extraída, assim como a quantidade de barstar detectável pelo blot Western, foi determinado, todos essencialmente como descrito no Exemplo 3. A Tabela 4 apresenta a quantidade da proteína total extraível (coluna 4) e a quantidade de barstar (coluna 2) encontrada em cada linhagem. A atividade barstar foi analisada essencialmente como descrito em Fitzgerald and Hartley (1993, supra). Para 660 μΐ de tampão TE (10 mM Tris/HCl pH 8,0; 1 mM EDTA) foi adicionado -20 μΐ de uma solução 0,02 Μ NH4 acetato pH 8,0 contendo 10 pg/ml albumina de soro bovino e 0,1 μg/ml bamase, -“x” μΐ de 1 em 5 diluições de proteínas extraídas dos brotos das flores (“x” é 0,4, 8, 12,16, 20, respectivamente).

Após misturar e esperar durante cerca de 1 minuto, 6 μΐ de um 1 em 10 diluições de uma solução de ação contendo 0,4 mg/ml de polietenoadenosinofosfato em tampão TE foi adicionado. A solução final foi misturada e transferida imediatamente a uma pequena cuba e o aumento em fluorescência foi registrada durante um a dois minutos.

Os valores do aumento inicial em fluorescência/minuto foram traçados em gráfico contra “x” (o volume de barstar contendo a solução). Em cada caso um relacionamento linear foi obtida, como esperado. O intercepto da linhagem de regressão com o eixo X foi calculado (Tabela 4, coluna 3): isto representa o volume de “x” que contém barstar suficiente para neutralizar completamente 2 ng de bamase (isto é o volume contendo uma quantidade molar de barstar que é equivalente com 2 ng bamase). Desta quantidade de barstar “ativo” nos brotos de flores (Tabela 4, coluna 5), assim como a proporção do barstar “ativo” a proteína total barstar pelo blot Western (Tabela 4, coluna 6)), pode ser determinado.

Destas relações pode ser deduzido que a atividade do barstar melhorado é pelo menos equivalente com de barstar tipo selvagem. Entretanto, nas linhagens transformadas com pTHWl 18 (expressando barstar tipo selvagem) a relação média é de 0,27 (divergência padrão 0,08). A diferença entre as relações médias para os dois tipos de linhagens é estatisticamente significante (t = -26, p< 0,005). Disto pode ser concluído que o barstar, quando produzido em brotos de flores de colza de semente oleígena geralmente resultará em um nível mais elevado do barstar ativo como comparado ao barstar tipo selvagem.

Todas as publicações citadas nesta aplicação são aqui incorporadas por referência. TABELA 1 a) +: indica que, na planta selecionada, o códon é um códon ótimo nesta planta, isto é, é um códon que tem nesta planta uma frequência que é pelo menos duas vezes a frequência do menos códon frequente e/ou que é pelo menos 50% da frequência dos códons mais usados naquela planta. A frequência de códons nas espécies das plantas é a dada (em por mil) por Ilemura (supra) -:indica que, na planta selecionada, o códon não é um códon ótimo nessa planta como definida acima b) aminoácido de que múltiplos códons existem (não o Trp, Met) c) o códon usado no DNA de barstar sintético da SEQ ID No. 3 para o aminoácido d) o número de aminoácidos codificados por este códon na SEQ ID No. 3 TABELA 2 a) Quantidade de barstar/50 pg de proteína carregada como determinado por blot Western. b) Atividade gus está em unidades arbitrárias. c) Barstar corrigida: ng barstar / unidades da atividade GUS. TABELA 3 TABELA 4 1) como determinado por blot Western 2) X-intercepto 3) quantidade total de proteína extraída de brotos de flores (isto é diluído 1 em 5 para teste de atividade barstar) 4) quantidade estimada de barstar ativo (cerca de 16,36 ng/ml de barstar é equimolar com 20 ng/ml bamase) 5) relação de barstar ativo (ver 4) ao barstar total (ver 1) acima).

Claims (10)

1. DNA caracterizado pelo fato de compreender um DNA de barstar codificando um barstar com uma sequência de aminoácido que começa com Met-Ala, em que dito DNA barstar compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ. ID. NO: 3.

2. DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido DNA de barstar é ligado de modo operativo a um promotor que dirige a transcrição em células de plantas.

3. DNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que referido promotor é um promotor que dirige a transcrição seletivamente em células de estame de uma planta.

4. DNA de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que referido promotor é um promotor que dirige a transcrição pelo menos em células de tapeto de uma planta.

5. DNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referido promotor é o promotor de gene TA29 de tabaco, o promotor de gene CA55 de milho ou o promotor do gene El, T72 ou T42 de arroz.

6. DNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que referido promotor é um promotor constitutivo.

7. DNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que referido promotor é promotor 35S.

8. Proteína de barstar, caracterizada pelo fato de ser codificada pelo DNA como definido na reivindicação 1.

9. DNA, caracterizado pelo fato de compreender um DNA de barstar, em que referido DNA de barstar tem a sequência de nucleotídeos da SEQ. ID. NO: 3 entre as posições 7 e 273, que é precedida por ATG.

10. Uso do DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 9, caracterizado pelo fato de ser para restaurar a fertilidade de uma linhagem estéril masculina, que é estéril masculina devido à expressão de um DNA de esterilidade masculina que codifica uma bamase.