JPH04500155A - メチオニン特異的アミノペプチダーゼ：ｍａｓ ｉおよびｍａｓ ｘの単離、精製および特性確認 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メチオニン特異的アミノペプチダーゼ：ＭＡＳ　ＩおよびＭＡＳＸの単離、精製 および特性確認 発明の分野 この出願は、アメリカ合衆国特許出願環０７／２３６９５７号（１９８８年８月 ２６日付）の一部継続出願である。

発明の背景 蛋白質合成は、常にメチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンにより開始される （ベンーバサット等、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」、１６９ニア５ ｌ−７５７（１９８７）、ジャーマン、Ｆ。

等、「パイオニ／セイズ」、３：２７−３１．（１９８５）、カベッチ、Ｍ、Ｒ ，、「バイオケミストリー」、５５：１５１７−１５２４（１，９６６）、これ らの参考文献を引用して説明の一部とする）。デホルミラーゼ酵素は、Ｎ−ホル ミル基の除去を触媒することにより、メチオニンを天然蛋白質のアミノ末端残基 として残す（アダムス、Ｊ、Ｍ、、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ ロジーＪ、３３：５７１−５８９（１９６８））。大部分の蛋白質において、ペ プチド結合の酵素仲介による翻訳後開裂か観察されている。前記ブロモ、７〉・ グには、シグナル分泌または局在ペプチド、Ｎ−末端アセチル化残基の開裂、ア ミノ末端メチオニン残基の特異的開裂等が含まれ得る（ベン〜バサット等、「ジ ャーナル・オブ・バタテリオロジーＪ、１６９ニア５ｌ−７５７（１９８７）） 。

蛋白質またはペプチドのＮ−末端および終わりから２番目の残基間のペプチド結 合を開裂し得る酵素は、「アミ／ペプチダーゼ」として知られている。それらの 酵素は、様々な微生物、例えばエシェリヒア・コリ、ハ千ルス・リケニホルミス 、バチルス・スブチリス、サルモ不う・千フィムリウムおよびマイコプラズマ・ サリバリウムにおいて同定されている（カーター、Ｔ、Ｈ，等、「ジャーナル・ オブ。

バクテリオロン−」、１５９：４５３−４５９（１９８４）、林、Ｓｏ、「ジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＪ、２５９：１０４４８ｉ０４５ ４（１９８４）、ベル１４スドルフ、Ｃ，Ｌ、、ｒバイオケミストリー」、１７ ：３３７０−３３７６（１９７８）、マクヒユー、Ｇ、Ｌ　、等、「ジャーナル ・オブ・バタテリオロジーＪ、１２０：３６４−３７１（１９７４）、ミラー、 Ｃ，Ｇ、等、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」、１３５：６０３−６１ １（１９７８）、シモンズ、Ｓｌ、「バイオケミストリー」、９：ｌ−８（１９ ７０）および柴田、Ｋ９等、「ジャーナル・オブ・バタテリオロジーＪ、１６９ ：３４０９−３４１３（１９８７））。

また、酵母および特に酵母サツカロマイシス・セレビシアエも、アミ／ペプチダ ーゼを含むことが見出された。例えば、トランブリー、Ｒ，Ｊ、等（「ジャーナ ル・オブ・バクテリオロジー」、１５６：３６−４８（１９８３））は、ロイシ ン含有ペプチドを開裂し得る酵母ロイシン・アミノペプチダーゼを同定した。酵 母ペプチダーゼは、アクステツタ−１Ｔ０等により概説されており（「イースト Ｊ、１：１３９−１５７（１９８５））、この参考文献を引用して説明の一部と する。

アミノ末端メチオニン残基の特異的開裂は、「メチオニン特異的アミノペプチダ ーゼ」と称する種類の酵素により触媒される。上記酵素は、ユシーリヒア・コリ ・メチオニン−特異的アミノペプチダーゼの同定を報告した（「ジャーナル・オ ブ・バクテリオロジー」、１６９ニア５ｌ−７５７（１９８７））ベンーバサッ ト等、および上記酵素の特性の理論的検討を与えている（「バイオエッセイズ」 、３：２７−３１（１９８５））ジャーマン、Ｆ６等により概説されている。

上述した通り、蛋白質は全てアミン末端メチオニン残基により最初に合成される か、この残基は内在性メチオニン特異的アミノペプチダーゼにより除去されるこ とが多い。アミノ末端メチオニンを除去し損ねると、蛋白質の特性が顕著に改変 され得る。例えば、アミノ末端メチオニンを含む組換えひと成長ホルモンは、受 容体の約３０％において免疫応答を誘導する。対照的に、アミノ末端メチオニン を除去すると、分子の免疫原性は低くなる。さらに、アミン末端メチオニン残基 を保持すると、蛋白質の溶解度、生物学的半減期、生物学的活性、立体配座等は 改変され得る。組換えＤＮＡ技術分野の方法に従い製造された蛋白質は、蛋白質 が天然に産生された場合にはメチオニン特異的アミノペプチダーゼにより除去さ れてしまうアミノ末端メチオニン残基を含み得ることが多いため、これらの考察 はこの分野にとって特別な関心事である。

すなわち、天然産生蛋白質および組換えＤＮＡ方法により生成された蛋白質の両 方を開裂し得るメチオニン特異的アミノペプチダーゼは非常に望ましい。

発明の要旨 この発明に従い、メチオニン残基のカルボキシル基および近接アミノ酸残基のア ミノ基間のペプチド結合を開裂し得るメチオニン特異的アミノペプチダーゼは、 単離され、実質的に精製されｌ；。従って、この発明は、上記酵素の精製、酵素 に関する用途および実質的に精製された酵素自体に関するものである。

詳しくは、この発明は、アミノ末端メチオニン残基、およびＡｌａ。

ＡＳｐＳＧｌｕ％Ｇｉｎ、　ＧｌｙＳＩ　ｌｅ、　Ｌｅｕｓ　ＬＹＳ％　Ｍｅｔ ＳＰｈｅ、　ＳｅｒおよびＴｈｒから成る群から選ばれた全ての終わりから２番 目のアミノ末端アミノ酸残基間のペプチド結合を開裂する能力を有する実質的に 精製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼ酵素を提供する。

また、この発明は、アミノ末端メチオニン残基、およびＶａＬ　ＡＩａ、　Ａｓ ｐ、　Ｇｌｕ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｙ、　Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、　ＳｅｒおよびＴｈｒ から成る群から選ばれた全ての終わりから２番目のアミノ末端アミノ酸残基間の ペプチド結合を開裂する能力を有する実質的に精製されたメチオニン特異的アミ ノペプチダーゼ酵素を含む。

また、この発明は、アミノ末端残基Ｘ（ただし、Ｘは、　ＬｅｕｌＰｈｅおよび Ｔｒｐから成る群から選ばれたアミン末端アミノ酸残基である）、およびペプチ ドの終わりから２番目のＩｌｅ残基間のペプチド結合を開裂する能力を有する実 質的に精製された基質特異的アミノペプチダーゼ酵素を含む。

この発明は、特に、ＭＡＳＩおよびＭＡＳＸである上記メチオニン特異的アミノ ペプチダーゼに関するものである。

また、この発明は、上記メチオニン特異的アミノペプチダーゼのいずれかをコー ドする遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む。

また、この発明は、アミノペプチダーゼ含有試料から実質的に精製されたメチオ ニン特異的アミノペプチダーゼを採取する方法であって、 （ａ）アミノペプチダーゼ含有試料から粗メチオニン特異的アミ、／ペプチダー ゼを採取し、 （ｂ）段階（ａ）からの粗メチオニン特異的アミノペプチダーゼをイオン交換ク ロマトグラフィーに付し、 （Ｃ）イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたメチオニン特異的アミノ ペプチダーゼを採取する 段階を含む方法に関するものである。

さらに、この発明は、追加的に、 （ｄ）段階（Ｃ）の採取されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼを水酸化リ ン灰石クロマトグラフィーに付し、そして（ｅ）水酸化リン灰石クロマトグラフ ィーにより精製されＩ；メチオニン特異的アミノペプチダーゼを採取する段階を 含む上記方法に関するものである。

さらに、この発明は、追加的に、 （ｆ）段階（ｅ）の採取されｔ；メチオニン特異的アミノペプチダーゼを、イオ ン交換クロマトグラフィーに付し、そして（ｇ）追加的イオン交換クロマトグラ フィーにより精製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼを採取する段階を 含む上記方法に関するものである。

また、この発明は、アミノ末端残基を含み、終わりから２番目のアミン末端アミ ノ酸残基として、Ａｌａ、　ＡｓｐＳＧｌｕ、　Ｇ１ｎ５Ｇｌｙ。

１１ｅ、　Ｌｅｕ％Ｌｙｓ、　ＭｅｔＳＰｈｅ、　ＳｅｒおよびＴｈｒから成る 群から選ばれたアミノ酸を含むペプチドからアミノ末端メチオニン残基を除去す る方法であって、ＭＡＳＩのメチオニン特異的アミノペプチダーゼの存在下でペ プチドをインキュベージジンすることにより、アミン末端残基を除去することを 含む方法を提供する。

また、この発明は、アミノ末端残基を含み、終わりから２番目のアミン末端アミ ノ酸残基として、ＶａＬ　Ａｌａ、　ＡｓｐＳＧｌｕＳＧｉｎ。

ＧＩＶｓ　Ｈｉｓ、　Ｐｒｏ、　ＳｅｒおよびＴｈｒから成る群から選ばれたア ミノ酸を含むペプチドからアミノ末端メチオニン残基を除去する方法であって、 ＭＡＳＸのメチオニン特異的アミノペプチダーゼの存在下でペプチドをインキュ ベージジンすることにより、アミノ末端残基を除去することを含む方法を提供す る。

また、この発明は、メチオニン特異的アミノペプチダーゼを固体支持体に固定す る上記方法の実施態様を包含する。

発明の詳細な記載 ■、この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼの単離および精製。

この発明によると、この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼの各々は、 酵素含有試料から単離され得る。メチオニン特異的アミノペプチダーゼは遍在す ると思われ、植物、動物および多細胞生物を含む全ての真核生物に見出される。

また、メチオニン特異的アミノペプチダーゼ活性を有する異なる酵素が厘核生物 に存在すると考えられる。従って、この発明はあらゆる細胞供給源を意図してい る。この明細書で使用されている、いずれかの酵素を含む試料を単に「試料」と 称す。この発明のメチオニン特異的アミノベプチダーゼのいずれか一方に特有で あるとして特記していなければ、ここに記載されている組換えＤ　Ｎ　Ａ方法を 用いることにより、この発明のアミノペプチダーゼのいずれかまたは両方をクロ ーン化および発現させることかできる。

この発明のメチオニ〉特異的アミノペプチダーゼの精製に関する下記本積におし ・て、アミノペプチダーゼの活性は好都合な方法により検定され得る。メチオニ ン特異的アミ７′ペプチダーゼ活性に関する好ましい検定法は次の通りである。

酵素活性は、基質とし、てペプチドＭｅｔ　−Ａ　Ｉａ　−Ｓｅｒを用（１で検 定され得る。前記検定では、クロマトグラフィー・カラムから集められに各フラ グ、ヨンからの１０２ｍのアリコートを、４ミリモルのＭｅｔ−Ａｌａ　−Ｓｅ ｒ、］　ＯミリモルのＨＥＰＥＳ−に＋、ｐＨ７，３５，０，２ミリモルのＣｏ Ｃｌ２．０．２モルのＫＣＩ、１．５ミリモルのＭ。

Ｃ１ｚ、０．０２％のＮａＮ３、ｌＯ＋ｕｇのＬ−アミノ酸オキシダーゼ、１１ ５μｇの西洋わさびベルオキシダーゼおよびｌＯμｇの０−シア４；シジン・ジ 塩酸塩を含む溶液４５μｍを含むマイクロタイター・プレートのラベルしたウェ ルに加える。これらの反応は室温で１時間行なわれ、４５０ｎｍまたは同じ＜４ １４ｎｍでの吸光度を記録する。

以後、この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼの単離および精製を酵母 試料からの場合について記載するが、他の試料でも供給材料として使用され得る ものと理解すべきである。

酵母細胞、好ましくはサツカロマイセス・セレビシアエを、適当な培地（好まし くはＹＰＤ培地：１％酵母抽出物、２％バタトーペプトン、２％グルコース）で ５−２０のＡ、。。に生長させる。細胞の製品を、後期対数（すなわち、１８− ２０のＡ６゜。）または、さらに好ましくは中期対数（すなわち、７−９のＡｓ ｏｏ）に生長させる。それらの製品は両方ともメチオニン特異的アミノペプチダ ーゼ活性を有することが見出されているが、中期対数細胞の製品から精製された ＭＡＳ　Ｉは、後期対数細胞から得られたＭＡＳ　Ｉとの共精製に見出される７ ００００ｄの汚染物質を欠くため、中期対数細胞の製品が好ましい。細胞を好ま しくは遠心分離により採取し、１５％グリセリンを含むＹ　Ｐ　Ｄ培地に再懸濁 する。次いで、細胞は一７０℃に冷凍され、さらに長い期間貯蔵され得る。

冷凍した細胞を、好ましくは３０℃水浴中でのインキュベーションにより解凍し 、室温で遠心分離により集める。沈澱した細胞を、リチカーゼを補足した適当な 緩衝液、例えばバ７アーＳ（１モルのソルビ］・−ル、５０ミリモルのトリス、 ｐＨ７，８，１０ミリモルのＭｇｃ＋、、３ミリモルのＤＴＴ）に再懸濁し、３ ０℃でインキュベーションすることｔこより、スフェロプラストが形成される。

次いで、スフェロプラストを集め、追加のバファーＳで洗浄し、溶菌し、低張性 緩衝液、例えはバフｙ−，Ａ（１０ミリモルのＨＥＰＥＳ−に＋、ｐＨ７，０， １，５ミリモルのＭｇＣｌ、、１０３９モルのＫＣＩおよび０．５ミリモルのＤ ＴＴ）中でホモジネートする。好ましくは、ホモジネート化は、ダウンス・ホモ ジナイザーを用いて４℃で行なわれる。酵母メチオニン特異的アミノペプチダー ゼは、穏やかに振り混ぜることにより細胞リゼイト中へ放出される。遠心分離に より屑を全て除去した後、グリセリンをリゼイトの上溝に加えることにょう（１ ０％最終濃度）、メチオニン特異的アミノペプチダーゼの安定性が高められる。

次いで、細胞リゼイトの上記上清を、ＰＭ−１Ｏｉｌ外ろ過膜の使用によりｌｏ Ｏｍｌに濃縮し、０．０５モルのＫＣＩを含ませるべく補足した適当な緩衝液、 例えばバファ−Ｈ（１０ミリモルのＨＥＰＥＳ−に＋１．）Ｈ７，３５，１，５ ミリモルのＭｇＣ１２，０，５ミリモルのＤＴＴ、０．２％ＮａＮ３．１０％グ リセリン）に対して透析する。

上溝に残留している細胞生体適合物質を除去することにより、後続段階における 蛋白質−生体適合物質の凝集を回避する。この処理についてはイオ〉交換クロマ トグラフィーが使用され得る。この段階において、使用されるイオン交換は、好 ましくはＣＭ−セファロース・クロマトグラフィーであり、最も好ましくは０， ０５モルＫＣＩと共にＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂを使用する。２カラム容量 の透析に使用したのと同じ緩衝液ｌこより、カラムを予め平衡状態にしておくの が好ましい。次いで、濃縮上清をカラムに適用し、１５−２０１１１１／時の割 合でバファーＨ中０．０５モル（２５０ｉ１〕〜０．５モル（２５０ｍ１）ＫＣ Ｉの一次勾配により溶離する。好ましくは２−）Ｏｍｌ、最も好まし、くは約５ ｍｌのフラクションを集める。フラクションに連続番号を付け、最初に集められ たフラクションをｒフラクション１」と命名する。

メチオニュ・特異的アミノペプチダーゼ活性は、典型的には７ラクシ、　＞４２ ないし４６、および５７ないし６７で見出される。これら２セントのフラクショ ンを別々にプールして、メチオニン特異的アミノペプチダーゼ含有製品を製造す る。プールしているフラクション４２−４６（平均伝導率〜６　、７　ｍｓ）に より形成された製品中のメチオニン特異的アミノペプチダーゼをｒＭＡＳ　ＸＪ と命名し、プールしているフラクション５７−６７（平均伝導率〜１１．１ｍ５ ）により形成された製品中のメチオニン特異的アミノペプチダーゼを［ＭＡＳ　 ＩＪと命名する。ＭＡＳＩおよびＭＡＳＸ製品は、好ましくはＰＭ−１０限外ろ 過膜を用いて濃縮される。

ＭＡＳ　＋含有製品は、水酸化リン灰石クロマトグラフィーを用いてさらに精製 され得る。濃縮したＭＡＳ　Ｉ製品を、適当な燐酸緩衝液（例えば、１０ミリモ ルの燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，１５，０，５ミリモルのＤＴＴ、５０ミリモ ルのＫＣＩ、１０％グリセリン、０．０２％ＮａＮ　３を含むＰＰバ７アー）に 対して透析し、予めＰＰバフア−に対して平衡状態にしておいた水酸化リン灰石 カラムに適用する。適用した物質を、０．０１モル（２５０ｍ１）−０，５モル ＰＰバファーの一次勾配によりカラムから溶離する。４−５ｍ１のフラクション を集め、メチオニン特異的アミノペプチダーゼ活性について検定する。上記活性 を有するフラクション（代表的にはフラクション９５−１０５、平均伝導率−２ ７，１ｍ５）をプールし、ＰＭ−１０＠外ろ過膜を用いて５ｍｌの容量に濃縮す る。プールしたＭＡＳ　Ｉフラクションを、好ましくは第２のＣＭ−セファロー スＣＬ−６Ｂカラムを用いてさらに精製する。

上記水酸化リン灰石クロマトグラフィーからの濃縮溶離液を、バファ−Ｈ（０， ０５モルＫＣＩを含ませるべく補足）に対して透析し、ＣＭ−セファロース・カ ラム（好ましくはＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ）に適用する。次いで、適用し た物質をインクラティックに、またはさらに好ましくは、約１５１５−２Ｏ／時 の割合でバファーＨ中０，０５モル（２５０１＋１１）−０，５モル（２５０ｍ １）ＫＣＩの一次勾配の使用により溶離する。約４ｍＩのフラクションを集め１ ．メチオニン特異的アミノペプチダーゼ活性について検定し、上記活性を有する フラクションをプールする。典型的には、７ラクシヨン１０３−１１１（平均伝 導率〜１４．０ｍ５）は上記活性を含んでいた。メチオニン特異的アミノペプチ ダーゼ活性を有するフラクションは、ＰＭ−１０限外ろ過膜を用いて濃縮され得 る。

この一連のクロマトグラフィ一段階を用いて、中期対数相で採取された細胞から （すなわち、約８のＡ６゜。での細胞から）酵母メチオニン特異的アＥ　、／ペ プチダーゼＭＡＳ　Ｉをほぼ均質に精製した。

精製試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルは、クーマシー・ブルーで染色し たときＭＡＳＩが見かけ上の分子量約４１０００の単一バンドとして移動するこ とを示している。１０％ゲルを用いたラエムリ、Ｕ、に、の方法（「ネイチャー 」、２２７：６８０−６８５（１９７０））に従い、電気泳動を遂行した。４５ ．６６．９７．１１６および２０５ｋｄ分子量の標準蛋白質を用いて、ゲルを較 正した。ＭＡＳ　Ｉを後期対数段階で採取した細胞から（すなわち、Ａ６゜。が １８−２０での細胞から）精製した場合、最終製品は、ＭＡＳ　Ｉおよび見かけ 上の分子量７００００の単一汚染物質しか含まないことが見出された。

ペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質という語は、全てアミノ酸残基のポリマー を指すものとする。ペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した少なくとも ２個のアミノ酸残基を有するポリマーである。ポリペプチドは、ペプチド結合に より互いに結合した幾つかのアミノ酸残基を有するポリマーである。蛋白質は、 ペプチド結合により互いに結合した多数のアミノ酸残基ををする大型ポリマーで ある。

この明細書で使用されている「アミノペプチダーゼ」という語は、ペプチド（ま た、すなわち、ポリペプチドよ！：は蛋白質）のアミン末端アミノ酸残基を、そ のペプチド（またはポリペプチドまたは蛋白質）の終わりから２番目のアミノ末 端アミノ酸残基に連結するペプチド結合を攻撃および開裂し得る酵素を包含する ものとする。

この発明のアミノペプチダーゼは、「メチオニン特異的アミノペプチダーゼ」ま たは「基質特異的アミノペプチダーゼ」と呼ばれる。

アミノペプチダーゼは、（１）それがペプチドまたは蛋白質からアミン末端メチ オニン残基を開裂し得る場合、および（２）アミノ末端メチ；引二ン残基全有す るペプチドまたは蛋白質がアミノペプチダーゼの好ましいまたは唯一の基質であ る場合、「メチオニン特異的」であると言われる。アミノペプチダーゼは、ある 種のペプチドまたは蛋白質のみ（すなわち、どのペプチドまたは蛋白質でもよい とは限らない）か酵素基質として機能し得る場合、「基質特異的」であると言わ れる。それらの適当な基質は、ペプチド結合により連結されている特定のアミ、 ／末端および終わりから２番目のアミノ末端残基を有する。アミ、ｙペプチダー ゼの基質特異性は、それが特定基質を開裂できるか否かにより規定される。この 発明のアミノペプチダーゼの基質特異性は下記の通りである。

この発明は、「実質的に純粋」であるか、または「実質的に精製」されたアミン ペプチダーゼ酵素に関するものである。この明細書で使用されている「実質的に 純粋な」または「実質的に精製された」という語は、均等内容であり、天然状態 の酵素に通常随伴する化合物、すなわち蛋白質、炭水化物、脂質等を実質的に含 まないアミノペプチダーゼの記載を意図している。さらに、この語は、当業界の 熟練者が使用する純度または均質性の検定法の１種またはそれ以上により均質と されたアミノペプチダーゼの記載を意図している。例えば、実質的に純粋なアミ ノペプチダーゼは、例えば分子量、クロマトグラフィー技術等といったパラメー ターに関する標準実験偏差範囲内に含まれる一定かつ再生可能な特徴を示す。し かしながら、「実質的に純粋な」という語は、酵素と他の化合物との人工的また は合成的混合物を排除するわけではない。また、この語は、酵素の生物学的活性 を妨害せず、例えば不完全な精製故に存在し得る不純物の存在を排除するわけで はない。

■、この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼＭＡＳ　１およびＭＡＳＸ の特性検定。

ＭＡＳ　＋の分子量。

精製試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルは、クーマン−。

ブルーで染色したときに、ＭＡＳＩが見かけ上の分子量約４１０００の単一バン ドとして移動することを示している。１０％ゲルを用いたラエムリ、ｔＪ、に、 の方法（「ネイチャー」、２２７：６８０−６８５（１９７０））に従い、電気 泳動を行った。ゲルをクーマシー・ブルーで染色した。４５．６６．９７．１１ ６および２０５ｋａ分子量の標準蛋白質を用いて、ゲルを較正した。ＭＡＳ　Ｘ の見かけ上の分子量は測定されなかった。

基質特異性。

３６種の純粋ペプチドのセントを用いて、ＭＡＳＩおよびＭＡＳＸの基質特異性 の部分的測定を行った。これらのペプチドは、２種の配列： （＋）ＭＥＴ−Ｘ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＴＨＲまグこは（ＩＩ）Ｘ−ＩＬ Ｅ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＴＨＲ［式中、「Ｘ」は、次の１８種のアミノ酸：Ｖａ１ ％Ａｈａ、　ＡｒｇＸＡｓｐ。

Ｃ７５％　Ｇｔｕ、　Ｇｌｎ、　ｃｉｙ、　Ｈｉｓ、Ｉ　ｌｅＳＬｅｕＳＬＹＳ ＳＭｅｔ、Ｐｈｅ。

Ｐｒｏ、　Ｓｅｒ、　ＴｈｒおよびＴｒｐのうちの一つを指す］のいずれかを有 していた。

ＭＡＳ　Ｉは、群（■）（ただし、ｒ）Ｊは、Ａｌａ、　ＡＳｐｓ　Ｇｌｕｓ　 Ｇｌｎ。

ＧＩＹＳＩ　Ｉｅ、　Ｌｅｕ、　ＬｙｓＳＭｅｔ、　Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈ ｒである）のペプチドを開裂し得ることが見出されｔ；。群（１）の他の試験ペ プチドはＭＡＳ　ｌにより開裂され得なかった。ＭＡＳ　Ｉは、群（１１）のＭ ｅｔ−含有ペプチドのみを開裂することができた。それは、試験されｆ二群（１ １）の他のペプチドを全く開裂し得なかった。

ＭＡＳＸは、群（ＩＸｒ二だし、ｒＸＪは、Ｖａｌ、Ａ　ｌａ、　Ａ　Ｓ＋）％ 　Ｇ　Ｉｕ。

Ｇｌｎ、　Ｇａｙ、　Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである）のペプチド を開裂し得ることか見出された。群（１）の他の試験ペプチドは開裂され得なか った。ＭＡＳ　Ｘは、群（ＩＩＸただし、「Ｘ」は、Ｌｅｕ％Ｍｅｔ、Ｐｈｅま たはＴｒｐである）のペプチドを開裂することができた。試験されＩ；群（１１ ）の他のペプチドは全く開裂され得なかつｔ；。

ＩＩｌ、　ＭＡＳ　１およびＭＡＳ　Ｘ（７）遺伝子工学。

実質的に精製されたＭＡＳ　ＴまたはＭＡＳ　Ｘ活性を含むフラクションの同定 により、これらの酵素のアミノ酸配列が決定され得、さらに、組換えＤＮＡ技術 の適用により、これらの分子を生成させることができる。すなわち、この発明は 、実質的に精製されたＭＡＳｌおよびＭＡＳＸおよびそれらの使用方法を含むだ けでなく、これらの酵素のアミノ酸配列、これらの酵素をコードする遺伝子配列 、それらの遺伝子配列を含むビヒクル、それにより形質転換された宿主、形質転 換宿主での発現による酵素生産、およびメチオニン含有ペプチドまたは蛋白質の 開裂における酵素の用途をも包含する。

ＭＡＳ　Ｉは、二の発明の好ましいメチオニン特異的アミノペプチダーゼである 。

酵素のアミノ酸配列を得るために、実質的に精製されたフラクションにおける酵 素を、ポリアクリルアミド・ゲルからの電気溶離により採取する。次いで、採取 された分子を、好ましくは自動Ｖ−ケ不−夕〜を用いて配列決定することにより 、酵素のアミノ酸配列が決定され得る。

別法として、そしてさらに好ましくは、酵素のアミノ酸配列は、酵素をコードす る遺伝子のＤＮＡまたはざらに好ましくはｃＤＮＡ配列の分析により決定される 。これらの核酸配列を得るため、ＭＡＳＩまたはＭＡＳ　Ｘ遺伝子またはｃＤＮ Ａ配列を含む供給源を、ＭＡＳ　ＩまたはＭＡＳＸ酵素の７ラグメントをコード するオリゴヌクレオチド・プローブによりスクリーニングする。

オリゴヌクレオチド・プローブを製造するためＩこ、実質的に精製されｊ；酵素 を採取し、臭化シアンまたはプロテアーゼ、例えばパパイン、キモトリプシン、 トリプシン等により（小池、Ｙｌ等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリーＪ、２５７：９７５１−９７５８（１９８２）、リウ、Ｃ９等、「イ ンターナショナル・ジャーナル・オブ・ベブタイド・アンド・プロティン・リサ ーチ」、２１：２０９−２１５（１９８３））切断する。生成したペプチドを好 ましくは逆相ＨＰＬＣにより分離し、アミノ酸配列決定処理に付す。

この作業を遂行するため、ペプチドを好ましくは自動式シーケ不一ターにより分 析する。

一旦１つまたはそれ以上の適当なペプチド・７ラグメントの配列が決定されると 、それらをコードし得るＤＮＡ配列が調べられる。

ペプチドが１０アミノ酸長より大きい場合、この配列情報は、一般に、遺伝子配 列、例えばこの発明の酵素をコードする遺伝子配列のクローン化を可能にするの に充分なものである。しかしながら、遺伝子フードは同義性であるため、特定ア ミノ酸をコードするのに複数のコドンか使用され得る（ワトソン、Ｊ、Ｄ、、ｒ モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン」、第３版、Ｗ、Ａ　、ベンジ ャミン、インコーホレイテッド、メンロパーク、カリフォルニア、（１９７７） 、３５６−３５７頁）６遺伝子コードを用いると、１つまＩ；はそれ以上の相異 なるオリゴヌクレオチドが同定され得、その各々は酵素ペプチドをコードするこ とができる。事実、特定のオリゴヌクレオチドが現実の酵素フラグメント暗号化 配列を構成する可能性は、真核生物細胞における異常な塩基対形成関係および特 定コドンが実際に使用される（特定アミノ酸をコードするｔ；め）頻度を熟慮す ることにより推定され得る。上記「コドン使用規則」は、レーダ、Ｒ１等による Ｆジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ、１８３：１−１２（１９ ８５）に開示されている。し〜ズの「コドン使用規則Ｊを用いると、酵素フラグ メントのペプチド配列をコードし得る理論上「最も可能性の高い」ヌクレオチド 配列を含む単一オリゴヌクレオチドまｔ；は−組のオリゴヌクレオチドが同定さ れる。

オリゴヌクレオチドの合成技術は、例えばウー、Ｒ５等、プログレス・イン・ヌ クレイツク・アシッド・リサーチ・アンド・モレキュラー・バイオロジー、２１ ：ｌ０ｌ−１４１（１９７８）に開示されている、上記方法による組換え分子の 構築方法は、マニアチス、Ｔ。

等、「モし・キュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル」、コー ルド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・バーバー、ニュ ーヨーク（１９８４）に開示されており、この参考文献を引用して説明の一部と する。

アミノ酸配列は単一のオリゴヌクレオチドのみによりコードされることもあり得 るが、多くの場合、アミノ酸配列は、１セツトの類似オリゴヌクレオチドのいず れかｔこよりコードされ得る。、！要なことに、このセットの構成員は全て、ペ プチド・フラグメントをコードし得るオリゴヌクレオラドを含む、すなわち、潜 在的にペプチド・フラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配 列を含むが、このセットのうちの一橋成員だけが遺伝子のヌクレオチド配列と同 一のヌクレオチド配列を含む。この構成員はこのセット内に存在し、セ・トの他 の構成員の存在下でもＤＮＡとハイブリダイゼーションし、得るため、単一オリ ゴヌクレオチドを用いてペプチドをコードすｂ遺伝子をクローン化する場合と同 じ方法ですリボヌクレオチドの非断片状セットを用いることが可能である。

酵素フラグメント・ペプチドをコードし得る理論上「最も可能性の高い」配列を 含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを用いることにより 、「最も可能性の高い」配列または配列のセットとハイブリダイゼーションし得 る相補的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオラドのセットの配列が同定さ れる。上記の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして用いること により、酵素をコードする遺伝子配列を同定および単離することができる（マニ アチス、Ｔ９等、「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュア ルｊ１　コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハ ーバ−、ニューヨーク（１９８２））。

ＤＮＡプローブは、検出可能な基により標識され得る。その検出可能な基は、検 出可能な物理的または化学的特性を有するものであればいずれの物質でもよい。

上記物質は免疫検定分野で既に充分開発されており、一般に、上記方法で有用な 標識であれば殆ど全てこの発明に適用され得る。特に有用なのは、酵素活性基、 例えば酵素（「クリニカル・ケミストリー」、２２：１２４３（１９７６）参照 ）、酵素基質（イギリス国特許明細書第１５４８７４１号参照）、補酵素（アメ リカ合衆国特許第４２３０７９７号および同第４２３８５６５号参照）、酵素阻 害剤（アメリカ合衆国特許第４１３４７９２号参照）、蛍光剤（「クリニカル・ ケミストリー」、２５：３５３（１９７９）参照）、発色団、発光剤、例えば化 学発光剤および生物発光剤（「クリニカル・ケミストリー」、２５＋５１２（１ ９７９）参照）、特異的結合可能リガンド、近接相互作用対、並びに放射性同位 元素、例えば３）（、３ＳＳ、　３２Ｐ、　＋２５１および１４ｃである。それ らの標識および標識対は、それら自体の物理的特性（例、蛍光剤、発色団および 放射性同位元素）またはそれらのり応もしくは結合特性（例、酵素、基質、補酵 素および阻害剤）に基づいて検出される。例えば、コファクター標識プローブは 、標識がそのコファクターおよび酵素基質といった関係にある酵素を加えること により検出され得る。例えば、基質に作用して測定可能な物理的特性を伴う産物 を生成させる酵素が使用さね得る。後者の例としては、ベーターガラクトシダー ゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼがあるが、これらに限定 されるわけではない。

酵素をコードする遺伝子配列のフラグぜントをコードし得る適当なオリゴヌクレ すラドまｔ二はオリゴヌクレオラドの七ノド（まｔ二はそのオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチドのセットに相補的なもの）を、（上記方法を用いて） 同定し、合成し、当業界でよく知られｊ：手段により、酵素を発現し得る細胞か ら誘導されたＤＮＡまたはさらに好ましくはｃＤＮＡ製品に対してハイブリダイ ゼーションする。「最も可能性の高い」酵素ペプチド暗号化配列に相補的な１本 鎖オリゴヌクレオチド分子は、当業界の通常熟練者に周知の方法を用いて合成さ れ得る（ベラガージェ、Ｒ８等、［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー」、２５４＋５７６５−５７８０（１９７９）、マニアチス、Ｔ９等、「 モレキュラー・メカニズムス・イン・ザ・コントロール・オブ・ジーン・エクス プレッション」、ナイアリソチ、Ｄ、Ｐ、等編、アカデミツク・プレス、ニュー ヨーク（］９７６）、ウー、Ｒｏ等、プログレス・イン・ヌクレイツク・アシッ ド・リサーチ・アンド・モレキュラー・バイオロジー、２１：１０１、−１４１ （１９７８）、コーラナ、Ｒ，Ｇ、、「サイエンス」、２０３：６１４−６２５ （１９７９））。さらに、ＤＮＡ合成は、自動式シンセサイザーの使用により達 成され得る。核酸ノ・イブリダイゼーション技術は、マニアチス、Ｔ９等（「モ レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル」中、コールド・ス プリング・／＼−バー・ラボラドリース、コールド・スプリング・／）−バー、 ニューヨーク（１９８２））およびハイメス、Ｂ、Ｄ、等（「ヌクレイツク・ア ンノド・ハイプリダイ七−ンヨン、ア・プラクティカル・アプローチ」中、ＩＲ Ｌプレス、ワシントンＤ、Ｃ，（１９８５））により開示されており、これらの 参考文献を引用して説明の一部とする。

ＭＡＳ　ＩまたはＭＡＳＸをコードするＤＮＡ配列は、様々な供給源から誘導さ れ得る。例えば、いずれかの酵素をコードするｍＲＮＡは、酵素を生成する種類 の組織から単離され、ノーザン・プロ・ノド方法（アルワイン等、「メソッズ・ イン・エンザイモロジー」、６８：２２０−２４２（１９７９））および標識オ リゴヌクレオチド・グローブの使用により同定され得る。次に、ｍＲＮＡは、当 業界の熟練者に周知の技術によりｃＤＮ、Ａに変換され得る。プローブは、上記 ＭＡＳ　Ｉの既知アミノ酸配列に基づいて合成され得る。次いで、ｍＲＮＡは、 技術によりｃＤＮＡに変換され得る。別法として、ゲノムＤＮＡが単離および使 用され得る。使用されるＤＮＡまたはｃＤＮＡの供給源は、好ましくは酵素をコ ードする遺伝子配列について濃縮されている。上記濃縮は、高レベルの酵素を製 造する細胞、例えば酵母細胞からＲＮＡを抽出することにより得られたｃＤＮＡ から最も容易に達成され得る。そのような細胞の一例は、サツカロマイシス・セ レヒシアエ細胞である。

様々な方法のうちのいずれかを用いて、この発明の酵素をコードする遺伝子配列 をクローン他側ることができる。それらの方法の一つは、酵素をコードし得る遺 伝子配列を含む挿入体の存在に関する（この発明の酵素を発現する細胞から誘導 された）ｃＤＮＡ挿入体のシャトルベクター・ライブラリーの分析を必要とする 。そういった分析は、ベクターにより細胞をトランスフェクションし、次いで酵 素発現について検定することにより行なわれ得る。

この発明の酵素のいずれかをコードし得る遺伝子配列を同定村よびクローン化す るため、ＤＮＡまたはさらに好ましくはｃＤＮＡのライブラリーを、上記オリゴ ヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼーション能力についてスクリーニン グする。適当なりＮＡ製品（例えば、ひとゲノムＤＮＡ）を酵素的に開裂、また は無作為にせん断し、組換えベクターにライゲーションする。次いで、上記オリ ゴヌクレオチド・プローブに対するこれらの組換えベクターの／％イブリダイゼ ー７３ン能力を測定する。上記ハイブリダイゼーシヨンを行い得ることが見出さ れｔ；ベクターを分析することにより、それらが含む酵素配列の範囲および性質 を測定する。純粋に統計的考察に基づくと、この発明の酵素のいずれかをコード し得る遺伝子配列は、１８個のヌクレオチドしかもＩ；ないオリゴヌクレオチド ・プローブを用いることにより明白に（）１イブリダイゼーシヨン・スクリーニ ングによる）同定され得る。

この発明の酵素をコードする遺伝子配列の別のクローニング方法では、ＤＮＡま たはさらに好ましくはｃＤＮＡ（酵素を発現し得る細胞に由来）を発現ベクター へクローニングすることにより、発現ベクターのライブラリーを製造する。次い で、酵素特異的抗体に結合し、酵素と同しアミノ酸配列を有するポリペプチドま たはそのフラグメン１−１−コードし得るヌクレオチド配列を有する蛋白質を発 現し得る成分について、上記ライブラリーをスクリーニングする。この実施態様 では、酵素を発現し得る細胞から、ＤＮＡまたはさらに好ましくはｃＤＮＡを抽 出および精製する。精製したｃＤＮＡを断片化して（せん断、ユノドヌクレアー ゼ消化等により）、ＤＮＡまたはＣＤＮＡフラグメントのプールを製造する。次 に、このプールからのＤＮＡまたはＣＤＮＡフラグメントを発現ベクターへクロ ーン化することにより、構成成分が各々特有のクローン化ＤＮＡまたはＣＤＮＡ フラグメントを含む発現ベクターのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを製造す る。

すなわち、要約すると、この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼを同定 することにより、これらの酵素のペプチド配列をコードし、得る理論上「最も可 能性の高いＪＤＮＡ配列または上記配列のセントが同定され得る。この理論的配 列に相補的なオリゴヌクレオチドを構築することにより（または「最も可能性の 高いｊオリゴヌクレオチドの七ノドに相補的なオリゴヌクレオチドのセントを構 築することにより）、プローブとして機能することによりこの発明の酵素のいず れかをコードし得る遺伝子配列を同定および単離させ得るＤＮＡ分子（またはＤ ＮＡ分子のセット）が得られる。

例えば上記の技術またはそれらに類似した技術により、ひとアルデヒド・デヒド ロゲナーゼ（ゲス、Ｌ、Ｃ，等、「ブロン−ディ〕・ゲス・オフ・ザ・す’＞Ｍ ナル・アカデミ−・オフ・サイエンレース・オフ・ザ−：ｘ−−−−ｒＺ　−ニ ーＪ、８２：３７７ｉ３７７５（１９８５））、フィブロネタチン（鈴木、Ｓｏ 等、Ｅｕｒ、　Ｍｏｂ　Ｂｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、Ｊ　。

４：２５１９−２５２４（１９８５））、ひとエストロゲン・レセプター遺伝子 （つτルター、Ｐｌ等、「ブａシープ１ングス・オフ・ザ・丈／ヨナル・アカデ ミ−・才ブ・サイエンレース・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー、］、］８２ニア８ ８９−７８９３１９８５））、ティッンユータイブ・プラスミノゲン活性化因子 （ペン二カ、Ｄ５等、「ネイチャーｊ、３０１：２１４−２２１（１９８３）） およびひとターム・ブラセンタル・アルカリ性ホスファターゼ相補的ＤＮＡ（カ ム、Ｗ、等、「プロシーディンゲス・オフ′・ザ・す７ヨナル・アカデミ−・オ フ・サイエンレース・オフ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ、８２：８７１５−８７＋ ９（１９８５））における遺伝子のクローニングが成功した。

■、メチオニン特異的アミノペプチダーゼ暗号化配列の発現。

ＭＡＳ＋またはＭＡＳ　Ｘ酵素をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を、発現 ベクターへ機能し得るように結合し、宿主細胞へ導入することにより、前記細胞 ＩこよるＭＡＳ　ＩまたはＭＡＳ　Ｘ酵素の発現が可能となり得る。２つのＤＮ Ａ配列（例えば、プロモーター領域配列および所望の酵素暗号化配列）間の結合 の性質が、（１）結果的にフレームシフト・突然変異の導入を誘発せず、（２） 所望の酵素暗号化遺伝子配列の転写を指示するプロモーター領域配列の能力に干 渉せず、または（３）プロモーター領域配列により転写される所望の酵素遺伝子 配列の能力に干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は機能し得るように結合してい ると言われる。

ＭＡＳ　ＩをコードするＤＮＡ配列は、ライゲーションを行うためのプラント末 端またはスタガー末端形成、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適当とさ れる付着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリ性ホスファタ ーゼ処理および適当なりガーゼとのライゲーションを含む慣用的技術に従いベク ターＤＮＡにより組換えられ得る。

この発明には、原核生物または真核生物細胞における所望の酵素の発現が含まれ る。好ましい真核生物宿主としては、酵母、真菌（特に、アスペルギルス）、イ ンビボまたは組織培養でのは乳類細胞（例えば、ひとまたは霊長類細胞）がある 。酵母はこの発明の好ましい宿主である。

また酵母かグリコジル化を含む翻訳後ペプチド修飾を行い得るという点で、酵母 の使用は実質的な利益を提供する。酵母における所望の蛋白質の製造に使用さね 得る強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する若干の組 換えＤＮＡ！略が存在する。酵母は、クローン化されたは乳類遺伝子産物上のリ ーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわち、プレーペプチ ド）を分泌する。は乳類細胞は、正確な部位における正確な折り畳みまたはグリ コ〉ル化を含む翻訳後修飾を蛋白質分子ｌこ加える。宿主として有用であり得る は乳類細胞には、線維芽細胞に由来する細胞、例えはＶＥＲＯまｔ；はＣＨＯ− ＫＩおよびそれらの誘導体がある。は乳類宿主の場合、所望の酵素の発現には幾 つかの可能なベクター系が利用可能である。宿主の性質Ｉこ従い、広い範囲の転 写および翻訳調節配列が使用され得る。転写および翻訳調節シグナルは、調節シ グナルか高レベルの発現性を有する特定遺伝子を随伴しているウィルス供給源、 例えばアデノウィルス、うしパピローマウィルス、サルウィルスなどから誘導さ れ得る。別法として、は乳類発現産物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン 等からのプロモーターが使用され得る。抑制または活性化を行わせる転写開始調 節シグナルが選択され得、その結果、遺伝子発現が変調され得る。興味深いのは 、温度を変えることにより発現が抑制または開始され得ることから温度感受性で あるか、または化学的調節に付された（例、代謝物）調節シグナルである。

真核生物宿主における所望の酵素の発現は、真核生物調節領域の使用を必要とす る。一般に、それらの領域は、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに充分なプロモー ター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには、マウス・メタロチオネイ ンＩ遺伝子のプロモーター（ヘイマー、Ｄｌ等、ジャーナル・オフ・モレキュラ ー・アンド・アプライド・ンエ不ティノクス　］：］２７３−２８８１９８２） ）、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（マクナイト、ｓ、等、「セル」、３ １：３５５−３６５（１９８２））、５Ｖ４Ｑ初期プロモーター（ヘノイスト、 Ｃ１等、「ネイチャー」（ａノド））、２９０：３０４−３１０（１９８１）） 、酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（ジョーンストン、Ｓ、Ａ、等、「ブロシー デインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンンーズ・オフ ・ザ・ニー・ニス・ニー」、７９：６９７１−６９７５（１９８２）、・二、ル バー、Ｐ、Ａ、等、「ブロンーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイユ〉シーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー」、８１：５９５１−５ ９５５（１９８４））かある。

広く知られているように、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコー ドするコドンから開始される。この理由により、真核生物プロモーターおよび所 望の酵素（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列間の結合が、メチ オニンをコードし得る介在コドン（すなわち、ＡＵＧ）を−切含まないことを確 実にするのが好ましい。それらのコドンが存在すると、融合蛋白質が形成される （ＡＵＧコドンか所望の酵素暗号化ＤＮＡ配列と同じリーディング・フレームに 存在する場合）か、またはフレームソフト突然変異（ＡＵＧコドンが所望の酵素 暗号化配列と同じリーディング・フレームには存在しない場合）が生じる。

好ましい原核生物宿主としては、細菌、例えばエシェリヒア・コリ、バチルス、 ストレプトマイシス、７・ニードモナス、サルモネラ、セラチア等かある。最も 好ましい原核生物宿主はエシェリヒア・コリである。特に興味深い細菌宿主とし ては、エシェリヒア・コリに１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、ニジエリｌ ニア−）すｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、エシェリヒア・コリＷ３１１０ （Ｆ−、ラムダ−、プロトトロフィック （例えば、サルモネラ・チフイムリウムまたはセラチア・マルセセンス）、およ び様々な種類のシュードモナスがある。原核生物宿主は、発現プラスミドにおい てレプリコンおよび制御配列と適合するものでなけれはならない。

原核生物細胞（例、エシェリヒア・コリ、バチルス・スブチリス、シュードモナ ス、ストレプトマイシス等）において所望の酵素（またはその機能的誘導体）を 発現させるために、所望の酵素暗号化配列を機能的原核生物プロモーターに機能 し得るように結合させることが必要である。それらのプロモーターは、構成性ま たはさらに好ましくは調節可能（すなわち、誘導可能または抑制解除可能）であ り得る。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモー ターおよびｐＢＲ３２２のβーラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター等かあ る。誘導可能原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージλの主た る左および右プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、工，ニリヒア・コリのｔｒｐ， 　ｒｅｃＡ，　ＩａｃＺ，　ｌａｃＬ　ｇａｌおよびｔａｃプロモーター、α− アミラーゼ（ウルマネン、■．等、［ジャーナル・オフ・バタテリオロジー」、 １６２：１７６−１８２（１　９８５））、バチルス・スブチリスのσー２８ー 特異的プロモーター（ギルマン、Ｍ．Ｚ．等、「ジーン」、３２：ｌ　ｌ−２０ （１　９８４））、バチルスのバクテリオファージのプロモーター（グリチャン 、Ｔ．Ｊ．、ｒザ・モレキュラー・バイオロジー・オフ・ザ・バチリ」中、アカ デミ・ツク・プレス、イ〉・コーホレイテッド、ニューヨーク（１９８２））お よびストレプトマイシス・プロモーター（ワード、Ｊ．Ｍ．等、「モレキュラー ・アンド・ジニネラル・ジェ不ティックスＪ、２０３：４６８−４７８（１９８ ６））がある。原核生物プロモーターは、グリ・ツク、Ｂ．Ｒ．（ジャーナル・ オフ・インダストリアル・マイクロバイオロジー　１．：２７７−２８２（１　 ９８７））、セナテイエンポ、Ｙ．（「ビオキミー」、６８：５０５−５１６（ １９８６））およびゴソテスマン、Ｓ．（ｒアニュアル・レビュー・オフ・ジエ ネテイクスＪ、１計４　１　５−４４２（１　９８４））により概説されている 。

まｊ；、原核生物細胞における正しい発現は、遺伝子暗号化配列から上流におけ るリポソーム結合部位の存在を必要とする。上記リポソーム結合部位は、例えば ゴールド、Ｌ．等（「アニュアル・レビュー・オノ・マイクロバイオロジー」、 ３５：３６５−４０４（１　９８１））により開示されている。

所望の酵素暗号化配列および機能し得るように結合したプロモーターは、線状分 子またはさらに好ましくは閉鎖共有結合環状分子であり得る、非複製性ＤＮＡ（ またはＲＮＡ）分子として受容体の原核生物または真核生物細胞へ・導入され得 る。それらの分子は自律複製能力をもグ：なＣ・ため、所望の酵素の発現は、導 入された配列の一時的発現を通して行なわれ得る。別法として、永続的発現は、 宿主染色体へ導入された配列の組み込みにより行なわれ得る。

一実施態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体へ組み込み得るベクターか 使用される。導入されたＤＮＡをそれらの染色体へ安定した状態で組み込んだ細 胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１種またはそれ以上のマ ーカーを導入することによっても選択され得る。マーカーは、宿主における栄養 要求性（例えば１ｅｕ２またはｕｒａ３、これらは共通の酵母栄養要求性マーカ ーである）、生物致死剤耐性、例えば抗生物質または重金属、例えば銅などを補 足し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接結 合されるか、または同時トランスフェクションにより同細胞へ導入され得る。

好ましい実施態様では、導入された配列は、受容体宿主において自律的に複製し 得るプラスミドまたはウィルス・ベクターへ組ミ込まれる。この用途に対して、 広い範囲のベクターのいずれかが使用され得る。特定プラスミドまたはウィルス ・ベクターの選択における重要な因子ｔ＝は、ベクターを含む受容体細胞が認識 され、ベクターを含まない受容体細胞から選択され得る場合の容易さ、特定宿主 において所望されるベクターのフビー数、および異なる種類の宿主ｍ？Ｍでベク ターを「シャトル」できることが望ましいか否かという点がある。

一連の酵母遺伝子発現系のいずれかが利用され得る。それらの発現ベクターの例 としては、酵母２−ミクロン・サークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰお よびＹＲＰ等またはそれらの誘導体がある。それらのプラスミドは当業界ではよ く知られている（ポットスタイン、Ｄｌ等、マイアミ・ウィンター・シンポジウ ム　１９：２６５−２７４（１９８２）、ブローチ、Ｊ、Ｒ，、［ザ・モレキュ ラー・バイオロジー・オフ・ザ・イースト・サツカロマイシス：　ライフ・サイ クル・アンド・インへりタンス」中、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ トリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー７．４４５−４７０頁（ １９８１）、ブローチ、Ｊ、Ｒ，、「セル」、２８：２０３−２０４（１９８２ ））。ＹＥＰ　ｌ　３は、この発明の好ましいベクターである。

は乳類宿主の場合、幾つかの可能なベクター系が発現用に利用され得る。１クラ スのベクターは、動物ウィルス、例えばうしバビＣ−マ・ウィルス、ポリオーマ ・ウィルス、アデノウィルスまたはＳＶ４０ウィルスから誘導された、自律的複 製性染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ成分を利用する。第２クラスのベクタ ーは、宿主染色体への所望の遺伝子配列の組み込みに基づく。導入されたＤＮＡ を染色体へ安定しｊ；状態で組み込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の 選択を可能にする１種またはそれ以上のマーカーを運込することｌこよ−）ても 選択され得る。上記マーカーは、栄養要求性宿主に対するプロトトロピー、生物 致死剤耐性、例えば抗生物質、まｊ＝は重金属、例えば銅なとを補足し得る。選 択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列へ直接結合されるか、または 同時トランスフェクションにより同じ細胞へ導入され得る。また、追加要素がｍ ＲＮＡの最適合成に必要とされ得る。これらの要素には、スプライス・／グナル 並びに転写プロモーター、エンハンサ−および終止シグナルが含まれ得る。上記 要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、岡山、Ｈ，（モレキュラー・アン ド・セルラー・バイオロジー　３．２８０（１９ｇ　３））！こより記載された ものなと゛がある。

好ましい原核生物ベクターには、プラスミド、例えばエシェリヒア・コリにおい て複製し得るプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏＩＥ　Ｌ　ｐＳＣｌ　０ １．ｐＡＣＹＣｌ　８４、ｘ　Ｖ　Ｘ　）がある。上記プラスミドは、例えばマ ニアチス、Ｔｏ等（［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ アルｊ中、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ へ〜バー、ニューヨーク（１９８２））により開示されている。バチルス・プラ スミドには、ｐＣ１９４、ｐｃ２２ＬｐＴ１２７等がある。それらのプラスミド はグリチャン、Ｔ、（ｒザ・モレキュラー・バ・イオロジー・オフ・ザ・バ＋Ｕ 」中、アカデミツク・プレス、ニューヨーク（１９ｇ　２）３０７−３２９）Ｔ ）ｌ：より開示されている。適当なストレプトマイシス・プラスミドには、ｐｌ ＪＩＯｌ（ケンダル、Ｋ、Ｊ、等、「ジャーナル・オフ′・バクテリオロジー」 、１６９：４１７７−４１８３（１９８７）ンがあり、ストレプトマイシス・バ クテリオファージには例えばメｃ３１（チャーター、Ｋ、Ｆ、等、［アクチノマ イセタール生物学に関する第６回国際ノンボジウムＪ中、アカデミアイ・カイト 、ブダペスト、ハンガリー（１９８６）４５−５４頁）がある。シュードモナス ・プラスミドは、ジョーン、Ｊ、Ｆ、等（レヒュー・オフ・インフニクンヨナル ・ディ〉−ズ　８：６９３−７０４（１９８６））およびイザキ、に、（ｒジャ パニーズ・ジャーナル・オフ・バクテリオロジー」、３３ニア２９−７４２（１ ９７８））により概説されている。

一旦、構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現用に製造されると、ＤＮＡ 構築物は適当な宿主へ導入され得る。様々な技術、例えばプロ］・ブラスト融合 、燐酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーションまｔ；は他の慣用的技術が使用 され得る。融合後、細胞を培地中で生長させ、適当な活性イこっＧ゛てスクリー ニングする。所望ノ配列を発現させた結果、メチオニン特異的アミノベブチダー ゼカ製造される。

この発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼは、慣用的方法、例えば抽出、 沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、電気泳動な どにより上記組換え体分子がら単離および精製され得る。

■、メチオニン特異的アミノペプチダーゼの用途。

一旦製造および単離されたこの発明のメチオニン特異的アミノペプチダーゼのい ずれかを、例えば製薬または製造環境で使用することにより、安定性、溶解性、 生物学的活性、生物学的半減期等を改良するか、またはペプチドまたは蛋白質の 免疫原性を減少させるためにアミノ末端メチオニンの除去が望まれるペプチドお よび蛋白質からそれらを除去することができる。さらに、それを用いることによ り、その基質特異性に従い蛋白質およびポリペプチドが開裂され得る。

メチオニン特異的アミノペプチダーゼは、可溶性酵素として所望の基質とインキ ュベーションされ得るか、または当業界でよく知られた手段により固体支持体（ 例えば、ガラス、ラテックス、プラスチック、セルロース等）上に固定され得る 。

以上、この発明について全般的に記載したが、具体的な実施例によりこの発明に 関する理解はさらに深まるはずである。それらの実施例は、説明を目的としてい るだけであって、特記しなければ限定を意図するものではない。

実施例１ 細胞生長ｉゴよび粗抽出物の製造。

細胞生長および貯蔵。

酵母株ＴＤ７１．８（アルファ、１ｎｏ３．１ｅｕ２、ｈｉｓ３、Ｉｙｓ　２　 ）を、１リツトルの）“ｌ’Ｄ培地（１％酵母抽出物、２％バタトーベブトン、 ２％グルコース）中３０℃で後期対数段＃（Ａ　ａ。。〜１８−２０）または中 期対数段階（ＡＭ。。〜８）に生長させた。細胞を、４℃で１０分間３５００ｒ ｐｍでの遠心分離を二より採取した。沈澱物（〜２５ｇ）を１５％グリセリン含 有ＹＰＤ培地２５ｍ１に再懸濁し、−７０’Ｃで貯蔵しｌこ。

全細胞抽出物の製造。

冷凍した酵母細胞（〜５００ｇ湿潤重量）を３０’Ｃ水浴中で解凍し、室温で１ ０分間３５０Ｑｒｐｍでの遠心分離により集めた。沈澱物を５０ｍｇリチカーゼ 含有バファー３（１モルのソルビトール、５０ミリモルのトリス、ｐＨ７，８， １０ミリモルＭｇＣＩ２．３ミリモルのＤＴＴ）１リツトルに再懸濁しこ。この 混合物を２時間３０’Ｃで振り混ぜなめ９らインキュベーションすることにより 、スフェロプラスト形成を誘発した。スフェロプラストを４６で１０分間３５０ Ｏｒｐｍでの遠心分離により集め、冷バファー８１リンドルに穏やかに再懸濁す ること４こより洗浄し、１０分間３５０Ｏｒｐｍでの遠心分離により集め、バフ ７−Ａ（１０ミリモルＨＥＰＥＳ−に＋、ｐＨ７，帆１．５　ミＵ　モルＭｇｃ 　１２、ｌ　Ｏミ’）　モ４Ｋ　ＣＩ８ヨび０−５ミｖモルｖＴＴ）５００ｍｌ に種やかに再懸濁した。後続段階は全て４℃で行なわれた・スフェロプラストを 、ダウンス・ホモジづゴザ−中、ぴったりと合わせた乳棒で１２−１５ストロー ク、次いで緩く合わせ！＝乳棒で１５−２０ストローク混ぜることにより、この 低張性緩衝液に溶解し、次いで冷２モルＫＣＩ溶液を加えることにより最終ＫＣ Ｉ濃度を０．２モルに調節した。リゼイトを３０分間氷上で撹はんし、屑を３０ 分間１７０００ｒｐｍでの遠心分離により除去した。後続の精製工程で使用され る全緩衝液中１０％となるようにグリセリンを加えることにより、アミノペプチ ダーゼをさらに安定させた。

上記の要領に従いメチオニン特異的アミノペプチダーゼ活性についてフラクショ ンを検定した。

実施例２ メチオニン特異的アミノペプチダーゼの精製。

ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトクラフィー。

ＰＭ−１０限外ろ過膜の使用により、粗すゼイトを１００ｍ１に濃縮し、０．０ ５モルのＫＣＩを含ませるべく補充したバファ−Ｈ（１０ミリモルのＨＥ　Ｐ　 Ｅ　Ｓ　−Ｋ　＋、ｐＨ７，３５，１，５ミリモルのＭｇＣｌ２．０．５ミリモ ルのＤＴＴ、０．２％ＮａＮ、、１０％グリセリン）２リツトルに対して３回透 析した。次いで、それを、透析に使用したのと同じ緩衝液で平衡状態にしておい ｆ：　ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２，５Ｘ　４５ｃｍ）上に載せｌ ；。このカラムを２リツトルの０．０５モルＫＣＩ含有バフ７−　Ｈで洗浄し、 次いで、１７ｍ１／時でバ７アーＨ中０．０５モル（２５０ｍ１）−０，５モル （２５０ｍ１）ＫＣｌの一次勾配ｔこより溶離した。フラクション（５、０ｍｌ ）を集めた。

アミノペプチダーゼ活性を含むフラクション４２〜４６および５７〜６７を各々 プールした。ＰＭ−１０１Ｅｉｊ外ろ過膜を用いて、これらのプールしたフラク ションを各々５Ｉ１１１の容量に濃縮した。７ラクシヨン５７〜６７中のアミノ ペプチダーゼをｒＭＡＳ　ＩＪと命名した。

フラクション４２〜４６中の他のアミノペプチダーゼをｒＭＡｓＸＪと命名した 。さらにＭＡＳ　Ｉを水酸化リン灰石カラムにより精製しｔこ。

水酸化リン灰石クロマトグラフィー。

上記ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーによる濃縮溶離液を、ｌ す／トルの０．０１モル燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７。

１５．０．５ミリモルのＤＴＴ、５０ミリモルのＫＣＩ、１０％グリセリン、０ ．０２％ＮａＮ１に対して一夜３回透析し、透析に使用したのと同じ緩衝液で平 衡状態にしておいた水酸化リン灰石カラム（２，５Ｘ　２０ｃｍ）ｌこ適用した 。１８．６ｍｌ／時で０．０１モル（２５０ｍ１）〜０，５モル（２５０ｍｌ） 燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，１５，０，５ミリモルのＤＴＴ、５０ミリモルの ＫＣＬＩＯ％グリセリン、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓの一次勾配により、上記カ ラムを溶離した。フラグ・／ヨン（４，４＋ｎｌ）を集め、アミノペプチダーゼ 活性含有フラクションをプールし、ＰＭ−１０限外ろ過膜を用いて５ｍｌの容量 に濃縮しｔ；。

このアミノペプチダーゼ（ＭＡＳ　Ｉ）を、第２ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ カラムによりさらに精製した。

第２０Ｍ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー。

水酸化Ｉル灰石クロマトグラフィーにより得られた濃縮溶離液を、ｌリットルの ０．０５モルＫＣＩ含有バファーＨに対して３回透析し、透析に使用したのと同 じ緩衝液により平衡状態にしておし・たＣＭ−セフ　７０−スＣＬ−６Ｂカラム （２，５Ｘ４５ｃｍ）に適用した。１８゜９　ｍｌ／時でバファーＨ中０．０５ モル（２５０ｍ１）−０，５モル（２５０ｍｌ）Ｋ　ＣＩの一次勾配により、カ ラムを溶離した。フラクション（３，７８ｍ１）を集め、アミノペプチダーゼ活 性含有フラクションをプールし、ＰＭ−１０限外ろ過膜を用いて５ｍｌに濃縮し た。

メチオニン特異的アミノペプチダーゼ活性を含むフラクションのプロフィールを 表１に示す。

表１ 活性含有フラクションのプロフィール カラム　活性データ　蛋白質　活性７ラクフラクシヨン吸光度　濃度　ジョンの 平均番号　４５０ｎｍ＊　２８０ｎｍ＊伝導率（ｍｓ）ＭＡＳ　Ｉ Ｃトセファロース　５７−６７　０．３６３　２．７３　１１．１水酸化リン灰 石　９５−１０５　０．１８８＊　＊　０．４６７　２７．１Ｃトセ７アロース 　１０３−Ｉｌｌ　０．０５６＊　＊　０．２７３　１４．０ＭＡＳ　Ｘ ＣＩＪ−セファロース　４２−４６　０−３３３　１．９９４　６．７水酸化リ ン灰石　実施されず　−　−−ＣＭ−セファロース　実施されず　−−−＊　吸 光度は、プールされた活性フラクションの平均である。

＊＊吸光度は４１４ｎｍである。

後期対数細胞から得られ、上記方法で精製されたＭＡＳ　Ｉの製品は、約７００ ００の単一汚染物質を含むことが見出された。対照的に、この汚染物質は、上記 に従い精製された中期対数細胞から得られたＭＡＳＩの製品には存在しなかった 。７００００の汚染物質は、ゲル電気溶離、ゲルろ過または他の慣用的手段によ り製品から除去され得る。

実施例３ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるアミノペプチダーゼの分子量 の推定。

１０％ゲルを用いたラエムリ、Ｕ、に、の方法（ｒ、ｆ、イチャー」、２２７： ６８０−６８５（１９７０））に従い電気泳動を行った。ゲルをクーマシー・ブ ルーで染色し、変性したＭＡＳ　＋の見かけ上の分子量を、（１）ミオンン（２ ０５０００）、（２）エシェリヒア・コリ・ベーターガラクトシダーゼ（１１６ ０００）、（３）うさぎ筋肉ホスホリラーゼ（９７０００）、（４）うし血清ア ルブミン（６６０００）および（５）卵アルブミンＣ４５０００）および（６） 炭酸脱水酵素（２９０００）を含む蛋白質標準の相対運動性から計算した。ＭＡ Ｓ　Ｉの見かけ上の分子量は約４１０００であった。ＭＡＳＸの見かけ上の分子 量は測定されなかった。

実施例４ 基質特異性。

３６のペプチドについて、この発明の精製アミノペプチダーゼの基質特異性の試 験を行った。前記ペプチドのうちの１８は、相異なるＮ−末端アミノ酸残基を有 し、残りの１８のペプチドは、終わりから２番目のアミノ末端位に異なるアミノ 酸残基を有してＧ゛た。検定すべき蛋白質溶液（１０μｍ）を、４ミリモルのＭ −Ｘ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔまｊ；はＸ−ＬＰ−Ｅ−Ｔ、ｌ　Ｏミ！Ｊモ４のＨＥＰＥ Ｓ−に＋、ｐＨ７。

３５．０．２ミリモルのＣｏＣｌ２．０．２モルのＫＣＩ、１．５ミリモルのＭ ｇＣ］２．０．０２％のＮａＮ、、３０ｐｇのＬ−アミノ酸オキシダーゼ、３μ ｇの西洋わさびペルオキシダーゼおよび２０μｇの。−ジアニシジン・ジ塩酸塩 を含む溶液９０μｌ加えた。反応は全て、９６ウエルのマイクロタイター・プレ ートＪ二おいて室温で行なわれ、吸光度は４１４または４５０ｎｍで検出された 。急速な色素展開は、その特異的ペプチドに対する高いペプチダーゼ活性の存在 を示す。

これらの実験の結果を表２８よび３に示す。Ｘの同一性を、共通アミノ酸に関し て共通に使用される単一文字省略形により示す。すなわち、Ｖ＝Ｖａ１．Ａ＝Ａ ｌａ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｅ−’Ｊ　ｌｕ、　Ｑ　＝　Ｇ　 Ｉｎ、Ｇ−Ｇｌｙ％Ｈ＝Ｈｉｓ１Ｔ　−ｌｉｅ、　Ｌ＝Ｌｅｕ、　Ｋ＝Ｌｙｓ、 Ｍ−〜ｊｅｔ、　Ｆ　＝　Ｐｈｅｓ　Ｐ　−Ｐｒｏ、Ｓ−５ｅｒＳＴ−Ｔｈｒお よびＷ　＝　Ｔｒｐ、表２および３における数は、活性の定性的評価を表す。

すなわち、０（活性無し）、ｌ　（＋／−）、２（＋）、３（＋＋／−）、４（ ＋＋）、５（＋＋＋／−）および５（＋＋＋）。

表２ 基質特異ｔ！＝：Ｍ−Ｘ−１−Ｐ−Ｅ−ＴＸの同一性：　ＶＡＲ’ＤＣＥＱＧ） ｌ　ｌ　ＬＫＭＦＰＳＴＷ酵素：ＭＡＳ　Ｉ　０２０１０１１１０２１１１１０ ２１０ＭＡＳ　Ｘ　ｌ　６０２０１１１１０００００６４１０表３ 基質特異性：Ｘ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ Ｘ（７）同一性：　ＶＡＲＤＣＥＱＧＨＩＬＫＭＦＰＳＴＷ酵素＋ＭＡＳ　Ｉ　 ００００００００００００１０００００ＭＡＳ　Ｘ　００００００００００１０ １１０００１以上、特に好ましい態様に関して記載しｔ；が、この発明をそれら に限定するわけではないものと理解すべきである。当技術分野に一般的ｔ：精通 した者であれば、開示された態様に様々な修正が加えられ得る点、およびそれら の修正もこの発明の範囲内に含まれるものとする点に容易ｊこ想到するはずであ る。

国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ末端メチオニン残基および、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇ ｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＳｅｒおよびＴｈｒから成る 群から選択されたあらゆる終わりから２番目のアミノ末端アミノ酸残基間のペプ チド結合を開裂する能力を有する実質的に精製されたメチオニン特異的アミノペ プチダーゼ酵素。
2. （２）ＭＡＳ　Ｉである、請求項１記載のメチオニン特異的アミノペプチダーゼ 。
3. （３）アミノ末端メチオニン残基および、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒから成る群から選択された あらゆる終わりから２番目のアミノ末端アミノ酸残基間のペプチド結合を開裂す る能力を有する実質的に精製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼ酵素。
4. （４）ＭＡＳＸである、請求項３記載のメチオニン特異的アミノペプチダーゼ。
5. （５）アミノ末端残基Ｘ（ただし、Ｘは、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＴｒｐから成る 群から選択されたアミノ末端アミノ酸残基である）、およびペプチドの終わりか ら２番目のＩｌｅ残基間のペプチド結合を開裂する能力を有する実質的に精製さ れた基質特異的アミノペプチダーゼ酵素。
6. （６）ＭＡＳ　Ｘである、請求項５記載の基質特異的アミノペプチダーゼ。
7. （７）請求項１記載のメチオニン特異的アミノペプチダーゼをコードする遺伝子 配列を含む組換えＤＮＡ分子。
8. （８）組換え分子の発現により生成される、請求事２記載のメチオニン特異的ア ミノペプチダーゼＭＡＳ　Ｉ。
9. （９）請求項３記載のメチオニン特異的アミノペプチダーゼをコードする遺伝子 配列を含む組換えＤＮＡ分子。
10. （１０）組換え分子の発現により生成される、請求項４記載のメチオニン特異的 アミノペプチダーゼＭＡＳ　Ｘ。
11. （１１）アミノペプチダーゼ含有試料から実質的に精製されたメチオニン特異的 アミノペプチダーゼを採取する方法であって、（ａ）アミノペプチダーゼ含有試 料から粗メチオニン特異的アミノペプチダーゼを採取し、 （ｂ）段階（ａ）からの粗メチオニン特異的アミノペプチダーゼをイオン交換ク ロマトグラフィーに付し、そして（ｃ）イオン交換クロマトグラフィーにより精 製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼが存在すれば採取する段階を含む 方法。
12. （１２）さらに、 （ｄ）段階（ｃ）の採取されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼを、水酸化 リン灰石クロマトグラフィーに付し、そして（ｅ）水酸化リン灰石クロマトグラ フィーにより精製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼが存在すれば採取 する段階を含む、請求項１１記載の方法。
13. （１３）さらに、 （ｆ）段階（ｅ）の採取されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼを、追加的 イオン交換クロマトグラフィーに付し、（ｇ）追加的イオン交換クロマトグラフ ィーにより精製されたメチオニン特異的アミノペプチダーゼが存在すれば採取す る段階を含む、請求項１２記載の方法。
14. （１４）試料が、中期対数または後期対数相で生長中の酵母から単離されたもの である、請求項１１記載の方法。
15. （１５）アミノ末端残基を含み、終わりから２番目のアミノ末端アミノ酸残基と して、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＧＩｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ ｅｔ、Ｐｈｅ、ＳｅｒおよびＴｈｒから成る群から選択されたアミノ酸を含むペ プチドからアミノ末端メチオニン残基を除去する方法であって、メチオニン特異 的アミノペプチダーゼＭＡＳ　Ｉの存在下でペプチドをインキュベーションする ことにより、アミノ末端残基を除去することを含む方法。
16. （１６）メチオニン特異的アミノペプチダーゼを固体支持体に固定する、請求項 １５記載の方法。
17. （１７）アミノ末端残基を含み、終わりから２番目のアミノ末端アミノ酸残基と して、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒおよびＴｈｒから成る群から選択されたアミノ酸を含むペプチドからアミノ 末端メチオニン残基を除去する方法であって、メチオニン特異的アミノペプチダ ーゼＭＡＳ　Ｘの存在下でペプチドをインキュべーションすることにより、アミ ノ末端残基を除去することを含む方法。
18. （１８）メチオニン特異的アミノペプチダーゼを固定支持体に固定する、請求項 １７記載の方法。