JPH04500157A - チモーゲン的またはフィブリン特異的特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５８、酵母細胞である請求の範囲６７に記載の細胞。

６９４哺乳動物細胞である請求の範囲６７に記載の細胞。

７０、請求の範囲６３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

７４　、真核生物細胞である請求の範囲７０に記載の宿主細胞。

７２、変異体をコードしているＤＮＡ配列を一時的に発現し得る請求の範囲７１ に記載の宿主細胞。

７３、請求の範囲６４に記載のベクターで形質転換された原核生物宿主細胞。

７４、請求の範囲６５に記載のベクターで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉａ７５、 請求の範囲１に記載のチモーゲンの治療的を動量を薬学的に許容し得る担体と混 合して含有する、血管の症状まｊ；は疾患の治療用組成物。

７６　請求の範囲７５に記載の組成物の有効量を哺乳動物ｌこ投与することから なる、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。

７７、請求の範囲１９に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体 と混合して含有する、血管の症状または疾患の治療用組成物。

７８、請求の範囲７７に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することからな る、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。

７９、請求の範囲ｌに記載のチモーゲンの治療的有効量を薬学的に許容し得る担 体と混合して含有する、フィブリンの沈着または付着の形成または再形成の予防 用組成物。

８０、請求の範囲７９に記載の組成物の有効量をフィブリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィブリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。

８１、請求の範囲１９に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体 と混合して含をする、フィブリンの沈着または付着の形成または再形成の予防用 組成物。

８２、請求の範囲８１に記載の組成物の有効量をフィブリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィブリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。

８３　請求の範囲３に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体と 混合して含有する、血管の症状または疾患の治療用組成物。

８４、請求の範囲８３に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することからな る、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。

８５、請求の範囲３に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体と 混合して含有する、フィブリンの沈着または付着の形成または再形成の予防用組 成物。

８６゜請求の範囲８５に記載の組成物の有効量をフィブリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィブリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。

明　細　書 チモーゲン的またはフィブリン特異的特性を有する組織プラスミノーゲン活性化 因子 本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ　−ＰＡ）チモーゲン、該チモ ーゲンの製造方法、および医学的適用において該チモーゲンを利用する方法およ び組成物に関するものである。また、本発明は、ｔ−ＦＡのプロテアーゼドメイ ン内に置換アミノ酸を有する修飾構造を有する変異体に関するものである。修飾 によって、変異体はチモーゲン的、即ち、その１本鎖形では比較的不活性である が、フィブリンの存在下でその２本鎖形に変換されると活性であり、モして／ま たは野生型（ｗｔ）ｔ−ＰＡより、より一層フィブリン（または凝固血漿）特異 的となる。

プラスミノーゲン活性化因子は、チモーゲンであるプラスミノーゲンを活性化し 、フィブリンを包含する種々のタンノ（夕を分解するセリンプロテイナーゼ、プ ラスミンを製造する（Ａｒｇ５６１−Ｖａ１５６２で切断することによって）酵 素である。研究されたプラスミノーゲン活性化因子には、細菌性タンパクである ストレプトキナーゼ、腎臓およびその他で合成される、最初、原から抽出された 酵素であるウロキナーゼ、および血管壁の内面を覆っている細胞によって産生さ れる酵素であるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＦＡ）がある。

これらのプラスミノーゲン活性化因子の各々の作用のメカニズムは、異なってい る：ストレプトキナーゼはプラスミノーゲンまたはプラスミンと複合体を形成し て、プラスミノーゲン活性化活性を生じ、ウロキナーゼはプラスミノーゲンを直 接切断し、ｔ−ＰＡ、フィブリン、およびプラスミノーゲンは全て相互作用し、 最大活性を生じる。

ｔ−ＰＡは、一部分、その高いフィブリン特異性およびイン・ビポにおける血餅 溶解能によって、心筋梗塞のような血管性疾患の治療で優れた結果を示す、とり わけ重要な、有効な新規生物学的医薬として確認され、記載された。

ｔ−ＰＡの存在は、幾つかの科学グループによる多数の研究を刺激したが、これ は最初、天然の供給源から実質上純粋な単離物として確認され、Ｃｏ１１ｅｎ等 、米国特許第４，７５２，６０３号、　１９８８年６月２１日登録によって、イ ン・ビポで必要なプラスミノーゲン活性化因子活性に次いで、ｔ−ＰＡは、別の 環境で大量のｔ−ＰＡを生じる組換ＤＮＡ法を使用する首尾よい研究に基づき、 基本的なりＮＡ配列および予想アミノ酸配列によって完全に確認され、特性化さ れた。この研究は、Ｐｅｎｎ　ｉｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ、３０１　：２］４（１ ９８３）および米国特許第４．７６６゜０７５号、　１９８８年８月２３日登録 によって報告された。

これらの開示に基づくと、現在では、ｔ−ＰＡ分子が、トリプシン、キモトリプ シン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、フィブロネクチン、および表皮成長 因子（ＥＧＦ）の様な種々のその他のタンパクにおいて確認された、Ｉ−ＦＡに ホモローガスな、またはホモローガスとは言えないまでもｔ−ＰＡに類似した構 造を参照して定義された５個のドメインを有していることは明らかであると思わ れる。これらのドメインは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列のＮ−末端から出発し、１ ）アミノ酸１から約４４を含んでいると種々定義されたフィンガー領域（Ｆ）、 ２）約アミノ酸４５から９１に及ぶと種々定義された成長因子領域（Ｇ）（ＥＧ Ｆとのそのホモロジーに基づき）、３）約アミノ酸９２から約アミノ酸１７３に 及ぶと定義されたクリングル１（Ｋｌ）、４）約アミノ酸１８ｏから約アミノ酸 ２６１＋１１よぶと定義されたクリングル２（Ｋ２）、および５）通常、約アミ ノ酸２６４から分子のＣ，を端ｌこ及ぶと定義されたいわゆるセリンプロテアー ゼドメイン（Ｐ）と呼称された。通常、互いに隣接して位置しているか、または 短いバリンカー′″領域によって分離されているこれらのドメインは、ｔ−ＰＡ の推定成熟形の１〜５２７アミノ酸の全アミノ酸配列を説明する。

各ドメインは、ある種の特異的な、生物学的に重要な特性を提供すると種々、記 載された。フィンガードメインは、フィブリンに対する高い結合親和性のｌ；め に少なくとも非常に重要な配列を含有していると特性化された。（この活性は、 ｔ−ＰＡが、フィブリンに富んだ血栓の位置での血餅溶解について示す高い特異 性のために重要であると考えられる。）成長因子様領域も、細胞表面結合活性に 関連付けられた。クリングル２領域も、フィブリン結合およびｔ−ＰＡの活性を 刺激するフィブリンの活性に強く関連付けられた。セリンプロテアーゼドメイン は、プラスミンを製造する、プラスミノーゲンの酵素的切断の原因である。

大きな利点は、血餅溶解剤としての天然のｔ　−ＰＡと関連しているが、この天 然のタンパクは必ずしも、全ての状況下で最適の１−ＰＡ剤であるわけではない と考えられる。従って、幾つかの変異体は、ｔ−ＰＡの特異的特性を高めると思 われＩ；。これらの変異体のあるものは、より長い半減期またはより遅い消失速 度を有する薬物が好ましい状況（例えば、梗塞症患者の深静脈血栓、および再が ん温浸の治療）または１本鎖薬物が好ましい状況に於いて、天然のｔ−ＦＡを使 用することによる不都合に対するものである。

例えば、フィンガードメインの実質的部分または全てを除去すると、生成した物 質の全体的な消失速度が低下するが、分子のフィブリン結合特性が実質上低下す る。１９８９年１月１２日公開のＷＯ３９１００１９７参照。

２７５．２７６、および２７７位のタンパク分解的切断部位にアミノ酸置換を有 する変異体は、ＥＰＯ特許公開第１９９５７４号に記載されている。２７５位に アルギニン以外のアミノ酸を有するｔ−ＰＡ変異体として優先的に特徴づけられ ているこれらの変異体は、１本鎖または２本鎖のいずれかの形で存在し得る天然 のｔ−ＦＡと異なり、プロテアーゼ耐性１本鎖ｔ−ＰＡと呼ばれ、これらは２７ ５位でのプロテアーゼ切断に耐性であり、従ってイン・ビポで代謝的に２本鎖形 に変換されない。この形態は、生物学的および商業的にある種の利点を有すると 思われる。即ち、これは、２本鎖ｔ−ＦＡに比較してフィブリン結合およびフィ ブリン刺激が増大される一方、より安定である。更に、プラスミノーゲン活性化 因子は、フィブリンと相互作用し得る１個のドメインおよびウロキナーゼのプロ テアーゼドメインを有すると記載され、２本鎖ウロキナーゼが形成されにくいよ うに変更されたウロキナーゼも１態様を構成する。１９８８年７月１４日公開の Ｗ　０８８１０５０８１号参照。

ｔ−ＰＡのプロテアーゼ切断部位の修飾に関する他の特許文献にツイテｉ：ｔ、 ＥＰＣＩ！’Ｆ第２４１．２０９号；　１９８６年１１月１２Ｅ公開ノＥＰ２０ １゜１５３号：　１９８７年８月１９日公開のＥＰ２３３，０１３号；　１９８ ８年１１月２３日公開のＥ　Ｐ　２９２．００９号；１９８８年１２月７日公開 のＥＰ２９３．９３６号；および１９８８年１２月７日公開のＥ　Ｐ　２９３， ９３４号；およびＷ　Ｏ８８／１０１１９号を参照されＩこい。

炭水化物のモル百分率が低下した時、１１７−１１９．１８４−１８６および、 ４４８−４５０位におけるグリコジル化変異体は、より高い特異的活性を示した 。１９８７年７月１日公開のＥＰＯ公開第２２７゜４６２号参照。この特許出願 は更に、２７２−２８０位でｔ−ＰＡ分子を修飾し得るか、またはＣ−末端から ２５アミノ酸まで欠失させ得ることをフィブリン、／ライブ９２分解産物の検定 を使用して開示し、教示している。更に、ＤＮＡ修飾によってＮ−グリコジル化 部位が選択的に除去されているが、残りの〇−結合した炭水化物を有する、Ａｓ ｎ１１９、ＡＩａ１８６ｊ５よびＡｓｎ４５０を有しているｔ−ＦＡ変異体は、 イン・ビトロ細胞溶解検定においてメラノーマを−ＰＡより約２倍活性であるこ とがわかりｌ；。１９８７年６月ｌＯ日公開のＥＰＯ公開第２２５．２８６号参 照。

グリコジル化部位を修飾するためのアルギニン以外のアミノ酸によるｔ−ＰＡの ４４９位のアミノ酸の置換、およびＡｒｇ２７５の修飾または−３から９１領域 の欠失も教示されている。１９８７年８月１３日公開のＷ　Ｏ８７１０４７２２ 号参照。ｔ−ＰＡの４４８位のアミノ酸置換は、グリコジル化を排除するために 望ましいと記載されている。１９８８年１２月２８日公開のＥＰＯ公開ｗｃ２９ ７，０６６号参照。４４ｇ−４５０位の修飾とＮ末端１−８２アミノ厳の欠失の 組み合わせは、１９８９年１月１２日公開のＷ　Ｏ８９１００１９１号によって 記載されている。また、ウロキナーゼは、グリコジル化を予防するために、Ａｓ ｐ３０２−５ｅｒ３０３−Ｔｈｒ３０４の領域で修飾された。　１９８９年１月 １８日公開のＥＰＯ公開第２９９，７０６号参照。しかしながら、グリコジル化 部位が変更、とりわけアミノｒ６１１７が変更されると常１こ、溶解特性が変化 した分子を生じるらしく、この結果更に、循環半減期パターンおよび／またはフ ィブリン結合特性が変化し得る。１９８７年９月２３日公開のＥＰＯ特詐特開公 開第２３８０４号参照。

Ａ、Ｊ、ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ等、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａ ｓ、　、５４（１）４（１９８５）によって報告された様に、ｔ−ＰＡの成長因 子ドメインが欠失された場合、得られた変異体は依然活性であり、フィブリンに 結合する。成長因子ドメインにおける種々の欠失も、特許文献に報告されｌ；。

ＥＰＯ公開第２４１，２０９号（デス−５１−８７）、ＥＰＯ公開第２４１，２ ０８号（デス−５１−８７およびデス−５１−１７３）、Ｐ　ＣＴ　８７１０４ ７２２号（Ｎ末端！−９１の全てまたは一部分の欠失）、ＥＰＯ公開第２３１． ６２４号（成長因子ドメインの全てが欠失された）、およびＥＰＯ公開第２４２ ゜８３６号および日本特許出願公開第６２−２６９６８８号（成長因子ドメイン の幾つかまたは全てが欠失された）参照。

ｔ−ＰＡを、第１クリングルドメインの領域および成長因子ドメインの両者で修 飾することができ、その結果循環半減期が延長することも示された。１９８７年 ｌＯ月１４日公開のＥＰＯ特許公開第２４１，２０８号参照。アミノ酸５１と８ ７を含む間の領域をｔ−ＰＡから欠失させ、血漿からより遅く消失する変異体を 生成させることができる。

Ｂｒｏｗｎｅ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　、２６３：　１５９９（６０ ２（１９８８）。また、幾つかのアミノ酸残基を欠失させるか、または１または それ以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することによって、生物学的に悪影響 を与えることなく、成熟、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸６７から６９の領域でｔ−Ｐ Ａを修飾することができる。１９８７年１０月７日公開のＥＰＯ特許公開第２４ ０，３３４号参照。

アミン８２７３−５２７を含有しているｔ−ＦＡの領域を使用するｔ−ＰＡ／ウ ロキナーゼのハイブリッドも、開示されている。１９８８年１１月９日公開のＥ Ｐ○２９０，１１８号参照。

ｄ２９６−３０２七−ＰＡ、Ｒ３０４Ｓｔ−ＰＡ、およびＲ３０４Ｅｔ−ＰＡを 包含する、プロテアーゼドメインに変更を宵するヒトｔ−ＦＡのセルビン（Ｓｅ ｒｐｉｎ）耐性変異体は、Ｍａｄｉｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ４時掲載の論文も参 照されたい。

プラスミノーゲン活性化因子およびその第２世代誘導体の全般的な検討は、Ｈａ ｒｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｉ二４４９−４５８（１ ９８７）に見いだすことができる。ｔ−ＰＡ変異体９その他の考察には、Ｐａｎ ｎｅｋｏｅｋ等、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、ｇ：　１２３−１３２（１９８８ ）およびＲｏｓｓ等、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａ ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２３．Ｃｈａｐｔｅｒ１２（１９８８）が ある。

前記の開示は、より新しく、種々の点で、より優れたｔ　−ＰＡ薬物が手中にあ るという証拠を提供したが、溶解しようとする血餅の部位に到達した時のみ活性 化されると記載されたｔ−ＰＡ分子は現在全くない。一般に、ｅ−ＰＡ分子は、 これらが１本鎖または２本鎖形のいずれであっても、フィブリンおよび／または 血漿性タンパクまたは全血の存在下で活性である。フィブリンの存在下、その１ 本鎖形がその２本鎖形へクリッピングして完全に活性になるのに必要なチモーゲ ンｔ−ＦＡを有することが望ましいであろう。この様な変異体分子は、より少な い出血の様なより少ない副作用を示したり、フィブリノーゲン節約特性を有する らしく、それによって、心血管疾患および血管の血栓塞栓症的閉塞に起因する多 数のその他の医学的症状の治療、および付着の形成の予防に、医科学的ｌこ重要 な新規な変法を提供する。

血餅の部位でのみ作用し、全身的に作用しないように、野生型（−ＰＡに比較し て、フィブリノーゲン刺激性（または血漿刺激性）活性より高いフィブリン刺激 性（または凝固血漿刺激性）活性を有する、即ちフィブリン（または凝固血漿） 特異性であるｔ−ＰＡ分子を与えることも望ましい。

従って、本発明は、改良された治療および医薬特性を示すチモーゲン的および／ まｔ；はフィブリン特異的ｔ　−ＰＡ分子を提供することを目的とする。

血餅の部位でのみ活性であり、他のこの様な薬物より高いレベルで有用な血餅溶 解剤の使用が有効と認められる症状の治療のために提供することは、他の目的で ある。

これらおよび他の目的は、当業者には明らかとなろう。

これらの目的は、プラスミンによって切断して酵素的に活性な形のｔ　−ｐ　Ａ 、ｉ：変換し得る組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ　−ＰＡ）チモーゲンの 提供によって達成される。別の態様では、本発明は、対応する野生型ｔ−ＰＡに 比較して、ｔ−ＦＡのプロテアーゼドメイン内の部位のアミノ酸が変更されたｔ −ＰＡ変異体を提供する。この変更によって、変異体は、対応する野生型ｔ　− ＰＡに比較してチモーゲン的となる。

とグわけ好ましいｌ態様では、ｔ−ＰＡはヒトｔ　−ＰＡであり、変更は、対応 する野生型ｔ−ＦＡの３０５位のフェニルアラニンをヒスチジンで置換するよう な、３０５を含む領域においてである。

その他の態様では、本発明は、上記のチモーゲンおよび変異体をコードしている ＤＮＡ配列、形質転換宿主細胞中でＤＮＡ配列を発現し得る複製可能な発現ベク ター、および該ベクターで形質転換された微生物および細胞培養に関するもので ある。

更にその他の態様では、本発明は、 ａ）ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメインにアミノ酸変更を導入し；そして ｂ）得られたｔ−ＰＡ変異体をチモーゲン特性についてスクリーニングする ことからなる方法を提供するものである。

その他の態様では、本発明は、】またはそれ以上の、以下の生物学的活性を示し 得るヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ　−ＰＡ）変異体を提供する：対 応する野生型ｔ−ＦＡに比較してそのプロテアーゼドメインにアミノ酸変更を有 し、その変更が該生物学的活性の原因であることを特徴とする、チモーゲン活性 、フィブリン特異性または凝固血漿特異性。ただし、この様な変更は、２７０− ２８０．４４８−４５０、および５０２−５２７の領域でのみ変更を除外する。

変異体は、変更が置換である変異体であるのが好ましい。

その他の態様では、本発明は、 （ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｉ−ＦＡ）のプロテアーゼドメインに アミノ酸変更を導入し：そして（ｂ）得られたｔ−ＰＡ変異体を、ｌまたはそれ 以上の以下の生物学的活性・チモーゲン活性、フィブリン特異性、または凝固血 漿特異性を示すその能力Ｉこついてスクリーニングすることからなる方法を提供 する。

別の態様では、本発明は、上記変異体をコードしているＤＮＡ配列および複製可 能なベクター、およびそれで形質転換された宿主細胞を提供する。

更に別の態様では、本発明は、本発明のチモーゲンまたは変異体の治療的有効量 を薬学的に許容し得る担体と混合して含有する、血管の症状または疾患を治療す るための組成物を目的とするものである。本発明は更に、本発明のチモーゲンま たは変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体と混合して含有する、フィ ブリンの沈Ｒまフニは付着の形成また：ｉ再形成を予防するための組成物を包含 するものである。

更！こその他の態様では、本発明は、上記の適当な組成物の有効量を哺乳動物に 投与することからな乙、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法を提 供する。

本発明はまＩ；、フィブリンまたは付着の形成の可能性のある哺乳動物の部位に 上記の適当な組成物の有効量を投与することからなる、フィブリンの沈着まｔ； は付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の処置法を提供する。

本発明の第１の態様はとりわけ、ある種のｔ−ＰＡ分子が、プラスミン分解性フ ィブリノーゲンフラグメントの様なｔ−ＰＡ活性の刺激物質の存在下でチモーゲ ンであり、従って、血漿中では一般にそのフィブリン溶解活性は消失し、血餅の 部位のプラスミンに最も近い時に活性化されるということを証明する個々の成功 した研究に基づく。即ち、チモーゲンは、個々の局在した血餅の治療のための必 要に応じて活性化される。本発明のチモーゲンは、フィブリノーゲン節約である と予想され、通常、その非チモーゲン対応物より高い投与量で使用し得、その結 果、より速く血餅を溶解し、より多くの血餅を溶解する。

本発明の第２の態様は、非修飾ｔ−ＰＡより血餅の部位でより選択的に作用する であろう、よりフィブリン（または凝固血漿）特異的なｔ−ＰＡ分子を得ること である。

第１図は、５個のドメイン、ジスルフィド架橋、および分子が２本鎖分子にクリ ップされている活性化部位の位置を示しているｔ−ＰＡの一次構造を示す。

第２図および第３図は、ｐｃｌｓｔ　−ＰＡの製造に好適な方法の図式表示なら びにその顕著な制限部位のいくつかの記載である。

第４図は、ｐ７−ＩＨの製造に好適な方法の図式表示ならびにその顕著な制限部 位の幾つかの記載である。

第５区は、主として１末鎖Ｆ３０５Ｈ（黒三角）、２本ＭＦ　３０５Ｈ（２重線 と黒丸）、１本鎖野生型ｔ−ＦＡ（黒画角）、２末鎖野生型ｔ−ＰＡ（黒菱形） 、および１本鎖および２末鎖野生型ｔ−ＰＡの混合物（白三角）のｌｏｎｇ７’ ｍｌのｔ−ＰＡ濃度でのフィブリン結合を示す。

第６−９図は、主として１重鎖野生型ｔ−ＰＡ（第６図）、２末鎖野生型ｔ−Ｐ Ａ（第７区）、主として１末鎖Ｆ３０５Ｈｔ　−ＦＡ（第８図）、および２末鎖 Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ（第９図）による、プラスミン分解性フィブリノーゲンの存 在下での、プラスミンへのプラスミノーゲンの変換の速度論のグラフを示す。四 角、線および丸は、検定緩衝液中でのプラスミノーゲンおよびｔ−ＰＡの種々の 濃度を表わす。

本明細書で使用する時、゛ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子″、゛ヒトｔ− ＦＡ”％および“ｔ−ＰＡ”なる語句は、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換 し得るプロテアーゼドメインおよびフィブリン結合の原因であると思われるＮ末 端領域からなる２個の機能的領域を有するヒトの外因性（組織整）プラスミノー ゲン活性化因子を意味する。従って、これらの３つの語句は、全配列の一部分と してこれらの機能的ドメインを含有しているポリペプチドを包含する。ｔ−ＦＡ は、プロテアーゼ部分及びその他はｔ−ＰＡの供給源に本来備わっているｔ−Ｐ Ａ部分からなる生物活性形で、例えば組換細胞培養系によって生産される。全配 列におけるアミノ酸の相異によって示される天然のアレル変異体がそれぞれに存 在し、生じることは理解されるであろう。

本明細書で使用する時、゛野生型ｔ−ＰＡ”なる語句は、米国特許第４．７６６ ．０７５号によって報告されたｃＤＮＡによってコードされたｔ−ＰＡを意味す る。コードされたｔ−ＰＡは、好ましくは、２９３または２９４細胞、チャイニ ーズハムスター卵巣細胞等を包含する天然の供給源、またはいずれかの組換発現 系由来のｔ−ＰＡ分子である。

本明細書で使用する時、“プロテアーゼドメインパなる語句は、成熟形の野生型 ｔ−ＰＡのアミノ酸２６４からアミノ酸５２７を含む領域を意味する。

本明細書で使用する時、本明細書でｔ−ＰＡを説明するために使用される゛チモ ーゲン活性、゛′チモーゲン的゛、および”チモーゲン活性“なる語句は、以下 に与えられる定義の一方または両者に適合しなければならない。第１の定義では 、これらの語句は、プラスミン分解性フィブリノーゲンの存在下でｔ−ＰＡが、 下記の検定条件下、以下に定義されるような、その酵素活性を増大させるために 、プラスミンの存在下で起こるのと同様に、その１本鎖形をその２本鎖（゛′酵 素的に活性な″）形にクリッピングすることを必要とすることを意味する。

フィブリノーゲンフラグメントの存在下では、本明細書で定義された１本鎖形の ｔ−ＰＡ（チモーゲン）は、下記の検定によって測定した時、野生型２本鎖ｔ− ＰＡより活性が低く、１本鎖形を２本鎖形へ完全ｊ：変換させるプラスミン濃度 に接触させることによって活性化された時、その酵素的により活性な形態に変換 される。通常、１本鎖形の活性は、対応する２本鎖形の活性の５０％またはそれ 以下に、好ましくは２０％またはそれ以下に、より好ましくは１０％以下の活性 に低下され；２本鎖形にクリッピングされると、その活性は野生型２本鎖形の活 性の約２０％から１００％以上、好ましくは少なくとも５０％以上に増大される 。

以下の実施例Ｉに記載の検定にて、フィブリノーゲンフラグメントの存在下、色 素形成性プラスミン基質Ｓ−２２５１を使用し、プラスミノーゲンをプラスミン に変換する速度論を調べることによって、その酵素活性について変異体を検定す る。

本明細書ではチモーゲンの第１の定義に関する目的で、チモーゲンは、上の条件 下、プラスミン生産において明確な遅延を示し、従って、Ａ４０５の上昇におい ては、時間の２乗に対してズロ／トシた時、時間の経過に従ってなお直線状速度 論を示すものである。時間の２乗の速度論の記載は、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅ ｎ、Ｗ、、　Ｖｏｓｋｕｉｌｅｎ、Ｍ、、　Ｔｒａａｓ、Ｄ、、　Ｈｏｅｇｅｅ −ｄｅＮｏｂｅｌ、Ｂ、、　Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎｊ、Ｈ，、ｉｎ　Ｆｉｂｒｉｎ ｏｇｅｎ−ＳｕｒｕｃＬｕｒａｌ　Ｖａｒｉａｎｔｓ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒａｃ ｔｉｏｎｓ、　ｅｄｓ、　Ａ、Ｈｅｎ５ｃｈｅｎ、　Ｂ、Ｈｅ５ｓｅｌ。

Ｊ、ＭｃＤｏｎａｇｈ、　Ｔ、５ａｌｄｅｅｎ　（１９８５）、　ｐ、３３１− ３４２に見い出すことができる。１つの理論に限定されないなら、この効果は多 分、プラスミン−触媒された１本鎖から２本鎖形への変換に起因し、それによっ て、ｔ−ＰＡチモーゲンが活性化される。これは、野生型１本鎖ｔ−ＰＡ、野生 型２本鎖ｔ−ＰＡ、および２本鎖形のチモーゲンｔ−ＰＡの場合、検定の始めか ら直線状速度であるという観察と対照をなしている。

第２の別の定義では、″チモーゲン活性は、チモーゲン活性の検定において、野 生型組換ｔ−ＦＡ（ｒ　ｔ−ＦＡ）より、１本鎖形と２本鎖形間でより大きい差 異のある活性を示すｔ　−ＰＡ分子を特に意味する。チモーゲンの差異のある活 性は、好ましくは野生型ｒｔ−ＰＡのそれの少なくとも約１．５倍である。この 活性は、野生型ｒｔ−ＦＡに比較して、２本鎖形のそれより大きい程度まで１本 鎖形の活性を低下させるか；野生型ｒ　ｔ−ＦＡに比較して１本鎖形のそれより 大きい程度まで２本鎖形の活性を上昇させるか；または記載された効果を生じる 上記の事象を組み合わせることによって得ることができる。野生型ｔ−ＦＡのチ モーゲン特性は、Ｌｏｓｃａｌｚｏ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　、８２： １３９１−１３９７（１９８８）およびＲａｎｂｙ等、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｇヱ：　１７５−１８３（１９８２）に記載されている。

“フィブリン特異性″なる表現は、Ｓ−２２５１検定において（１本鎖または２ 本鎖形のいずれかで）、フィブリノーゲン依存性特異的活性に対するフィブリン 依存性特異的活性が野生型ｒｔ−ＰＡより高い割合、好ましくは少なくとも１． ５の割合を示す変異体の活性を意味する。

”凝固血漿特異性゛なる表現は、Ｓ−２２５１検定において（１本鎖または２本 鎖形のいずれかで）、血漿依存性特異的活性に対する凝固血漿依存性特異的活性 が野生型ｒｔ−Ｐ、Ａより高い割合、好ましくは少なくとも１．５の割合を示す 変異体の活性を意味する。

本明細書で使用する時、パ一時的発現系″は、一時的に、即ち安定ではないかも しれない方法で変異体をフードしているＤＮＡ配列を発現スる、ｔ−ＰＡ変異体 をコードしているベクターで形質転換された細胞を含何１３．ている細胞培養を 意味する。この様な細胞は゛″一時的発現可能゛°と考えられ己。

本明細書において変異体を議論するために、ｔ　−ＦＡの一次構造を示す第１区 について参照事項をつける。第１図では、円の中の文字は１文字アミノ酸コード であり、鎖間を連結しでいる線は、ジスルフィド架橋を示し５、白丸はグリフシ ル化部位を示し、Ｆ、ＧＦ、Ｋｌ、Ｋ２およびＳＰなる表示はそれぞれ、フィン ガー、成長因子、クリングルｌ、クリングル２、およびセリンプロテアーゼドメ インを示す。

本明細書記載のｔ−ＰＡ変異体の短縮表示を目的として、数字は推定成熟ｔ−Ｐ Ａのアミノ酸配列（ＥＰＯ公開第９３，６１９号）に従ったアミノ酸残基／位置 を意味することを記載しておく。アミノ酸の表示は、アミノ酸の１文字アルファ ベント、即ち、Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸１１ｅ　Ｉ　イソロイシンＴｈｒ　 Ｔ　）レオニン　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ’Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロ シンＧｌｕ　Ｅ　’；ｆルタミン酸Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　 プロリン　Ｈｉｓ　ＨヒスチジンＧｌｙ　Ｇ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡ ｈａ　Ａ　アラニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃンステイン　Ｔｒｐ　Ｗ 　トリプトファンＶａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メ チオニン　Ａｓｎ　Ｎ　アスパラギンを使用する。

本明細書では置換変異体についての表示は、文字、次いで数字、次いで文字で構 成される。最初の（左端の）文字は、野生型成熟ｔ−ＰＡにおけるアミノ酸を表 わす。数字は、アミノ酸置換がなされたアミ２・酸の位置を意味し、第２の（右 端の）文字は、野生型のアミノ酸を置換するために使用されるアミノ酸を表わす 。挿入変異体のための表示は、文字、次メニ、その前で挿入が始まる野生型成熟 ｔ−ＰＡにお（する残基の位置を表わす数字、次に、行われた挿入全てを示１７ ているｌまたはそね以上の大文字で構成される。欠失変異体についての表示は、 文字、次いで、欠失の開始位置の数字から欠失の終止位置の数字で構成され、こ の位置は野生型成熟ｔ−ＰＡに基づく。

複数の変異は、それらを読み取り易くするため、表示中のコンマによつｔｌｌ′ 分離される。

命名法の例は、次のとおりである：野生型ｔ−ＰＡの３０５位のフェニルアラニ 〕／がヒ又チジン残基で置換されている置換変異体はＦ３０５Ｈと呼ばれる。連 続した２９６−２９９位のＫＨＲＲがＡＡＡＡで複数個置換されている置換変異 体は、Ｋ２９６Ａ、Ｒ２９７Ａ、Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９９Ａと呼はれる。野生型ｔ −ＰＡの３０５位の後に７ステインおよびバリンが挿入されている挿入変異体は １３０５ｃｖと呼ばれる。野生型成熟ｔ−ＰＡから、３００−３０５位のアミノ 酸が欠失されている欠失変異体は、ｄ３００−３０５と呼ばれる。それぞれの変 異体の後にｔ−ＦＡ’の表示が続く。

本発明で好ましい種類のチモーゲンの１つは、野生型ｔ−ＰＡの３０５位または その周縁に置換、欠失または挿入を有するチモーゲンである。これらの変異体に は、対応する野生型ｔ−ＦＡの３０５位にフェニルアラニン以外のアミノ酸を有 する変異体がある。より好ましくは、この様な変異体は、ヒドロキシル基または 窒素原子を含有している側鎖のような、水素結合ドナーとして作用し得るかまた は作用する側鎖を有するアミノ酸を３０５位に有する変異体である。更に好まし くは、この様なアミノ酸は、アルギニン、リシン、チロシン、アスパラギン、グ 、・レタミンおよびヒスチジンであり、最も好ましくはヒスチジンである。この タイプの好ましい挿入チモーゲン変異体は、３０４または３０５位のアミノ酸の 後に、１またはそれ以上、好ましくは１個のアミノ酸が挿入されている変異体を 包含し、その様なアミノ酸は、上記の様な、即ち水素結合ドナーとして作用し得 るかまたは作用する側鎖を有する、例えばヒドロキシル基または窒素原子を含有 しているアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、チロシン、アスパラギン、グル タミンおよびヒスチジン、最も好ましくはヒスチジンである。好ましい欠失チモ ーゲン変異体には、野生型ｔ−ＦＡの２９７〜３０５位の両端を含む領域に欠失 を有する変異体があり、ｄ２９７ｔ−ＰＡ、ｄ２９８ｔ−ＰＡ等、およびその組 み合わせ、例えばｄ２９７−２９９ｔ−ＦＡ、またはｄ２９７、ｄ３０５ｔ−Ｐ Ａを包含する。

上記チモーゲン変異体の具体的な態様は、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｔｔ− ＰＡ＋Ｆ３０５Ｎｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｋｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｒｔ−ＰＡ；Ｆ３０ ５Ｑｔ−ＰＡ；　１３０４Ｈｔ−ＰＡ；１３０４Ｔｔ−ＰＡ：　１３０４Ｎｔ− ＰＡ；　１３０４Ｋｔ−ＰＡ；１３０４Ｒｔ−ＰＡ；　１３０４Ｑｔ−ＰＡ；　 １３０４ＨＨｔ−ＰＡ；　１３０５Ｈｔ−ＰＡ；　１３０５Ｔｔ−ＰＡ；　１３ ０５Ｎｔ−ＦＡ：　１３０５Ｋｔ−ＰＡ；　１３０５Ｒｔ−ＰＡ；　１３ｃ１５ Ｑｔ−ＰＡ；　１３０４Ｈ，１３０５Ｈｔ−ＰＡ；　１３０５ＨＨｔ−ＰＡ；ｄ ２９７ｔ−ＰＡ；ｄ２９８ｔ−ＰＡ；ｄ２９９ｔ−ＰＡ；ｄ３００を−ＰＡ；ｄ ３０１ｔ　ＰＡ；ｄ３０２ｔ−ＰＡ：ｄ３０３ｔ　Ｐ、Ａ；ｄ３０４ｔ−ＰＡ； ｄ３０５ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−２９８ｔ　−ＰＡ；ｄ２９７−２９９ｔ−ＰＡ； ｄ２９７−３００ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３０１ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３０２ｔ− ＰＡ；ｄ２９７−３０３ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３０４　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３ ０５ｔ　−ｐＡ；ｄ３００−３０ｉ　ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０２　ｔ−Ｐ、１ ｄ３００−３０３ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０４ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０５ｔ− ＰＡ；ｄ３０４−３０５ｔ−ＰＡ；ｄ２９７．ｄ３００ｔ−ＰＡ；ｄ２９７．ｄ ３０５ｔ−ＰＡ；ｄ　］−４４，Ｎ１８４Ｄ、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ　；ｄ　１− ４４．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ　；　ｄ　１−４４．１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２ １２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ、ｄ　１−４４，１２１ＯＲ，Ｇ２１ １Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３に、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄｉ−４４，Ｖ２１３に 、Ｆ３０５Ｈｔ　−ＰＡ；ｄｌ−４４，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｃｌ ｌ−４４゜Ｖ２１３に、Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄｉ−４４，Ｉ２１ ＯＫ、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ＋ｄｌ−４４，１２１ＯＲ，Ｇ２１　１Ｈ，に２１２ Ｑ、Ｖ２１３に、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；　１２１ＯＲ，Ｇ２］　ＩＨ，に２１２ Ｑ、Ｖ２１３に、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；　１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄｉ−４４゜Ｎ１８４Ｄ、Ｉ２１ＯＲ，Ｇ ２＋　１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；Ｎ１ ８４Ｄ、１２１０Ｒ，Ｇ２１　１Ａ。

Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９． Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９，１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ， Ｖ２Ｊ３Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９、Ｎ１８４Ｄ、１２１ＯＲ， Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ。

Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９．Ｉ　２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ 、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；Ｙ６７Ｎ、Ｆ３ ０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄｉ−４４，Ｙ６７Ｎ、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ　；およびそのＴ ２５２ＲまたはＮ１８４Ｓ類似体、またはその組み合わせ。（プロテアーゼドメ インにおける変更以外の変更を更に以下に記載する。） これらの内、好ましいチモーゲン変異体は、Ｆ３０５Ｈｔ　−ＰＡ；Ｆ３０５Ｔ ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｎｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｋｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｒｔ−ＰＡ；Ｆ ３０５Ｑｔ−ＰＡ；　１３０４Ｈｔ−ＰＡ；ｄ　１−４４．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ ；ｄ９２−１７９．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ　１−４４．Ｎ１８４Ｄ、Ｆ３０５ Ｈｔ−ＰＡ；ｄ　１−４４゜１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ、ｄｌ−４４，１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ ２１３Ｋ。

Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；　１２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９．Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９゜Ｎ１８４Ｄ、Ｉ２１ＯＲ，Ｇ ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９．Ｎ １８４Ｄ、＋２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ ３０５Ｈ１−ＰＡ；ｄｌ−４４，Ｎ１８４Ｄ、１２１ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１ ２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；およびＮ１８４Ｄ、！２ １ＯＲ，Ｇ２１１Ａ、に２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−Ｐ Ａである。

チモーゲンの第１の種類のより好ましい変異体は、Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；Ｆ３０ ５Ｔｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｎｔ−ＰＡ：Ｆ３０５Ｑｔ−ＰＡ；　１３０４Ｈｔ−Ｐ Ａ；ｄｌ−４４，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ９２−ｉ７９．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡで あり、最も好ましくはＦ３０５Ｈｔ−ＰＡである。

本発明における別の好ましい種類のチモーゲンは、よりフィブリン（または凝固 血漿）特異的であり得る種類の変異体と同様、荷電されたアミノ酸側鎖を有して いることで確認されるプロテアーゼドメインのｌＪ・さな領域を二１またはそれ 以上の変更を有する変異体であり、その領域および／′またはそれに隣接する領 域はその種々の活性に影響し得るその他の物質とｔ−ＰＡの相互作用に関与して いるものである。

この方法によ６活性について試験するために確認された領域は、対応する野生型 ｔ−ＰＡの２６７．２８３−２８７．２９６−２９９、：３０３−３０４．３２ ２．３２６−３２７，３３］　３３２゜３３９−３４２，３４７−３５１，３５ ３−３５６，３６０−３６２．３６４−３６６．３６９−３７１，３７８−３８ ３．３８７−３９２．４００−４０５，４０８，４１０．４１６−４１８．４２ ６−４３０，４３２−４３４，４４０．４４５−４４９．４４９−４５３．４６ ０−４６２．４７１−４７２．４７７．４８７−４８９．５０５−５０６，５１ ３，５１９−５２３．および５２３−５２６の残基番号である。所望の生物学的 特性が得られるか否かを調べるために、これらの領域の１またはそれ以上、また はそのサブユニットを変更させる。荷電された残基（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、 Ｌｙｓ、およびＧ　ｌｕ）を、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｓ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５　（１９８９）に開示されたアラ ニンースキャンユング突然変異誘発法として知られている方法を使用して適切に 確認し、細胞内外の周囲の水性環境とアミノ酸の相互作用に影響するように中性 または負に荷電されたアミノ酸で置換する。

この第２の好ましい種類のチモーゲンおよびフィブリン特異的分子にあると判明 した変異体は、置換されたアミノ酸が対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７．２８３ ＋２８７．２９６−２９９．３０３−３０４．３３１−３３２，３３９＋３４２ ，３４７−３４９＋３５１．３６４−３６６．４０８，４１０．４１６−４１１ ３．４２６−４２７＋４２９−４３０，４３２−４３４．４４０，４４５＋４４ ９．４４９＋４５３．４６０＋４６２．８よび／または４７７位Ｉこある変異体 である。”＋”は表示された位置でのみの置換を示し、−”′は表示された全て の位置での置換を示す。

アラニンスキャンニング突然変異誘発のためには、分子に反対の電荷を与えるよ り、野生型ｔ−ＦＡの対応するアミノ酸の電荷を中和するようにアミノ酸が置換 されるのが好ましい。好ましくは、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、 アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ ンまたはチロノンを包含する、疎水性の、実質上荷電されていないか、反対に荷 電されているアミノ酸を使用することができる。これらの内、バリン、ロイシン およびイソロイシンの様なより大きいアミノ酸より、アラニン、セリンおよびト レオニンの様な小さいアミノ酸が好ましい。アスパラギン酸またはグルタミン酸 の様な荷電されたアミノ酸は、あまり好ましくない。

より好ましくは、置換のために使用されるアミノ酸は、アラニン、セリン、トレ オニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、まｔ：はチロシンであ り、更に好ましくはアラニン、セリンまたはトレオニンである。ベーター炭素上 の側鎖を排除し、野生型ｔ−ＰＡ分子の主鎖立体配置をあまり変更しないので、 アラニンは、この目的のために最も好ましいアミノ酸である。更に、アラニンは 、埋没しているかまたは露出している両位置でしばしば見いだされる（Ｃｒｅｉ ｇｈｔｏｎ、Ｔ、Ｅ、、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（ｅｄｓ、Ｗ、Ｈ ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｎ。

Ｙ、）　；　Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，（１９７６）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　 １５０：ｌ）。

この後者の種類のチモーゲ〉・またはフィブリン（または凝固血漿）特異的変異 体の好ましい変異体は、変異体Ｄ３６５Ａ　ｔ　−ＦＡ、　Ｒ４６２Ｌｔ−ＰＡ 、　Ａ４７３ｓｔ−ＰＡ、ｄ２９６−３０４ｔ−ＰＡ、ｄ２９６−３０２ｔ−Ｆ Ａ、Ｒ２９８Ｅｔ−ＰＡ、Ｒ２９９Ｅｔ−ＦＡ、Ｒ３０４Ｅｔ−ＰＡ、Ｒ３０４ Ｓｔ−ＦＡ、ｄ２９６−２９９ｔ−ｐＡ、およびに２９６Ｅ、Ｒ２９８Ｅ、Ｒ２ ９９Ｅｔ−ＰＡ以列の、ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメイン内に変更を含む変異体 である。

より詳細には、これらは、対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７．２８３．２８７， ２９６．２９７．２９８，２９９，３０３，３０４゜３３１．３３２，３３９， ３４２，３４７，３４８．３４９．３５１．３６４，３６５，３６６．４０８． ４１０，４１６，４１７゜４１８．４２６，４２７，４２９，４３０，４３２， ４３４，４４０．４４５．４４９．４５３．４６０，４６２．または４７７、ま たはその組み合わせの位置に１またはそれ以上の置換を有する変異体である。

より好ましくは、このプロテアーゼドメイン変異体は、対応する野生型ｔ−ＦＡ の２６７．２８３＋２８７，２９６−２９９．３０３　３０４．３３１−３３２ ，３３９＋３４２．３４７−３４９＋３５１．３６４−３６６．４０８．４１０ ，４１６−４１８．４２６−４２７＋４２９−４３０，４３２＋４３４，４４０ ，４４５＋４４９．４４９＋４５３，４６０＋４６２．および４７７位に置換を 有する。′＋″は、その間ではなく示された位置でのみの変更を示し、パ−′′ は、その間の位置を含む示された全ての位置での変更を示す。

更に好ましくは、この後者の種類のチモーゲンまたはフィブリン（まＩ；は凝固 血漿）特異的変異体のプロテアーゼドメイン変異体は、Ｒ２６７Ａｔ−ＰＡ、Ｄ ２８３Ａ、Ｒ２８７Ａｔ−ＰＡ、に２９６Ａ、Ｈ２９７Ａ、Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９ ９Ａｉ−ＰＡ、Ｈ３０３Ａ、Ｒ３０４Ａｔ−ＰＡ、Ｈ３３１Ａ、Ｒ３３２Ａｔ− ＦＡ、Ｒ３３９Ａ、Ｒ３４２Ａｔ−ＦＡ、Ｈ３４７Ａ、Ｈ３４８Ａ、Ｈ３４９Ａ 、に３５１Ａｔ−ＦＡ、０３６４Ａ、Ｄ３６５Ａ、Ｄ３６６Ａ、ｔ−ＦＡ、Ｅ４ ０８Ａｔ−Ｐ、Ａ、Ｅ４１０Ａｔ−Ｐ、Ａ、、に４１６Ａ、Ｈ４１７Ａ、Ｅ４１ ８Ａｔ−ＰＡ、Ｈ４２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４２９Ａ、Ｅ４３０Ａｔ−ＰＡ、Ｈ ４３２Ａ、Ｒ４３４Ａｔ−ＰＡ、Ｒ４４０Ａｔ−ＰＡ。

Ｈ４４５Ａ、Ｒ４４９Ａｔ−ＰＡ、Ｒ４４９Ａ、Ｄ４５３Ａｔ　−ＦＡ。

Ｄ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａｔ−ＦＡ、およびＤ４７７Ａｔ−ＰＡである。

これらの内、最も好ましい置換は、野生型ｔ　−ＰＡの２９６−２９９位に存在 する残基のそれぞれに代わるアラニン残基であり、即ち、Ｋ２９６Ａ、Ｈ２９７ Ａ、Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９９Ａｔ−ＰＡである。

チモーゲンまたはブイプリン特異的活性を示し得る好ましい挿入変異体は、２９ ６．２９７．２９８、および／または２９９位のアミノ酸の後に１またはそれ以 上のアミノ酸が挿入されている変異体でアル。更にこの目的に好ましいのは、チ ロシン、アスパラギン、リシン、アルギニ〕／、またはグルタミンのいずれかを 構成成分とする挿入を有するこれらのプロテアーゼドメイン変異体である。

野生型ｔ　−Ｐ　、Ａに比較した時、チモーゲン的特性を示す天然のむ−ＰＡ分 子のプロテアーゼドメイン（アミン８２６４−５２７）内に１またはそれ以上の アミノ酸変更（欠失、置換、または挿入であるが、好ましくは置換）を有するそ の他の変異体は、以下に挙げたスクリーニング試験の１またはそれ以上を使用し 、確認することができる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体は、チモーゲン的および／またはフィブリン（または凝 固血漿）特異的特性を示すように１またはそれ以上のプロテアーゼドメイン部位 で天然の配列から変更されていることに加え、更に、分子のある種の特性を改善 するために天然の配列のその他の領域において残基の置換、欠失、または挿入を 含むこともある。ただし、ｔ−ＰＡの１本鎖形がその２本鎖形に切断されること を防ぐか、または本発明のプロテアーゼドメインにおける変更によって分子に与 えられた望ましい生物学的特性を変化させる変更が行われないことを条件とする 。これらのその他のドメインにおける好ましい変更は、上の、第１のタイプの最 も好ましいチモーゲン変異体のリストに提供されている。

例えば、本発明の変異体は、好ましくはフィンガードメイン、成長因子トメ・イ ン、および／まｌ；はクリングル２ドメインの少なくとも一部分を欠いているか 、および／またはアミノ酸１８４の周縁のグリコジル化部位にグリコジル化能を 欠いており、好ましくはクリングル１または２の推定リジン結合部位にアミノ酸 変更を有している。

また、ｔ−ＰＡのフィブリン結合は、ｔ−ＰＡのクリングル２ドメインの推定リ ガンド結合ポケットの反対端において正または黄に荷電されたアミノ酸残基で適 当に置換することによって、調整され、最も好ましくは回復されるかまたは増大 されることができる。本発明の変異体は通常、特定部位突然変異誘発または更に 本明細書、以下に記載する切り出し／連結法によって製造される。

この様な変異体の具体例Ｉｉ、アミノ酸１〜４４を欠失している分子（ｄｌ−４ ４で示される）および１８４位にアスパラギン厳を有している分子（Ｎ　ｌ　８ ４　Ｄで示される）を包含する。アミノ酸１〜４４を欠失している変異体は、ｗ ｏ８９１００１９７、前掲に、より完全に記載されている。

上の変異体は全て、修飾がチモーゲン的および／またはフィブリン（または凝固 血漿）特異的特性のために本明細書に示された基準に合うなら、分子の種々のそ の他の領域で修飾されてもよい。この様な修飾Ｉこは、例えば： １、例えば約９２〜１７９の欠失であるクリングルｌの修飾、お２、例えば約１ ７４−２６１の欠失またはアミノ酸約２０５−２１５、特に２１０−２１３の領 域における修飾であるクリングル２の修飾、および／または ３、アミノ酸約２４４−２５５、特に２５２またはその部位、および／または ４、アミノ酸約２３３−２４２、特に２３６−２３８、および／または ５、アミノ酸１８４の様な既知のグリフシル化部位、および／または ６、ＦＲ長因子ドメイン内のグリコジル化がある。要約すると、その成長因子ド メイン内、好ましくは６７−６９位でＮ−または〇一連結グリコシル化する。６ ７位のチロシンがアスパラギン残基で置換されている場合は、ｔ　−ＰＡ分子の 半減期が変わる。

これらの修飾の多くによって、消失速度およびフィブリン結合を、天然のｔ−Ｐ に比較して有意に変更することができる。当業者なら、各変異体のどの最適特性 が個々の場合に望ましいかを適当な検定によって調べることができるであろう。

上の配列の変更を行なうために天然の分子に適当なアミノ酸を変更または挿入す る修飾は、例えば特定部位突然変異誘発、または下記の様に問題のタンパクをコ ードしているＤＮＡに適当な配列を連結すること等の、当業者に既知の方法によ って行われる。

本発明によるｔ−ＰＡ変異体の製造は、タンパクの初期製造変異体またはＩＰ変 異体をコードしているＤＮＡを特定部位突然変異誘発することによって、好適に 行われる。所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードしている特異的オリゴヌクレオ チド配列の使用、および交差結合の両側において安定な二重鎖の形成に十分なサ イズおよび配列複雑さのプライマー配列を提供するために十分な数の隣接ヌクレ オチドの使用により、特定部位突然変異誘発によって、ｔ−ＰＡ変異体を製造す ることができる。通常、約２０〜２５ヌクレオチド長さの、配列の結合の両側で 約５〜１０残基が変更されているプライマーが好ましい。通常、特定部位突然変 異誘発の方法は、Ａｄａｌｍａｎ等、＋：＋ＮＡ、２：１８３　（１９８３）の 様な出版物によって例示されるように、当業者に既知である。

特定部位突然変異誘発法は通常、１本鎖および２本鎖両形態で存在するファージ ベクターを使用することは、理解されるであろう。

特定部位突然変異誘発に有用な代表的ベクターには、例えばＭｅｓｓｉｎｇ等、 Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏ ｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ａ、Ｗａｌｔｏ ｎ編、　ＥＩｓｅｖ：ｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９８１’）によって記 載された如き、Ｍ１３ファージの様なベクターがある。これらのファージは、市 販品として容易に入手し得、その使用は通常、当業者に既知である。また、１本 ｌＤＮＡを得るために、１本鎖ファージの復製起点を含有し、ているプラスミド ベクター（Ｖｅｉｒａ等、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５３：３　（１９ ８７））を使用することができる。

通常、本発明による特定部位突然変異誘発は、先ず、その配列内に、問題のｔ− ＦＡをフードしているＤＮＡ配列を含有している１本鎖ベクターを得ることによ って行われる。所望の突然変異配列を担持しているオリゴヌクレオチドプライマ ーは通常、例えばＣｒｅａ等。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ’ａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７５：５７６５　（１ ９７８）の方法によって、合成的に製造される。次に、このプライマーを１本ｇ ｔ　−ＰＡ配列含有ベクターとアニーリングし、Ｅ、ｃｏｌ　ｉポリメラーゼＩ クレノウフラグメントの様なりＮＡ−ポリメラーゼ酵素に付して、突然変異を有 する鎖の合成を完成する。この様にして、一方の鎖が元の非突然変異配列をコー ドし、他方の鎖が所望の突然変異を有しているヘテロ二重鎖が形成される。次に 、このへテロ二重鎖ベクターを使用してＪＭＩＯＩ細胞の様な適当な細胞を形質 転換腰！２ｐでラベルされた突然変異誘発プライマーを構成成分とする放射活性 なプローブにハイブリダイズさせることによって、突然変異配列を担持している 組換ベクターを含むクローンを選択する。

この様なりローンを選択した後、突然変異ｔ−ＰＡ領域を取り、ｔ−ＰＡの製造 に適当なベクター、通常、典型的には適当な真核細胞の形質転換に使用されるタ イプの発現ベクターに入れる。本発明の場合、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞または２９３（Ｇ「ａｈａｒｒｌ等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、３ ６：５９　（１９７７）によって記載されたヒト腎細胞）が、長期間安定なｔ− ＦＡ生産体の製造に好適である。しかしながら、とりわけ、試験目的のために、 酵素の一時的製造のみを所望する場合、多数のその他の細胞タイプが好適に使用 されることが知られているように、本発明は、ＣＨＯ生産に限定されない。例え ば、下記は、２９３細胞を使用する一時的な系であり、これは分析目的のだめの ｔ　−ＰＡ変異体の製造に好都合な系を提供する。

ｔ−ＰＡをコードしているＤＮＡ配列中に突然変異を設けるためのその他の方法 は、制限酵素で消化することによって、ｔ−ＰＡをコードしているＤＮＡを適当 な位置で切断し、適切に切断されたＤＮＡを回収し、所望のアミノ酸および平滑 末端を有するポリリンカーの様なフランキング領域をコードしているオリゴヌク レオチドを合成しくまたは、ポリリンカーの使用の代わりに、ｔ　−ＦＡをコー ドしているＤＮＡを切断するためにも使用される制限酵素で合成オリゴヌクレオ チドを消化し、それによって粘着末端を作成し）、この合成りＮＡを、ｔ−ＰＡ をコードしている構造遺伝子の残部にライゲートすることを包含する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現は最終的にｔ　−ＰＡの製造に好ま しいが、本明細書に記載のベクターおよび方法は、広範な真核生物ｌこ及ぶ宿主 細胞での使用に好適である。

もちろん、通常、原核細胞は、ＤＮＡ配列の初期クローニングおよび本発明で有 用なベクターの構築に好ましい。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４（ＡＴ ＣＣＮｏ、３１．４４６）およびＥ、ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣＮｏ、２ ７．３２５）は、とりわけ有用である。他の好適な微生物株には、Ｅ、ｃｏｌｉ 　ＢおよびＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ、３１，５３７）の様なＥ 、ｃｏｌ　ｉ株がある。これらの例はもちろん、制限を目的とするものではなく 、例示を目的とするものである。

原核細胞はまた、発現に有用である。前記の株、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ ｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓの様なりａａ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｉ　、および例えばＳａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまｊ；は５ｅｒｒａＬｉａ　ｍａｒｃｅｓａ ｎｓｓおよび種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の様な他のｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ ｅｒｉａｃｅａａは、発現に有用な宿主の例である。

通常、宿主細胞と両立可能な種由来のレブリフンおよびコントロール配列を含有 しているプラスミドベクターを、これらの宿主について使用する。ベクターは通 常、複製部位、および形質転換細胞において表現型の選択を提供し得るマーキン グ配列を有する。例えば、Ｅ−ｃｏｌｉは通常、ｐＢＲ３２２、即ちＥ、ｃｏｌ ｉ種由来のプラスミド（例えば、Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ４二９５　（１９ ７７）参照）を使用して形質転換される。ｐｓＲ３２２は、アンピシリンおよび テトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、それによって、形質転換細胞を 確認するための容易な方法を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド、またはその他 の微生物性プラスミドまたはファージは更に、それ自体のタンノぐりの発現のた めｌ；微生物によって使用され得るプロモーターを含有するか、含有するように 修飾されなければならない。

組換ＤＮＡの構築で最も一般に使用されるこれらのプロモーターは、β−ラクタ マーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、Ｎ ａｔｕｒｅ、３７５：６１５（１９７８）　；　Ｉｔａｋｕｒａ等、５ｃｉｅｎ ｃｅ、１９８：１０５６１９７７）　；　Ｇｏｃｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ、２ ８１　：５４４（１９７９））およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系 （Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、４：４０５７（１９８０ ）　＋　Ｅ　Ｐ　Ｏ出願公開！３６，７７６号）およびアルカリ性ホスファター ゼ系を包含する。これらは最も一般に使用されるが、その他の微生物性プロモー ターが発見されて使用されており、そのヌクレオチド配列に関す乙詳細は公開さ れているので、それによって、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に ライゲートさせることができる（例えば５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、　Ｃｅ　ｌ　 ｌ　、　２０　：　２６９（１９８０）参照）。

原核生物以外に、酵母の様な真核微生物も、本発明で好適に使用される。Ｘ核微 生物の内、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通常の製 パン用酵母が最も一般に使用されるが、多数のその他の株が通常利用可能である 。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現のためには、プラスミドＹ 　Ｒｐ　７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７ ９）　；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、Ｇｅｎｅ、Ｚ：１４１（１９７９）　：　Ｔｓ ｅｈｅｍｐｅｒ等、Ｇｅｎｅ、１０：１５７（１９８０））が通常、使用される 。このプラスミドは既に、トリプトファンにおいて成長能のない酵母の突然変異 株、例えばＡ　Ｔ　ＣＣＮｏ、４４，０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マ ーカーを提供するエニｐ１遺伝子を含有している（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ、８５：　１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてｔｒｐｌ変 異が存在することは、更に、トリプトファンの非存在下での成長によって形質転 換を検出するための効果的な環境を提供する。

酵母ベクターにおける好適なプロモーティング配列は、３−ホスホグリセレート キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等山Ｂｉｏ１．Ｃｂｅｍ、　、２５５＋２０７３（ １９８０））またはその他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ等、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ 　Ｒｅｇ、、７：１４９（１９６８）；Ｈｏ１ｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、　１７：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデ ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル ボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グメレコース−６−ホスフェートイソ メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホ スフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ を包含する。好適な発現プラスミドの構築では、これらの遺伝子に関連する終止 配列を更に、発現ベクターの発現させようとする配列の３′にライゲートし、ｍ ＲＮＡのポリアデニル化および終止を得る。

成長条件によってコントロールされる転写の利点を更に有するその他のプロモー ターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ，酸ホスファター ゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前記グリセルアルデヒド−３−ホスフ ェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関与す る酵素のためのプロモーター領域である。酵母と両立し得るプロモーター、複製 起点および終止配列を含有しているプラスミドベクターが好適である。

微生物以外に、多細胞生物由来の細胞培養も、宿主として使用し得る。原則とし ては、背椎動物培養由来であっても無腎椎動物培養由来であっても、この様な細 胞培養を利用することができる。しかしながら、関心はを椎動物細胞において最 も大きく、近年では、培養（組織培養）中、を椎動物細胞の増殖が常法となっｆ ：　［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋ ｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　ＩＩ　（１９７３）］。この様な有 用なセルラインの例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯセルライン、およ びＷ２Ｂ５、ＢＨＫ％ＣＯ３−７，２９３、およびＭＤＣＫセルラインである。

この様な細胞のための発現ベクターは通常（必要に応じて）、複製の起点、発現 させようとする遺伝子の前に位置するプロモーター、並びに必要なリポソーム結 合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を含 有する。

哺乳動物細胞で使用するためには、発現ベクター上の制御機能はしばしば、ウィ ルス性物質によって提供される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリ オーマ、アデノウィルス２、および最も頻繁にはＳ　１ｍ１ａｎウイルス４０（ Ｓｖ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期両プロモーターはＳ Ｖ４０ウィルスの複製起点をも含有するフラグメントとしてウィルスから容易に 得られるので、これらはとりわけ有用である（Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、２ ７３：１１３（１９７８））。ウィルスの複製起点に位置しているＨｉｎｄＩＩ ［部位からＢｇｌＩに及ぶ約２５０ｂｐ配列が含有されている限り、より小さい かまたはより大きいＳＶ４０フラグメントも好適に使用される。更に、この様な 制御配列が宿主細胞系と両立し得る限り、所望の遺伝子配列に通常関連している プロモーターまたは制御配列を使用することも可能であり、しばしば望ましい。

復製起点は通常、ＳＶ４０またはその他のウィルス性（例えば、ポリオーマ、ア ゾｙ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源に由来し得るような、外来の起点を含有するベク ターの構築、または宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供される。ベクタ ーが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者はしばしば十分である。

細胞培養によって十分量のヒ）ｔ−ＰＡが産生されるが、第２のコード配列を使 用する改良が、更に産生レベルを高めるのに役立つ。

第２のコード配列は、外部的に制御されるパラメーター、例えばメトトレキセー ト（ＭＴＸ）によって影響されるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含有 し、それにより、ＭＴＸ濃度の制御によって発現を制御することができる。

変異体ｔ−ＰＡおよびＤＨＦＲタンパクの両者をコードしているＤＮＡ配列を含 有している本発明のベクターによって形質転換するのに好ましい宿主細胞の選択 においては、使用するＤＨＦＲタンノくりのタイプを考慮するのが適切である。

野生型ＤＨＦＲタンノくりを使用する場合、ＤＨＦＲを欠いている宿主細胞を選 択するのが好ましく、これによって、ヒボキサンチン、グリシンおよびチミジン を含んでいない選択培地における適切なトランスフェクトのためのマーカーとし て、ＤＨＦＲをコードしている配列を使用することができる。この場合の適切な 宿主細胞は、ＬｌｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、ｓｃｉ　、（ＵＳＡ）７７：４２１６（１９８０）によって記載された様に して製造および増殖されｆ＝、ＤＨＦＲ活性を欠いてしλるＣＨＯセルラインで ある。

一方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンノ（りを制御配列と して使用する場合、ＤＨＦＲＨＦ性細胞を使用する必要はない。突然変異体ＤＨ ＦＲはＭＴＸに耐性なので、宿主細胞がそれ自体ＭＴＸ感受性であることを条件 として、選択手段としてＭＴＸ含有培地を使用することができる。ＭＴＸを吸収 し得る大部分の真核細胞は、ＭＴＸに感受性であるらしい。その様な有用なセル ラインの１つは、ＣＨＯラインである、ＣＨＯ−Ｋ　１（ＡＴＣＣＮｏ、ｃｃＬ ６１）である。

哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは通常、Ｇ ｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：５４６（１ ９７８）による記載に従い、リン酸カルシウム沈澱法によって行われる。しかし ながら、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合の様な、細胞にＤＮＡを 導入するためのその他の方法も好適に使用される。

酵母を宿主として使用する場合、トランスフェクションは通常、Ｈｉｎｎｅｎ　 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ　、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、　 ７５　：１９２９−１９３３（１９７８）に謔驪■ 示に従い、ポリエチレングリコールを使用して行われる。

原核細胞または寅買上細胞壁構築物を含有している細胞を使用する場合、好まし いトランスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）６９：２１１０（１９７２）による記載に従いカ ルシウムを使用するカルシウム処理、まｔ；はより最近は電気穿孔法である。

所望のコード配列および制御配列を含有している好適なベクターの構築は、通常 のライゲーション法を使用する。分離したプラスミドの製造に望ましい形態に再 ライゲートする。

適当な緩衝液中、制限酵素（または酵素）で処理することによって、切断を行な う。通常、約２０μｌの緩衝液中、約１単位の酵素について、約１μｇのプラス ミドまたはＤＮＡが使用される。（個々の制限酵素のための適当な緩衝液および 基質の量は、製造業者によって指定される。）３７°Ｃで約１時間のインキュベ ート時間が使用される。インキュベート後、フェノールおよびクロロホルムで抽 出してタンパクを除去し、エタノール沈澱によって、水性画分から核酸を回収す る。

平滑末端が必要な場合、ＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ）のクレノウフラグメ ント１０単位と一緒に１５℃で１５分間、標本を処理し、フェノール−クロロホ ルム抽出し、エタノール沈澱させることができる。

切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅ　１等、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅミドゲルを使用して行われる。

ライゲートのためには、正しく適合するように好適に組み立てられた、はぼ等モ ル量の所望の成分を、０．５μｇＤＮＡ当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ で処理する。（切断されたベクターを成分として使用する場合、細菌性アルカリ 性ホスファターゼで予め処理することによって、切断されたベクターの再うイゲ ーンヨンを防ぐことが有用かもしれない、） 上で議論したように、ｔ−ＦＡ変異体は、特異的突然変異法によって好適に製造 される。本発明の方法で有用な変異体は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をフード している特異的オリゴヌクレオチド配列、並びに交差している突然変異の両側で 安定な二重鎖の形成に十分なサイズおよび配列複雑さの配列を提供するのに十分 な数の隣接ヌクレオチドを使用することによって、最も容易に製造される。

構築されたプラスミド中の正確な配列を確認する分析のためには、通常、ライゲ ージｇン混合物を使用してＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１， ４４６）またはその他の適当なＥ、ｃｏｌｉ株を形質転換し、良好な形質転換体 を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体 からプラスミドを調製し、制限地図、およＡ配列決定によって分析する。

哺乳動物細胞宿主にＤＮＡを導入し、安定な形質転換体について培地中で選択し た後、約２０，０００−５００．０００ｎＭ濃度のＭＴＸ、ＤＨＦＲ活性の競合 阻害剤の存在下で宿主細胞培養を増殖させることによって、ＤＨＦＲ−タンパク をコードしている配列を増幅させる。有効な濃度範囲はもちろん、ＤＨＦＲ遺伝 子およびタンパクの性質および宿主の特性に大いに依存する。明らかに、一般的 に定義された上限および下限を確認し得ない。ＤＨＦＲを阻害するその他の葉酸 類似体またはその他の化合物の好適な濃度も使用することができる。しかしなが ら、ＭＴＸそれ自体は、好適であり、容易に入手し得、有効である。

実施例を簡潔にするために、幾つかのしばしば出てくる方法を、短縮した句によ って表わす。

゛′プラスミド″′は、小文字の９１次いで英数字表示によって表わされる。本 発明の出発プラスミドは市販品として入手し得、制限なく誰でも入手し得るか、 または公開された方法に従ってその様な入手し得るプラスミドから構築すること ができる。また、他の等価のプラスミドは当該技術分野で知られており、当業者 には明らかとなろう。

Ｄ　Ｎ　Ａの゛消化′°とは、ＤＮＡの特定の位置でのみ作用する酵素によるＤ ＮＡの触媒的切断を意味する。この様な酵素は、制限酵素と呼ばれ、それぞれが 特異的である部位は制限部位と呼ばれる。本発明で使用した種々の制限酵素は市 販品として入手し得、その反応条件、コファクター、および酵素供給者によって 確立されたその他の必要要件を使用した。制限酵素は通常、大文字、次に各制限 酵素が起源として得られた微生物を表わすその他の文字、次に個々の酵素を示す 数字で構成された略語によって表わされる。通常、約１μｇのプラスミドまたは ＤＮＡフラグメントを、約２０μｍの緩衝液に入れた約２単位の酵素と一緒に使 用する。各々の制限酵素のために適当な緩衝液および基質の量は、製造業者によ って具体的に示されている。通常、３７°Ｃで約１時間のインキュベート時間が 使用されるが、供給者の指示に従って種々であってよい。インキュベート後、フ ェノールおよびクロロホルムで抽出することによってタンパクを除去し、エタノ ールで沈澱させることによって水性画分から消化された核酸を回収する。制限酵 素による消化の後に、まれに末端５″リン酸の細菌性アルカリ性ホスファターゼ 加水分解を行い、ＤＮＡフラグメントの制限切断された２つの末端が、制限部位 における他のＤＮＡフラグメントの挿入を妨げるようにパ環形成″することまた は閉じたループを形成することを防ぐ。特に断らない限り、プラスミドリ消化の 次に５′末端脱リン酸化は行なわない。脱リン酸化のための方法および試薬は、 通常のものである（Ｔ、ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐｐ、１３３−１３４）。

制限消化から得られたＤＮＡフラグメントの“回収″または゛″単離パとは、電 気泳動法によって、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルで消化物を分離し 、その移動度を既知の分子量のマーカーＤＮＡフラグメントのそれと比較するこ とによって、問題のフラグメントを同定し、所望のフラグメントを含有している ゲル部分を採取し、ＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この方法は、広 範に知ｌ；い。

′″サザン分析パは、消化物まｌ；はＤＮＡ含有成分中のＤＮＡ配列の存在を、 既知のラベルされたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントにハイブリダ イズさせることによって確認する方法である。

本明細書の目的のために、特に断らない限り、サザン分析とは、Ｅ。

５ｏｕｔｈｅｒｎ、ｌ９７５．Ｊ、Ｍｏ＋、Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７の 方法およびＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等。

法による、ｌパーセントアガロースでの消化物の分離、変性、およびニトロセル ロースへの移動を意味する。

“形質転換″とは、染色体外エレメントまたは染色体組み込み体として、ＤＮＡ が復製可能な生物に、ＤＮＡを導入することを意味する。特に断らない限り、Ｅ 、ｃｏｌｉの形質転換のために本発明で使用する方法は、Ｍａｎｄｅｌ等、１９ ７０．Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５３：１５４のＣａＣＩｚ法である。

゛′ライゲーション″は、２つの２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル 結合を形成させる方法を意味する（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前記ｐ。

１４６）。特に断らない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件を使 用し、ライゲートしようとするほぼ等モル量のＤＮＡ７ラグメント０．５μｇ当 たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（”　ｌ　ｉｇａｓｅ”）を用いて行うこと ができる。

形質転換体からのＤＮＡの“調製″とは、微生物培養からプラスミドＤＮＡを単 離することを意味する。特に断らない限り、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前記ｐ、９０ のアルカリ性／ＳＤＳ法を使用することができる。

゛オリゴヌクレオチド”とは、既知の方法によって化学合成され、次いでポリア クリルアミドゲルで精製される短い１本または２本鎖のポリデオキシヌクレオチ ドである。

本発明の化合物は、本発明のｔ−ＰＡ産物を、薬学的に許容し得る担体ビヒクル と混合することによる、薬学的に有用な組成物を製造するための既知の方法によ って製剤化することができる。好適な担体ビヒクル、および他のヒトタンパク、 例えばヒト血清アルブミンを包含するその製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、１９８０．Ｍ ａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、、０ｓｌｏ等編に記載されている。

この様な組成物は通常、有効量の本発明変異体例えば約０．５〜約５ｍｇ／＋＋ ＋］と一緒に、宿主への効果的な投与に好適な薬学的に許容し得る組成物を製造 するために適当な量の担体ビヒクルを含有する。

本発明のｔ−ＰＡ変異体は、心血管の疾患または症状に罹患してい証するその他 の方法によって投与することができる。

本発明の方法で使用される変異体ｔ　−ＦＡ産物の臨床的投与にとりわけよく適 合している組成物は、例えば、滅菌水溶液、または凍結乾燥しｌ：タンパクの様 な滅菌水化性粉末を包含する。通常、製剤中に更に適当量の薬学的に許容し得る 塩を、通常、製剤を等優性に維持するのに十分な量で含んでいるのが望ましい。

通常、アルギニン塩基、およびリン酸の様なｐＨ［節剤も、通常５．５〜７．５ である適切なｐＨを維持するのに十分な量で含有させる。更に、水性製剤の貯蔵 寿命または安定性を改善するために、更にグリセロールの様な薬物を含有させる のが望ましいことがある。この様にして、変異体ｔ−ＰＡ製剤を、非経口投与、 とりわけ静脈内投与に好適にする。

本発明の医薬組成物の投与量および望ましい薬物濃度は、計画される個々の用途 によって、異なり得る。例えば、深血管血栓または末梢血管疾患の治療では、通 常、約０８０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇのオーダーの゛ポーラス′°投与量が好ま しく、次いで、はぼ一定の血中濃度、好ましくは約３μｇ／ｍｌのオーダーに維 持するために、約０．１〜約０．２ｍｇ／ｋｇのオーダーの投与が行われる。

しかしながら、通常、注入（インクニージョン）設備のない緊急医原機関で使用 するために、および問題としている疾患が通常危険なものである（例えば、塞栓 症、梗塞）ために、通常、約０　、３　ｍｇ／ｋｇのオーダーの静脈内１回投与 の様な、幾分大きい初期投与量を与えるのが望ましいであろう。

例えば、本発明のｔ−ＦＡ変異体は、心臓血管の疾患または症状に罹患している 患者に非経口投与されるのが好ましい。投薬量および投与速度は、例えば、心筋 梗塞、肺塞栓症、等に罹患しているヒトの患者における１、５〜１２時間での静 脈内まｌ；は動脈内投与量として約１−２　ｍｇ／ｋｇ体重の様な、他の心臓血 管性血栓溶解剤の臨床研究で現在使用されているのと同等またはそれより高くす ることができる。しかしながら、本発明の変異体は、野生型ｔ−ＦＡより低い副 作用を有し、より速くより完全な血餅溶解を導くので、より高い投与量を許容す ることができる。

好適な投与剤型の１例としては、５０ｍｇｔ−ＰＡ、アルギニン、リン酸、およ びポリソルベート８０を含有しているバイヤルを、注射用滅菌水５０＋＋＋２で 再構成し、適当容量の０．９パーセント塩化ナトリウム注射剤と混合する。

本発明のｔ−ＰＡ変異体は、フィブリンの沈着または付着の形成または再形成を 予防するためにも有用である。この用途の１態様は、１９８９年１月１２日公開 のＰ　ＣＴ　Ｗ　Ｏ８９１０００４９に記載されている。通常、この様な治療は 、フィブリンまたは付着形成する可能性のある部位への組成物の局所投与を含む 。組成物は、治療的有効量のｔ−ＰＡ変異体を、約３日〜２週間、その部位で連 続的に放出される難溶性形態で含有する。通常、手術、感染、外傷、または炎症 後のフィブリンの沈着または付着の形成を予防するのに十分な投与量で、ｔ−Ｆ Ａ変異体を投与する。通常、この量は、０．０２ｍｇ／ｇゲル〜２５ｍｇ／ｇゲ ル、好ましい量は０．２０ｍｇ／ｇゲル〜約２−５ｍｇ／ｇゲＪＬ＝。

最も好ましくは０．２５ｍｇ／ｇ〜約１．０ｍｇ／ｇゲルである。

付着の形成を予防するＩこめにｔ−ＰＡが通常製剤化されるビヒクルは、付着形 成の可能性のある部位に酵素を位置させるための、半固形、粘性の薬学的に不活 性な担体である。この様な担体は、長鎖炭水化物または植物油、および飽和およ び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物または修飾された飽和および不飽和脂肪酸グ リセリドの混合物からなるワックスを包含する。例には、半固形ビヒクル、例え ば石油ゼリーまたは半合成グリセリド、ポリヒドロキシ溶媒、例えばグリセロー ル、長鎖炭水化物、生体侵食性ポリマー、またはリボ以下の実施例は、単に、本 発明を行うために現在知られている最も好適な方法の例示を意図するものであり 、本発明がこれらに限定されると理解されるべきではない。

実施例１ １、プラスミドｐ７−ＩＨの構築 ａ）プラスミドｐＣＩＳｔ−ＦＡ 以下の様にして、プラスミドｐｃ１ｓｔ−ＦＡを製造した。要約すると、サイト メガロウィルスのエンハンサ−およびプロモーター、サイトメガロウィルスのス プライス供与部位およびイントロン、１ｇ可変領域スプライス受容部位、ｔ−Ｐ ＡをコードしているｃＤＮＡ（Ｐｅｎｎｉｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ、３０１　：２ １４（１９８３））および肝炎表面抗原ポリアデニル化および転写終止部位を含 有しているベクターｐｃＩＨｔ−ＰＡを最初に構築した。

サイトメガロウィルスのエンハンサ−（Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅ１１，４１：５ ２０（１９８５））８よびプロモーター（Ｔｈｏｍｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ Ｊ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８１：６５９（１９８４））、サイト メガロウィルスのスプライス供与部位およびイントロンの一部分（Ｓｔｅｒｎｂ ｅｒｇ等、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、４９＋１９０（ｔ９８４））、１ｇ可変領域 イントロンおよびスズライス受容部位、第■因子をコードしているｃＤＮＡ、８ よびＳＶ４　Ｑポリアデニル化部位を含有しているベクターｐＦ　８　ＣＩ　Ｓ を４１１１ＪＬ、た。構築の３部分を以下に説明する。

ｌ、アンピシリン耐性マーカーおよび最終ベクターの複製起点は、出発プラスミ ドｐＵＣ１３ｐＭＬ、　プラスミドｐＭ　Ｌ　（Ｌｕｓｋｙ等、Ｎａｔｕｒｅ。

２９３ニア９（１９８１））の変異体に由来しｆ；、ｐｕＣｌ　３ｐＭＬは、ｐ Ｕｃ１３（Ｖｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ、　１９：２５９（１９８２））のポリリン カーをｐＭＬのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃｌＩｎ部位に移すことによって構築さ れた。第２の出発プラスミドｐＵｃ８ｃＭｖは、ＣＭＶエンハンサ−、プロモー ターおよびスプライス供与配列の供給源であった。ｐＵｃ８ｃＭＶは、ＣＭＶエ ンハンサ−、プロモーターおよびスプライス供与配列のためのヌクレオチｎ〜７ ３２をｐＵｃ８の平滑化されたＰｓｔＩおよび５ｐｈ１部位に挿入することによ って構築されたーＶｉｅｒａ等、前掲。合成りａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｎリンカ −（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓがら市販品として入手可能）を、 粘着ＢａｍＨＩ末端にライゲートし、ＨｉｎｄＩ１１部位を作成した。このライ ゲーションの後、Ｈｉｎｄｍ　−Ｈｉｎｃ　ｎ消化を行った。この消化ｉ：よっ て、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびゲル分離後、この８００ｂｐ７ラ グメントをｐＵＣｌ　３ｐＭＬ（７）２９００ｂｐ断片にライゲートした。１） Ｆ８ＣＴＳの構築のために必要なフラグメントは、上の中間体プラスミドを５ａ ｌｌおよび）（ｉｎｄｎ［で消化することによって得た。この３１２３ｂｐ断片 は、アンピシリンのための耐性マーカー、ｐＵｃ１３ｐＭＬ由来の複製起点、お よびエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス供与部位を包含するＣＭＶの ための制御配列を含有した。

２、合成オリゴマーを使用し、Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライス受容配 列を構築した。ＩｇＧイントロンおよびスプライス受容部位のための以下の配列 ： １　３”−ＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧ丁ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡ− ５’を有する９９−マーおよび３０−マーを、化学的に合成した（Ｂｏｔｈｗａ ｌｌ等、Ｃｅ１１，２４：６２５（１９８１））。

ＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウフラグメント）によって、合成断片を充填し、 二重鎖フラグメントを製造した（Ｗａｒｔｅｌｌ等、　Ｇｅｎｅ　、　９　：３ ０７（１９８０）。この後、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで二重に消化した。

この合成リンカ−をｐＵ　Ｃｌ　３　（Ｖｅｉｒａ等、前掲）のＰｓｔＩ８よび Ｈｉｎｄ［［部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチド、ラベルされたｐＵ ｃＩｇ。

１０を含何しているクローンをＰｓｔＩで消化した。Ｐｓｔｒ−Ｃ１ａｌリンカ −の使用によって、このフラグメントにＣｌａＩ部位を付加した。ＨｉｎｄｌＩ Ｉで消化した後、１ｇ可変領域スプライス受容体および１ｇイントロンの一部分 を含有している１１８ｂｐ断片をゲル分離した。

３、構築反応式の第３部分は、肝炎表面抗原３′末端を、ＳＶ４０の初期領域の ポリアデニル化部位および転写終止部位で置換した。

ベクター、ＳＶ４０の配列を含有シティるｐＵｃ、５Ｖ４Ｑを、Ｖｅｉｒａ等、 前掲に記載されたｐＵｃ３のＢａｍＨＩ部位に挿入した。次いで、ｐＵｃ、５Ｖ ４０をＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化した。５Ｖ４０（７）ポリアデニル化部 位のみを含有している１４３ｂｐフラグメントを、この消化物からゲル分離した 。ｐｓＶＥ、８ｃｌ　Ｄ（ＥＰＯ公開第１６０゜４５７）の消化後、更に２種の ７ラグメントをゲル分離した。Ｅｃ。

ＲＩおよびＣ１ａｌ消化によって作成された４、８ｋｂフラグメントは、ＳＶ４ ０−ＤＨＦＲ転写ユニット、ｐＭＬの複製起点、およびアンピシリン耐性マーカ ーを含有する。Ｃ１ａｌおよびＨｐａＩで消化することによって製造された７、 ５ｋｂフラグメントは、第■因子のためのｃＤＮＡを含有している。３部分ライ ゲーションによって、ｐＳＶＥ、８ｃ２４Ｄを製造した。この中間体プラスミド をＣ１ａｌおよび５ａｌｌで消化し、第■因子のためのｃＤＮＡと共にＳＶ４０ ポリアデニル化および転写終止部位次いで５Ｖ４０ＤＨＦＲ転写ユニツトをを含 有している９６１１ｂｐフラグメントを得た。

ｐＦ８ｃＩｓを製造するための最後の３部分ライゲーションは：ａ）複製起点、 アンピシリン耐性−Ｊ−カーおよびＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびス プライス供与体を含有している３１２３ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄＩ［フラ グメント；ｂ）１ｇイントロンおよびスブライス供与体を含有している１　１８ ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［［−ＣＩａＩフラグメント：およびＣ）第■因子のためのｃ ＤＮＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、およびＳＶ４０　ＤＨＦＲ転写ユニット を含有している９６１１ｂｐ　Ｃ１ａＮ−３ａｌＩフラグメントを使用した。

次に、中間体プラスミドｐｃｌａｔ−ＦＡおよびプラスミドｐＦ８ＣＩｓ（上記 ）からプラスミドｐｃＩＨｔ−ＦＡの構築を完成させた：先ず、ｔ−ＰＡｃＤＮ ＡをｐＭＬにクローンし、遺伝子の５′末端にＣｌａＩ部位を与えた。これを行 うために、ｐＳＶｐａ−ＤＨＦＲ（またはｐＥＴＰＦＲと呼ぶ、前掲）由来の３ ２３８ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［［フラグメントをｐＭ　Ｌ　（Ｌｕｓｋｙ等、前掲） のＨｉｎｄＩ［１部位に挿入した。ｃＤＮＡの５′末端がＣｌａｌ部位に並置さ れたクローンについて、コロニーをスクリーニングした。中間体プラスミドは、 ラベルされたｐＣＬＡｔ−ＰＡであった。次に３′ポリアデニル化領域が統＜ｔ −ＰＡｃＤＮＡを、２８７０ｂｐのＣ１ａＩ−ＫｐｎＩ７ラグメントとして単離 シタ。

このフラグメントをｐＦ８ｃＩｓの５１４６ｂｐフラグメントにライゲートした 。ＣＩＳベクターのこのＣＩａＩ　−ＫｐｎＩ　７ラグメントは５′制御領域、 ＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット、アンピシリン耐性遺伝子、およびｐＭｌ−由 来のオリジン領域を提供した。第２図参照。

通常、自体既知であるか、または前記の方法に従い、ＣＨＯまたは２９３細胞を ｐＣＩＨｔ−ＰＡでトランスフェクトすることによって、ｔ−ＦＡの発現レベル を得た。トランスフェクトされた２９３細胞からの培地を例えば分析し、ｐｃＩ Ｈｔ−ＰＡがｔ−ＰＡ４２０ｎｇ／ｍｌを産生じたことを証明した。

最後に、サイトメガロウィルスのエンハンサ−およびプロモーター、サイトメガ ロウィルスのスプライス供与部位およびイントロン、Ｉｇ可変領域スプライス受 容部位、ｔ−ＰＡをコードしているｃＤＮＡｌおよびｐｓＶ４０のポリアデニル 化配列を含有しているベクターｐＣＩ　Ｓ　ｔ−ＰＡを、以下の様にして構築し た：この構築のだめの出発ベクターは、ｐＣＩＨｔ−ＰＡおよびｐＦ８ＣＩＳ（ 前掲）であった。後者のベクターはｐｃｒＨｔ−ＰＡと同じ５′コントロールを 有するが、第■因子のためのｃＤＮＡおよびＳＶ４０のポリアデニル化部位を含 有している。５ａｃＩ［を使用し、を−Ｐ　ＡｃＤ　Ｎ　Ａの３′を切断した。

得られた３′突出端をＴ４ポリメラーゼによって平滑化した。次に、ｐＣＩＨｔ −ＰＡをＣ１ａＩで切断した。この部位はＣＭＶイントロン配列およびＩｇ可変 領域イントロン間を分断しているキメライントロンを分離する。２８７０ｂｐフ ラグメントをＣ）ａＩ処理物からゲル分離した。ＳＶ４０のポリアデニル化部位 、ＤＨＦＲ１転写コントロール、細菌性複製起点、およびａｍｐ’遺伝子、およ びＣＭＶエンハンサ−およびプロモーターおよびスプライス供与体を、ｐＦ８Ｃ ＩＳから分離した。これらのエレメントを２５２５ｂｐ　Ｓａｌｌ−ＢａｍＨＩ フラグメントおよびＨｌ）ａＩ−３ａｌおよび３１］３ｂｐフラグメントとして 、フラグメントに分離した。ＫｐｎＴ（平滑）−ＣｌａＩフラグメントとＨｐａ Ｉ−８ａｔフラグメントおよびＳａｌからＢａｍＨＩの７ラグメントの３部ライ ゲーションによってｐｃＩｓｔ−ＦＡを製造し、プラスミドｐＣＩＨｔ　−ＦＡ のために上で説明したのと同様にしてＣＨＯおよび２９３の両細胞で発現させ、 それぞれ５５および３０００　ｎｇ／ｍｌのｔ　−ＰＡを得た。

第３図を参照されたい。

ｂ）ｐ７−ＩＨの最終構築 プラスミドｐＣＩＳｔ−ＰＡを５ｐｅＩで消化し、次いで、Ｅ−ｃｏｌｉＤＮＡ ポリメラーゼＩの大きいフラグメント（フレノウ）およびデオキシリポヌクレオ シド３リン酸で処理し、平滑末端を作成しｔ；。得９８５）の記載に従い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートし、１本鎖ＤＮＡ７アージ、ｆ１起点の十 鎖起点を含有している０、４５　ｋｂ　Ｒｓａ　Ｉ　／　Ａｈａｎｌフラグメン トとした。ライゲーション産物は、ｐＣＩＳｔ−ＰＡフラグメントの５ｐｅＩ部 位に両方の可能な方向性で挿入されたｆｌの起点と共に分離された。ｔ−ＦＡ遺 伝子のアンチセンス鎖かへルバーファージの存在下でピリオンに充填された様な 方向性でこの起点を含有しているプラスミドを選択し、ｐ７−ＩＨと命名した。

第４図を参照されたい。

２、発現プラスミドの突然変異誘発 ａ）鋳型の製造 ＣａＣ１ｔを介する形質転換によって、プラスミドｐ７−ＩＨをＥ、ｃ。

１１株ＪＭＩＯ１（ＡＴＣＣＮｏ、３３．８７’６）に導入した。次に、Ｖｅｉ ｒａ等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ　、　、１５３：３（１９８７）の記載と同 様にして、これらの細胞をヘルパーウィルスＭ１３ＫＯ７で感染させ、１末鎖ｐ ７−ＩＨＤＮＡを調製した。要約すると、２ＹＴグロスに形質転換細胞を入れた 飽和培養０．３ｍｌに、Ｍｌ　３に０７　１０’−１０１ｏｐｆｕを加え、この 混合物を１５分間、３７℃でインキュベートした。５０μｇ／ｍｌのカルベニシ リンを含有している別の２ＹＴブロス１．５ｍｌを加え、この培養物を３７°Ｃ で１６時間、穏やかに振とうした。細胞をペレット化した後、７アージおよび充 填されたプラスミドＤＮＡを集め、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、、９：３０１５（１９８１）の記載と同様にして１本ＭＤＮＡを製造し た。

ｂ）特定部位イン・ビトロ突然変異誘発突然変異ｐｈｅ３０５−ｈ　ｉ　５３０ ５を有する突然変異体を、グラークハイプリダイゼーションではなくコロニーハ イブリダイゼー００　：　４６８（１９８３）の記載に従い、オリゴデオキシリ ボヌクレオチド、５’−ＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＧＧ−３ ’を使用し、ｐ７−ＩＨに突然変異を誘発した。ジデオキシヌクレオチド鎖終止 法（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、（Ｕ、Ｓ、Ａ 、）７４：５４６３（１９７７））を使用し、１本鎖プラスミドＤＮＡにて直接 、ＤＮＡ配列決定することによって、突然変異を確認した。

３、発現および精製 ａ）プラスミドの製造 形質転換した細胞を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有している５００ｍ １ＬＢグロス中で飽和まで増殖させた。遠心によって細胞をペレット化し、５０ ｍＭグルコース、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ、２５ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０） ４０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液に、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０７ Ｍ　ＮａＯＨ６０ｍ１を加え、この混合物を２５℃で２分間、次いで０℃で１０ 分間インキュベートした。これに、４Ｍ酢酸、３Ｍ酢酸ナトリウム５２１１１１ を加え、混合物を３０分間、０℃でインキュベートした。次に、これをｌｌ。

５００　ｒｐｍで２０分間遠心し、上溝を２倍容の１００％冷二り／−ルと混合 し、生成した沈澱を遠心によって集めた。プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡを含有 しているペレットを乾燥させ、１００ｍＭトリス（ｐＨ８，０）、ｌ　ＯｍＭ　 ＥＤＴＡ、ｌ　μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡに再溶解させた。得られた溶液を遠心 によって澄明にした後、これを臭化エチジウム中、０．５ｍｇ／＋＋＋ｌに調節 し、等重量のＣｓＣ１を加えた。

次いで、ＤＮＡを、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＶＴ１６５０−ターにて、５５，０００ｒ ｐｍ、１８℃で１６時間遠心した。ＤＮＡバンドをサイドバンクチュアーによっ て集め、ｎ−ブタノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、Ｈ，Ｏで希釈し、 エタノールによって沈澱させた。ＤＮＡを、ｌＯ＋ｎＭトリス（ｐＨ８，０）、 １ｍＭＥＤＴＡに再溶解し、１ｍｇ／ｍｌの終濃度にした。

ｂ）トランスフェクションおよび発現 ２９３細胞を全面成長まで増殖させた。ｔ−ＰＡプラスミドＤＮＡ変異体１０μ ｇを、ＶＡ　ＲＮＡ遺伝子（Ｔｈ　ｉｍｍａｐｐａｙａ等、Ｃｅｌ　１．３１　 ＋５４３（１９８２））をコードしているＤＮＡ　Ｉ　ｐｇと混合し、ＩｍＶト リス−ＨＣｌ、Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣ１ｚ（５００μｌ ）に溶解した。これに、５０ｍＭ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　５（ｐＨ７，３５）、２８Ｑ ｍＭＮａｃＩ、１．５ｍＭ　ＮａＰＯ＋（５００μｌ）を加え（撹拌下に滴下す る）、２５℃で１０分間、沈澱を生成させた。次に、懸濁した沈澱を細胞（１０ ０ｍＭプレート）に加え、インキュベーターにて４時間、静置した。次いで、培 地を吸引して除去し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中２０％グリセロール２ｍ ｌを３０秒間で加えた。血清不含の培地５ｍｌで細胞を２回洗浄し、次に新たな 培地を加え、細胞を５日間ｔ−ＦＡ変異体を発現している安定なＣＨ○セルライ ンを作成するために、ｔ−ＰＡをコードしている配列の大部分を含有している１ 、４ｋｂ　ＢｇｌＩ［／Ａｐａ！フラグメント（Ｂｇ１１１部位は完全長ｔ−Ｆ ＡをコードしているＤＮＡのコドン−１〜１にあり、ＡｐａＩ部位は完全長のｔ −ＦＡをコードしているＤＮＡのコドン４６５〜４６６にある）を、ベクター、 ｐＰＡＤＨＦＲ−６（ＥＰＯ特許公開第９３゜６」９に記ｖ、）由来の６．０ｋ ｂ　ＢｇｌＩＩ／Ａｐａｌフラグメントにライゲートすることができる。次いで 、得られたプラスミドをＣＨＯ細胞に導入し、メトトレキセート含有培地中で選 択してコード配列を増幅することによって、ｔ　−ＦＡ変異体を過発現させた。

Ｃ）精製 抗−ｔ−ＰＡヤギポリクローナルＡ６抗体（自体既知の常法によって調製）を結 合させた、コントロールされたガラスピーズのカラム（１ｍｌベッドボリューム ）に調整培地を通すことによって、ｔ　−ＰＡ産物の精製を行った。培地を負荷 する前に、カラムをＰＢＳで平衡化し、負荷後、カラムを０．１１ＶＤリス−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，５）、ＩＭＮａＣｌで平衡化した。Ｏ，１Ｍ・酢酸、０．１５Ｍ 　ＮａＣ１，０，０２Ｍアルギニン、０．．０１％ツイーン８−０（ｐＨ’２　 、０　）でｔ−ＰＡを溶離し、直ちに、画分をトリス−塩基で中和した。プール する前に、画分を０．０１％ツイーン８０に調節したａｔ−ＰＡは、還元ＳＤＳ ゲルで主として（８０％）１本鎖であることがわかった。

Ｂ、生物学的検定 １、ｔ−ＦＡの定量 天然の配列のｔ−ＰＡに対して標準化されたＥＩＩＳＡ（ＥＰＯ特許公開第９３ ，６１９、前掲）によって、タンパク濃度を型通り測定しｔ；、　Ｌａｅｍｍｌ ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：６８０（１９７０）の緩衝液系を用い、ドデシル硫 酸すトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ−３ＤＳ） することによって、タンパクの純度および均一性を分析した。通常、７〜１７％ グラジェントのゲルを使用し２、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　、　１１７：３０７（１９８１）の銀染色法でタンパクを可視化した。

この方法によって、上記のようにして製造したｔ−ＰＡｉ異体は純粋であり、均 一であることがわかった。

２．３−２２５１検定 血餅溶解およびＳ−２２５１検定の結果は、幾つかの独立した観察（血餅溶解、 ２試験；Ｓ−２２５１，３試験）の平均値を示す。

ｔ−ＦＡとプラスミノーゲンをブレインキュベートし、次いで、プラスミン特異 的基質であるＨ−Ｄ−バリル−Ｈ−口イシル−Ｈ−リシン−バラニトロアニリド （Ｓ−２２５１）を加えることによって、ｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能 をイン・ビトロ検定で測定することができる。この反応の最大速度を、反応の刺 激剤として作用するフィブリン（フィブリノーゲン）またはフィブリン（フィブ リノーゲン）の７ラグメントの存在下で観察する。

試料のプラスミノーゲン活性化能を測定するために、２段階検定において、プラ スミン特異的基質であるＳ−２２５１を使用した。

総容量０．１２ｍ１の０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ、０．１２Ｍ　ＮａＣ１，０， ０１％ツイーン８０、ｐＨ７，４中、２０ｍｇ／ｍｌの７４ブリノーゲン溶液０ ．０２ｍ１と一緒に試料をインキュベートすることによって、フィブリノーゲン を刺激剤として使用することができた。

次いで、０．０５Ｍトリス、Ｏ，１２Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ８中、２．０ｍ ｇ／ｍｌの溶液であるＧｌｕ−プラスミノーゲン溶液（市販品として入千可能） を０．０３ｍ１加えた。３７℃で１０分後、０．０３７Ｍトリス、０．０８６Ｎ ａＣＩ、０．００７％０７％ツイーン８０７．４中０．８６ｍＭ５　２２５１を ０．３５ｍ１加えｊ；。この混合物を５分間インキュベートし、次いで、５０％ 氷酢酸０　、１　ｍｌを加えることによって反応を停止させた。４０５　ｎｍｌ ニー　８ける吸収を測定した。活性を、基質の存在下、１分当たり１ナノグラム 当グ；りの吸収の変化として表わした。

結果は、フィブリノーゲンを加えたＦ３０５Ｈ変異体は、野生型特異的活性の７ ８％を有するというものであり、これは、Ａ４０５が増大する前のずれによるか もしれない。

３、血餅の溶解 Ｃａｒｌｓｅｎ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１６８：４２８−４３５ （１９８８）の方法によって、野生型およびＦ３０５Ｈｔ−ＰＡを、飽和濃度の プラスミノーゲンの存在下でフィブリンを溶解するその活性について検定した。

イン・ビトロの血餅溶解検定は、微量遠心分析機を使用し、比濁法によってｔ　 −Ｐ　、Ａの活性を測定する。トロンビンとｔ−ＰＡ試験試料の混合物を遠心し て、フィブリノーゲンとプラスミノーゲンの混合物とし、血餅の形成、次いで血 餅の溶解を起こす。得られた、吸収対時間のプロファイルを分析し、検定の終点 を決定する。ｔ−ＰＡ変異体の活性を、ｒｔ−ＰＡ（ＥＰＯ公開第９３．６１９ 、前掲）の標準曲線に比較した。検定にお（１て使用した緩衝液は、０．０１％ （ｖ／ｖ）ツイーン８０８よび０．０１％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを含有し ている。０．０６Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４であった。ヒトトロンビンは ３３単位／ｍｌの濃度であった。フィブリノーゲン（２，Ｏｍｇ／ｍｌの凝固性 タンパクで）を湿った氷で冷却してフィブロネクチンを沈澱させ、次いで重力濾 過した。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは１ｍｇ／ｍｌの濃度であった。分析機宜の 温度を３７℃に設定する。装填機（ローダ−）を、標準曲線のための試料として ｒｔ−ＰＡを２０μｌ（約６２．５ｎｇ／ｍ１−１．０μｇ／ｍｌ）、または標 準曲線の範囲内で溶解を起こす濃度の変異体ｒｔ−ＰＡを２０μｌ分配するよう に設定する。

トロンビン２０μｍを第２の試薬として、５０　：　ｌ　（ｖ／ｖ）フィブリノ ーゲン：プラスミノーゲン混合物２００μｌを主要な試薬として使用した。吸収 ／時間プログラムを、５分間のインキュベーション時間、３４０ｎｍフィルター および９０間隔の記録値で使用した。

結果は、この検定を使用した時、Ｆ３０５Ｈ変異体は正常な野生型ｔ−ＰＡの約 ４５％の血餅溶解活性を有することを示す。

４、フィブリン結合 フィブリン結合のための方法は、Ｒｉｊｋｅｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５７：２９２０（１９８２）によって記載された方法の改良法である。試験し ようとするｔ−ＰＡ試料を、０．０５Ｍ）リス（ｐＨ７，４）、Ｏｉ　２Ｍ　Ｎ ａＣ１，００１％ツイーン８０．１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン、および種 々の濃度のプラスミノーゲン不合のブイプリン（０，０，０５，０，１，０，２ ５、および０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有している溶液Ｉ：加える。

】　反応混合物の終容量は１ｍｌであり、ｔ−ＰＡ濃度は各試料イこっきｌＯｎ ｇ／ｍｌであった。試料を３７℃で５分間インキュベートし、次いで、１単位の トロンビンを加えた。次に、試料を３７°Ｃで１時間インキュベートした、遠心 して血餅を除去し、上溝中に、結合しないで残存しているｔ−ＰＡの量を、ＥＬ ＩＳＡによって測定した。

結果（第５図）は、主として１末鎖Ｆ３０５Ｈｔ　−ＦＡ（黒三角）が、使用し た検定条件下、１重鎖野生型ｔ−ＰＡ（黒画角）および１本鎖および２末鎖野生 型ｔ−ＰＡの混合物（白玉角）とほぼ同様に、フィブリンに結合することを示し ている。また、２末鎖Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ（黒丸）は、少なくとも２末鎖野生型 ｔ−ＰＡ（黒菱形）と同様にフィブリンに結合する。

５．５−２２５１によるチモーゲン的動力学ａ）フィブリノーゲンの調製 ヒトフィブリノーゲン（カルビオケム）をリシン−セファロースカラムに負荷し 、流出物を集めることによって、これをプラスミノーゲン不合にした。得られた フィブリノーゲンのプールを、プラスミン−セフ７０−スで室温にて一夜処理す ることによって変性させた。

得ら１また凝固度は７％であった。次いで、濃度を１　、５１　ｍｇ／ｍｌに調 節した。

ｂ）方法 野生型ｔ−ＦＡおよびＦ３０５Ｈｔ−ＰＡによる、プラスミノーゲンのプラスミ ンへの変換速度を、フィブリノーゲンの存在下、色素形成性のプラスミン基質５ −２２５１を使用して調べた。野生型およびＦ３０５Ｈｔ−ＰＡ分子を、主とし て１本鎖の形（前記のようにして精製することによって得た）および２本鎖の、 クリップした形（主として１本鎖の形をプラスミン−セファロースと一緒に３７ ℃で１時間インキュベートすることによって得た）の両者で使用上記の様にして 製造した１、２μＮ１のプラスミンで変性させたフィブリノーゲンフラグメント の存在下、Ｏ−１２Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍトリス、０．０１％ツイーン８０ 、ｐＨ７，４中、０．０８〜０．８濃度で反応を行った。プラスミノーゲン、フ ィブリノーゲンおよび緩衝液を、室温で３時間ブレインキュベートした。Ｓ−２ ２５１を０．９ｍＭの終濃度になるようＩこ加え、試料を３７°Ｃで約５分間温 めた。０時間で、ｔ−ＰＡ試料を加え、各試料の吸収を３７℃にて３０秒間隔で １０分間記録した。

結果を、第６図および第７図（それぞれ、野生型、１本鎖および２末鎖ｔ−ＦＡ について）、および第８図および第９図（それぞれ、Ｆ３０５Ｈ，１本鎖および ２本鎖ｔ−Ｆ’Ａについて）に示す。図において、縦座標は４０５ｎｍにおける 吸収であり、横座標は吸収を調べた時間（分）の数の２乗である。黒丸は０．０ ９μＭのグラスミノ−ゲン（および１５．７ｎＭ野生型２本鎖ｔ−ＰＡ、ｌ　０ ．８ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ２本Ｎｔ−ＰＡ、ｌ　６．ｌｎＭ野生型１本鎖ｔ−ＦＡ、 および１１７−２ｎ　Ｆ３０５Ｈ１本鎖ｔ−ＰＡ）を表わし、黒三角は０．１１ μＭのプラスミノーゲン（および］１．８ｎＭ野生型２本％ｔ−ＦＡ、８．１ｎ Ｍ　Ｆ３０５Ｈ２本鎖ｔ　Ａ１，１２．］ｎＭ野生型１本ｇｔ−ＰＡ、１２．９ ｒ＋Ｍ　Ｆ３０５Ｈ１本鎖ｔ−ＰＡ）を表わし、黒四角は０．１６μＭのプラス ミノーゲン（および９　、８　ｎＭ野野生型２鎖鎖ｔＰＡ、６．７ｎＭ　Ｆ３０ ５Ｈ２本鎖ｔ−ＰＡ１ｌ　Ｏ，ｌｎＭ野生型１本Ｉｔ−ＦＡ、ＩＯ，８ｎＭ　Ｆ ３０５８１本鎖ｔ−ＰＡ）を表わし、白丸は０，２２μＭのプラスミノーゲン（ および７．９ｎＭ野生型２本ｔｊＱｔ−ＰＡ、５．４ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ２本ｐｔ −ＰＡ、８．１ｎＭ野生型１本ｇ４ｔ　−Ｐ　、Ａ、８．６ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ１ 本鎖ｔ−ＦＡ）を表わし、白三角は０．４４μＭのプラスミノーゲン（および３ ．９ｎＭ野生型２本鎖ｔ−ＰＡ、２．７ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ２本鎖ｔ−ＰＡ１４゜ ＯｎＭ野生型１本ｇｔ−ＰＡ、４．３ｎＭ　Ｆ３０５８１本鎖ｔ　−ＦＡ）を表 わし、白四角は０．９μＭのプラスミノーゲン（および３．９ｎＭ野生型２本鎖 ｔ−ＦＡ、２．７ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ２本Ｍ　ｔ　−Ｐ　Ａ、４゜０ｎＭ野生型１ 本Ｉｔ−ＰＡ、４．３ｎＭ　Ｆ３０５Ｈ１本ｇｔ　−ＰＡ）を表わす。

グラフは、主として１末鎖Ｆ３０５Ｈ変異体である場合のみ、吸収が反応の初期 において著しくずれ、その後、活性が上昇することを示すことを表わしている。

２末鎖Ｆ３０５Ｈ変異体はこのずれを示さず、むしろ、１または２本鎖の野生型 ｔ−ＰＡと同様の動力学的特性を有するらしい。この挙動は、野生型ｔ−ＰＡで は観察されない、Ｆ３０５Ｈ変異体のチモーゲン的特性を証明するものである。

実施例■ この実施例で評価したｔ−ＰＡ変異体の製造のために、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍお よびＷｅｌｌｓｓ前掲に記載された、アラニン−スキャニング突然変異誘発法（ Ａ　Ｌ　Ａ　−５ｃａｎ）として知られている方法を使用した。この方法は、荷 電したアミノ酸側鎖を含有しているｔ　−ＦＡプロテアーゼドメインの小さい表 面領域を確認することを包含した。１つの理論に限定されることなく、電荷の群 を含有しているこれらの領域、または近隣の領域のいずれか、またはその両者が 、ｔ　−ＦＡ分子とその基質、およびその活性を調節し得るその他の種々の化合 物との相互作用に関与していると思われる。ｔ−ＰＡ分子の全活性に対する特定 の領域の重要性を評価するために、各領域の荷電したアミノ酸（即ち、Ａｒｇ、 Ａｓｐ、ＨｉｓＳＬｙｓおよびＧｌｕ）をアラニンで置換した（変異体１分子当 たり１領域）。結果を以下に示す。

１、ｐＲＫ７−　ｔ　−ＰＡの構築 ｔ−ＰＡ変異体の製造のために、プラスミドｐＲＫ７をベクターとして使用した 。ｐＲＫ７は、Ｃ１ａｌとＨｉｎｄＩ［［の間のポリリンカー領域でエンドヌク レアーゼ制限部位の順序が逆である以外、ｐＲＫ５　（１９８９年３月１５日公 開のＥＰ公開Ｎｏ、３０７，２４７）と同一である。

ベクターへ挿入するために、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉ（ＡＴＧ開 始コドンの５′を４９塩基対切断する）および制限エンドヌクレアーゼＢａ１Ｉ （ＴＧＡ終止コドンの下流で２７６塩基対を切断する）法（１＋１２１ｉａｔｉ ｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｒ＋ｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）を使用して、ＨｉｎｄｎＩおよびＳ　ｍａ　Ｉで 予め切断しておいｆ：ｐＲＫ７にライゲートした。この構築物をｐＲＫ７−ｔ　 −ＰＡと命名した。

２、ｐＲＫ７−　ｔ　−ＰＡの特定部位突然変異誘発Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎから購入したキット（カタログ番号ＲＰＮ１２５３）を使用し 、Ｔａｙｌｏｒ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　、　１３：８７６５（１ ９８５）の方法によって、ｔ−ＰＡｃＤＮＡの特定部位突然変異誘発を行った。

所望の突然変異体を製造するために、所望のアミノ酸置換をフードしている配列 のオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーとして使用し！；。これらのオリゴ ヌクレオチドを、常法（Ｖｉｅｒａ等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　。

３種類のデオキシリボヌクレオチド、即ちデオキシリポアデノシン（ｄＡＴＰ） 、デオキシリポグアノシン（ｄＧ　Ｔ　Ｐ　）、およびデオキシリポチミジン（ ｄＴＴＰ）の混合物を、キットの製造業者によってキットで提供された、ｄＣＴ ’Ｐ（ａＳ）と呼ばれる修飾されｔ；チオ−デオキシリポンドシンと合し、１重 鎖ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡに加え、オリゴヌクレオチドにアニーＩノングさせた。

この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えたら、変異した塩基以外、ｐＲＫ７−ｔ −ＦＡと同一であるＤＮＡの鎖が得られた。また、ＤＮＡのこの新しい鎖は、ｄ ＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ（ａＳ）を含有しており、これを制限エンドヌクし・ アーゼ消化から保護するのに役立つ６２本鎖へテロ二重鎖の鋳型鎖に適当な制限 酵素で切れ目を入れた後、突然変異誘発オリゴマーを含有している領域を越えて 、Ｅｘ。

■ヌク１−アーゼで鋳型鎖を消化した。次いで、反応を停止させて、一部分のみ １本鎖である分子とした。次ぎに、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸 全て、Ａ　Ｔ　Ｐ　、およびＤＮＡリガーゼの存在下、ＤＮＡポリメラーゼによ って、完全な２本！＋１ＤＮＡホモ二重鎖分子を製造した。

上記のＡ　Ｌ　Ａ　−５ｃａｎ法を使用してｐＲＫ７−ｔ−ＰＡ分子を製造する ために、以下のオリゴヌクレオチドを製造し、プライマーとして使用した・ ５’−ＧＧＣＴＧ丁ＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＡ−３’　（Ｒ２６７Ａ） ５’−ＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡ、ＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧ ＣＧＡ、ＡＧＡＧ−３てＤ２ｇ３Ａ、Ｈ２ｇ７Ａ）＆’−ＣＣＧＣ７ＣＴＣＣＧ ＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＯＣＧＧＣＡＡＡＧＡ丁−３’（Ｒ２９６人　 、Ｈ９７Ａ、Ｉ’ｕ９！Ａ、ＲP９９人） ５’−ＧＣＣＣＣＣＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＧＡ−３’ 　（Ｈ３０３Ａ、Ｒ，３０４Ａ）５’−Ｃ丁ＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣ ＧＧＣＡＧＡ−３°（Ｈ３２２Ａ）５゛−Ｇ丁ＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＧ ＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＡ−：！’　（Ｈ３２６Ａ、Ｒ３２７Ａ）５’−ＣＡ ＡＧＡ丁ＣＡＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡ−３′（Ｈ３３１ Ａ、Ｈ３３２Ａ）５’−ＣＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＧＴＡ丁ＧＴＴ ＧＣＧＣＣＣＡＡＧＡＴ−３”　（Ｒ３３９Ａ、Ｒ３４２Ａ）＆’−ＴＴＴＴＴ ＣＧＡＣ：Ｔ丁Ｃ人人ＡＴＧＣＣ丁ＧＣＧＣＣにＣＣＣＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣ− ３’（ＩｔＪ４７Ａ、１ｌＪ４１１人、ＥI４０Ａ、Ｘ３５１Ａ） ５’−ＣＴＴＡ丁ＧＧＡＣＡＡ丁ＧＴＡ丁ＧＣＴＧＣＧＡＣＴＧＣＡＡＡｍＣＴ Ｇ−３’（Ｈ３５３Ａ、Ｈ３５５Ａ、に３５６Ａ）５’−ＡＧＴＧ丁ＣＡＴＣＡ ＴＣＧＡＡＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡ丁ＧＴＡ−３’　（Ｈ３６ＯＡ、’ｊ ０６１Ａ、Ｅ３６２＾）５’−ＧＴＣＡＴＴＧＴＣＧＴＡＡＧ丁ＧＧＣＡＧＣＡ ＧＣＧＡＡＴＴＣＣ丁Ｔ−３’　（Ｄ３６４Ａ、Ｄ３６５Ａ、Ｄ３６６Ａ）５゛ −ｃｒｃｙｃｐ、ａｃＡａｃａｃＡＡＴａａｃ＾丁丁ＧＧＣＧ丁ＡＡＧ丁Ｇ丁Ｃ −３”　（Ｄ３６９Ａ、Ｄ３刀Ａ）ｓ−ｃｉｃｃＴｃｃａｃ人ＣｋＧＧＣＧＧＡ Ｃ（、）ＪＣ：ＣＣＣＡτＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧ−３’　（Ｒ３７１人、Ｄ３ １ｅ１人、孔リn＾） ５’−ＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＣＧＣ丁ＧＣＴＣＧＣＣＴＧ ＧＧＣＡＣＡ−３’　（Ｅ３１１７Ａ、Ｒ３９２Ａ）５’−ＡＣＡＣＴＣＣＧ丁 ＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧ−３”　（Ｄ ４００Ａ、Ｄ４０５Ａ）５’−ＧＧＡＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＣＧＴＣＣＡＧ 丁Ｃ−３”（Ｈ４０８Ａ）５’−ＧＴＡＧＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＣ ＣＧＴ−３’　（Ｅ４１ＯＡ）５’−ＡＧＧ、＾ＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＣ ＣＧＣＧＣＣＧ丁ＡＧＣＣ−３”（（Ｒ４１６人、Ｈ４１７Ａ、Ｈ４１８Ａ）！ ’−ＴＣＴＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣｒ；ＣＣにＣＣＣＡＡＴＡ ＧＡＡ−３’（ＩＪ２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４！９Ａ、ＥS！ＤＡ） ５’−ＧＴＣＧＧ丁ＧＡＣＴＧＴｒＧＣＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧ丁ＧＡ ＴＧＴ−３’（Ｈ４４５Ａ、Ｒ４４９Ａ）５−＾ＣＡＣＡＧＣＡＴＧＴｒＧＧＣ ＧＧ丁ＧＡＣＴＧ丁丁ＧＣＧ丁丁ＡＡＧＴＡＡ−３°（Ｒ４７１９Ａ、Ｄ４５３ Ａ）５’−ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＡＧ丁ＧＧＣ丁ＣＣＡＧＣＡＣＡ− ３’　（Ｄ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ）５’−ＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＣＡＡＧＴＩＴＧＣ−３’　（Ｈ４７１Ａ、Ｄ４７２Ａ）５’−ＧＧＧＧＣＣ ＴＣＣＣＧＡＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡ−３’　（Ｄ４７７Ａ）５’−ＣＡＣＣ ＡＡＡＧ丁ＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＡＧＡＣＡ−３’Ｄ４１１１Ａ、 ＲＡ８９Ａ）−５’−ＣＡＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧ丁ＣＣＡＣ Ａ−３’　（Ｒ５０５人、Ｄ５０６Ａ）５’−ＧＴＡＧＴｒＧＧ丁ＡＡＣＧＧＣ ＴＧＴＧＴＡＣＡＣ−３’　（Ｋ５ＤＡ）５”−ＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧ丁ＴＧＧ ＣＡＧＣＡＡ丁ＣＣＡＧＧＣＴＡＧＧ丁ＡＧ丁丁−３（Ｄ５］９Ａ、Ｒ５２２Ａ 、Ｄ５２３Ａ）５−丁ＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＴＧ”ｎＧＧＣＡＣＧ ＡＡＴＣＣＡ−３’　（Ｄ５２３Ａ、Ｒ５２６Ａ）３、細菌の形質転換およびＤ ＮＡの調製上のプロトコールによって作成した変異体ｔ−ＦＡ構築物を、コンピ テントなＭＩ胞の製造および形質転換のための通常のＣａＣ］、法（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ等、前掲）を使用し、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ宿主株ＭＭ　２９４　ｔｏｎＡにト ランス７オームした。ＭＭ　２９４　ｔｏｎＡ（Ｔ　Ｉファージに耐性）は、ｔ ｏｎＡ遺伝子へのＴｎｌＯトランスポゾンの挿入、不正確な切り出しによって製 造した。次いで、トランスポゾン挿入突然変異誘発法（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ等、　 Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、　、　１１６：　１２５−１５９（１９７７））を 使用して、この遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ宿主ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６） に挿入した。

ＭａｎｉａＬｉｓ等、前掲の通常の少量調製法を使用し、細菌形質転換体の各コ ロニーからＤＮＡを抽出した。セファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムを通すことに よってプラスミドを更に精製し、次に、配列決定法および制限エンドヌクし・ア ーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって分析した。

Ｒ２９６人、Ｈ２９７Ａ、Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９９Ａ変異体をコードしているプラ スミドを含有しており、ｐＴＰＡ３３　２と命名されたこれらの形質転換体の１ つは、１９８９年７月１８日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション にＡＴＣＣＮｏ、６８．０５９で受託された。

４、ヒト胎児腎２９３細胞のトランスフェクション（少規模）２９３細胞を６ウ エルプレートにて７０％全面成長まで増殖させた。、ｔ−ＰＡプラスミドＤＮＡ 変異体２．５　、ｃｏｇを、１ｍＭトリス−ＨＣｌ、Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０ ．２２７Ｍ　ＣａＣＩｚ（１５０μｌ）に溶解した。これに、５０ｍＭＨＥＰＥ Ｓ緩衝液（ｐＨ７，３５）、２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１，５ｍＭ　ＮａＰＯ＜（ １５０μｍ）を加え（撹拌下、滴下する）、２５°Ｃで１０分間、沈澱を形成さ せた。次いで、懸濁した沈澱を６−ウェルプレートの各ウェル中の細胞に加え、 インキコベーターに４時間、静置Ｌ　ｆ：、次に、培地を吸引し、ＰＢＳ中２０ ％グリセロール１ｍｌを３０秒間で加えた。細胞を、最初は血清不含の培地３ｍ ｌで、次に、同培地１ｍｌで、、２回洗浄した。次に、新たな培地３ｍｌを加え 、細胞を５日間インキュベートした。次いで、培地を集め、分析した。

１本Ｍ　ｔ　−Ｐ　Ａが必要な場合、細胞の増殖期にプラスミノーゲン不含の血 清を使用した以外、上２己と同様であった。

５、ヒト胎児腎２９３細胞のトランスフェクシ目ン（大規模）有意な量での製造 ＋７使用し得乙Ｋ　２９６　Ａ　、　Ｈ２９７Ａ　、　Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９９Ａ 変異体の大量精製のために、使用したトランスフェクション法は、Ｃｕｒｒｅｎ ｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ａｕ ５ｕｂｅ１等Ｊｉｇ（Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８）から 得られ、以下の様に少し変更された：ヒト胎児腎２９３細胞の懸濁液を細胞培養 培地で増殖させ、ベレット化することによって濃縮した。ベレットを１ミリリツ トル当たり約１０”個細胞の濃度に再懸濁し、必要に応じて血清不含の培地で細 胞を洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン溶液を細胞５００　ｍ１ＭたりＤＮＡ約２ ５０μｇの濃度で加え、この混合物を穏やかに撹拌しなから３７°Ｃで９０分ま でインキュベートした。ＤＭＳＯをｌＯパーセントの終濃度まで加え、約２分後 、新たな培地を加えて１ミリリツトル当たり約１０６個まで細胞を希釈した。次 いで、細胞を７日間までインキュベートし、その後、上溝を集めた。

抗ｔ　−Ｐ　、ＡヤギポリクローナルＡ６抗体に結合させたガラスピーズのカラ ムに上溝を通すことによって５この変異体を精製した。カラムをＰＢＳで予め調 整しておいｊ；。上清を負荷した後、カラムをトリス−食塩緩衝液［０，１Ｍト リスＨＣＩ（ｐＨ７，５）およびＩＭＮａＣＩ］で平衡化した。次いで、０−　 Ｉ　Ｍｌ！ｒｌ’酸、０．１５Ｍ　ＮａＣＬ　Ｏ。

０２Ｍアルギニン、および０，０１％ツイーン８０でｔ−ＰＡ変異体を溶離した 。画分を直ちにトリス塩基で中和し、０，０１％ツイーン８０に調節した。

６、生物学的検定 Ａ、ｔ　−ＰＡの定量 細胞培養上溝中に存在するｔ−ＦＡの量を、野生型ｔ−ＰＡに対して調製された ポリクローナル抗体を使用し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって測定した。

Ｂ、Ｓ−２２８８検定 ｌおよび２本鎖両形態の変異体′ めに、５−２２８８検定 り分解活性についての直接検定であり、ｔ−ＰＡは小さいペプチドとパラニトロ アニリド発色団の間の結合を切断する。

細胞培養培地で野生型ｒｔ−ＦＡを希釈することによって、標準曲線用試料を調 製した。標準曲線用試料およびｒｔ−ＰＡ変異体試料をマイクロタイタープレー トのウェルに加えた。２本ｆｉ４ｒｔ　−ＦＡの活性を測定するためにこの検定 を使用する場合、この方法にヒトプラスミンとのインキュベーションステップを 含ませｔ−。ヒトプラスミン（ＫａｂｉＶｉ　Ｌｒｕｍ）を０．１３ＣＵ（カゼ イン単位）／　ｍ　ｌの終濃度まで加えた。試料を室温で９０分間インキュベー トした。１本鎖形の試料を検定するｌ：めには、プラスミン溶液をＰＢＳによっ て置き換え、９０分間のインキュベーションを削除した。

プラスミン活性を阻害するために７２ノ１ｇ／ｍｌの終濃度までアプロチニン［ シグマ、約１４７１Ｕ（トリプシンインヒビタ一単位）／ｍｇ］を加え、試料を 室温で１５分間インキュベートした。Ｓ−２２８８の２．１６ｍＭ溶液を、Ｏ， １Ｍ）リス、０．１０６ｍＭ　ＮａＣＬ　０゜０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８ ，４で１．４５ｍＭに希釈し、この溶液１００μ】をマイクロタイタープレート の各ウェルに加えた（各ウェルにおける許容量は２００μｍであった）。発色を ４０５ｎｍでモニターした。対照および試料各々について、時間に対する吸収の 傾きをめた。ｒｔ−ＰＡ対照について、吸収対時間の曲線の傾きをｒｔ−ＰＡ濃 度の関数としてグラフ化することによって、標準曲線を作成した。次に、標準曲 線から、突然変異体の相対活性濃度を決定した。各突然変異体の活性濃度を、ｒ ｔ−ＰＡ　ＥＬＩＳＡで得た突然変異体についての濃度で除し、得られた比活性 を、１．０の値とした野生型ｔ　−ＰＡに比較して表わした。

データは２回の分析値の平均値であり、第１表において野生型ｒｔ−ＰＡに比較 した活性として表わされる。結果は、示された突然変異体全てについて、野生型 ｒｔ−ＰＡに比較して、２本鎖形は１本鎖より活性である（少なくとも１７５倍 からほぼ６０倍まで）ことを示し、これらの突然変異体はそれぞれ、この検定で チモーゲン的であると考え得ることを表わしている。

第１表　５２２８８検定Ｉこおけるチモーゲンｗｔ　ｒｔ−ＰＡに比較した活性 （ｗｔが１．０である場合： 五６７Ａ　Ｏ，：：（Ｃ，０３５０，８５（Ｇ、１３）２．６ｐ２８３＾、Ｒ２ ８７Ａ　Ｏ，０ｇ（０，１１）　０．６０（０，２３）　７．５に４］６Ａ、Ｈ ４］７Ａ、Ｅ４１８Ａ　Ｏ，０１（０，０１）　０．５９（０，０１）　５９Ｅ ４２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４２９Ａ、Ｅ４３０Ａゝ　０．０１（０，０１）　０ ．３３（０，０４）　３３Ｈ４３２Ａ、Ｒ４３４Ａ　００８（０，０Ｉ）０．７ Ｊ（０，Ｏ８）　８．９Ｒ４４０Ａ　０．５３（０，０３）　０．７Ｆｔ（０， ０４）　１．５Ｃ，Ｓ−２２５１検定 二の検定は、ｊ−ＦＡ活性のための間接検定である。この検定では、ｔ−ＰＡの 作用によってプラスミノーゲンがプラスミンに変換され、プラスミンがＳ−２２ ５１基質を切断してパラニトロアニリド発色団を放出する。次いで、この発色団 の生成を時間に従って測定する。

１、フィブリンによって刺激されるＳ−２２５１の検定Ｓ−２２８８検定のため の記載と同様に１７で、標準曲線用試料を調製した。２本鎖形で検定される試料 をプラスミン−セファロースと一緒にインキュベートしｔ；。プラスミン−セフ ァロースは、約２０．８ＣＵのヒトプラスミン（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）を、臭 化シアン活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　１　ｍｌに結合させるこ とによって調製した。

プラスミン−セファロース（５％スラリー５０μｌ）を振盪しながら、試料１５ ０μｌと一緒に９０分間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、 遠心によって樹脂を除去し、試料１０μｍをマイクロタイタープレートのウェル に加えた。

１本鎖形で検定された試料の場合、樹脂の代わりに細胞培養培地５０μｌを加え 、インキュベーションステップを除外した。各ウェルにヒトトロンビン（４２単 位／ｍｌの溶液１０μｍ）を加えた。ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲン（５，３μ Ｍ）２８μｍ；プラスミノーゲン不含のヒトフィブリノーゲン（Ｉ　ＯμＭ）ｌ 　Ｏ／７１：　３ｍＭ　Ｓ−２２５１（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）３０　ｐ　ｌ　 ；　Ｐ　Ｂ　Ｓ　６２　ｐ　ｌからなるカクテル（１３０μｍ）を加えることに よって、各ウェルで反応を開始させた。発色を４０５ｎｍでモニターし、各時点 で４９２ｎｍの参考波長の吸収を読み取った。対照および変異体試料それぞれに ついて、吸収対時間の２乗の曲線の傾きをめた。ｒｔ−ＰＡ対照について、吸収 対時間の２乗の曲線の傾きをｒｔ−ＦＡ濃度の関数としてグラフ化することによ って、標準曲線を作成した。変異体についての相対比活性の決定は、Ｓ−２２８ ８検定のための記載と同様であった。

２、フィブリノーゲンによって刺激されるＳ−２２５１の検定トロンビンをＰＢ Ｓと置き換える以外、フィブリン−刺激性Ｓ−２２５１検定のための記載と同様 ｉこして、この検定を行なった。

３、凝固血漿Ｓ−２２５１検定 標準曲線用試料の調製およびプラスミン−セファロースによる、１本ｆｉＲｒｔ −ＰＡの２本ｆＪ４ｒｔ−ＰＡ〜の変換は、フィブリンによって刺激されるＳ− ２２５１検定のための記載と同様であった。ヒトトロンビン（３１μｌ／ｍｌの 溶液１０μｌ）をマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。対照および変 異体試料（４０μｌ）をプレートＩこ加え、酸ントレートデキストロースヒト血 漿９０μｍと９．４　ｍＭ　Ｓ　２２５１　（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）　ｌ　Ｑ 　ｐ　ｌの混合物ｉｏｏμｌを加えることによって、反応を開始させた。４０５ ｎｍで発色をモニターし、４９２ｎｍの参考波長での吸収を各時点で読んだ。デ ータの分析は、フィブリン刺激されたＳ−２２５１検定のｊ；めの記載と同様で あつブこ。

４、血漿Ｓ−２２５１検定 トロンビンをＰＢＳと置き換える以外、凝固血漿Ｓ−２２５１検定のための記載 と同様ｌこシて、この検定を行なった。

フィブリン依存性および凝固血漿依存性の検定を使用し、チモーゲ：／の質につ いて変異体を検定し、野生型に比較した結果をそれぞれ第■および第ｍ表に示す 、、１本鎖形の変異体についての値は２測定値の平均値である。２本鎖形の変異 体についての値は４測定値の平均値である。

第■表　フィブリン−依存性Ｓ−２２５１検定におけるチモーゲンに２９６Ａ、 Ｈ２９７Ａ、Ｒ２９８Ａ、Ｒ２９９Ａ　１．２６（０，０２）　２．８２（０， ３２）　２．２Ｅ３０３Ａ、Ｒ３０４Ａ　１．３！ｌ（０，０４）　２．１３（ ０，２９）　１．５Ｈ３３１Ａ、Ｈ３３２Ａ　１．２９（０，０４）　２．１９ （０，６８）　１．７Ｒ３３９Ａ、Ｒ３４２Ａ　０．３８（０，０７）　Ｊ、０ ４（０，１１）　２．７に４１６Ａ、Ｈ４１７Ａ、Ｈ４１８Ａ　０．２Ｊ（０， ０４）　０．９６（０，０９）　４．６Ｅ４２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４２９Ａ、 Ｈ４３０Ａ　０．４４　（０）　０．７６　（０，０７）　５．４Ｈ４３２Ａ、 Ｒ４３４Ａ　０．１６（０，０８）　０．９９（０，１３）　６．２Ｄ４６０Ａ 、Ｒ４６２Ａ　０．６８（０，０４）　１０４（０，０８）　１．５第■表　凝 固血漿依存性Ｓ−２２５１検定におけるチモーゲンＤ２８３Ａ、Ｈ２８７Ａｏ、 ５３（ｏ、ｏｇ　ｏ、ｇ２（ｏ、ｏ４）　１．６に２９６Ａ、Ｈ２９７Ａ、Ｒ２ ９１１Ａ、Ｒ２９９Ａ　Ｏ，４２（０）　１．２９（０，２０）　３．１Ｅ３Ｄ ３Ａ、Ｒ３０４Ａ　Ｏ，９０（０，０３）　１．３４（０，１０）　１−５’Ｈ ３３］Ａ、Ｈ３３２Ａ　１．０９（０，０９）　１．６３（０，６１り　１．５ Ｒ４４９Ａ、Ｄ４５３Ａ　０．７９（０，ＯＪ）　１．２２（０４３）　１．５ Ｄ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ　０．２１（０，ＯＪ）　０．３２（０，０２）　」、 ５Ｄ４７７Ａ　Ｏ，Ｈ（０，０２）　０２５（０，０８）　２．３＊ＮＤ−試験 せず どの検定について各変異体がチモーゲン性を示すかを表わしている第１−ｍ表に おけるデータの要約を以下の第■表に示す。

第■表 Ｒ４４０Ａ　Ｘ ＊Ｆｎ寓フィブリン 第■表に挙げたチモーゲン性ｔ−ＰＡ変異体を、５−２２５１フイブリン特異性 検定および／またはＳ−２２５１凝固血漿特異性検定で、１本鎖および２本鎖の 両形態で検定した。１本鎖および２末鎖ｔ−ＰＡ変異体についての結果を、それ ぞれ第Ｖおよび■表に示す。

第Ｖおよび■表におけるデータの要約を、以下に示す。第■表から、チモーゲン 性ｒｅ−ＰＡ変異体のそれぞれは、野生型ｔ　−ＰＡに比較してフィブリン−お よび／または凝固血漿−特異的でもあることがわかる。Ｘは、Ｓ−２２５１検定 で測定され、第Ｖおよび第■表で報告された様に、＞１．５の、フィブリノーゲ ンに対するフィブリンの比、または血漿に対す−る凝固血漿の比、を示す。

第Ｖ３！Ｆ　ｒｔ−Ｐｒ八へ異体（１不鎖）のフィブリン−および凝固血漿−特 異性 第７表（続き） Ｆｇ−フィブリノーゲン Ｆｂ−フィブリン Ｐｌ−血漿 ＰＣ−凝固血漿 ＡＹＥ−平均値 ＳＤ−標準偏差 第■表　ｒｔ−Ｐ、Ａ変異体（２本鎖）のフィブリンおよび凝固血漿特異性 変異体　Ｉ　ＰＩ 第■表（続き） 変異体 Ｆｇ−フィブリノーゲン Ｆｂ−フィブリン Ｐｌ−血漿 ＰＣ−凝固血漿 ＾ＶＥ−平均値 ＳＤ−標準ＩＪＡ差 第１表 フィブリンおよび／または凝固血漿特異性を示すｒｔ−ＰＡの変異体と、上で特 定されたチモーゲン性の基準に合致する変異体の間には、著しい相関性がある。

更に、ｒｔ−ＰＡの２種類の変異体１ま、フィブリン特異性を示すことがわかっ たが、野生型ｒｔ−ＰＡｉこ比較してチモーゲン的ではなかった。第１表は、フ ィブリン−特異的および凝固血漿特異的な変異体についてのＳ−２２５１検定の データを示す。

第１表　ｒｔ−ＰＡのフィブリン−および凝固血漿−特異的、非チモーゲン的変 異体 変異体　Ｉ　Ｃ 変異体　ｃ　ｃ　ｈｌｃ　１ｃｈ Ｐ１−血漿 ＰＣ−凝固血漿 １ｃｈ＝１本鎖 ２ｃｈ−２末鎖 ＡＶＥ−平均値 ５Ｄ−４ｌｌ！偏差 物質の寄託 以下の培養物は、アメリカ合衆国、メリーランド、ロンクビル、バークローン・ ドライブ１２３０１番、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ ＣＣ）に寄託された。

！佳−ＡＴＣＣ受託番号　受託日 ｐＴＰＡ３３−２、Ｅ、ｅｏｌｉ　ＭＭ２９４ｔｏｒ＋Ａ中　６８．０５９　１ ．９８９年７月１８日この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関する ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ）の規定およびそれに基づく 規則の下に行われた。これは、受託日から３０年間の生存培養の維持を保証する 。微生物はブダペスト条約の条件においてＡＴＣＣによって利用可能とされ、Ｇ ｅｎｅｎｔｅｅｈ、Ｉｎｃ、とＡＴＣＣの合意を条件とする。これは３５ｔＪＳ Ｃ＠１２２およびそれに基づくコミノショナー規則（８８６０ｃ６３８＋こ特定 基準を有する３７ＣＦＲ１１，１４を包含する）に従い、米国特許商標局によっ て資格を有すると決定されｌ；者に、米国特許の登録または米国またはその他の 国の特許出願の最初に行われた公開の後、培養物の永久かつ制限のない入手を保 証し、後代の入手を保証する。

本出願の譲受人は、寄託されている培養物が好適な条件下で培養された時に死ぬ かまたは屓失されるかまたは破壊された場合、通知を受けたらこれを直ちに同一 培養物の生存標本で置き換えることに同意する。寄託された菌株の入手可能性は 、その特許法に従い政府の権限の下で許可された権利に反して本発明を支流する ライセンスとみなされるべきではない。

フィブリンＭＯ／ＭＬ 国際調査報告 国際調査報告 ５Ａ３０Ｂ８コ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プラスミンによって切断されると酵素的に活性な形態の組織プラスミノーゲ ン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に変化し得るｔ−ＰＡチモーゲン。 ２．ヒトｔ−ＰＡであって、ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメイン内の部位にアミノ 酸変更を有する請求項１に記載のチモーゲン。 ３．対応する野生型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に比較すると ｔ−ＰＡのプロテアーゼドメイン内にアミノ酸変更を有し、該変更によって、対 応する野生型ｔ−ＰＡに比較するとチモーゲン的となっているｔ−ＰＡ変異体。 ４．ｔ−ＰＡがヒトｔ−ＰＡである請求の範囲３に記載の変異体。 ５．変更が置換である請求の範囲４に記載の変異体。 ６．対応する野生型ｔ−ＰＡの３０５位にフェニルアラニン以外のアミノ酸を含 有する請求の範囲５に記載の変異体。 ７．アミノ酸が水素結合のドナーとして作用し得るかまたは作用する側鎖を有す る請求の範囲６に記載の変異体。 ８．アミノ酸がヒスチジン、チロシン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ま たはグルタミンである請求の範囲７に記載の変異体。 ９．アミノ酸がヒスチジンである請求の範囲８に記載の変異体。 １０．変更が挿入である請求の範囲４に記載の変異体。 １１．挿入が、野生型ｔ−ＰＡの３０４または３０５位の後、または３０４およ び３０５の両者の後である請求の範囲１０に記載の変異体。 １２．挿入されるアミノ酸が、水素結合のドナーとして作用し得るかまたは作用 する側鎖を有する請求の範囲１１に記載の変異体。 １３．アミノ酸がヒスチジン、チロシン、アスパラギン、リシン、アルギニン、 またはグルタミンである請求の範囲１２に記載の変異体。 １４．変更が欠失である請求の範囲４に記載の変異体。 １５．欠失が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２９７〜３０５位の１またはそれ以上 のアミノ酸である請求の範囲１４に記載の変異体。 １６．欠失が２９７、３００、３０４、または３０５位である請求の範囲１５に 記載の変異体。 １７．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ； Ｆ３０５Ｔ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｎ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｋ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０ ５Ｒ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｑ　ｔ−ＰＡ；　ｊ３０４Ｈ　ｔ−ＰＡ；　ｊ３０４ Ｔ　ｔ−ＰＡ；　ｊ３０４Ｎ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０４Ｋ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０４Ｒ　 ｔ−ＰＡ；　ｊ３０４Ｑ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０４ＨＨ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０５Ｈ　ｔ −ＰＡ；　ｊ３０５Ｔｔ−ＰＡ，ｊ３０５Ｎ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０５Ｋ　ｔ−ＰＡ ；ｊ３０５Ｒ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０５Ｑ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０４Ｈ，ｊ３０５Ｈ　ｔ −ＰＡ；ｊ３０５ＨＨ　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７　ｔ−ＰＡ；ｄ２９８　ｔ−ＰＡ； ｄ２９９　ｔ−ＰＡ；ｄ３００　ｔ−ＰＡ；ｄ３０１　ｔ−ＰＡ；　ｄ３０２　 ｔ−ＰＡ；ｄ３０３　ｔ−ＰＡ；ｄ３０４ｔ−ＰＡ；ｄ３０５　ｔ−ＰＡ；ｄ２ ９７−２９８　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−２９９　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３００　ｔ −ＰＡ；ｄ２９７−３０１　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−　３０２　ｔ−ＰＡ；ｄ２９ ７−３０３　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３０４　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７−３０５　ｔ− ＰＡ；ｄ３００−３０１　ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０２　ｔ−ＰＡ；　ｄ３００ −３０３　ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０４　ｔ−ＰＡ；ｄ３００−３０５　ｔ−Ｐ Ａ；ｄ３０４−３０５　ｔ−ＰＡ；ｄ２９７，ｄ３００　ｔ−ＰＡ；　ｄ２９７ ，ｄ３０５　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｎ１８４ｄ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１ −４４，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，１２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１ ２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１ Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｋ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｖ２１３Ｋ， Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１ −４４，Ｖ２１３Ｋ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｉ２１０ Ｋ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ｈ，Ｋ２１２Ｑ ，Ｖ２１３Ｋ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ｈ，Ｋ２１２Ｑ， Ｖ２１３Ｋ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；　Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ， ｖ２１；Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄｊ−４４，Ｎ１８４Ｄ，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；　Ｎ １８４Ｄ，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９，Ｆ３０ＳＨ　ｔ−ＰＡ；ｄ９２−　１７ ９，Ｉ２１０Ｒ，Ｃ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ ；　ｄ９２−１７９，Ｎ１８４Ｄ，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２ １３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；　ｄ９２−１７９，Ｉ２１０Ｒ， Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；Ｙ ６７Ｎ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；　ｄ１−４４，Ｙ６７Ｎ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−Ｐ Ａ；およびそのＴ２５２ＲおよびＮ１８４Ｓ類似体からなる群から選択される請 求の範囲４に記載の変異体。 １８．Ｆ３０５Ｈｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｔｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｎ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３ ０５Ｋ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｒ　ｔ−ＰＡ；Ｆ３０５Ｑ　ｔ−ＰＡ；ｊ３０４Ｈ 　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９，Ｆ３０５Ｈ 　ｔ−ＰＡ；　ｄｊ−４４，Ｎ１８４Ｄ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４， Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ １−４４，ｒ２１０Ｒ，Ｃ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｋ，Ｆ３０５Ｈｔ− ＰＡ；Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−Ｐ Ａ；ｄ９２−１７９，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３ ０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９，Ｎ１８４Ｄ，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−ＰＡ；ｄ９２−１７９，Ｎ１８４Ｄ， Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　 ｔ−ＰＡ；ｄ１−４４，Ｎ１８４Ｄ，Ｉ２１０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　Ｔ−ＰＡ；　ａｎｄ　Ｎ１８４Ｄ，Ｉ２１ ０Ｒ，Ｇ２１１Ａ，Ｋ２１２Ｒ，Ｖ２１３Ｒ，Ｔ２５２Ｒ，Ｆ３０５Ｈ　ｔ−Ｐ Ａ．からなる群から選択される請求の範囲４に記載の変異体。 １９．１またはそれ以上の以下の生物学的活性：チモーゲン活性、フィブリン特 異性、または凝固血漿特異性を示し得る、 対応する野生型ｔ−ＰＡに比較するとそのプロテアーゼドメインにアミノ酸の変 更を有し、該変更が該生物学的活性の原因であって、 ２７０−２８０、 ４４８−４５０、および５０２−５ ２７の領域のみにおける変更ではないことを条件とするヒト組織プラスミノーゲ ン活性化因子（ｔ−ＰＡ）変異体。 ２０．変更が置換である請求の範囲１９に記載の変異体。 ２１．置換が、中性のまたは負に荷電されたアミノ酸によるＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈ ｉｓ、ＧｌｕまたはＬｙｓの置換である請求の範囲２０に記載の変異体。 ２２．置換のために使用されるアミノ酸がアラニン、グリシン、 セリン、 トレオニン、 アスバラギン、 グルタミン、 バリン、ロイシ ン、イソロイシン、 フェニルアラニン、 またはチロシンである請求 の範囲２１に記載の変異体。 ２３． 置換のために使用されるアミノ酸がアラニン、セリン、トレオニン、 アスパラギン、 グルタミン、 フェニルアラニン、または チロシンである請求の範囲２１に記載の変異体。 ２４．置換のために使用されるアミノ酸がアラニン、セリン、またはトレオニン である請求の範囲２１に記載の変異体。 ２５．変異体Ｄ３６５Ａｔ−ＰＡ，Ｒ４６２Ｌｔ−ＰＡ，Ａ４７３Ｓｔ−ＰＡ， ｄ２９６−３０４ｔ−ＰＡ，ｄ２９６−３０２ｔ−ＰＡ，Ｒ２９８Ｅｔ−ＰＡ， Ｒ２９９Ｅｔ−ＰＡ，Ｒ３０４Ｅｔ−ＰＡ，Ｒ３０４Ｓｔ−ＰＡ，ｄ２９６−２ ９９ｔ−ＰＡおよびＫ２９６Ｅ，Ｒ２９８Ｅ，Ｒ２９９Ｅｔ−ＰＡを除外する請 求の範囲１９に記載の変異体。 ２６．置換が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７、２８３、２８７、２９６、２ ９７、２９８、２９９、３０３、３０４、３３１、３３２、３３９、３４２、３ ４７、３４８、３４９、３５１、３６４、３６５、３６６、４０８、４１０、４ １６、４１７、４１８、４２６、４２７、４２９、４３０、４３２、４３４、４ ４０、４４５、４４９、４５３、４６０、４６２、または４７７位またはその組 み合わせである請求の範囲２１に記載の変異体。 ２７．置換が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７、２８３＋２８７、２９６−２ ９９、３０３−３０４、３３１−３３２、３３９＋３４２、３４７−３４９＋３ ５１、３６４−３６６、４０８、４１０、４１６−４１８、４２６−４２７＋４ ２９−４３０、４３２＋４３４、４４０、４４５＋４４９、４４９＋４５３、４ ６０＋４６２、または４７７位であって、“＋”は、示された位置でのみの変更 を示し、“−”は、示された全ての位置での変更を示す請求の範囲２６に記載の 変異体。 ２８． Ｒ２６７Ａｔ−ＰＡ，Ｄ２８３Ａ，Ｈ２８７Ａｔ−ＰＡ，Ｋ２９６Ａ，Ｈ２９７ Ａ，Ｒ２９８Ａ，Ｒ２９９Ａｔ−ＰＡ，Ｅ３０３Ａ，Ｒ３０４Ａｔ−ＰＡ，Ｈ３ ３１Ａ，Ｈ３３２Ａｔ−ＰＡ，Ｒ３９９Ａ，Ｒ３４２Ａｔ−ＰＡ，Ｅ３４７Ａ， Ｅ３４８Ａ，Ｅ３４９Ａ，Ｋ３５１Ａｔ−ＰＡ，Ｄ３６４Ａ，Ｄ３６５Ａ，Ｄ３ ６６Ａｔ−ＰＡ，Ｅ４０８Ａｔ−ＰＡ，Ｅ４１０Ａｔ−ＰＡ，Ｋ４１６Ａ，Ｈ４ １７Ａ，Ｅ４１８Ａｔ−ＰＡ，Ｅ４２６Ａ，Ｒ４２７Ａ，Ｋ４２９Ａ，Ｅ４３０ Ａｔ−ＰＡ，Ｈ４３２Ａ，Ｒ４３４Ａｔ−ＰＡ，Ｒ４４０Ａｔ−ＰＡ，Ｈ４４５ Ａ，Ｒ４４９Ａｔ−ＰＡ，Ｒ４４９Ａ，Ｄ４５３Ａｔ−ＰＡ，Ｄ４６０Ａ，Ｒ４ ６２Ａｔ−ＰＡ，またはＤ４７７Ａｔ−ＰＡである請求の範囲２７に記載の変異 体。 ２９．変更が挿入である請求の範囲２０に記載の変異体。 ３０．挿入されるアミノ酸がチロシン、アスパラギン、リシン、 アルギニンまたはグルタミンである請求の範囲２９に記載の変異体。 ３１．変更が欠失である請求の範囲２０に記載の変異体。 ３２．対応する野生型ｔ−ＰＡのフィンガードメインの少なくとも１部分を欠い ている請求の範囲１９に記載の変異体。 ３３．アミノ酸１８４が機能的炭水化物構造を欠いている請求の範囲１９に記載 の変異体。 ３４．対応する野生型ｔ−ＰＡに比較すると、アミノ酸の（１）２０５−２１５ 領域、（２）２４４から２５５領域、（３）２３３−２４２領域、または（４） （１）（２）および（３）の２またはそれ以上で更に変更されている請求の範囲 ３３に記載の変異体。 ３５．対応する野生型ｔ−ＰＡの成長因子ドメイン内でグリコシル化されている 請求の範囲１９に記載の変異体。 ３６．対応する野生型ｔ−ＰＡの６７位にアスパラギンを有する請求の範囲３５ に記載の変異体。 ３７．対応する野生型ｔ−ＰＡのアミノ酸９２−１７９を欠いている請求の範囲 １９に記載の変異体。 ３８．（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のプロテアーゼドメ インにアミノ酸変更を導入し、（ｂ）得られたｔ−ＰＡ変異体をチモーゲン特性 についてスクリーニングする ことからなる方法。 ３９．ｔ−ＰＡがヒトｔ−ＰＡであり、変更がアミノ酸置換である請求の範囲３ ８に記載の方法。 ４０． 置換が、対応する野生型ｔ−ＰＡの３０５位のフェニルアラニン残基である請求 の範囲３９に記載の方法。 ４１．フェニルアラニン残基がヒスチジン残基で置換される請求の範囲４０に記 載の方法。 ４２．ｔ−ＰＡがヒトｔ−ＰＡであり、変更がアミノ酸挿入である請求の範囲３ ８に記載の方法。 ４３．挿入が、対応する野生型ｔ−ＰＡの３０４または３０５、または３０４お よび３０５位の両者の後である請求の範囲４２に記載の方法。 ４４．ｔ−ＰＡがヒトｔ−ＰＡであり、変更が１またはそれ以上のアミノ酸の欠 失である請求の範囲３８に記載の方法。 ４５．欠失が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２９７から３０５の領域である請求の 範囲４４に記載の方法。 ４６．（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のプロテアーゼドメ インにアミノ酸変更を導入し、（ｂ）得られたｔ−ＰＡ変異体を、１またはそれ 以上の以下の生物学的活性：チモーゲン活性、フィブリン特異性、または凝固血 漿特異性を示すその能力についてスクリーニングすることからなる方法。 ４７．スクリーニングされるｔ−ＰＡ変異体が一時的発現系で産生される請求の 範囲４６に記載の方法。 ４８．変更が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２７０−２８０、４４８−４５０、お よび５０２−５２７の領域のみにおける変更ではない請求の範囲４６に記載の方 法。 ４９．変更がアミノ酸置換である請求の範囲４６に記載の方法。 ５０．置換が、中性のまたは負に荷電されたアミノ酸による野生型ｔ−ＰＡのＡ ｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＬｙｓの置換である請求の範囲４９に記載 の方法。 ５１．置換が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７、２８３＋２８７、２９６−２ ９９、３０３−３０４、３２２、３３１−３３２、３３９＋３４２、３４７−３ ４９＋３５１、３５３＋３５５−３５６、３６０−３６２、３６４−３６６、４ ０８、４１０、４１６−４１８、４２６−４２７＋４２９−４３０、４３２−４ ３４、４４０、４４５＋４４９、４４９＋４５３、４６０＋４５２、４７１−４ ７２、または４７７位、またはその組み合わせであって、“＋”は、示された位 置でのみの置換を示し、“−”は、示された全ての位置での置換を示す請求の範 囲５０に記載の方法。 ５２．置換のために使用されるアミノ酸がアラニン、セリン、トレオニン、アス バラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、 またはチロシンである請求の範囲５１に記載の方法。 ５３．置換のために使用されるアミノ酸がアラニンである請求の範囲５２に記載 の方法。 ５４．置換が、対応する野生型ｔ−ＰＡの２６７、２８３＋２８７、２９６−２ ９９、３０３−３０４、３３１−３３２、３３９＋３４２、３４７−３４９＋３ ５１、３６４−３６６、４０８、４１０、４１６−４１８、４２６−４２７＋４ ２９−４３０、４３２＋４３４、４４０、４４５＋４４９、４４９＋４５３、４ ６０＋４６２、または４７７位であって、“＋”は、示された位置でのみの置換 を示し、“−”は、示された全ての位置での置換を示す請求の範囲５３に記載の 方法。 ５５．変更がアミノ酸挿入である請求の範囲４６に記載の方法。 ５６．変更が、１またはそれ以上のアミノ酸の欠失である請求の範囲４６に記載 の方法。 ５７．請求の範囲１に記載のチモーゲンをコードしているＤＮＡ配列。 ５８．請求の範囲６に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。 ５９．請求の範囲１９に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。 ６０．請求の範囲２８に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。 ６１．形質転換宿主細胞において、請求の範囲５７に記載のＤＮＡ配列を発現し 得る複製可能な発現ベクター。 ６２．真核生物形質転換宿主細胞において、請求の範囲５７に記数のＤＮＡ配列 を発現し得る複製可能な発現ベクター。 ６３．形質転換宿主細胞において、請求の範囲５９に記載のＤＮＡ配列を発現し 得る複製可能な発現ベクター。 ６４．原核生物形質転換宿主細胞において、請求の範囲５９に記載のＤＮＡ配列 を発現し得る複製可能な発現ベクター。 ６５．ｐＴＰＡ３３−２である請求の範囲６４に記載のベクター。 ６６．請求の範囲６１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 ６７．請求の範囲６２に記載のベクターで形質転換された真核生物宿主細胞。 ６８．酵母細胞である請求の範囲６７に記載の細胞。 ６９．哺乳動物細胞である請求の範囲６７に記載の細胞。 ７０．請求の範囲６３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 ７１．真核生物細胞である請求の範囲７０に記載の宿主細胞。 ７２．変異体をコードしているＤＮＡ配列を一時的に発現し得る請求の範囲７１ に記載の宿主細胞。 ７３．請求の範囲６４に記載のベクターで形質転換された原核生物宿主細胞。 ７４．請求の範囲６５に記載のベクターで形質転換されたＥｃｏｌｉ。 ７５．請求の範囲１に記載のチモーゲンの治療的有効量を薬学的に許容し得る担 体と混合して含有する、血管の症状または疾患の治療用組成物。 ７６．請求の範囲７５に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することからな る、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。 ７７．請求の範囲１９に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体 と混合して含有する、血管の症状または疾患の治療用組成物。 ７８．請求の範囲７７に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することからな る、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。 ７９．請求の範囲１に記載のチモーゲンの治療的有効量を薬学的に許容し得る担 体と混合して含有する、フィプリンの沈着または付着の形成または再形成の予防 用組成物。 ８０．請求の範囲７９に記載の組成物の有効量をフィブリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィプリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。 ８１．請求の範囲１９に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体 と混合して含有する、フィプリンの沈着または付着の形成または再形成の予防用 組成物。 ８２．請求の範囲８１に記載の組成物の有効量をフィプリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィプリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。 ８３．請求の範囲３に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体と 混合して含有する、血管の症状または疾患の治療用組成物。 ８４．請求の範囲８３に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することからな る、哺乳動物における血管の症状または疾患の治療方法。 ８５．請求の範囲３に記載の変異体の治療的有効量を薬学的に許容し得る担体と 混合して含有する、フィプリンの沈着または付着の形成または再形成の予防用組 成物。 ８６．請求の範囲８５に記載の組成物の有効量をフィプリンまたは付着の形成の 可能性のある哺乳動物の部位に投与することからなる、フィプリンの沈着または 付着の形成または再形成を予防するための哺乳動物の治療方法。