JPH04500313A

JPH04500313A - 糸状菌からの目的とするポリペプチドの分泌を増幅するｄｎａ配列、ベクター、及び融合ポリペプチド

Info

Publication number: JPH04500313A
Application number: JP2509228A
Authority: JP
Inventors: ローリス　ヴァージル　ブライアン
Original assignee: ジェネンコー　インコーポレーテッド
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2016-04-03
Also published as: FI910752A0; AU627334B2; EP0429628A4; WO1990015860A1; JP3153234B2; FI110124B; DK0429628T3; ES2120947T3; CA2034487C; DE69032616D1; EP0429628A1; CA2034487A1; EP0429628B1; AU5846790A; ATE170556T1; DE69032616T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】糸状菌からの目的とするポリペプチドの分泌を増幅するＤＮＡ配列、ベクター、及び融合ポリペプチド発明の背景本願は、１９８６年７月７日出願の米国特許出願第０６／８２２、２２４号の継続出願である１９８８年２月２６日出願の米国特許出願第０７７１６３，２１９号の一部継続出願である。この米国特許出ｍ第０６　／　８８２．２２４号は、１９８５年８月２９日出願の米国特許出願第０６　／　７７１，３７４号の一部継続出願である。このうち、米国特許出願第０６　／　８８２．２２４号は、既に放棄されている。。

発明の詳細な説明本発明は、糸状菌からの目的とするポリペプチドの分泌を促進することに向けられている６本発明は、目的とするポリペプチドの生成レベル及分泌レベルを増幅するためのＤＮＡ配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその方法を開示するものである。より詳しくは、本発明は、糸状菌からのウシのキモシンの分泌を増幅させるための、ＤＮＡ配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその方法を開示するものである。

発明の背景組換えＤＮＡ技術の最近の進展の一つに、β−ガラクトシダーゼに対するカルボキシル融合体の如きバクテリア中でのインシユリンのＡ及びＢ鎖の紺胞内発現がある。ジッーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７６．１０６−１１０（１９７９）；ジテンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　）による５ｃｉｅｎｃｅ　Ｚ１エ、６３２−６３７　（１９８３）を参照、その後、異種のボ・リペプチドを一部含有する融合ポリペプチドの発現に関し、数例が開示されている。マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ　）は、Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、２土工、１−１２（１９８６）で、大ｉ！菌による異種ポリペプチドの生産をまとめている。そこに開示されているように、数種の異種ポリペプチドが、大腸菌内での融合ボリベブ千Ｆとして細胞内で発現されている。

更に、異種ポリペプチドをシグナル配列と融合させることによって、その配列を有する微生物の周辺質域の中に、該ポリ＜７°千１′が分泌されたとい−）、二とである。ある場合には、バクテリアを＃古する囁−の・、・グナル止共に発現されるとき、該異種、セ１しくブ千ドは、大腸菌から培地の中に分泌された。異種タンパクが宿主バクテリアの完全な天然タンパクとの融合体として発現されてきたが、その理由は、主として、該融合ポリペプチドの安定性を向上させるため、または、Ｉ＃製を容易にすることにあった、例えば、スコルチゼー・り（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ　）らは、Ｇｅｎｅ６２゜５５−６４．（１９８Ｂ）で、バクテリアのβ−ガラクトシダーゼ、コーラーテ゛＋−ゼ認識位置及び大腸菌由来のタンパクに結合している１本のねじれたＤＮＡからなるトリプロティンの大腸菌内での発現を報告している。この融合ポリペプチドのβ−ガラクトシダーゼタンパクは、ＡＰＴＧ−セファローズを担体とするアフィニティークロマトグラフィーで融合ポリペプチドを粗細胞溶解物からＭ製するために使用された上いうことである。大腸菌由来のタンパクに結合ｊノでいる１本のねしれたＤＮＡは、その後、コラーゲＪ−−ゼ認識位置をコラ−ゲナーゼと反応させることによって融合ポリペプチドからは離された。同様に、スミス（ＳｍｉＬｈ　）らは、Ｇｅｎｅ　６ユ、３１４０　（１９８８）で、Ｐ、フアルシパルム（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の異なる抗原に対応する２種の異種ポリペプチドのいｒれかと融合した血液凝固因子Ｘａに対する認識付１とそのＣ−末端で融合しているグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからなる融合ポリペプチドをコードするベクターのバクテリアによる発現を報告し７ている。もう一つの例では、ダアン（Ｇｕａｎ）らは、Ｇｅｎｅ６７．２１−３０　（１９８８）で、β−ガラクトシダーゼまたはＰｓｔＩエンドヌクレアーゼのいずれがと融合したタンパクに結合しているマルトースからなる融合ポリペプチド、並びに、バクテリアのｐｈｏ　Ａシグナル、タンパクに結合しているマルトース及びｐｈｏ　Ａタンパクからなる融合タンパクの発現と精製について報告している。前者の場合、該融合ポリペプチドは、架橋型アミロースを担体とするアフィニティクロマトグラフィーによって粗バクテリア溶解物から抽出されたのに対し、後者においては、該融合タンパクは、スフェロプラストの形成及び架橋型アミロースを担体としたアフィニティクロマトグラフィー処理を行なったのちの周辺賞域から得られた。

イースト菌での融合ポリペプチドの発現もまた報告されている。

例えば、カーセンス（Ｃｏｕｓｅｎｓ　）らは、Ｇｅｎｅ６１．２６５−２７５（１９８７）で、その２つのタンパクの連結部でメチオニン残基を有するスーパーオキシドジスムターゼ−ヒトプロインシュリン融合タンパクからなる融合ポリペプチドを開示している。スーパーオキシドジスムターゼは、細胞内タンパクであり、その融合ポリペプチドは、不正確なジスルフィド結合を有するイースト発現宿主内の不溶性包摂体として発現されたということである。亜硫酸分解のあと、プロインシュリンは、精製され、天然系に戻され、そしてシアノーゲンブロマイドでのメチオニン残基の分解ののちインシュリンを生成するよう処理された。

カーセンスらに与えられた米国特許第４．７５１．１８０号は、興味の対象であるポリペプチドが完全に異種融合ポリペプチドとして発現されるとき、該興味の対象であるポリペプチドは、イーストのような発現宿主から高収量で得られ得ると述べている。異種ポリペプチドの一つは、該発現宿主内で高収量で、典型的には、該宿主によ−って生産される総タンパク量の５％より多い量で生産される。

しかしながら、開示された唯一の高程ＩＩ異種ポリペプチドは、アロイフン−１リンかまたはＩｇＦ−２のいずれかと融合した細胞内タンパクヒトスーパーオキシドジスムターゼのそれである。その明細書は、また、分泌リーダ一部及びプロセシングシグナルが、融合ポリペプチドの一部として含まれ得ることを述べている０分泌物が得られるであろうということや、もし、得られたとして、それが、例えば、プロインシュリンまたはインシュリン様成長因了（ＩｇＦ−２＞のような興味の対象であるポリペプチドだけに融合した分泌リーダー配列からなる融合体中で高収量の異種タンパクを検出する融合構造体を使用して得られた分泌物よりも高いレベルであろうということを示唆するいかなる例も示されていない。

異種遺伝子発現も、また、糸状菌についても報告されている。

例えば、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　）らは、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−（，１４１１−１４２２（１９８８）で、糸状菌リズムコール・メイー・イ　（Ｒｈｉｚｕｍｕｃｈｏｒ　ｍｅｉｈｅｉ）由来のアスバルチルブロテインナーゼのプレープロ型を発現するアスペルギルスーオリザエ（Ａ。

ａｒｙｚａｅ）由来のα−アミラーゼプロモーターを利用した発現ベクターを報告している。アスバルギルス・オリザエで発現すると、アスバルチルプロテインナーゼは、培地から得られた。グインネ（Ｇｗｙｎｎｅ）らは、Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　．７１３−７１９　（１９８７）で、細菌のグル：１アミラーゼシグナルまたは人工のコンセンサスジグチル配列のいずれかでこれらの遺伝子を発現することによって糸状菌由来のヒトインターフェロン及びバクテリアのエンドグルカナーゼの発現と分泌を報告している。

アブシャル（υｐｓｈｓ目）らは、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５．１３０１−１３０４　（１９８７）で、糸状菌中のｔ−ＰＡのプレ型をコードする遺伝子の発現によって、ヒト組織プラスミノーゲン活性剤の発現及び分泌を報告している。更に、ターンプル（Ｔｕｒｎｂｕ目）らは、Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７．１６９−１７４で、糸状菌由来のバクテリアエンターロトキシンサブユニットＢを発現及び分泌するための試みを報告している。しかし、分泌物は検出されなかった。

ウシのプロキモシンが、大腸菌、イースト菌のサフカロミケス・セレビシア（Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）及びヤローイア、　ＩＪボリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ　）内で発現されたということであり、また、本発明者によって糸状菌のアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）内で発現されたことが報告されている。

大腸菌内において、ｔｒｐ　Ｅ遺伝子のアミノ末端フラグメントによって置換された最初から４つのアミノ酸残基を有するプロキモシンは、ｔｒｐプロモーターの制御下に生産されてきたということであるクニシモリ　（ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　）らによるＧｅｎｅ　２９．　４１−４９（１９８４））、該融合タンパクは、細胞質内で包摂体として蓄積されたが、適当な抽出条件で処理したのち、活性化され、成熟したキモシンを生成することができた。

モイル（Ｍｏ１ｒ　）らは、サッカロミケス・セレビシア内でのプロキモシンの細胞内生産を開示している（工業微生物学の発展（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）第２６巻アンダーコフラー（Ｕｎｄｅｒｋｏｆｌｅｒ　）＆Ｌ工業微生物学会（５ｏｃｒｅｔｙ　ｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　％米国パージニア州アーリシトン〕。

該タンパクは、アミノ末端に接合したグリセリン酸リン酸キナーゼ、トリオセホスフェートアイソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ　）またはガラクトキナーゼからなる多種のセグメントで合成され、それは、同じプロモーターからの直接の発現と比較して増幅した生産を与えた。生成量のこの増加は、ｍＲＮＡのより効率的な翻訳によるものであることを示唆している。モイルらは、また、インベルターゼまたはα−因子の最初のほんの僅かの残基との融合体の形で、サフ力ロミケス・セレビシアからのプロキモシンの分泌を報告している。細胞内プロキモシンは、前記列上の付加アミノ酸であるにも拘わらず、低いｐＨで活性化され、成熟したキモシンを与える。同様に、活性化し得るプロキモシンは、そのアミノ末端に接合した野性アルカリ細胞外プロテアーゼの１４または９０残基のいずれかと共にイースト菌ヤローイア・リポリチカから分泌された〔フラツグ（Ｆｒａｎｋｅ　）　らによる「工業微生物学の発展（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２９巻ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ　）　ｋＭ＊工業微生物学会（５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　、米国バージニア州アーリントン〕、この報告では、該プロテアーゼのアミノ末端の約２０％未満しか融合ポリペプチドを生成するのに使用されておらず、融合ポリペプチドとしての発現による明白な効果も生していない。活性な仔牛のキモシンもまた糸状菌トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ＊ａ　ｒｅｅｓｅｉ　）内で生産されてきた（ハルキ（）ｌａｒｋｋｉ　）らによるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７．　５９６　６０３　（１９８９）　）。

セロビオハイドロラーゼ■遺伝子（ｃｂｈ　Ｉ　）プロモーター及びターミネータ−領域が用いられ、そして、プロキモシンｃＤＮＡと融合した異なるシグナル配列を用いて４つの相異なる構造体が作成された。キモシンシグナル配列、ｃｂｈ　Ｉシグナル配列、ｃｂｈ　１／キモシンシグナル配列混成体またはｃｂｈ　ｌシグナル配列＋成熟ｃｂｈ　Ｉの２０アミノ酸のいずれかがプロキモシンのアミノ末端に融合した。確認するには不充分な数の形質転換体しか試験されなかったが、僅かによりよい生成量が前記最後の構造体から得られた０分泌は、使用されたベクター構造体のタイプを問わず、形質転換体の細胞内に残存するキモシン派生物質の６６％に無効果であった。

ｇｌａＡ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　）の多くの菌株に高度に発現されるグルコアミラーゼをコードする。ｇｌａＡ遺伝子のプロモーター及び分泌シグナル配列は、本発明者ら（キュシン（Ｃｕ１ｌｅｎ　）らによるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　、　７１３−７１９　（１９８７））及びＥＰＯ公開第０２１５５９４号によって以前開示されたように、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）中にウシキモシンを含むアスペルギル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ　）及びアスペルギルス・アワモリ内で異種遺伝子を発現するのに用いられてきた。後者の実験においては、グルコアミラーゼ、または、キモシン分泌シグナル及びある場合には成熟グルコアミラーゼの最初の１１コドンのいずれかのプロキモシンｃＤＮＡを組み込んで多様な構造体が作られた。アスペルギルス・アワモリから得られた分泌キモシンの最大量は、５０ｍｊ７振盪フラスコ培養で１５■／ｌ以下であり、ｐＧＲＧ３によってコードされたキモシンシグナル配列を使用して得られた。これら従来の研究は、総プラスミド複写数がキモシン生成量と無関係であり、豊富なポリアデニレート化キモシンｍＲＮＡが生成すること、及びキモシンの細胞内レベルは、分泌シグナルの起源とは無関係に、いくらかの形質転換体において高いレベルであるということを示した。キモシン生成においては、転写は、限定要因ではないが、分泌は非効果的であったのであろうということを意味した。また、プロキモシンのプロペプチドへのグルコアミラーゼの小さなアミノ末端セグメント（ＩＩアミノ酸）の付加は、成熟キモシンへの活性化を阻害しないということは明らかであった。

しかしながら、グルコアミラーゼの最初の１１コドンと共に得られた細胞外キモシンの量は、該グルコアミラーゼシグナルだけを用いた場合の量よりも実質的に少なかった。

従って、ここに本発明の目的は、融合ＤＮＡ配列を含む糸状菌、そのようなりＮＡ配列を含む発現ベクター、形質転換された糸状菌、融合ポリペプチドからの目的とするポリペプチドの発現と増幅した分泌を提供すること及びそのような望ましいポリペプチドを高レベルで発現し及び分泌するための方法を提供することにある。

更に、本発明の目的は、融合ＤＮＡ配列を含む糸状菌、そのようなりＮＡ配列を含むベクター、形質転換された糸状菌、融合キモシンポリペプチドからのキモシンの発現と増幅した分泌を提供すること及びキモシンを高レベルで発現し及び分泌するための方法を提供することにある。

これまでに議論した引用文献は、単に本願の出願日以前の先行技術を明らかにするために記載したものである。ここに、先行発明またはより早い時期に提出した出願を基礎とする優先権によって、かかる開示よりも本願の時期を早める資格が本発明者らにないという認定をする事実は何もない。

！里生！ｌ上記の目的に従って、本発明は融合ポリペプチドをコードする新規な融合ＤＮＡ配列を含むものであり、その融合ＤＮＡは、糸状菌中で発現されたときは、融合ポリペプチドの発現を起こし、分泌に際しては、従来使用されてきたＤＮＡ配列で形質転換された糸状菌からの該ポリペプチドの発現及び分泌と比較して、増幅したレベルで目的とするポリペプチドの分泌を起こすものである。

該融合ＤＮＡ配列は、アミノ末端からカルボニル末端に至る第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列を包含する融合ポリペプチドをコードする５′−末端の４つのＤＮＡ配列から成る。第１のＤＮＡ配列は、第１の糸状菌中の分泌配列としてシグナルペプチド機能をコードしている。第２のＤＮＡ配列は、その同じ糸状菌か第２の糸状菌から正規に分泌される分泌ポリペプチドまたはそのタンパクをコードしている。第３のＤＮＡ配列は、開裂可能なリンカ−ポリペプチドをコードし、第４のＤＮＡ配列は、目的とするポリペプチドをコードしている。第１または第２のいずれかの糸状菌内で、融合ＤＮＡ配列が発現された場合、それらはいずれかの糸状菌から正規に分泌された第２のポリペプチドを含んでいない融合ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列から発現された場合に得られる目的とするポリペプチドに比較して、目的とするポリペプチドの増幅した分泌が得られるのである。

本発明は、また、上記融合ＤＮＡ配列を包含する発現ベクター及びそのようなベクターで形質転換された糸状菌を含むものである０本発明は、また、そのような融合ＤＮＡ配列によってコードされた融合ポリペプチドを含むものである。

更に、本発明は、宿主糸状菌の上記発現ベクターでの形質転換及び培地中に目的とするポリペプチドを分泌する宿主糸状菌の培養を含む目的とするポリペプチドの生産方法を包含するものである。

図面の簡単な説明第１図は、ｐＢＲΔｇａｍ−ａｒｇ構築を描いたものである。

第２図は、ｐＢＲ△ｇａＩＩ−ａｒｇ　Ｂからの４．５ｋｂフラグメントで５．５　ｋｂ　ＤＮＡ染色体フラグメントを置き換えることによるｇｌａ　Ａ遺伝子の破壊を描いたものである。

第３Ａ図及び第３Ｂ図は、ｐＧＲＧ　（１−４）の構築を描いたものである。

第４．４Ａ、４Ｂ、４Ｃ乃び４Ｄ図は、ｐ　Ｇ　ＲＧ　４を経由してｐ　Ｇ　ＲＧ　１を生成するために用いられる多種のカセ、・ｌ・挿入物を描いたものである、第５．５Ａ及び５（３図は、ｐ　Ｇ　Ａ　Ｍ　ｐ　Ｒの構築を描いたものである。

第（５図は、ｐＵＣＡＭｐＲｌの構築を描いたものである。

第７図は、ｐｓＧｌの構築を描いたものである。

第８閏は、にｒ）１２及びＧＣ△Ｇ　ＡＭ　ｐ　Ｒ菌株の形質転換体からのＤＮＡのサザン７゛ロフト分析を描いたものである。

第９図は、ＧＣ１２及び１２ｇｒｇ！−１２及び１２　ｇａｍｐｒ４菌株からのＲＮＡの７ノ一ザンプロツト分析を描いたものである。

第１０図は、ＧＣ１２及び形質転換体１２ｇｒｇ＋−１ａ及び１２　ｇａｍｐｒ４の菌株からのＲＮＡの生体外翻訳の生産物を描いたものである。

第１１図は、形質転換体１２ｇｒｇｌ−１ａ及び１２　ｇａｍｐｒ４の培養Ｊ− 澄み液中のキモシンのウェスタン分析を描いたものである。

ｊ：ｖ−畦ｆ説明本発明者らは、目的とするポリペプチドを糸状菌から正規に分泌されたポリペプチドと融合するこ点によって、従来得られたレベ！しよりも高いレベルで目的とするポリペプチドを発現し分泌することができるとい）ことを発見した。以前、本発明者らは、特にここに参考文献として引用している米国特許出願及びＥＰＯ公報第０２１５５９４号に記載したように、ウソキモシンやゲルコアミラー＋や糸状菌からのカルボキシ（−アスバルチ）［）プロテアーゼの如き異種ポリペプチドが、アスパルチルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）から発現されそして分泌され得るということを発見した。

例えば、本発明者らは、以前、アスペルギルス。ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）由来のウソキモシンをグルコアミラーゼう／グナルとキモシンのプロー型との融合体として発現したとき、その発現及び分ン′ メを培地１ｍｊ２当り１．５マイクログラムに接近するレベルで達成した。この主要な構造体をコードするベクターは、ｐＧＲＧｌと呼ばれている（第３及び４Ａ図参照）、シかしながら、グルコアミラーゼングｔルベブチドをグルコアミラーゼプロペプチド及びグルコアミラーゼの最初の１１のアミノ酸と共にプロキモシンに融合した場合、分泌レベルは、従来の構造体で得られた値の約半分、即ち、培地１　ｍｌ当り約０．７５μｇに実質的に減少した。このベクターは従来、ｐＧＲＧ４として規定されたものであり、第３図及び第４Ｄ図で規定したものである。プラスミドｐＧＲＧ１、ｐＧＲＧ３及びｐＧＲＧ４　（第３図及び第４ＡＳＢ、Ｃ及びＤ図参照）の全ては、アスペルギルス・アワモリ中に形質転換されてきた。最大量の細胞外キモシンを生産する形質転換体は、ｐ　Ｇ　ＲＧ　３を用いて得られたものである。培地及び培養条件の改良で、得られた分泌キモシンの最高レベルは、酵素免疫学的分析法（成熟キモシンに加えて不活性キモシン及び退化したキモシンをも検出するであろう）で測定して１５μｇ／ｙｌｌ１未満であった。

ここに記載した融合ＤＮＡ構造体を使用することによって、細胞外キモシンのめざましい増加が得られた。ある場合には、キモシンのレベルは、従来得られたレベルの約２０倍以上である。この分泌の増加に比例して、糸状菌発現宿主の細胞内に保持されたキモシンの量は減少した。従来は、生成したキモシンの５０％以上、場合によっては、殆ど９８％もが、細胞内に保持された（表２参照）。しかしながら、ここに本発明のＤ　Ｎ　、Ａ配列をコードするベクターを使用した場合、発現したキモシンの３０％以下、場合によっては、１９４以下が細胞内に保持されるに過ぎなかった。

キモシンの分泌レベルの増加は、糸状菌によって正規に分泌されたポリペプチドとの融合ポリペプチドとしてのプロー型内でのキモ・シンの発現の結果である。

好ましい態様においては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列を含むｇｌａＡ遺伝子によってコードされるアスペルギルス・アワモリからのグルコアミラーゼは、プロキモシンのアミノ−末端と融合している。グルコアミラーゼシグナル配列及び成熟グルコアミラーゼペプチド配列の存在は、培地中への融合ポリペプチドの増幅した分泌を促進する。次いで、培地を酸性して、キモシン前記列を処理し、プロペプチドを除去して活性キモシンを生産することによって、成熟キモシンを得る。

ここで用いる場合、「融合ＤＮＡ配列」は、５′から３′に至る第１１第２、第３及び第４のＤＮＡ配列を含むものである。

「第１　ＤＮＡ配列」は、第１の糸状菌の分泌配列として、シグナルペプチド機能部をコードする。かかるシグナル配列は、ウシキモシン、ヒトＭｉ織プラスミノーゲン活性剤、ヒトインターフェロン由来のシグナル配列及びグインネ（Ｇｗｙｎｎｅ　）によるスブラ（１９８７）によって開示されたシグナル配列の如き合成コンサンセス真核シグナル配列を含む真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ　）由来のシグナル配列と同様に、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ及びアスパルチルプロテアーゼからのシグナル配列、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　）由来のセロビオハイドロラーゼＩ、セロビオハイドロラーゼ■、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼ■からのシグナル配列、ニューラスバラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　）及びヒューミコラ（Ｈｕｓｉｃｏｌａ　）由来のグルコアミラーゼからのシグナル配列を含む、特に好ましいシグナル配列は、融合ポリペプチドを発現し分泌するために使用された発現宿主によって分泌されたポリペプチドから誘導されたシグナル配列である。例えば、アスペルギルス・アワモリ由来のグルコアミラーゼからのシグナル配列は、アスペルギルス・アワモリ由来の融合ポリペプチドを発現し、分泌する場合に選択される。ここで用いる場合、第１アミノ酸配列は、糸状菌の中の機能部である分泌配列に対応している。かかるアミノ酸配列は、既に規定した第１　ＤＮＡ配列によってコードされる。

ここに用いる場合、「第２ＤＮＡ配列」は、糸状菌から正規に発現された「分泌ポリペプチド」をコードする。かかる分泌ポリペプチドは、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザエ由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ及びアスパルチルプロテアーゼ、トリコデルマ由来のセロビオハイドロラーゼＩ、セロビオハイドロラーゼ■、エンドグルカナーゼＩ及びエンドグルカナーゼ■、ニューラスパラ種及びヒューミコラ種由来のグルコアミラーゼを含む。第１　ＤＮＡ配列と同様に、好ましい分泌ポリペプチドは、糸状菌発現宿主によって天然に分泌されたポリペプチドである。従って、例えば、アスペルギルス・アワモリを用いる場合、好ましい分泌ポリペプチドは、アスペルギルス・アワモリ由来のグルコアミラーゼ及びα−アミラーゼであり、最も好ましくは、グルコアミラーゼである。

ここで用いる場合、「第３ＤＮＡ配列」は、開裂可能なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、かかる配列は、ウシキモシンの前記列、サブチリシンの前記列、ヒト免疫不全ウィルスプロテアーゼを含むレトロウィルスのプロテアーゼを含むＤＮＡ配列、及びトリプシン、因子Ｘａコラシーナーゼ、クロストリビン、サブチリシン、キモシン、イーストＫＥＸｚプロテアーゼ等によって認識されて開裂したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む。例えば、マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ　）によるＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ。

λ」」ト　１−１２　（１９８６）を参照のこと。かかる第３　ＤＮＡ配列は、またシアノゲンブロマイドによって選択的に開裂され得るアミノ酸メチオニンをコードすることもできる。第３ＤＮＡ配列は、融合ポリペプチドの開裂を引き起こす特定の酵素または化学試剤によって認識される必要があるアミノ酸配列をコードすることだけを必要としていると理解されるべきである。従って、例えば、キモシンまたはサブチリシンの全前記列を用いる必要はない、むしろ、適当な酵素による認識と開裂のために必要な前記列の一部分だけが要求されるのである。

ここで用いる場合、「第４ＤＮＡ配列」は、「目的とするポリペプチド」をコードする。か力する目的とするポリペプチドは、ウシキモシン、ヒトｍ織プラスミノーゲン活性剤等の哺乳動物酵素、ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロン、ヒトインターロイキンの如き哺乳動物ホルモン、及びヒト血清アルブミンの如き哺乳動物タンパクを含む。目的とするポリペプチドは、また、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）由来のα−アミラーゼ、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）由来のリパーゼの如きバクテリアの酵素にも及ぶ。目的とするポリペプチドは、更に、ファ矛ロカエーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　）由来のリグニンパーオキシダーゼ及びＭｎ”　−依存パーオキシダーゼ、ヒエーミコラ種由来のアミラーゼ並びにミューコア種（Ｍｕｃｏｒ　５ｐｅｃｉｅｓ　）由来のアスパルチルプロテアーゼの如き菌による酵素をも含む。

対応する４つのアミノ酸配列をコードする上記で規定した４つのＤＮＡ配列は、「融合ＤＮＡ配列」を形成すべく結合している。

かかる融合ＤＮＡ配列は、第１、第２、第３及び第４ＤＮＡ配列の順で５′−末端から３′−末端に至る適当な読み方をする構成に組まれている。そのように組まれているので、ｉｆ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、糸状菌、分泌ポリペプチドまたは糸状菌から正規に分泌されたポリペプチドの一断片中の配列、開裂可能なリンカ− ポリペプチド及び目的とするポリペプチドの如きそのアミノ−末端からシグナルペプチドｍ能部をコードする「融合ポリペプチド」をコードするであろう。

既に示したように、第１ＤＮＡ配列は、第１糸状菌中の分泌シグナルとして、シグナルペプチド’ｌｉ能部をコードする。該シグナル配列は、糸状菌の特定の種から分泌されたポリペプチドから誘導してもよい。これもまた既に示したように、第２ＤＮＡ配列は、第１糸状菌（これから該シグナルペプチドが得られたのである）または第２糸状菌（キレ、該シグナルペプチド及び分泌ポリペプチドが異なる糸状菌からのものであるなら、または、該シグナルペプチドが糸状菌以外、例えばウシ類由来のキモシンシグナルを起源として得られたものであるなら）のいずれかによって正規に分泌されたポリペプチドの全部または一部分に対応する第２アミノ酸配列をコードする。

既に示したように、分泌ポリペプチドの成熟した配列の全部または一部分が、融合ＤＮＡ配列の構築に使用される。本発明を実施するのに完全長の分泌ポリペプチドが使用されるのが好ましい。

しかしながら、分泌ポリペプチドの機能部分を用いてもよい、ここで用いているように、分泌ポリペプチドの「部分」は、ここで定義した融合ポリペプチドの他の成分と結合した場１合に、該分泌ポリペプチドを利用していないベクターを用いたときに分泌される目的とするポリペプチドのレベルと比較して、目的とするポリペプチドの増加した分泌を行なう分泌ポリペプチドの機能部分として、機能的に定義される。従って、第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列をコードする融合ＤＮＡ配列（その第２ＤＮＡ配列は分泌ポリペプチドの全部または一部分を含んでいる）の分泌レベルは、第１、第３及び第４アミノ酸配列だけを含む（つまり、分泌ポリペプチドまたはその一部分を欠いている）第２融合ポリペプチドの分泌レベルと比較される。該第２融合ポリペプチドと比較して増加した分泌を行なうことのできる、それら分泌ポリペプチドから得られるアミノ酸配列及びそのようなアミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、ここに定義した如き分泌ポリペプチドの「部分」を含む。

一般に、分泌ポリペプチドのかかる部分は、該分泌ポリペプチドの５０％を越え、好ましくは７５％を越え、最も好ましくは９０％を越えて含む、かかるタンパクは、好ましくは、該分泌ポリペプチドのアミノ−末端部分を含む。

本発明の「糸状菌」は、真核微生物であり、再分割真菌間（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ　）の全ての糸状型を含む。アレクツポーラス（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ　）によるＩｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、ニューヨーク：Ｗｉｌｅｙ　（１９６２）　、これら菌は、キチン、セルロース及び他の複合ポリサンカライドから成る細胞壁を有する植物性の菌糸体によって特徴付けられる０本発明の糸状菌は、イースト菌とは、形態学的にも生理学的にも、遺伝学的にも相違している。糸状菌による植物的成長は、分節菌伸長によるものであり、炭素分解作用は、空気を必須とする。これに対し、サンカロミケス・セレビシアの如きイースト菌による植物的成長は、単細胞葉状体の発芽によるものであり、炭素分解作用は、醗酵によるものであろう、サッカロミケス・セレビシアは、非常に安定な二倍体相である突起を有しているのに反し、アスペルギリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ　）及びニューラスバラのような糸状菌では、二倍体は、減数分裂の前に短時間に存在するだけである。サツ力ロミケス・セレビシアは１７本の染色体を有しているのに対し、アスパルギルス・ニドゥランスやニューラスバラ・クラップ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）は、それぞれ８本及び７本有しているに過ぎない。サッカロミケス・セレビシアと糸状菌の相違に関する最近の説明は、アスパルギルスとトリコデルマのイントロンを処理する能力及び糸状菌の多くの転写調節部分を認識する能力をサツ力ロミケス・セレビシアが欠いているという点を含む（イ＝ス（Ｉｎｎｉｓ）らによる５ｃｉｅｎｃｅ、２２８゜２１−２６　（１９８５））。

次の属を含む多種の糸状菌を発現宿主として使用することができる。即ち、アスペルギルス、トリコデルマ、ニューラスバラ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファｏスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏ−ｒｉｕｍ）　、アクリヤ（Ａｃｈｌｙａ）　、パダスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）　、ミューコア（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオポラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）及びピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）属である。更に特定すると発現宿主には、アスペルギルス・ニドゥランス〔イニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１　。

１４７０−１４７４　（１９８４）；７ラネイ（Ｍｕｌｌａｎｅｙ）らによる− ２２１　（１９８２）；バランｘ　（Ｂａｌｌａｎｃｅ）らによるＢｉｏｃｈｅｍ。

＋３１１　（１９８５）”ｌアスペルギルス・ニガー〔ケリー（Ｋｅｌ！ｙ）らによるＥＭＢＯ４，４７５−４７９）　、例えば、ＮＲＲｌ−。

３　１　１　２、　ＡＴＣＣ２”！　３　４　２．　Ａ’１″　（：Ｃ４４７３３，、’ｉ’ｌ″　ＣＣｚａ３＋ａびＵＶＫ　ｌ　４３　ｆ菌等のアスペルギルス・・７　″７　Ｐｌ、！、例えば、ＡＴＣＣｉ　ｉ　４９０浄のアスペルギルス・す１１ザエ、−二、　−５２、パ３　＝　７５＝　、、す１ケー’　７．（Ｃａ　５　Ｑ　）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｉ。

Ａｃａｄ、　５ｒｉｅ、　１ｉｓＡ　’／６．　５２５９−５２６３　（１９７９）；ランホウィ・リツの米国特許第４．４８６，５５３号；キンゼイ（Ｋｉｎｓｅｙ）らによ例えば、ＮＲＲＴ、１５７０９．ＡＴＣＣ１３６３１，５６７６４゜５６７６５．５（＋１６６．５６７６７等のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）及び、例えば、ＡＴＣＣ３２０９８及び３２０８６等のトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）が含まれる。好ましい発現宿主は、多数の分泌アスパルチルプロテアーゼをコードＣる遺伝子が削除されているアスペルギルス・アワモリである。この好まし２い発現宿主の作成は、１９８８年７７１１　［ｉに出願された米国特許出願第２１４．２３７号に記載されてＩ５す２こｔｌは、この明細書に引用されている。

こ、−て用いる場合、１“プロモーター配列Ｊとは、発現を目的として特定の糸状菌によって認識されるＤＮＡ配列のことである。

それは、上記で定義した融合ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ配りリに実施＋１１能に連結されている、かかる連結は、融合Ｄ　Ｎ　、Ａ配列を」−ドするＤＮＡ配列の翻訳開始コドンに関して、プロモーターの位苦定めを含んでいる。

３プロモ一ター配列は、融合ＤＮＡ配列の発現を媒介している転写及び翻訳の制御配列を含んでいる。

例としては、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ）らによる、、ニー、−」ア・ミーヘイ　（Ｍｕｅｏｒ　ｍ１ｐｈｅｉ）カルボキジルプロテアーゼ”遺伝子、トリコデルマ・リーゼイ゛ヒロビオハイドロシーゼ■遺伝子し・／□−鷺−カーカーＳｈｏｅｍａｋｅｒ）らのヨーロッパ特許出願ＥＰＯθ１３７２８０Ａ１　（１９８４））、アスペルギルス・ニドゥランスｔｒｐＣ遺伝Ｔ−［イエルト：／　（Ｙｅｌｔｏｎ）らによるＰｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

（１９８５））、アスペルギルス・ニドゥランスａｌｅＡ遺伝子しロツキントン（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ）らによるＧｅｎｅ３３．　ｌ　３７−１４９（１９８６）　）　、アスペルギルス・ニドゥランスｔｐｉ　Ａ遺伝子〔マツフナイト　（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）らによるＣｅ１１４６．１４３−１４７（１９８６）　］　、アスペルギルス・ニドゥランスａｍｄ　Ｓ遺伝子〔ヒネス（Ｈｙｎｅｓ）らによるＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３．　１４３０−１４３９　（１９８３）Ｆ由来のプロモーター及びＳＶ４０初期プロモークーの如きより高い真核プロモーター〔バークレイ（Ｂａｒｅｌａｙ）らによるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３　、２月７−２１３０　（１，９８３））がある。

開襟にＦターミネータ−配列」は、転写を終了させる発現宿主によって認識されるＤＮＡ配列である。それは、発現されるべき融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡの３′−末端に実施可能に連結されているう例としては、アスペルギルス・ニドゥランスｔｒｐＣ遺伝子〔イニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

（１９８５））、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ）らによ４．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、４．　２３０６　２５３　（１９８４）：ボニル（Ｂｏｅｌ）らによるＥＭＢＯＪ、３．１５８１−１５８５（１９８４））及びミューコア・ミーヘイカルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のターミネータ−（Ｅ　Ｐ　Ｏ公報第０２１５５９４号）がある、もっとも、いかなる菌のターミネータ−も本発明において機能すると思われる。

［ポリアデニル化配列」とは、転写の際に、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する発現宿主によって認識されるＤＮＡ配列である。それは、発現されるべき融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡの３′−末端に実施可能に連結されている。

例としては、アスペルギルス・ニドゥランスｔｒｐ　Ｃ遺伝子〔イニルトン　（Ｙｅｌｔｏｎ）　らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　。

１４７０−１４７４　（１９８４）ｉマラネイ　（Ｍｕ　１１ａｎｅｙ）　らによるＭｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、上９旦、３７−４５　（１９８５））、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子（ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ）らによるＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｔ。

のミューコア・ミーヘイカルボキシルプロテアーゼ遺伝子がある。

しかしながら、いかなる菌のポリアデニル化配列も本発明におい°Ｃ機能すると思われる。

凰貝、Ｂ、で一方店一般的な方法は、以前、ＥＰＯ公報第０２１５５９４号に記載したとおりである。

Ｍ−抹この研究で用いｔ−アスペルギルス・アワモリは全てグルコアミラーゼ過剰生産（ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）株（ＵＶＫ　ｌ　４３　ｆ）由来であり、ＵＶＫ１４３ｆ自体＋；ｔＥＰＯ公報第０２１５５９４号に記載のようにＮＲＲＬ３１１２由来であった。菌株のゲッタイブは、株ＧＣＩ　２　（ｐｖｒＧ５　：　ａｒｇＢ３）　（米国特許出願第２１４．２３７号に記載したように菌株ｐｙｒ４−５　（ＧＣ５としても知られている）由来である〕及び菌株ＧＣΔＧＡＭ２３　（ｐｙｒＧ５　；ΔｇｌａＡ２３）であった。

菌株ＧＣΔＧＭＡ２３は、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子の分裂によって株ＧＣ１２から導いたものである。これは、線状ＤＮＡフラグメントでの形質転換により行なわれた（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らによるＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５．　１７１４−１７２１（１９８５）に記載された方法と同様である）。この線状ＤＮＡフラグメントは、いずれかの末端でｇｌａＡの側防（ｆ　ｌａｎｋｔｎｇ）配列を有し、２．７ｋｂのプロモーターを伴い、そして選別可能なマーカーとしてアスペルギルス・ニドウランスａｒｇ　Ｂ遺伝子によって置き換えられたｇｌａＡ遺伝子の領域をコードしている。我々がそれからこのＤＮＡの線状フラグメントを得たところのベクターは、次のようにして組み立てた（第１図）。約３．５ｋｂの５′側防（ｆ　ｌａｒ＋ｋｉｎｇ）Ｄ　Ｎ　Ａ及びアスペルギルス・アワモリＵＶＫ１４３ｆｇｌａＡ遺伝子をコードする２ｋｂの配列を含むＤＮＡの５．５　ｋｂＣｌａｌフラグメントは、ｐＢＲ３２２のＣ１ａ、！位置にクローン化されたものである。このプラスミドは、翻訳開始コドンから上流１９６６ｂｐ位置から約２００コドンのコード配列が続（位置までに及ぶＤＮＡの区画を除去するため制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｒ及びＢｇｌｎで切断した。張り出したＤＮＡ末端は、ＤＮＡポリメラーシーのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用してふさぎ、Ｂｇｌ、ＩＩ開裂位置を修復するために連結し、ｐＢＲΔＧＡＭＸＢを得た。アスペルギルス・ニドゥランスａｒｇＢ遺伝子を含む１．７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントは、第１図に示したベクターｐＢＲΔｇａｍ　−ａｒｇＢ　４を作るため、このＢｇｌＩｒの修復位置にクローン化した。このベクターは、Ｃ１ａｌで切断され、形質転換体を選別するために、ａｒｇ　Ｂ変異体の相補体を使用して株ＧＣ１２を形質転換するのに使用された。そのクロモソマールｇｌａＡ位置でｇｌａＡ側防配側皮配列ｒｇＢ遺伝子を含有する線状フラグメントの合成体は、サザンプロ７）分析によって同定した。簡単に言えば、形質転換体及び菌ＧＣ１２由来のＤＮＡは、Ｃ１ａｌで消化され、アガロースゲル電気泳動に付され、メンブランフィルタ−で濾過し、そしてアスペルギルス・ニドゥランスｇｌａＡ遺伝子を含むＤＮＡのラジオラベル化したフラグメントとハイブリダイズした。形質転換されていないＧＣ１２ＤＮＡにおいて、２本のバンド（５，５及び１．９ｋｂの大きさ）が観察され、続いて、オートラジオグラフ法でクロモソマールｇｌａＡ遺伝子が現れた（データは示されていない）。

予期されたｇｌａＡ遺伝子の分裂による入れ替わりは、５．５ｋｂＤＮＡフラグメントの４．５ｋｂフラグメントによる変換であった（第２図）、この変換は、形質転換された株ＧＣΔＧＡＭ２３に生じた。グルコアミラーゼに対する特別の酵素免疫学的分析方法により、この菌株は、検出できるレベルのグルコアミラーゼを分泌しないことが確認された。

豊−燗アスペルギルス完全培地及び最小培地（ロウランズ（Ｒｏｗｌａｎｄｓ）らによるＭｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１２６，２０１−２１６（１９７３））が、菌のコロニーを成長させるために使用され、２ｍｇ／ｌｅ１．のアルギニンまた必要とされるだけのウリジンが供給された。２つの異なる液体培地が、振盪フラスコ中でのキモシンの産生の研究のために使用された。ＳＣＭは、マルトース５０ｇ／ｎ、麦芽エキス２０ｇ／ｌ、イーストエキス５ｇ／ｌ、バクトーペプトン１ｇ／ｌ、アルギニンＩｇ／ｆ、ウリジンｌ　ｇ／ｆ、メチオニン０．５ｇ／ｎ、ビオチン２ｍｇ／ｊ！、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｉ）、ＫＨ，ＰＯ４３４ｇ＃、ＮａＮＯｓ　６　ｇ　／　Ｉ！、ＭｇＳＯ４−７Ｈｆｆ０１　ｇ　／　１、ＫＣＩ！０．５２ｇ／Ｉ！、微量栄養元素溶液（１８）１ｍ７／４１’、ツイーン−８０１、ｍ（！／Ｉ！、ＭａｚｕＤＦ　６０−Ｐ消泡剤（Ｍａｚｕｒケミカルズ社製）２ｍｆ／ｊ？からなり、ｐＨは５であった。

大豆培地は、マルトース１５０ｇ／Ａ、大豆粉または溶解性豆乳粉末６０　ｇ／ｌ、クエン酸ソーダ７０　ｇ／ｌ、（ＮＨｓ）ＪＣＬ　１５ｇ／ｌ、ＮａＨｔＰＯｉ　ｌ　ｇ／　Ａ’　、　Ｍｇ５（Ｌ　ｌ　ｇ／　ｆ、ツイーン−８０１ｍｇ／　ｌ　、　ＭａｚｕＤ　Ｆ　６０−　Ｐ消泡剤２１ｎｌ＃、アルギニンＩｇ／１２、ウリジン１　ｇ／ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｌを含み、ｐＨは６．２であった。

菌の形質転換プロトプラストの調製に際して０．７Ｍ　ＫＣＩを使用したこととＰＥＧ溶液を添加したことを除いては、以前、カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）らによるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｇｏｌｙ　５．　３６９−３７６　（１９８７）に記載された方法と同様にしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を媒体とした形質転換を実施した。

更に、ＰＥＧ処理の前にオーリントリカルボン酸（１０μｇ／ｌｌ１ｊｌりを最終プロトプラスト洗浄物に加えた。我々は、このヌクレアーゼ禁止剤がアスペルギルス・アワモリの形質転換頻度を２〜５倍増加するが、プロトプラストの生育力には殆ど影響しないことを認めた（データは示してに記載の方法と同様に、エレクトロポレーション法による形質転換を実施した。簡単に言えば、洗浄したプロトプラストをエレクトロポレーション緩衝液（７ｍＭリン酸ソーダ、ｐＨ７，２，１ｍＭＭｇＳＯ４，１，４Ｍソルビトール）に懸濁し、ＤＮＡを加え、そして、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）遺伝子パルス発生装置の２５μＦＤコンデンサーで２．　ｌ　２５　Ｖ／ｃｍのパルスを与えた。

これらいずれかの形質転換方法に続いて、１．２Ｍソルビトールを含みウリジンを含まない固形化したアスペルギルス最小培地上にプロトプラストを敷いた。

ＤＮＡ及びＲＮＡの処理プラスミド単離、制限酵素処理、ＤＮＡのライゲーション、ＤＮＡフラグメントの単離、ＤＮＡの脱リン、ニック（ｎｉｃｋ）翻訳及びサザン分析（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らによるＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）　、　：７−ルドースプリング・バーバー研究所、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）は標準法に従った。菌のＤＮＡは、従来開示された方法（カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）らによるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５．　３６９−３７６　（１９８２））と同様にして単離した。

総ＲＮＡは、菌（２４）から抽出し、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラム上でマニアチルの標準操作（スプラ（１９８２））に従って選別した。ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲルで電気泳動（Ｉｄ）Ｌ、ノーザン分析をするため、メンブランフィルタ−にプロットした。

生体外翻訳ウサギ網赤血球溶解物（ベゼスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）リサーチ研究所、ガイゼルスベルグ、ＭＤ）を使用して、アスペルギルス・アワモリ由来のポリ（Ａ）” 　ＲＮＡの生体外翻訳を行なった。各６０μｌ反応液は、以下の成分を含む、即ち、２．６μｌの２Ｍ＃酸カリウム（ｐＨ７，２）　、３μｌの２０ｍＭ酢酸マグネシウム（ｐＨ７，２）、１０μＩ！、（１００μＣｉ）の■Ｓ−システィン（アメルスハム（Ａ＋ｍｅｒｓｈａｍ）、アーリシトンハイツ　（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）、Ｉ　Ｌ）、２０μｌの反応緩衝液（ベゼスダリサーチ研究所、カタログＮｏ。

８１１２）、４０μｌのウサギ網赤血球溶解物（ベゼスダリサーチ研究所、カタログＮｏ、８１１１）　、３６．８ｔｔｌの水及びＲＮＡ（約１０μｇ）０反応液を３０℃で６０分間インキュベートし、次いで、氷上に移して、反応を停止した。冷トリクロロ酢酸（１０％ｖ／ｖ）で沈殿させて、ｘｓＳ−システィンの取込み量を測定した。

以下の方法により、ラジオラベル化したキモシンポリペプチドの免疫学的沈澱法を行なった。即ち、５０μｌの１ＳＳ−ラベル化した生体外翻訳反応液を等容量の２ＸＮＥＴＳ緩衝液（ｌ　ｘＮＥＴＳ緩衝液は、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌｏ、０５％トリトンＸ−１００及び０．２５％ゼラチンを含み、ＰＨ７，４である）と混合した。タンパクＡと明確に結合していないタンパクを除去するため、２０μｌのパンソルビン〔スタフィラコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞と結合しているタンパクＡ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、う・ジョラ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）　、ＣＡ）を加え、混合し、室温で３０分間インキュベートした。従来は、該パンソルビン細胞をｌ　ｘＮＥＴＳで２回洗浄し、その元の容量で懸濁したのである（１０％懸濁液）。

インキュベートしたのち、該混合液を遠心分離し、上澄み液を清浄な試験管にとった。次に、３０μｌのキモシン抗体（アフィニティクロマトグラフィーで精製し、Ｉ　ＸＮＥＴＳ中で最終濃度を４３０μｇ　／　ＩＩ　７！に調節した）を加え、該混合液を室温で２時間インキュベートした。インキュベートに続いて、洗浄したパンソルビン細胞５０μｌを加えた。該懸濁液を完全に混合して室温で１時間インキュベートした。そののち、この混合液を遠心分離し、得られたベレットをｌ　ｘＮＥＴＳ中で３回洗浄した。最後に、このベレットを２５μｌの水で再懸濁し、サンプルと等容量の緩衝液（１％ＳＤＳ、２５ｍＭグリシン、１９２ｍＭ）リス、ｐＨ８，３，５０％サンカロース、５０−Ｍβ−メルカプトエタノール）に混合し、そして９５℃で５分間加熱してがら５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。

肛１１１゛によるキモシンの２５０ｔａｉ！振盪フラスコに５０＋ｗｆのＳＣＭまたは大豆培地を加え、新鮮な細胞懸濁液を接種し、３７℃で培養した。得られたサンプルは、ウサギ、抗− キモシン抗体及び真正な仔牛キモシン（クリスハンセン研究所、デンマーク）をスタンダードに使用して、酵素免疫学的測定方法ｒＥＩＡ法」　（エングバール（εｎｇｖａｌｌ）によるＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１７０．　４１９−４３９　（１９８０）　）によりキモシンの量を測定した。

キモシン活性の測定は、マイクロタイタープレートで行ない、凝乳による堆積物の増加に基づいた。２５μｌのサンプルを１０ｍＭのリン酸ソーダで希釈し、ｐＨ６，０の基質（１％スキムミルク、４０ａＭ　ＣａＣｌ２２及び５０ｍＭ酢酸ソーダ、ｐＨ６，０）１５０μｌを加えた。３７℃で１５分間インキュベートしたのち、堆積物の量を６９Ｏｎ＋＊で読みとった。真正な子牛キモシンをスタンダードとして使用した。

細胞内のキモシンの濃度を決定するために、５０ｓｊ！の培養物から採取し、水で完全に洗浄し、凍結乾燥して、モルタル及び乳棒で砂を加えて粉砕した。５０ｍ／の抽出用緩衝液（５０ｍＭリン酸ソーダｐＨ５，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭのフッ化フェールメチルスルホニル、０．１ｍＭペプスタチン）を加え、完全に混合した。

抽出物のサンプルにｌ　Ｍ　ＮａＯＨを加えて５０　ｍＭ　ＮａＯＨに調整し、３７℃で３０分間インキュベートし、最後に遠心分離して（１３，０００Ｘｇ）　、細胞の破壊屑を除去した。上澄み液中のキモシン濃度は、ＥｒＡ法により測定した。

ウェスタン分析を行なうため、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでサンプルを電気泳動に付し、標準法（トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６　、　４３５０−４３５４（１９７９）　）によりメンブランフィルタ−に吸取った。吸取ったものは、次いで、ウサギ抗−キモシン及び、ホースラディツシュバーオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗−ウサギＩｇＧで処理された。そして、ＨｔＯ，及び４−クロロ−１−ナフトールでインキュベートすることにより、ＨＲＰ発色を行なった。

キモシン発現ベクターｐＧＲＧｌ及びｐＧＲＧ３の構築は、がって、カレンらによるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　、　３６９−３７６（１９８７）及びＥＰＯ公報０２１５５９４号で開示されている。

それらは、アスペルギルス・ニガーｇｌａＡプロモーター及びターミネータ−、グルコアミラーゼまたはキモシン分泌シグナルのいずれか、及びプロキモシンＢ　ｃＤＮＡコード配列を含む発現カセットからなる。このカセットは、ｐＢＲ３２５、ノウロスボラ・クラフサｐｙｒ　４遺伝子及びアスペルギルス・ニドゥランスから単離したａｎｓ　１配列からなるｐＤＪＢ３（バランスらにょるＧｅｎｅルギルス・ニドゥランス中に高い形質転換頻度を与えている（第３図）。ｐＧＲＧＩからｐＧＲＧ４をそれぞれ生産するのに使用されているカセット挿入物を描いている第４Ａ図がら第４Ｄ図を参照のこと。

ベクターｐＧＡＭｐＲは、アスペルギルス・アワモリｇｌａＡ遺伝子の最後のコドンとその骨格内で融合したプロキモシンＢ　ｃＤＮＡ配列を含有した。このベクターの構造は、第５Ａ図及び第５Ｂ図に略図で示されている。簡単に言えば、合成オリゴヌクレオチド（最後の１０コドンがグルコアミラーゼをコードしており、最初の６コドンがプロキモシンをコードしている５　４　ｂｐ　５ａｉｌ　 −ＢａｍＨＩフラグメント）は、Ｍ１３ベクター中でクローン化され、そのヌクレオチド配列か確認されたのである。我々は、同じＭ１３ベクター内に、第７番目のコドンで開始する配列をコードするプロキモシンの５′部分を含むｐＲｌ（カレンのスプラ及びＥＰＯ公報第０２１５５９４号）由来の２３５　ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ａｓｐ７１８フラグメントを挿入した。得られたベクター（Ｍ　１３ｍｐ１９　ＧＡＭ３’　−５’　ＰＲと称する）から、２８０　ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ａｓｐ７１８’フラグメントが単離され、５′側防ＤＮＡの領域プラス０．５ｋｂ及びｐＢＲ３２２レプリコンを含むＭｌｕＩ　−Ａｓｐ７１８ベクターフラグメントをコードするアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼの大半；プロキモシンの３′部分；及びアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼプロモーター領域の１．４ｋｂセグメント（ＸｈｏＩ−Ｍｌｕｌ）　、を含む２．３ｋｂＳａｌＩ　−Ｍ　１　ｕ　Ｉフラグメントとの３部分ライゲージ３ンに使用した。このライゲーションで得られたプラスミド（ｐＢＲ−ＧＡＭｐＲ）をＣＩａｌで消化して、ニューラスパラ・クラフサ（ブクストン＜１９８３））由来のｐｒｙ　４遺伝子をコードする２、　１　ｋｂ　Ｃｌａ　＋フラグメントでライゲーションし、最終のベクターｐＧＡＭｐＲ（第５Ａ図及び第５Ｂ図）を誘導した。

キモシン化　レベルＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用して、菌株ＧＣ１２及びＧＣΔＧＡＭ２３のプロトプラストをプラスミドｐＧＲＧ１゜ｐＧＲＧ３及びｐＧＡＭｐＲ（第３．４Ａ、４Ｃ，５Ａ及び５Ｂ図）で形質転換した。これらプラスミドは、全て、アスペルギルス・アワモリのｐｙｒ　Ｇ　ＩＩ異体を相補することのできるニューラスバラ・クラフサｐｙｒ　４遺伝子を包含するので、形質転換体の選別が可能である。ナンバー１２で始まる称呼を存する形質転換体は、菌株ＧＣ１２に含まれ、２３で始まるものは、ＧＣΔＧＡＭ２３に含まれる。形質転換に使用されたプラスミドの名称は、該呼称の中に含まれている。Ｖｔいて、形質転換体からの精製細胞を５０ｍ１のＳ０Ｍ中に接種し、４日間培養した０個々の形質１ｉ−換体について複数の培養を行なわなかったので、異なる成長速度を修正するための試みもしなかった。培養上澄み液及び直系体の細胞内抽出物について免疫学的分析を行なった（表１）、不溶性の細胞層からキモシンを放出させるため、細胞内抽出物のＮａＯＨでの処理が必要であった。しかしながら、この処理は、同時に、ＥｒＡで使用する標準サンプル中の検出可能なキモシンの量を約２５％だけ減少させることがわかった。従って、表１中に記載した細胞内キモシンの値は、見積り価である。

表　１キモシン濃度（μｇ／ｍｆ）菌　株　細胞内　細胞外　％細胞内Ｎ、Ｄ、：　検出されず；ａ：　高生長量として選択した形質転換体グルコアミラーゼへの融合なしにプレプロキモシンを合成することを期待したが、ｐＧＲＧｌまたはｐＧＲＧ３形賞転換体のいずれも３．７μｇ／ｌ１１より高い分泌キモシンのレベルを与えなかった。かつて、特に言及されたように、ＧＣ５を使用すると（米国特許出願第２１４，２３７号参照）、ｐＧＲＧｌ及びｐＧＲＧ３形質転換体の多くは、生成したキモシン総量の７５％より多い量をその細胞内に保持して、キモシンを高レベルで有した。これに対し、いくつかのｐＧＡＭＩ）Ｒ形質転換体は、比較的高レベルのキモシンを分泌し、大多数の場合、キモシンの細胞内レベルは、分泌キモシン総量よりはるかに低かった。今日では、大豆培地中で、より高い発現レベルを得ることができ、これは、多分、天然の分泌アスパルチルプロテアーゼの活性を抑制することができるこの培地の高ｐＨに関連しているということが特に言及された。

更なる研究のため、最も高効率な生産菌株として、菌株１２ｇｒｇｌ　−１ａ、１２ｇａｍｐｒ４及び２３ｇａｍｐｒ４６　（表１に【よ示してし）なし））を選択した。これら菌株を６日間、５０ｍ１大豆粉培地で培養した３つの培養物により生産された細胞内及び細胞外キモシンのレベルをＥＩＡ及び活性測定法により測定した。更に、培養液の上澄み液グルコアミラーゼ濃度をＥＩＡにより測定した（表■）。

表　■ 表　２　菌糸体のダラム重量に対し、ミリグラムで表示した形質転換体生産キモシンとグルコアミラーゼ量１２ｇｒｇｌ−１ａ　１．０　１．３　６４．１　０．６１２ｇａ＊ｐｒ４　２２．０　２７．７　１４６．０　０．０２３ｇａ＊ｐｒ４６　１４．３　ｊｌ、７　５９．１　０．７全ての場合において、ＥＩＡによつて検出された分泌キモシンの量は、活性測定法により検出された量よりも大きかった。このことは、不活性なまたは分解したキモシン分子の存在を反映しているかも知れない、この結果は、融タンパクとしてキモシンを発現する形質転換体によって生産された分泌キモシンの高いレベルを明確とした。　１２ｇｒｇｌ　−Ｌ　ａでは約８μｇ／ｍｅであるのに対して、形質転換体１２ｇａｍｐｒ４では、約１４０／Ｊｇ／＋ｗｊ！の活性キモシンが培養菌１１１１につき分泌された。

形質転換体２３ｇａｍｐｒ４６　（天然ｇｌａＡ遺伝子が除かれている）によって生産されたグルコアミラーゼだけが、グルコアミラーゼ−キモシン融合タンパクの一部としてのものであろう、グルコアミラーゼの２つの型の大きさくＭＷ６１．ＯＯＯとＭＷ７１，０００）は、キモシン（ＭＷ３７，０００）の大きさの約２倍であるから、分泌されるグルコアミラーゼの重量をキモシンの２倍と考えるであろう、実際は、培養培地中のキモシンに対するグルコアミラーゼの測定比は、３：１にかなり近かった。この食い違いは、分析法の不正確さによるのか、または、キモシンの分解が起こっていることを示すものなのかも知れない、形質転換体１２ｇｒｇｌ−１ａでは、天然のグルコアミラーゼだけが生成するのに対し、１２ｇａｍｐｒ　４では、天然のグルコアミラーゼとキモシンと組み合わさったグルコアミラーゼの両方が分泌されるであろう、おもしろいことに、２３　ｇａｍｐｒ　４６では、１２ｇｒｇｌ−１ａで生成する天然のグルコアミラーゼと殆ど同量の再結合体グルコアミラーゼが生成した。　ｌ　２ｇｒｇｌ　−１ａによって生成したキモシンの総量の高パーセント（３２％）のキモシンが細胞内に保持されたが、このことは、ＳＣＭ培地でみられた細胞内蓄積のめざましさには到底及ばない。

ｉ尤ヱ１三ヱ上立扼菌株ＧＣ１２及びＧＣΔＧＡＭ２３から、及び形質転換体１２ｇａｍｐｒ　２．１２　ｇａｍｐｒ　３．１２ｇａｍｐｒ４．２３　ｇａｅａｐｒ　１及び２３ｇａｍｐｒ４６からＤＮＡを抽出し、Ｘｈｏｌ及びＨｉｎｄｌｌ＋で消化し、電気泳動に付した。メンブランフィルタ−上に吸取ったあと、ラジオラベル化されたｐＧＡＭｐＲ（第８図）でＤＮＡをハイブリダイズした。菌株ＧＣ１２で、天然ｇｌａＡ遺伝子を示す１本のノ＜ンドが認められたく第８図、レーンａ）、菌株ＧＣΔＧＡＭ２３においては、遺伝子組み換えを原因として、この位置により小さな大きさのｇｌａＡフラグメントがみられた（第８図、レーンｅ）、プラスミドｐＧＡＭｐＲも、また、該ゲル上に泳動され、ＸｈｏＴ及びＨｉｎｄＩＩ［で消化して得られたフラグメントの大きさを示した（第８図、レーンｈ）、ｐＧＡＭｐＲから由来した追加のバンドが、該形質転換体中に見られた＊　１２ｇａｍｐｒ４及び２３　ｇａｓｐｒ　１のパターンは、白人遺伝子座位からはなれた単一サイトにおけるｐＧＡＭｐＲの２，３のタンデムコピーを統合したものと一致していた（第８図、レーンｄ及びｆ）、これら形質転換体でのプラスミド複写の数は、キモシン生産力において大きな差があるにもかかわらず、類似しているように思われる。タンデムプラスミド統合は、おそらく、より大量のプラスミドを発生してきたとはいえ、再配列体も、また、形質転換体１２ｇａｔａｐｒ２．　ｌ　２ｇａｓｐｒ３及び２３　ｇａｍｐｒ　４６に含まれていた（第８図、レーンｂ、ｃ及びｇ）。

スニ里ｚ分扼菌株ＧＣ１２，１２ｇｒｇｌ　−１ａ及び１２ｇａｓ＋ｐｒ４から総ＲＮＡを抽出し、電気泳動に付し、メンブランフィルターに吸取った。

次いで、そのＲＮＡを２つのラジオラベル化されたＤＮＡプローブで同時にハイブリダイズした。これらのプローブのうちの１つは、相違するＲ　Ｎ　Ａサンプルの等量がゲルに負荷されたこと、及びいずれのサンプルも過剰に劣化しこいないことを立証する内部コントロールとして作用するように１、アスベノトギルス・ニガー・ｔリーノク（ｏｊｉｃ）遺伝子（ワード（Ｗａｒｄ）　らによるＣｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ。

１４．３７−４２　（１９Ｆ！８））庖含む５　ｋ、ｂ　ＥｃｏＲＩフラグメニ／トであった。第２のプローブは、５キモシンをコードする配列の約８５０　ｂｐのＫｐｎ　Ｉ　−Ｂｃｌ　Ｉフラグメン（・であった、約１ｋｂの該オリツクｍＲＮＡバンドに加えて、キモシンｍＲＮＡを示す１．４に、ｂのバンドが形質転換体１２ｇｒｇｌ　−１ａに認められた（第９図、レーンｂ）。キモシン生産レベルがグルコアミラーゼ生産よりも極めて低いが、この形質転換体中には、豊富なキモシン−特定メーセージ（ｃｈｙｍｏｓｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｓｓａｇｅ）が存在していることは、明らかであった（この菌株は、約０．８ｇ田／ｌのグルコアミラーゼを分泌することができる）。融合グルコアミラーゼ−キモシンメツ七−ジ（３，４ｋｂ）を予期する大きさのｍＲＮＡ種が、菌株１２　ｇａｍｐｒ　４にみられた（第９図、レーンＣ）、たと犬、形質転換体１２ｇ非ｐｒ４のキモシン笠産が非常に多いとはいえ、この融合ｍ、　ＲＮ　Ａ種は、形質転換体１２ｇｒｇｌ　−１ａ　！ご存在するキモシン−特定ｍＲＮＡより豊富ではないと思われる。菌株ＧＣ１２には、該オリ、りｍＲＮＡだけが観察された（第９図、レーンａ）。

注−俸剖Ｊ彬択形質転換体１２ｇａｍｐｒ４．２３ｇａｍｐ４６及び１２ｇｒｇｌ−１ａの培養菌からｔｇｌしたボリアデニＬ／−ト化ＲＮＡサンプルを市販のウサギ−網赤血球中で、イン・ビトロ翻訳系を用いて翻訳した。

キモシンを翻訳生産物から免疫学的に沈澱させ、Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にイ」シ、そして、オートラジオグラフ法よって視覚で確認できるようにしたく第１０図）　、　ＭＷ３７，０００とＭＷ４２．　ＯＱ　Ｏのタンパクを示す２つの別個のバンドが、プレプロキモシン（ＭＷ　４２．　Ｑ　００　）のみを生産することが期待される１　２ｇｒｇｌ　−１ａ　（第１０図、レーンｂ）由来のｍＲＮＡについて観察された。該翻訳反応が行なわれるｒｌＨでは、自動触媒プロセ７ングが開始されることは期待できないが、この低い分子量の方は、成熟キモシンであるかも知れない。１２ｇａ、＋ｎｐｒ４　（第１０図、１）−ンａ）及び２３　ｇａｍｐｒ　４６のｍ　Ｒ，Ｎ　Ａサンプルで、２つの高分子量種が、抗−キモシン抗体で析出した。これらは、プロキモシンと、２つの型のグルコアミラーゼのうちのいずれかを含量する完全長融合タンパクｃｉｏｏ、ｏｏｏ及び１１０，０００ＭＷ）と期待される程度の大きさであった。

生体外翻訳システムに、ＧＣ１２ＲＮＡ（第１０図、レーンＣ）が添加されるか、または、ＲＮＡ　（第１０図、レーンｄ）が添加されないなら、キモシンは免疫学的方法で沈殿できなかった。

ウェスタン分析菌接種後の種々の時点で、形質転換体１２　ｇａｍｐｒ　４．２３　ｇａｍｐｒ４６及びｌ　２　ｇｒｇｌ−１ａの５０ｍｆＳ（Ｊｉまたは大豆培地の培養物から、上澄み液を採取した。サンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分別し、メンブランフィルタ−に吸取り、そしてキモシン特定抗体で検査し、た（第１１図）。菌株ＧＣ１２からの培養上澄み液には、キモシンが認められなかった（第１Ｉ図、レーンｂ）。真正なウシキモシンについてもゲルに泳動シ１．た（第１１図、１）−ンａと１）。２日間及びそれ以」二培養した３０Ｍ培養物からのサンプルの全てに、真正ウシキモシン（３７，０００ＭＷ）と同じ大きさのバンドが認められた。１２ｇａｍｐｒ　４　（第ｉｉ図、レーンｇ）及び２３　ｇａｍｐｒ　４６の大豆培地培養菌において、２日間及び３日間の時点で、完全長グルコアミラーゼ−キモシン融合タンパクと期待される程度の大きさく１００．０００ＭＷ）の追加のハンドがはっきり現れた。もっとも、これは、よりあとの時点で縮小した。大豆培地での２日間の時点における１　２ｇｒｇｌ　−１ａ培養物からのサンプルに存在する主要なキモシン−特定バンドは、プロキモシンについて予測された大きさであった（第１１図、レーンｄ）。大豆培地は、ｐＨ６，２に緩衝されたのに対し、ＳＣＭ培地は、ｐＨ５に緩衝された。

より高いｐＨでは、プロキモシンの活性化は、遅くなると予期される。

２日間または３日間の時点での大豆培地培養物からのサンプルのｐＨは、室温で３０分間、ｐＨ２と低くなった。その後、ウェスタン分析のためにＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にサンプルを負荷する前に、ｐＨは急速にｐＨ６以上に上昇した。この処理は、１、２ｇａｍｐｒ４　（第１１図、レーンｈ）または２３　ｇａｍｐｒ　４６からの高分子量バンドの損失、またはｌ　２ｇｒｇｌ　−１ａ　（第１１図、レーンｅ）からのプロキモシンの損失を導き、おそらく全形質転換体におけるプソイドキモシンであろうが、成熟キモシンよりわずかに大きいタンパク種の蓄積を導いた。キモシン−特定バンドの大きさにおけるこれらの変化は、もし、アスパルチルプロテアーゼ禁止剤・＼ブスタチン（マルシニスツイン（Ｍａｒｅｉｎｉｓｚｙｎ）らによるＪ、　Ｂ１ｎ１．　Ｃｈｅｍ、　２５１．７０９５−７１０２　（１９７６））は、低ｐＨ処理の間、０．１ｍＭの濃度で含まれていたなら、禁止できたつＩ　２ｇｒｇ！−１ａ及び２３　ｇａｍｐｒ４６を２日間大豆培地で培養し、た培養物からのサンプルについて、活性分析法により測定されたキモシンの濃度は、ｐＨ２で処理する前で、それぞわ、０．７及び３．２　ｕｇ、／ｍ７！であった５、続く処理で、これらの値は、そわぞれ３．６及び１７．５μｇ　、／ｒｎ　ｌにＪ二昇し、いずれも約５倍の増加があった。

表Ｉ及び■から分かるように、アスペルギルス・アワモリにおける分泌キモシンの生成量は、プロキモシンがグルコアミラーゼのカルボキシル末端との融合体として合成されているなら、グルコアミラーゼシグナルペプチドを利用したｇｌａＡプロモーターか、らの直接の発現と比較して太き（増加している。プロキモシンと比較して増加した融合タンパクの分泌効率は、より高い発現レベルの少なくとも一部の説明になると思われる。このことは、ｐＧＡＭｐＲ形質転換体と比較して、ｐＧＲＧｌ及びｐＧＲＧ３形質転換体いおいてその細胞内にみられるキモシンの割合の高さから明らかである。標品ウシキモシンもアスペルギルス・アワモリの中で生産されたキモシンの大多数もグルコキシレート化されていない、アスペルギルス・ニガー中で〇一連結炭化水素により幅広く修飾されたグルコアミラーゼへのプロキモシンの接合（バザー（Ｐａｚｕｒ）らによるＪ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｌｌ、６．　５１７−５２７（１９８７））は、アスペルギルス分泌通路を通るより効率的な経路で可能であろう。

プラスミドｐＧＲＧ１及びＰＧＲＧ３の両者は、直接のキモシン発現に、アスペルギルス・ニガーｇｉａＡプロモーターを用いるのに対し、アスペルギルス・アワモリ　ｇｌａＡプロモーターは、ｐＧＡＭｐＲ中に存在している。これらプラスミドの間には、ｐＧＲＧｌ及びｐＧＲＧ３上のａｎｓ　１配列の包含の如き、更なる差異がある０種々のブラスミｒの統合は、おそらく天然のｇＬｉＡ位置と相同関係になかった。結果として、統合されたプラスミドのクロモリマール位置は、各々の形質転換体において子分相異していたであろう。これら全ての相違は、生成したキモシンの総量（細胞内子細胞外）を比較するご古、及び融合タンパクとしての直接の発現か生産かの区別だけがある細胞の内側と外側の分布について、これが各形質転換体間で同様であるのがどうかを決定することを困難にしている。ノーザン分析は、キモシン生成量の比較を確かなものにしており、キモシン−特定ｍＲＮＡの定常状態レベルが、形質転換体１２ｇｒｇｌ−１ａにおいては、ｌ　２　ｇａａ＋ｐｒ　４ににおけるよりも高いことを示唆した。

大豆培地において形質転換体１２ｇｒｇｌ−１ａ、１２ｇａｍｐｒ４及び２３　ｇａｍｐｒ　４６が産生したキモシンの総量の分析から、直接発現形質転換体中で産生されるキモシンの総量は融合蛋白質としてキモシン発現形質転換体中で産生されるキモシンの総量よりもはるかに少ないことがわかった。このことは、分泌効率の向上が、グルコアミラーゼに融合したキモシンの発現の唯一の利点ではないかも知れないことを示唆するものであろう、グリコアミラーゼ−キモシン融合ｍＲＮＡの翻訳が、非翻訳リーダー配列及び分泌シグナル配列のみが白人遺伝子から誘導されたプロキモシンｍＲＮＡの翻訳よりも、より効率的であった可能性がある。しかしながら、抽出が完全ではないかも知れず、かつキモシンを遊離するのに必要とされるＮａＯＨ処理がＥＩＡによる検出を低下させるかも知れないので、細胞間のキモシンのレベルについての正確な値を得ることが困難であろう、又、細胞間に蓄積されるキモシンは、抽出前に本来的に存在するプロテアーゼにより分解されるかも知れない、従って、細胞間キモシン自体について得られた値は、いつでも実際よりは少い値となっているであろう。

ｐＨ６の大豆粉培地において、若い培養物からのサンプルを用いる場合には、いくつかの成熟キモシンが観察されたが、グルコアミラーゼ−プロキモシン融合蛋白質の大部分が、そのまま培地に分泌されたことが明白であった。このような条件下では、直接発現形質転換体１２　ｇｒｇｌ　−１ａからのサンプルのウェスタン分析により検出された唯一の形がプロキモシンであった。これに反し、成熟キモシンのみが、ｐＨ５のＳＣＭにおいて形質転換体の培養物中に検出された。

これらの結果から、グルコアミラーゼ−キモシン融合蛋白質からのキモシンの遊離は低いｐＨで起りやすく、プロキモシンの天然自動触媒活性化機構を伴うかも知れないことが示唆された。融合蛋白質の損失及び活性キモシン濃度の増加は、サンプルのｐＨを２に低下させることにより簡単に誘発させることができた。仮りにプロセッシングがキモシンの活性に依存するならば、予想されるように、これらの条件下で融合蛋白質から遊離したキモシンの少くともいくらかは、シュードキモシン（ｐｓｅｕｄｏｃｈｙ翔ｏｓｊｎ）の形であろう、多分、適当な条件下では、これは、結局、さらにプロセッシングされて成熟キモシンになるであろう、ｐＨ２で融合蛋白質をプロセッシングすることは、ペプスタチンにより抑制されたが、このことはアスパルチルＣａ５ｐａｌ−ｔｙｌ　）プロテアーゼ活性を必要とすることを示唆するものである。

この活性は、キモシン自体又は天然アスペルギルス・アワモリ（Ａ、ａｗａｍｏｒｉ　）プロテアーゼによって供給できた。主要な分泌アスパルチルプロテアーゼ、アスベルギロベブシンーＡをコードする遺伝子を除いた（米国特許出願＆２１４，２３７参照）アワモリ（Ａ、ａｗａｍｏｒｊ　）株を構築した。この株中に残存する細胞外の蛋白質加水分解活性は低いレベルであるが、この活性は、ペプスタチンによって影響されない。このアスペルギロベブシン除去株におけるグルコアミラーゼ−キモシン融合体のプロセッシングは、形質転換体１２ｇａｓｐｒ４及び２３　ｇａｓｐｒ　４６について上述したプロセッシングとは区別し得ない（データ示さず）、このことは、さらに、融合蛋白質のプロセッシングを引き起すペプスタチン抑制活性が実際にはキモシン自体の活性であることを示している。

ｐＧＡＭｐＲ形質転換体から得られた成熟キモシンのアミノ末端配列から、正しいプロセッシングが生じたことが確認された（結果を示さず）。アミノ酸組成分析、比活性測定、オフテルロニー平板法及びチーズ形成試験を含む他の試験によって、これらの形質転換体で産生されたキモシンが真正なものであることが確認された。

からのキモシンの　泌ｐＡＭｐＲＩ及びｐＡＭｐＲＩＩの構築アスペルギルス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　）株ＵＶＫ１つの配列が決定された（コールマン（Ｋｏｒｍａｎ、　Ｄ、Ｒ，）（１９８８）、転子のクローンニングと特徴づけ、”ＭＡ、　ｔｈｅｓｉｓ、サンフランシスコ州立大学）。次いで、第２の遺伝子の配列も決定された。前記ａｍｙ　Ａ遺伝子は、２１個のアミノ酸からなるアミノ末端シグナル配列を含む４９６個のアミノ酸をコードする。２つの遺伝子のそれぞれの配列は同等であり、配列５′から翻訳開始コドンまでの２００ｂｐを含み、８つのイントロン配列とその位置についても同じであり、全配列についても最終の２つ又は３つのカルホキで置換されている。）。ベクターｐＵＣＡＭｐＲＩとｐＵＣＡＭｐＲＵは、ｐＧＡＭｐＲと同様のプロキモシンＢ発現カセットを含んでいるが、但しプロモーター、Ａ、　ａｗａｍｏｒｉ印り八又はＪすＪ −遺伝子のすべてをコードする配列、用人ターミネータ−及びポリアデニル化配列が魁立ム遺伝子の対応する部分を置きかえている。

ｐＵＣＡＭｐＲＩの構築を第６図に示す、簡単に説明すると、α−アミラーゼ（へ肚人バージョン）の最後の５つのアミノ酸及びプロキモシンの最初の６つのアミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて、正確に、かつフレーム中で、７番目のコドンから開始するプロキモシンＢコード配列領域をコードするＢａｍＨＴ　−Ａ！Ｊ！１１８フラグメントを、プロモーター領域（翻訳開始コドンの６１７ｂｐ５’まで）及び翻訳停止コドンの前の６番目のコドンまでのびＬ戊のすべての配列をコードする鉦ＩＩ　一旦力鎮■とリンクさせた（ｐ　ＵＣＡＭＹｉｎｔ　＃２）、キモシンコード配列の残りの部分を、ＧＲＧｌタイプ発現カセットから得た人肚７１８−　Ｘｂａ　Ｉフラグメントとして加えて、ｐＵｃＡＭＹｉｎｔ＃３を得たくつまり、翻訳停止コドン後のＸｂａｌサイ）ｌｌｂｐはｐＧＲＧｌの構築の間に導入されたエンジニアサイトである。）。

突然変異生成に向けられたサイトを用いてＸｂａｌサイト１１ｂｐをｍ遺伝子の翻訳停止コドンの後に導入したので、この遺伝子からのターミネータ−及びポリアデニル化領域（５８１ｂｐ）は、すみやかに、ｐＵｃＡＭＹｉｎｔ　＃３のプロキモシン配列の後に置くことができ、これによりＩＩＵＣＡＭｐＲＩが得られた。ベクターｐＵＣＡＭｐＲＵは、朋１Ｎプロモーターが朋Ｕ遺伝子の対応する領域で置換されていることを除き、本質的に同じである。

土至之ヱ生分撒プラスミドｐＵＣＡＭｐＲＩ及びｐＵＣＡＭｐＲＩ［は、糸状菌に形質転換するための選択マーカーとして使用できる遺伝子を含んでいない、従って、選択マーカーを含む第２のプラスミドを用いた共形質転換によりＡ、　ａｗμ四■中にこれらのプラスミドを導入することが必要であった。よって、ｐＬ］ｃＡＭｐＲ＋又はｐｌ、ＪｃＡＭｐＲＩＩの約ｌＯμεをρＢ１４２の約２μｇと混合しく２．４ｋｂの一脛明Ｈ１−Ｈ力可■フラグメントを有するｐ　［、Ｊ　Ｃ１，８は、アスペルギルスニガー（柑９Ｊ但↓Ｂｓ　ｎｊ４ｅｒ）　ｋ？１匹−遺伝゛ｒを含む）、これを用い、かつ形質転換体の選択システムとしてこの株におけるＰ２工喝−の突然変異の相補性を利用してΔＡＰ３株（米国特許用［ｍ２１４．２３７に記載）を形質転換した。この方法で得た形質転換体は、両方のプラスミドを含むべきである６個々の形質転換体を２４穴のマイクロタイタープレート中、１　ｍ１４の液体培地で壇養し、培養上清についてキモシンの活性を調べた。

活性のある分泌キモシンを多量に産生じた形質転換体を、次いで、次の分析を行うために、５０−ｌの振とうラスコ培養において、大豆粉培地を用いて成長させた。ΔＡＰ３株の形質転換体により産生された多量のキモシンは、形質転換のためにｐＵｃＡＭｐＲ■又はｐＵＣＡＭｐＲＩＩが用いられたかにかかわらず同等であった。観察された最大生産量はキモシン７０〜８０μｇ／ｍＡであった。この値は、α−アミラーゼコード配列を含まないで、ブレブｌ′Ｉキモ７・ンがα −アミラーゼプロモーターに直接融合ｊＪた場合にＹ−１−される生産量よりも高いものであった。特別な染色のためニ抗キモシン抗体を用いた培養上清のうニスタン、ノムノブロソティング分析の結果から、ｐＧＡＮｐＲ形質転換体なので、融合蛋白質は１つのコドンを示すことに加えて、成熟キモ、／ンのサイズ（３７，０００ＭＷ）を示すことがわかった。この融合蛋白質は、α−アミシーゼ／ブロキモシン融合ポリペプチドの全長についての期待されたサイズ（９１，０００ＭＷ）を有し、このことは特別の染色のための抗−α−アミラーゼ抗体を用いて同定することができた。成熟キモシンは、ゲルコアーラーゼ、／プロキモシン融合蛋白質についで観察されたのと同様に、低ｐＨでα〜アミラシー／′プロキモシン融合蛋白質から放出された。

グルコアミラーセポリペプチド配列の非常に小さい部分をプロキモシンのアミノ末端に融合させることによって、キモシンの産生と分泌が増強されるか否かを調べるために、ベクターｐｓＧｌを構築した（第７図）。このプラスミドの構築の出発点は２゜ター、コード配列及びターミネー・ター領域）を含むベクター（ｐＵ　ＣＡａｇｒｇ４　）を用いたことにあるが、ただし、ここでは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　ＵＶＫ　ｌ　４３　ｆ　ｇｌａＡプロモーター、シグナル配列、プロ配列及び成熟コード配列の最初の１１個のコドンニッンユペロンら（Ｙａｎｉｓｈ　−Ｐｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　ｌ　９８５、Ｇｅｎｅグルコアミラーセシード配列の最初の１１個のコドン及びブロキ８リストリクショ、７サイトにクローンニングしてｐＵＣｇｒｇ　４　ｘ内のユニーク旦憇ＨＩＩザイトに挿入してｐＵＣｇｒｇ　４　ｘ、／ｋ　＋Ｂを得た。最後に、ｐＵＣレプリコン、キモシンコード配列の３′末端、Ａ、　匣り白人ポリアデニル化及びターミナル領域を含むより大きなへ扛７１８フラグメントをｐＵＣＡａｇｒｇ４から車離し、これをｐＵｃｇｒｇ　４　ｘ／ｋ　＋Ｂからの大きな入社７１８フラグメントと結合し、ｐＳＧｉを得た。転写と翻訳の結果として産生されると予期されるグルコアミラーゼ／プロキモシンポリペプチドは、グルコアミラーゼシグナル配列、グルコアミラーゼプロ配列、成熟グルコアミラーゼの１〜２９７のアミノ酸及びこれにすぐ続いている成熟グルコアミラーゼの１〜１１のアミノ酸及びカルボキシ末端のプロキモシンから構成されているはずである。

ｐＢＨ２を用いた共形質転換実験においてｐｓｃ；ｌを用いたが、活性キモシンを産生ずる形質転換体を同定できなかった。この理由は不明確であり、この状況を明確にするためにはさらに実験を進めている。これは、このプラスミドによってコードされたグルコアミラーゼ／プロキモシン融合ポリペプチドは効率的に分泌されないか、又は成熟した活性キモシンが融合ポリペプチドから放出されないことによるかも知れない。しかしながら、プラスミドが″ｆ−想通り構築されなかったか、グルコアミラーゼ／キモシンコード配列の転写又は翻訳がを効ではなかったとも考えられる。

」−記実施例は単なる例として示したものであり、請求の範囲を限定するもの古して解釈してはならない。

本発明の好まし７い態様を記載したが１、−の開示内容に対して当業者は種々の変更を行うことができ、このような変更も本発明の範囲内に入ることが明らかであろう。

すべての文献は、本明細書中に参照とし７て加えられる。

浄書（内容に変更なし）Ｃ（α　Ｉ浄書（内容に変更なし）７ｆｔ！（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）浄ＩＦ（内容に変更なし）Ｓｃｌｌ　ＢａｒｑＨ１浄１（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）浄Ｗ（内容に変更なし）浄書（内容に変更ない浄！（内容に変更なし） ↓ ＦＩＧ、−７Ｂ ■ 手続補正書（方式）３．補正をする者事件との関係　出願人名　称　ジエネンコー　インコーホレーテッド４、代理人５、補正命令の日付　自　発国際調査報告ｂＨ＋＋Ｑｌ”１″ｖａａ昏１゛”””　ＰＣＴ／Ｉ！！；Ｑｌ’１ノ０３フ７フ

Claims

【特許請求の範囲】

１．融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ配列であって、前記融合ＤＮＡ配列の５′−末端から第１、第２、第３及び第４ＤＮＡ配列が、前記融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へ向かって、対応する第１、第２、第３及び第４アミノ酸配列をコードすること、前記第１ＤＮＡ配列が第１糸状菌の分泌配列として、シグナルペプチド機能をコードすること、前記第２ＤＮＡ配列が前記第１糸状菌または第２糸状菌から正規に分泌された分泌ポリペプチドまたはその一部分をコードすること、前記第３ＤＮＡ配列が開裂できるリンカーポリペプチドをコードし、かつ、前記第４ＤＮＡ配列が目的とするポリペプチドをコードすることを含み、ここに、前記第１または前記第２糸状菌の前記融合ＤＮＡ配列の発現が、前記第１、第３及び第４ＤＮＡ配列のみを含む第２融合ＤＮＡ配列によってコードされた第２融合ポリペプチドとして発現されたときの前記第１または前記第２糸状菌由来の前記目的とするポリペプチドの分泌と比較して、前記目的とするポリペプチドの増幅した分泌をもたらす融合ＤＮＡ配列。
２．前記第１ＤＮＡ配列が、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びアスパルチルプロテアーゼからのシグナルペプチド、ウシキモシン及びヒト組織プラスミノーゲン活性剤由来のシグナルペプチド並びにトリコデルマセロビオハイドロラーゼＩ及びＩＩ由来のシグナルペプチドからなる群から選ばれたシグナルペプチドまたはその一部分をコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
３．前記第１ＤＮＡ配列が、アスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチドをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
４．前記第２ＤＮＡ配列が、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びアスバルチルスプロテアーゼ、並びにトリコデルマセロビオハイドロラーゼＩ及びＩＩからなる群から選ばれた分泌ポリペプチドをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
５．前記第２ＤＮＡ配列が、アスペルギルス・アワモリ由来のグルコアミラーゼをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
６．前記第３ＤＮＡ配列が、キモシン由来の前配列、サブチリシンの前配列、及びトリプシン因子Ｘａ、コラーゲナーゼ、クロストリパイン、サブチリシン及びキモシンによって認識される配列からなる群から選ばれた開裂できるリンカーポリペプチドをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
７．前記第３ＤＮＡ配列が、キモシンの前配列またはその一部をコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
８．前記第４ＤＮＡ配列が、酵素、タンパク質ホルモン及び血清タンパクからなる群から選ばれた目的とするポリペプチドをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
９．前記第４ＤＮＡ配列が、ウシキモシンをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
１０．前記第１ＤＮＡ配列がアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチドをコードし、前記第２配列がアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ由来のグルコアミラーゼをコードし、前記第３配列がキモシンの前配列をコードし、そして、前記第４配列がキモシンをコードする、請求項１記載の融合ＤＮＡ配列。
１１．請求項１記載の融合ＤＮＡ配列の５′末端に実施可能に結合したプロモーター及び転写及び翻訳開始配列を含む前記宿主糸状菌によって機能的に認識される調節配列をコードするＤＮＡ配列及び転写停止配列及び前記融合ＤＮＡ配列の３′末端に実施可能に結合したポリアデニル化配列を含む宿主糸状菌の形質転換のための発現ベクター。
１２．前記シグナルペプチド及び前記分泌ポリペプチドをそれぞれコードする前記第１及び前記第２ＤＮＡ配列が、前記宿主糸状菌と同属の糸状菌から選ばれる、請求項１１記載の発現ベクター。
１３．前記属が、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューラスバラ属、ペニシリウム属、セファロスポリウム属、パダスポラ属、エンドチア属、ミューコア属、コクリオボラス属、ピリキュラリア属、アクリヤ属及びヒューミコラ属からなる群から選ばれたものである、請求項１１記載の発現ベクター。
１４．前記属がアスペルギルス属である、請求項１３記載の発現ベクター。
１５．前記シグナルペプチド及び前記分泌ペプチドをそれぞれコードする前記第１及び前記第２ＤＮＡ配列が前記宿主糸状菌由来のものである、請求項１１記載の発現ベクター。
１６．請求項１１〜１５記載の発現ベクターの群から選ばれた発現ベクターを含む糸状菌。
１７．アミノ末端からカルボキシ末端に向かって第１、第２、第３及び第４アミノ酸配列を含み、前記第１アミノ酸配列が第１糸状菌の分泌配列としてシグナルペプチド機能を含み、前記第２アミノ酸配列が前記第１糸状菌または第２糸状菌から正規に分泌された分泌ポリペプチドまたはその一部分を含み、前記第３アミノ酸配列が開裂できるリンカーポリペプチドを含み、かつ、前記第４アミノ酸配列が目的とするポリペプチドを含み、ここで、前記第１または前記第２糸状菌の前記融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ配列の発現が、前記第１、第３及び第４アミノ酸配列を含む第２融合ポリペプチドをコードする第２融合ＤＮＡ配列から発現されたときの前記第１または前記第２糸状菌由来の前記目的とするポリペプチドの分泌と比較して、前記目的とするポリペプチドの増幅した分泌をもたらす融合ポリペプチド。
１８．前記第１アミノ酸配列が、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ、α −アミラーゼ、及びアスパルチルプロテアーゼからのシグナルペプチド、ウシキモシン及びヒト組織プラスミノーゲン活性剤由来のシグナルペプチド並びにトリコデルマセロビオハイドロラーゼＩ及びＩＩ由来のシグナルペプチドからなる群から選ばれたシグナルペプチドまたはその一部分を含む、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
１９．前記第１アミノ酸配列が、アスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチドである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２０．前記第２アミノ酸配列が、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼ、α −アミラーゼ、及びアスパルチルプロテアーゼ並びにトリコデルマセロビオハイドロラーゼＩ及びＩＩからなる群から選ばれたものである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２１．前記第２アミノ酸がアスペルギルス・アワモリ由来のグルコアミラーゼである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２２．前記開裂できるリンカーポリペプチドが、サブチリシンの前配列、及びトリプシン因子Ｘａ、コラーゲナーゼ、クロストリパイン、サブチリシン及びキモシンによって認識される配列からなる群から選ばれたものである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２３．前記第３アミノ酸配列が、キモシンの前配列である、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２４．前記第４アミノ酸配列が、酸素、タンパク質ホルモン及び血清タンパクからなる群から選ばれたものであ、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２５．前記第４アミノ酸配列がキモシンである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２６．前記第１アミノ酸配列がアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼのシグナルペプチドであり、前記第３アミノ酸配列がキモシンの前配列であり、そして、前記第４アミノ酸配列がウシキモシンである、請求項１７記載の融合ポリペプチド。
２７．目的とするポリペプチドを製造する方法であって、請求項１記載の配列によってコードされる目的とするポリペプチドの分泌を起こす前記融合ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件で、前記融合ＤＮＡ配列を含む発現ベクターで宿主糸状菌を形質転換することを含む方法。