JPH04500274A - 高感度螢光単一粒子及び単一分子の検出装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高感度蛍光単一粒子及び単−Ｈ出装置及び方法本発明は、部分的にナショナル　 サイエンス　ファウンデーション、ナショナル　インスティテ二−ト　オブ　ヘ ルスにより、更に米国デパートメント　オブ　エナジーのオフィス　オブ　エナ ジーリサーチ、オフィス　オブ　ヘルス　アンド　エンピロンメンタル　リサー チ、フィジカル　アンド　テクノロジカル　リサーチディビジョン長官（Ｄｉｒ ｅｃｔｏｒ）により支持されている。

発明の詳細な説明 本発明は、一般に個々の蛍光粒子から単一分子までの範囲の検出装置及び方法に 関し、より詳細には、流体溶液内の蛍光粒子又は分子の濃度の測定装置及び方法 、或いは基板上又はフィルム内の蛍光粒子又は分子を探り出し、カウントする装 置及び方法に関する。

発明の背景 個々の分子又は粒子の検出する感度の良い装置及び方法に対する要求がある。医 学的及び生物学的研究においては、バクテリア、ウィルス、ＤＮＡフラグメント 等の本来的に蛍光性或いは蛍光性のマーカー又はプローブで標識することのでき る個々の粒子の濃度、数又は位置を測定できることが重要である。

高められた感度の探求において、バーシュフェルト（Ｈｊｒｓｃｈｆｅｌｄ）は 、極微小波（ｅνａｎｅｓｃｅｒ＋ｔ−ｗａｖｅ）励起を使用して、ガラススラ イド上に吸着された８０のフルオレセインで標識された抗体分子を検出した■。

流れる標本を使用して、ドビチ（Ｄｏｖｉｔｉ　ｅｔ　ａｌ、）■は、１秒（Ｉ ｓ）の組込（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）時間内に２２，０００のローダミン６Ｇ 分子の検出限界を達成し、ゲニン等（Ｎｇｕｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）■は、流 体力学的に焦点を合わせた（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ−ｆｏｃｕｓｅ ｄ）流れにより８００分子までこの限界を広げた。マチイス（Ｍａｔｈｉｅｓ） 及びストウリヤー（Ｓｔｒｙｅｒ）■は、光破壊により押しやられた（ｉｍｐｏ ｓｅｄ）限界を指摘し、１０ｐＬのプローブ体積において３分子のＢ−フィコエ リトリン（Ｐ　Ｅ）を検出した。最近、ゲニン等は、ＰＥの１０−１２モル溶液 を焦点の合ったレーザー光線を通過させて流した時に蛍光の破裂を観察し、これ らの破裂は個々の分子の通過によるものと解釈した■。単一分子蛍光破壊を検出 するためには、光線内で二つの分子から同時に放射が観察される確率を無視でき ることを確実にしなければならない。分布関数では、所定の時間間隔の間に蛍光 標本からゼロカウントを検出する確率は、溶媒からの確率より１０％未満だけ異 なる。標本における平均カウント速度をブランクと比較して１０％未満だけ上げ るとすれば、便利な試験である。ゲニン等の実験では、ＰＨについての最も蓋然 性の高いカウント速度は、ブランクのそれの二倍であり、それらの単一占有の確 率（０，３４）は、二重占有（ｄｏｕｂｌｅ　ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）の確率０． １１を与える。このことは、ゲニン等は、単一分子の存在というよりもむしろ投 射された体積における二辺上の分子が同時に存在することによる蛍光の破裂を観 察していたことを示す。

先行技術は、速やかな超高感度検出及び蛍光粒子から単一分子までの範囲のカウ ントができる方法及び装置を提供しておらず、この高検出感度を得るための最適 条件を決定する方法も提供していない。

■旧ｒｓｅｈｆｅｌｄ、Ｔ、（１９７６）　Ａｐｐｌ、　０ｐｔｉｃｓ　１５． ２９６５−２９６６゜■Ｄｏｖｉｃｈｉ、　Ｎ、　Ｊ、　、　Ｍａｒｔ　ｉｎ、 　Ｊ、　Ｃ，、Ｊｅｔｔ、　Ｊ、　Ｈ，、Ｔｒｋｕｌａ、　Ｍ、　＆　Ｋｅｌｌ ｅ秩A　Ｒ。

Ａ、　（１９８４）　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ　５６．３４８−３５４゜■Ｎｇｕ ｙｅｎ、Ｄ、、Ｋｅｌｌｅｒ、Ｒ，＆　Ｔｒｋｕｌａ、Ｍ、（１９８７）　Ｊ、 　Ｏｐｔ、　Ｓｏｃ、　Ａｍ、　４゜■Ｍａｔｈｉｅｓ、Ｒ，Ａ、　＆　５ｔｒ ｙｅｒ、Ｌ、　（１９８６）　ｉｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｆｎ　ｔｈｅ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｅｊｅｎｅｅ、　ｅｄｓ、　ＴａｙＪｏｒ、ＤＡ２ ．　Ｗａｇｇｏｎｅｒ、　Ａ、　Ｓ、　、　Ｌａｎｎ　ｉ、　ＦA　、　Ｍ ｕｒｐｈｙ、Ｒ，Ｆ、＆　Ｂｉｒｇｅ、Ｒ，（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ 、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１２９−１■Ｎｇｕｅｎ、　Ｄ、　Ｃ，、Ｋｅｌｌｅ ｒ、　Ｒ，Ａ２．　Ｊｅｔｔ、Ｊ、Ｈ，＆　Ｍａｒｔｉｎｊ、Ｃ，（１９８７） Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ　５９．　２１５８−６１゜発明の目的及び概要 本発明の目的は、溶液中の個々の蛍光粒子から単一分子のレベルまでを定員的に 検出する装置及び方法を提供することである。

本発明の他の目的は、基板上の蛍光粒子又は蛍光分子を探り出しカウントする装 置を提供することである。

本発明の他の目的は、溶液中又は基板上の個々の粒子をリアルタイムに検出し２ 、定量する装置及び方法を提供することである。

本明細書における別の目的は、個々の本来的に蛍光性の粒子又は蛍光材料の付い た粒子の定量的検出をする装置及び方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、流体溶液中の個々の粒子を光線で照明し、粒子及び流 体から放射された光を処理して粒子のカウントを提供する装置及び方法を提供す ることである。

本発明の他の目的は、蛍光粒子を含む流体を照明し、粒子から破裂する蛍光光子 をバックグラウンド光子放射と区別して粒子の表示を与える装置及び方法を提供 することである。

本発明の上記の目的及び他の目的は、流体中の蛍光粒子の検出装置であって、流 体の特定の体積を照明し、それにより前記流体からのバックグラウンド散乱及び 前記流体体積中の粒子からの光の破裂を含む光が放射され、光検出手段が出力信 号を生じさせる手段と、−と区別して、粒子の表示又はカウントを与える手段と を、含む装置により達成される。

図面の簡単な説明 本発明の上記の目的及び他の目的は、添付図面を参照することにより以下の説明 から更に明確に理解されるであろう。

第１図は、本発明の装置の好ましい実施態様の模式図であり、この実施態様では 、粒子が流体流中にある。

第２図は、第１図の電子ゲート回路のブロック図であり、この回路の種々の点に おける信号入力及び出力を示す。

第３図は、第１図のゲート回路の別の実施態様である。

第４図は、第１図のゲート回路の更に別の実施態様を示す。

第５図は、ゲート回路のデジタル回路の実施態様を示す。

第６図は、最適信号／ノイズ条件に関するレーザー強度と粒子走行時間とを示す 。

第７図は、走行時間の関数としての、最適レーザー強度における最適信号／ノイ ズ比のプロットである。　第８図は、第１図の装置の作動の結果を示すプロット である。

第９図は、基板上の蛍光粒子又は分子をカウントし、探り出す本発明の他の実施 態様の模式ブロック図である。

第１θ図は、基板上の蛍光粒子又は分子をカウントし、探り出す本発明の別の実 施態様の模式ブロック図である。

第１１図は、基板上の蛍光粒子又は分子をカウントし、探り出す本発明の更に別 の実施態様の模式ブロック図である。

好ましい実施態様の詳細な説明 第１図を参照すると、レーザー光線１】が、レーザー】２により偏光子１３を通 して投射され、レンズ１４により、焦点合せされた光線１６によって示すように 、流体流に焦点を合せられる。前記光線は、毛管１８内を流れる流れ標本流体流 （ｆｌｏｗｉｎｇ　ｓａｍｐｌｅ　ｆｌｕｉｃｔｓｔｒｅａｍ）　ｌ　７に焦点 を合せられる。流れ１７の流速を制御する役割をするフロー制御手段１９が、模 式的に示されている。レーザー偏光は、偏光子１３により散乱面内に方向付けさ れてバックグラウンド散乱を最小にしている。レーザー光線は、拡大図２２に示 す領域を照明する。照明され′た体積（ｖｏｌｕｍｅ）の映像が、対物レンズ２ ４により空間フィルタ２３に映写される。空間フィルタ２３は、照明された領域 及びプローブされる体積を参照番号２６で示される体積にする。空間フィルタは 、プローブ体積の高さと巾とを定めている。

分光フィルタ２８が、照明された体積からのレイリー及びラマン放射（Ｒａｙｌ ｅｉｇｈ　ａｎｄ　Ｒａｍａｎ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ）をはねつける。空間フィル タ及び分光フ、ｆルタを通過するエネルギーは、集束レンズ２８により、２次電 子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｊｐｌｉｅｒ　ｔｕｂｅ）でも、必要な感度を有 する他のいかなる光変換器（ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）でも良い光変換 器２９に焦点を合せられる。

蛍光粒子３１が、レーザー光線を流れ抜け、レーザー光線によって照射されると 、光子の破裂が起こる。この光子の破裂は、バックグラウンド放射とともに、出 力信号を発生させる２次電子増倍管によって検出される。この出力信号は、特定 の振幅及び期間の破裂を探すように設計された電子ゲート回路３３に送られる。

インタレスト（ｉｎｔｅｒｅｓｔ　）の破裂は、前記体積を通る走行時間に等し い期間と、少なくとも最小の振幅を有する。斯かる破裂が検出されると、発生し た信号がカウンター３４及びコンピュータ３６に送られ、それらは処理を行い、 処理を施したカウントを所定の時間にわたって記憶して濃度又は他の関連する情 報を提供することができる。

第２図を参照すると、２次電子増倍管からの出力が第２Ａ図に示されており、こ の出力は、レイリー及びラマン散乱を表わす低周波バックグラウンド放射３８及 び前記プローブ体積を通過する粒子を表わす高周波破裂３９の両方を含む複数の 光子破裂と、電子ノイズ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｎｏｉｓｅ）４０から成って いる。２次電子増倍管からの信号は、所定の振幅を有するパルスを通過させる波 高弁別器４１に送られ、その後パルスの周波数を電圧４３に変換する周波数から 電圧への変換器４２へと送られる。しかる後、電圧４３は、一対の出力パルス４ ６．４７を発生させるとともに低周波バックグラウンド放射を弁別する波高弁別 器４４に送られる。パルス幅から電圧への変換器４８が、前記パルスを受け、第 ２Ｅ図の５１．５２に示す出力を発生させる。

波高弁別器５３が、パルス５１及び５２を検出し、パルス５２が所定の振幅を越 える場合、即ち第２Ｅ図の二本の点線によって示される所定の範囲内にある場合 に、出力パルス５４を発生させる。物理的でない非常に長いパルスを受入れない ように、窓付弁別器（ｗｉｎｃｌｏｗ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）を用いて も良い。前記振幅は、粒子の存在を表わすものである。回路は、低周波バックグ ラウンド放射３８だけでなく、パルス５１として表わされる高周波の短期間の鋭 い電子スパイク４０も弁別する。

別の検出方法が、第３図に示されており、この方法では、２次電子増倍管２９か らの信号は、第２Ｃ図に示す信号とほぼ対応する信号を発生させる電流から電圧 への変換器５２に送られる。しかる後、信号は、波高弁別器４４及びパルス幅弁 別器４８に送られ、粒子の存在を示す出力を発生させる。

第４図は、上述した波高弁別器及びパルス幅弁別器４８を備えた処理回路部品（ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）の−膜化したブロック図である。

第５図には、波高及びパルス幅弁別を行い蛍光粒子からの光子の有効な破裂を検 出するデジタル回路が示されている。２次電子増倍管からの出力は、増幅され５ ６、波高弁別器５７に送られ第２Ｂ図に示す種類の信号を与える。波高弁別器の 出力は、最初に到来するパルスにより始動するカウンターに送られる。パルスは 、更にゲート５８を閉じ、レーザー光線を通過する分子の走行時間に合せてセッ トした可変遅延回路５９を始動させる。カウンターは、可変遅延回路がトリガー してカウンター６１を停止させ、カウンターをリセットする迄カウントを続け、 新しい遅延サイクルを開始させるようにゲートを開く。マグニチュード比較器６ ２が、所定のバックグラウンド値についての遅延期間にわたってカウンターが発 生させたカウント数を比較するが、これは粒子からの蛍光破裂（ｆ　Ｉｕｏｌｅ ｓｅｅｎｔｂｕｒｓｔｓ）が、バックグラウンド放射よりも高いカウント速度を 有しているからである。数が嘗て永のバックグラウンド値を越えると、それは、 分子が光線を通過したことを示し、１カウントが為される。

単−粒子又は分子検出においては、単−粒子又は分子イベントを、バックグラウ ンド放射の変動と比較してできるだけ明る（する条件を提供することが重要であ る。この点に関し、レーザーをしっかりと焦点合せする必要があり、空間フィル タは、多数の分子又は粒子が体積を占める蓋然性を無視できる様に充分に小さな プローブ体積を定める必要がある。レーザーパワーは、過剰なバックグラウンド 放射の発生なしに最も明るい蛍光を提供する様に選択する必要がある。

単一分子レーザーで誘発された蛍光により検出するのに必要な感度を得るため、 入射レーザー励起強度（ｉｎｃｉｄｅｎｔ　１ａｓｅｒ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）及び分子のレーザー光線を通過する走行時間を制御しなけ ればならない。我々の理論と実験は、励起状態吸収の飽和及び光化学的光破壊が 、レーザーパワー及び照射時間（走行時間）に根本的な制限をかけ、これが最も 良い信号／ノイズ比を与える。最適条件を定義するには、先ず関連する変数を定 義することが役にたつ。

（１）観測した蛍光放射の壊変速度（ｄｅｃａｙ　ｒａｔｅ）をｋｆ（光子７秒 ）と定義する。

（２）分子吸収の励起速度をｋａ（光子７秒）で与える。この速度は、入射光強 度及び分子の光吸収断面積に依存する。

ｋａ＝Ｉσａ、　（１） ここで、σａは、 σａ＝３．８２４ｘｌＣ１〜２１ε　（２）で表わされる従来のモル吸光係数（ リットル／（モルｃｍ）　）に関連する吸収断面積（ｃ＋ｎ２／分子）である。

（３）分子のレーザー光線を通過する走行時間、又は光線が分子にあたる走行時 間は、τｔ＝ｗ／ｖ（秒）で与えられ、ここでＷはレーザー光線の幅であり、■ は速度である。

（４）特性光破壊（ｃｈｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｐｈｏｔｏｄｅｓｔｒｕｅｔ ｉｏｎ）速度ｋｐｄ（秒−１）が、分子が光により破壊される第１のオーダー速 度を定義する。特性光破壊速度は、 ｋｐｄ＝Φｐｄｋｆ　（３） により、光破壊量子収率Φｐａと関連している。特性光破壊壊変時間τｐｄが、 ｋｐｄの逆数で与えられる。

下記の方程式（４）は、走行時間あたりの平均バックグラウンド−信号（ｍｅａ ｎ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｃｌ−ｓｉｇｎａｌ−ｐｅｒ−ｔｒａｎｓｉｔ　ｔｉｍ ｅ）の平方根で割った分子あたりの蛍光を与える。これは、信号のノイズに対す る比であり、このことは我々がバックグラウンドの変動に関連する信号（分子あ たりの蛍光）を最適化することに関心があるからである。方程式は、 Ｓ／ｆＢ　（ｋｒ）−１／２［１−ｅｘｐ［−ｋ　ｒ／（ｋ＋１））］である。

この方程式では、変数にはｋａ／ｋｆとして定義され、τはτｔ／τｐｄとして 定義される。そのため、実験の最適化は、放射速度に対する励起速度の比（ｋａ ／ｋｆ）及び光破壊時間に対する走行時間（τｔ／τｐｄ）に依存する。ｋ及び τの関数としてのＳ／ｆＢのに次元的プロットが、第６図に示されている。これ は、全ての発蛍光団に当てはまる根本的関数である。

特定の発蛍光団に関する条件を最適化するには、特性光破壊時間及び観察蛍光寿 命さえ分かれば良い。第６図の点は、走行時間τが０乃至３の最適光度における 最適Ｓ／ｆＢ値を示す。第７図は、走行時間の関数としての最適Ｓ／ｆＢのプロ ットを示す。実験を行うには、用意のできた実験について実用的である最長の走 行時間を選択し、しかる後その最長走行時間における最大Ｓ／Ｊ″Ｂを与える励 起強度を選択する。

第１図及び第２図の装置は、Ｂ−フイコエリトリン（Ｐ　Ｅ）のモノマー及びダ イマーのサブピコモル溶液の単一分子蛍光を検出するのに使用された。アルゴン レーザー１２が、毛管１８内にある流れ標本流の中心に数μｍの点の大きさに焦 点合せされた励起光線を提供した。流速は、ＰＥに関する光破壊時間にほぼ等し い走行時間を与えるように選択され、レーザー強度は、第６図及び第７図に示す ような最適Ｓ／ＩＢを与えるように選択される。蛍光発光は、顕微鏡対物レンズ ２４によって集められ、空間フィルタ２３に映写される。空間フィルタは、プロ ーブ体積を定め、毛管壁からの散乱及び蛍光を受入れなかった。蛍光干渉フィル タ２７が、レイリー及びラマン散乱を受入れないようにするため使用された。蛍 光は、２次電子増倍管及び増幅器／弁別器により検出された。第２図の蛍光破裂 検出器は、しかる後オンラインリアルタイム方式でイベントの数を記録するのに 使用された。

第８図は、単一分子イベントの数の対数に対するＰＥモノマー及びダイマーの濃 度の対数を表わす。

これら二つのプロットの回帰線は、かなり１に近い勾配を有しており、モノマー のデータの勾配は１．０５であり、ダイマーのデータの勾配は１．１５である。

この線形濃度従属性は、我々が単一分子イベントを見ていることを証明している 。動的範囲は、低濃度におけるサンプリング時間及び高濃度における多数占有（ ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｃｃｕｐａｎｃｙ）によって制限される。１０−１．２モル よりも高濃度だと、プロ・−ブ体積の周りの蛍光によって平均値が上に移動する 。これらの実験は、全て充分に低濃度で行ったので、単一占有（ｓｉｎｇｌｅｏ ｃｃｕｐａｎｃｙ）の確率は約０．２０未満であった。このことは、更に我々が 単一分子イベントを見ていることを保証するものである。

第１図において、流体溶液は照明された領域を流れ過ぎ、それにより粒子は、そ れらが前記体積内にある際に光子の破裂を発する。

照明された領域は、粒子を探り出し検出するために基板の表面又は基板上のフィ ルム−面にわたり移動することができることは明らかである。粒子は、それらが 照明されている走行時間τの間だけ放射するので、最終的効果は同じである。光 線を表面に対して移動させることにより、又はスライド等に載った基板を移動さ せることにより、基板上又はスライド含まれる総面積を走査して粒子を探り出し 又はカウントする。

第９図を参照すると、溶液は基板又は薄いフィルム６６としてのスライド６７上 で、ラックピニオン装置、ステッパーモーター等の好適なＸ−Ｙドラ４１手段に より移動可能なろ紙又はゲル内で移動させることができる。レーザー等である光 源６８からの光は、レンズ６９によりスライドに焦点を合せる。光は、ビームス プリッタ−７１を通過し、標本溶液に当る。溶液により放射された光子は、二色 性の（ｄｉｅｈｒｏｉｃ）ビームスプリッタ−により、集光光学素子（ｃｏｌｌ ｅｅｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｃｓ）７２、空間フィルタ７３、分光フィルタ７４及び 検出器７６へと反射される。上述のように、空間フィルタは、観察する領域を定 め、分光フィルタは、散乱したレイリー及びラマン放射を受入れない、しかる後 、信号は、上述のように、ゲート回路３３により処理され、カウンター３４でカ ウントされ、３６のコンピュータに送られる。そのため、このことが、スライド 等に関する用途に蛍光単一粒子スキャナーを提供する。Ｘ−Ｙドライブを制御す ることにより、フィルム全体を分析できる。照明された体積内における粒子の走 行時間は、ステージの移動の速度により制御できる。領域は、所望のままに走査 することができる。上記のいかなる信号処理電子回路でも検出器の出力を処理す るのに使用摺ることができ、粒子認識出力を提供する。

第１０図は、基板６７上のフィルム６６を走査する他の装置を示す。基板を移転 させ（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）たり移動させたりするよりも、基板は固定的で あり、投射される光線が走査鏡又は走査組立体によってスキャンされるのが良い 。第１０図を参照すると、光源７８が、光線７９を投射し２、この光線は、二色 性のビームスブリック−８１を通過し、走査鏡組立体８２により方向を変えられ 走査し：／ズ８３によりフィルム６６に焦点を合せられる。放射された光子エネ ルギーは、走査レンズにより集められ、走査鏡組立体によりビームスプリッタ− ８１へと方向を変えられることにより集束集光光学素子７２に当り、空間フィル タ７３、分光フィルタ７４を通過し２、検出器７６に集められる。しかる後、出 力は電子ゲート装置３３、カウンター３４により分析された後、コンピュータ３ ６に送られる。走査鏡は、二つの走査検流計鏡を備えていても良く、この鏡は検 流計に送られた信号で振れて走査鏡を方向転換させる。一方の鏡は、第一の方向 に速やかに移動して標本を横切って走査し、より遅い速度で走査を進める第二の 鏡は、線８４により示される種類のラスク走査を行う。そのかわりに、光線をス テッパーモーター等によりゆっくりとＸ方向にスキャンさせることもできる。更 に、電子流は検出器と協働して、必要な信号弁別を提供し７、単一粒子を認識し 、検出する。

第１１図においては、基板６７及びフィルム６６は、第９図を参照しながら説明 した種類の移転ステージに載せられている。光源８６が、二色性のビームスプリ ッタ−８７にエネルギーを与え、このエネルギーは、し：／ズ８８によりフィル ム６６に焦点を合わされる。

放射されたエネルギーは、し：／ズ８８に捕捉され、二色性のビ・−ムスプリッ ター８７を通過し、分光フィルタ８９、集束Ｉ／ンズ９１及び空間フィルタ９２ を通って検出器９３へと進む。検出器からの出力信号は、電子ゲート装置３３、 カウンター３４及びコンピュータ３Ｇを備えた電子回路により処理される。上記 の各々の実施例においては、蛍光分子又は粒子が、粒子の移動又は照明領域の移 動により照明された体積を通過する時に、分子又は粒子は、所定の時間照明され 光子の破裂を発することは明らかである。この光子の破裂は、光子の破裂が適当 なマグニチュード及び期間又は幅を有する場合にのみ応答する本発明の単一粒子 破裂検出器を使用することにより、バックグラウンド放射と区別することができ る。本発明を具体的実施態様を参照して説明してきたが、この説明は、本発明を 例解摺るものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。添付の請求 の範囲により定義される本発明の真実の精神から逸脱することなく、種々の変更 及び応用を当業者は思い付くことがあろう。

０　寸　１ Ｍ　ｆ”）　ｍ 走行時間 −１６−１５−１４−ｉ３　−１２　−１．１ＬＯＧ　（モル濃度）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．流体中の単一蛍光粒子及び／又は分子の検出装置であって、流体の所定の体 積を照明する手段と、 粒子に前記照明された体積を通過させ、それにより粒子又は分子が前記領域を通 過する際に、照明に応答して前記体積から放射される蛍光エネルギーが、バック グラウンドエネルギーと粒子又は分子からの破裂エネルギーとを含む手段と、前 記エネルギーを検出し、出力信号を発生させる手段と、前記出力信号を受け、前 記粒子からの破裂エネルギーをバックグラウンドエネルギー又は電子ノイズと区 別し、前記領域を通過する粒子又は分子の検出の表示を与える手段とを、備えて いることを特徴とする装置。
2. ２．前記受信及び粒子破裂エネルギー区別手段は、前記破裂の振幅と期間とを検 出する手段を備えていることを特徴とする請求項１記載の装置。
3. ３．前記破裂の振幅と期間とを検出する手段は、周波数から電圧への変換器と、 アナログ信号と、前記信号を受け、信号が所定の値を越えた場合に前記時間に等 しいパルス幅を有する出力パルスを発生させる波高弁別器と、前記出力パルス幅 が粒子の走行時間を表わす所定の値を越えた場合に出力を発生させるパルス幅弁 別器とを備えていることを特徴とする請求項２記載の装置。
4. ４．前記パルス幅弁別器は、前記出力パルスを受け、パルス幅に依存する振幅を 有する出力電圧を発生させるパルス幅から電圧への変換器と、前記出力電圧が、 所定の振幅を越えた場合、即ち所定の窓内にある場合に検出する波高弁別器とを 含むことを特徴とする請求項３記載の装置。
5. ５．前記破裂の振幅と期間とを検出する手段は、前記検出器の出力を受けてアナ ログ出力信号を発生させる電流から電圧への変換器と、前記信号が所定の値を越 えた場合に前記時間に等しいパルス幅を有する出力パルスを発生させる波高弁別 器と、前記出力パルス幅が所定の値を越えた場合、粒子が前記領域を通る走行時 間を表わす所定の窓又は範囲内にある場合に出力信号を発生させるパルス幅弁別 器とを備えていることを特徴とする請求項２記載の装置。
6. ６．前記破裂の振幅と期間とを検出する手段は、所定の期間にわたり放射された 光子をカウントし、数が所定の数を越えた場合に粒子を表わす出力信号を発生さ せる手段を備えていることを特徴とする請求項２記載の装置。
7. ７．流体中の単一蛍光粒子の検出装置であらて、流体に、前記流体から散乱した エネルギーと前記流体中の蛍光粒子からのエネルギーとを含む光子エネルギーを 放射させるため、前記流体のある領域を照明する手段と、 蛍光粒子に前記領域を通過させ、それにより前記粒子は、前記領域通過する走行 時間に等しい期間を有する破裂エネルギーを放射する手段と、 前記エネルギーを受け、焦点を合せるレンズと、前記焦点を合わせたエネルギー を受け、出力信号を発生させる検出器と、 エネルギーを受取られる前記領域を定めるため、前記検出器とレンズ手段との間 に置かれた空間フィルタと、前記出力信号を受け、前記粒子により放射された光 子破裂エネルギーとバックグラウンドエネルギーとを区別して、前記領域を通過 する粒子の検出の表示を与える手段とを、備えていることを特徴とする装置。
8. ８．前記蛍光粒子に前記領域を通過させる手段は、粒子及び流体に前記領域を通 って移動させる手段を備えていることを特徴とする請求項７記載の装置。
9. ９．前記粒子及び流体に前記領域を通って移動させる手段は、流体流を含むこと を特徴とする請求項８記載の装置。
10. １０．前記粒子及び流体に前記領域を通って移動させる手段は、流体をステージ に置き、前記ステージを前記領域に対して移動させ、それにより前記流体を走査 することを含むことを特徴とする請求項８記載の装置。
11. １１．前記蛍光粒子に前記領域を通過させる手段は、流体をステージに置き、照 明を前記ステージ一面にわたりスキャンすることを含むことを特徴とする請求項 ７記載の装置。
12. １２．前記照明は、回転鏡によりＸ及びＹ方向にスキャンされることを特徴とす る請求項１１記載の装置。
13. １３．前記光源は、レーザーからなることを特徴とする請求項２記載の装置。
14. １４．対物レンズを通して光を標本に焦点を合わせ、標本からの光を同じレンズ を通して集める蛍光顕微鏡を更に備えていることを特徴とする請求項１１記載の 装置。
15. １５．流体中の単一蛍光粒子の検出方法であって、流体の所定の体積を照明する 工程と、 粒子に前記照明された体積を通過させ、それによりバックグラウンドエネルギー と通過粒子からの破裂エネルギーとを含む蛍光エネルギーを前記体積から放射さ せる工程と、前記破裂エネルギーをバックグラウンドエネルギーと区別して前記 領域を通過する粒子の表示を与えるため前記放射エネルギーを処理する工程とを 、 含む方法。
16. １６．前記処理工程が、 前記放射エネルギーを検出し、相応する電気信号を発生させることと、 前記電気信号を処理してバックグラウンドエネルギーを表わす電気信号を受入れ ないようにし、電気信号が粒子の前記体積の通過に対応する振幅及び期間を有す る場合には、出力を発生させることを、含むことを特徴とする請求項１５記載の 方法。
17. １７．最適の粒子からの放射エネルギーのバックグラウンドエネルギー又はエネ ルギーの変動に対する比を与えるため、照明エネルギーと、粒子が所定の体積を 通る走行時間とを選択することを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
18. １８．前記工程は、決定因子として、発蛍光団の蛍光放射寿命及び蛍光光破壊時 間を使用することを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
19. １９．単一粒子破裂エネルギーを検出し、バックグラウンド放射と識別する手段 は、リアルタイムに作用することを特徴とする請求項２記載の装置。