JPH04500385A

JPH04500385A - 酵素洗剤組成物

Info

Publication number: JPH04500385A
Application number: JP2509048A
Authority: JP
Inventors: カステレイン，エリツク; エフモント，マールテン・ロベルト; ハーヘルカンプ，ヨハン; マルツフ，ヨン・ダヒト; ムーレン，アルノルダス・テオドルス・アントニウス
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1989-06-26
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 1992-01-23
Also published as: DE69034159T2; WO1991000334A1; ES2227508T3; EP0405901A1; CA2034486A1; BR9006827A; DE69034159D1; EP0405901B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

旺ＷＭ」本発明は　向Ｈ＝ｒ−浩１効能を示す洗剤組成物を調製するのに有効な新規の突然変異酵素または酵素変種と、かがる酵素を含有する洗浄及び洗剤組成物と、適当な宿主細胞または微生物中に挿入されたときにががる酵素の発現をコードする突然変異遺伝子と、特定の条件下の所与の洗濯液中でより良く機能するために親酵素中で変更されるべきアミノ酸残基を選択する方法とに係わる。ｌ肌凶１１洗剤業界においては２０年以上も洗濯製剤中に酵素が使用されている。このような製剤中に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びその他の酵素またはこれらの混合物である。商業的に最も重要なものはプロテアーゼである。プロテアーゼは洗剤業界で２０年以上も使用されているが、いずれの物理的または化学的特性がプロテアーゼの優れた洗濯効能または洗濯能に寄与するがは未だ正確には知られていない。現在使用されているプロテアーゼは、天然からプロテアーゼを単離し、それらを洗剤製剤中で試験することにより見い出された。パ　ルスプローアーゼタンパク質基質においてアミド結合を切断する酵素はプロテアーゼまたは（互換的に）ペプチダーゼとして分類される（参照Ｗａｌｓｈ、１９７９．ＥｎｚｙｍａＬｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ。Ｎ、１１．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、サンフランシスコケ第３章）、バチルス属の細菌は２種の細胞外プロテアーゼ、即ち中性またはメタロプロテアーゼと、機能的にはセリンエンドペプチダーゼでありズブチリシンと称されるアルカリ性プロテアーゼとを分泌する。これらプロテアーゼの分泌は、細菌の成長サイクルに関連しており、胞子形成も生じる定常期の間にプロテアーゼの発現は最大となる。　Ｊｏｌｉｆｆｅら（１９８０゜Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉａｌ　１４１：１１９！ｌｌ−１２０８）は、バチルスプロテアーゼが細胞壁の代謝回転において機能することを示唆した。攻工±ユ之Ｚセリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、その中の活性部位には必然的にセリン残基を有する（Ｗｈｉｔｅ、Ｉ（ａｎｄ！ｅｒ及びＳｍ１ｔｈ、１９７３″Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”第５版、ＭｅＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、ｐｐ。２７１−２７２＞。細菌由来のセリンプロテアーゼは２０，０００〜４５，０００の範囲の分子量を有する。細菌由来のセリンプロテアーゼはジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害されるが、メタロプロテアーゼとは反対に、（高温ではカルシウムイオンによって安定化されるが）エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴ＾）には耐性を示す、これらは単純末端エステルを加水分解し、やはりセリンプロテアーゼである真核キモトリプシンと活性において類似である。より狭義には１つのサブグループを形成するアルカリ性プロテアーゼは、ｐ［＋９〜１１．０の高い最適ｐｉを有する成る種のセリンプロテアーゼである（検討にはＰｒ１ｅｓｔ、１９７７、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　４１：〕１１〜７５３を参照されたい）。本発明におけるズブチリシンは、ダラム陽性菌または菌類によって産生されるセリンプロテアーゼである。広範囲にわたる種々のズブチリシンが同定されており、多数のズブチリシンのアミノ酸配列が決定されている。これらの例としては、Ｂａ５ｉｌｌｕ、株由来の少なくとも６種のズブチリシン、即ちズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ”、ズブチリシンＣａｒｔｓｂｅｒｇ、ズブチリシンＯＹ、ズブチリシンａｍｙｌｏｓｉｃｅｈａｒｉｔｉｅｕｓ及び−ｅｓｅｎｔｅｒｉｅｏｐｅｐｔ　１ｄａｓｅ（ｋｕｒｉｈａｒａら、１９７２．Ｊ。Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋、２４７：５６２９〜５６３１　；　Ｈｅ１ｌｓら　、１９８３．Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１ニア９１１〜７９２５　；　５ｔａｈｌ及びＦｅｒｒａｒｉ、１９８４ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５９：８１１〜８１９　；　Ｊａｃｏｂｓら、　１９８５　、　Ｎｕｃ　Ｉ　、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８９１３〜８９２６　；　Ｎｅｄｋｏｖら、１９８５．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｆｌｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３６６；４２１〜４３０　；　５ｖｅｎｄｓｅｎら、１９８６．ＦＥＢＳ　ｔ、ｅｔｔ　１９６：２２８− ２３２）、ａｃｔｉｎｏＩＩｙｃｅｔａｌｅｓ由来の１種のズブチリシン、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｎ　ｃｅｓ　ｖｕｌ　ａｒｉｓ由来のｔｂｅｒｍｉｔａｓｅ（Ｍｅｌｏｕｎら、１９８５．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９８３：１９５〜２００）、並びに、Ｔｒｉｔｉｒａｅｈｉｕｍ　ａｌｂｕ−由来の１種の菌類ズブチリシンプロテイナーゼＫ　（Ｊａｎｙ及びＭａｙｅｒ、１９８５．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、１（ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３６６：５８４〜４９２）を挙げることができる。ズブチリシンは物理的及び化学的によく特性化されている。これら酵素の一次構造（アミノ酸配列）の認識の上に、ズブチリシンの５０以上の高分解能Ｘ線構造が決定されており、それによって、基質の結合、遷移状態、産物、少なくとも３種の異なるプロテアーゼ阻害物質が明らかとなり、天然変種の必然的構造が規定されている（Ｋｒａｕｔ、１９７７、＾ｎｎ。Ｒｅｖ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　４６：３３１〜３５８）。本発明においてズブチリシン変種または突然変異ズブチリシンプロテアーゼとは、適当な宿主において発現させたときにかかる突然変異ズブチリシンプロテアーゼが産生される突然変異遺伝子を産生ずるように突然変異処理された、！！遺伝子または親遺伝子を有し、対応する親！？素を産生した親機生物から誘導された突然変異遺伝子を発現する微生物によって産生されたズブチリシンを意味する。ズブチリシン遺伝子のランダムな及び部位特定の突然変異はいずれら酵素の物理的及び化学的特性の知識から生まれたもので、ズブチリシンの触媒活性、基質特異性、三次構造などに関する情報を与えている（ｌｌｌｅｌｌｓら、１９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８４：１２１９〜１２２３　Ｈｌ１ｅｌｌｓら、１９８６．Ｐｈ１１、Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、１．ｏｎｄ、＾、　３１７：４１５〜４２３　：　Ｈｗａｎｇ及び−ａｒｓｈｅｌ　。１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６：２６６９〜２６７３；Ｒａｏら　、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５５１〜５５４）。ズブチリシン遺伝子の特に部位特定の突然変異誘発は多いに注目を集め、種々の突然変異が以下の特許出願及び特許に記載されている： “カルボニルヒドラーゼ”において部位特定的にまたはランダムに誘発される突然変異と、その後で突然変異酵素をＫｃａｔ／に＋ｍ比、ｐ）ｌ活性分布及び酸化安定性といった種々の特性についてスクリーニングすることとに関する欧州特許公開第１３０７５６号（ＣＥＮＥＮＴＥＣ）ｌ　）　（米国特許第４，７６０，０２５号（（：ＥＮＥＮＣＯＲ）に対応）０部位特定的突然変異が可能であること、所定め特定位！、即亡、−１７，、、３２八ｓ　ｐ　、　ｌ　Ｓ　Ｓ＾ｑ３　”’Ｔｙｒ、　”’Ｎｐ↑目’［；ｌｙ、　”Ｈｉｓ、　目！Ｇｌｙ、１ｌｌｐｌ、ｅ、３コＳｅｒ、　２２１Ｓｅ、、　２１）Ｔｙｒ、”’Ｇｌｕｄたは１５２＾ｌａにおけるズブチリシンＢＰＮ’の突然変異が改質特性を示す酵素を与えることを開示しているほかには、上記明細書は、所望の特性を有する酵素を得るために突然変異を導入すべき場所を決定する問題を解決するには寄与していない。ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ及びその２種類の突然変異体のクローニング及び発現に係わる欧州特許公開第２１４４３５号（ＨＥＮＫＥＬ）、この出願明細書には、″６八ｓｐ〜ｌｓ”Ｓｅｒ及びｌ″Ｓｅｒ〜目１＾ｓｐの突然変異の理由については記載がない。国際特許公開筒Ｗ０８７１０４４６１号（＾ＭＧＥＮ）においては、優れたｐＨ及び熱安定性を示す突然変異酵素を得るために、親酵素中に存在する＾ｓｎ〜Ｇｌｙ配列の数を減らすことが提案されており、ズブチリシンＢＰＮ’におけるＩＩＩＩＡＳｌ及び２１＾ｓｎ残基る。国際特許公開第一０８７１０５０５０号（Ｇ；ＥＮＥＸ）は、特性を向上するためのズブチリシンＢＰＮ’のランダムな突然変異と、その後で多数のズブチリシンＢＰＮ’の突然変異体をスクリーニングすることを開示している。この明細書においては、ｚ　＋　＄Ａｓ口、　１コＩＧｌｙ、　２５４７）、、、　口’ＣＩ、、　１１６＾１ａ、　１１ｍ５ｅ、、”’Ｌｅｕ及び”Ｓｅｔの位置における突然変異が記載されている。欧州特許出願第８７３０７６１号（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）には、−次構造及び三次構造レベルにおける類似性が、保存されているいないにかかわらず等価のアミノ酸残基を固定するのにいかに適用され得るかが記載されている。この情報とズブチリシンＢＰＮ’の三次構造についての本発明者らの知識とによって。本発明者らは、改質特性を有する突然変異体を得る見込みのある突然変異を受け易い多数の部位を選択するに至った。このようにして同定された位置は、＋　２４　Ｍｅ　Ｌ　、　１２２　＠　ｅ　ｔ、１０４　Ｔ、、　、口２＾１ａ　、Ｉ％！にｌ、、　ｌｉ＆にｌ、　、宜　＠Ｉにｌ、、　Ｉ　＠ｌｐ）、　ｅ、ｔ　＋　ｙ７．、である、更に、′５５＾ｓｎ、２１７　ｙ　ｒ、”Ｔｈｒ、　２４Ｓｅｔ、３２＾ｓ　ｐ　、３コＳｅｒ、　コロ＾ｓｐ、”Ｇｌｙ、　”Ａｌｔ、”Ｓｅｔ、　”Ｎｅｔ、フチ＾ｓｎ、　ｌ５ｅｒ、　”Ｌｙｓ、　ツ’Ｖａｌ、　”Ｌｅｕ、　目フｌｉｅ、　重１０ＧＩ、、口’Ｌｙｓ、　”’Ｔｙｒ、　＄フ２ｐｒｏ、ＩＩｔ八ｓへ、　目’Ｎｅｔ、　”’Ｓｅｔ、！＋１Ｌ、ｓ及び２２１　Ｓｅ、は、酵素の種々の特性に影響を及ぼすことが見込まれるとして同定された。更に多数の例が突然変異がかかる提案を支持するために列挙されている。上記位置における単一の突然変異に加えて本発明者らは多数の多重突然変異も実施した。更に本発明者らは、２１９にｌ、、６１旧Ｓ、１２８Ｌｅｕ、＋３５Ｌｅｕ、及び、断片９７〜１０３．１２６〜１２９゜２１３〜２１５及び１５２〜１フ２内のアミノ酸残基を重要であるとして同定したが、これらの位置の突然変異の例は全く示されていない。欧州特許公開第２６０１０５号（ＧＥＮＥＮＣＯＲ）は、触媒三組体（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ）から約１５人以内にあるアミノ酸残基を選択し、選択したアミノ酸残基を別の残基と置換することにより触媒三組体を含む酵素において所定の特性を改質することを記載している８本明細書に記載のズブチリシン系の酵素は、特に触媒三組体を含む酵素の種類に属すると述べられている。ズブチリシンにおいては位１ｊ　２２２と２１７とが１Ｈ１ｋに好ましい位置であると示唆されている。国際特許公開第一０８８７０６６２４号（ＧＩＳＴ−ＢＲＯＣＡＤＥＳ　ＮＶ）ハ、アミノ酸配列においてズブチリシ〉／３０９のものとほぼ１００％類似であるＰＢ９２と称されるズブチリシンプロテアーゼのＤＮ＾及びアミノ酸配列を開示している。国際特許公開第一０８８７０７５７８号（ＧＥＮＥＮＴＥＣＩＩ）は、アミノ酸残基の少なくとも１種の触媒反応基を置換または改質する二とによ〜でｑデ前駆体から誘導される突然変異酵素を特許請求している。該特許の発明者らは、そうすることによって、改質または１損された触媒反応基を含む基質に反応性を示す突然変異酵素（基質助成触媒（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ａｓｓｉｓｔｅｃｌ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ＞）が得られると述べている。全般的な説明は、単独でまたは’５ｅｒ−２４−Ｃｙｓ”の゛°ヘルパー″“突然変異との組合わせで６″Ｈｉｓが６４＾１ａに改質されている４ｕ　ｅ　ｒ　ａ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｓズブチリシン（ＢＰＮ’　）をもとに行なっているが、アミノ酸残基３２＾ｓｐ及び２２１Ｓｅ、とΔ１ａ−４８−ｆ；ｌｕの“ヘルパー”突然変異における改質も示唆されている。国際特許公開第一０８８１０８０２８号（ＧＥＮＥＸ）は、タンパク質の安定化のために金属イオン結合部位周辺の遺伝子工学を開示している。この公開特許も例としてズブチリシンＢＰＮ’を使用しており、置換の候補としてアミノ酸残基１　’　２　Ｐ　ｒ　。（Ｐ１７２［１，Ｐ１７２Ｅ）、１３’Ｇｌｙ（（：１３１Ｄ）、′６＾５ｎ（Ｎ７６Ｄ；Ｎ７６Ｄ＋　Ｐ１７２Ｄ（Ｅ））、”５ｅｒ（５７８Ｄ）を指示している９更に、突然変異体の組合せＮ７６Ｄ＋　５７８Ｄ＋　Ｇ１３１Ｄ＋Ｐ１７２Ｄ（Ｅ）　：　Ｎ７８［１＋　（：１３１Ｄ　：　５７８Ｄ＋　Ｇｔ３１Ｄ　；　５７８Ｄ＋　Ｐ１７２Ｄ（Ｅ）及び５７８Ｄ＋　Ｇ１３１Ｄ＋　Ｐ１７２Ｄ（Ｅ）についても示唆している。国際特許公開第一０８８１０８０３３号（３ＭにＥＮ）は、優れた熱安定性及びｐＩ′１安定性を示す酵素を得るために、改質されたカルシウム結合部位を有し、分子中に存在する任意の＾５ｎ−１：ｌｙ配列において＾ｓｏまたはＧｌｙのいずれかが置換された多数のズブチリシン類縁体を開示している。カルシウム結合部位の１つはアミノ酸残基４１　Ａ　ｓ　ｐ、７５Ｌｅｕ、１６＾ｓｎ、γ７＾ｓｎ、フ’Ｓｅｒ、フ’Ｔｌｅ、”Ｇｌｙ、”Ｖａｌ、２°’Ｔｈｒ及び２目Ｔｙｒに関与しており、他の考え得るカルシウム結合部位は、′４０八ｓｐ及び＋　１２ｐ、０と、ｌ　４　Ｐ　ｒ　ｏ及び２７１にｌｎと、ｌ　？　２　Ｐ　ｒ　ｏ及び１１５にｌｕまたは＋″′＾ｓｐにあると示唆されている。更に位置 ′。９＾ｓｎ及び２日へｓｎを突然変異させることも示唆されている。生産される突然変異体はＮ１０９Ｓ、Ｎ１０９Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ、　Ｎ７６Ｄ十Ｎ１０９Ｓ十Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ＋Ｎ７７Ｄ＋Ｎ１０９Ｓ十Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ−１１７９Ｅ＋Ｎ１０９ｓ＋Ｎ２１８Ｓである。国際？ｅ許ＩＦＬＪ０８８１０８１６４号（［：ＥＮＥＸ）は、安定化の可能を含むジスルフィド結合の形成を許す、システィンによって置換し得る残基をタンパク質中で同定する方法を開示している。この方法は、タンパク質の三次元構造についての詳細な知識に基づいており、位置を選択するためにコンピュータを使用する。ズブチリシンプロテアーゼに関してはズブチリシンＢＰＮ’がモデル系として使用されている。ズブチリシンＢＰＮ’においてこの方法を使用しジスルフィド結合を導入する候補位置は１１カ所示唆されている（１　：Ｔ２２Ｃ＋　５８７Ｃ５２：Ｖ２６Ｃ＋　Ｌ２３５Ｃ１３：Ｇ４７Ｃ＋Ｐ５７Ｃ１４：Ｍ５０Ｃ＋　Ｎ１０９Ｃ１５：Ｅ１５６Ｃ＋　Ｔ１６４Ｃ５６：Ｖ１６５Ｃ＋　Ｋ１７０Ｃ１７：Ｖ１６５Ｃ＋　５１９１Ｃ１８：Ｑ２０６Ｃ＋＾２１６Ｃ１９：＾２３０Ｃ＋　Ｖ２７０Ｃ２１０：１２３４Ｃ十八２７４Ｃ１１１：　）１２３８Ｃ＋Ｗ２４１Ｃ）　、これらのうち４つは産生され（１，２，４及び８）、そのうちの２つ（２及び４）は安定作用を与えなかった。上記２つの突然変異体を相互に組合わせること、及び１つを他の突然変異と組合わせること、即ちＴ２２Ｃ＋５８７Ｃ＋　Ｎ２１８Ｓ及びＴ２２Ｃ＋　５８７Ｃ＋　Ｑ２０６Ｃ＋＾２１６Ｃにより、更に別の突然変異体を生産した。また更に、＾ＩＣ＋５７８Ｃ，５２４Ｃ＋５８７Ｃ，Ｋ２７Ｃ十５８９Ｃ２Ａ８５Ｃ＋＾２３２Ｃ，［１２２Ｃ＋Ｖ１４７Ｃ，５２４９Ｃ＋Ａ２７３Ｃ及びＴ２５３Ｃ＋＾２７３Ｃにより多数の不良の突然変異体が生産された。また、Ｔｈｏｍａｓ　、　Ｒｕ５ｓｅ　ｌ　Ｉ及びＦｅｒｓｈｔ、Ｎａｔｕｒｅ　３１８，３７５〜３７Ｂ（１９８５）によって、ズブチリシンＢＰＮ’において′１＾ｓｐを”Ｓｅｒに交換することにより酵素のｐＩ（依存性を変更することが示された。次いで上記著者は文献Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　、（１９８７）　１９３．８０３〜８１３において、Ｉｓ＠にｌ、をＩｓ！Ｓｅｒに置換することも検討している。上記突然変異はいずれも活性６４旧Ｓから約１５人の距離内にある。Ｎａｊ、ｕｒｅ　３２８，４９６〜５００（１９８７）においてＲｕ５ｓｅ　ｌ及びＦｅｒｓｈｔは彼らの実験結果を検討し、酵素を突然変異させて表面電荷を変更することによりｐＨ活性分布を変更する法則を提示した。ＩｉＬ並ｂ１等電点ｐ１６は、（必要によっては金属イオンまたは他のイときのｐＨの値と定義される。この総和においては勿論、正または負の個々の静電電荷を考慮せねばならない。等電点は便宜的には、当該酵素における種々の荷電残基におけるｐＫ値を使用して平衡を考慮し、反復法によって酵素分子のＮＥＣがゼロに等しくなるｐｉｆ値を見つけることにより計算される。この計算の１つの問題は、荷電残基におけるｐに値がそれらの環境に依存し、従って変化することである。しかしながら実際の値とは無関係に特定のおおよそのｐＫ値を荷電残基に割り当てることにより、極めて優れた結果を得ることかて゛きる３部分的に環境を考慮に入れてより複雑な計算を実施することもできる。酵素を含む溶液を等電点電気泳動または滴定することにより＋　ｐｒｏを実験的に決定することもできる。更に、荷電残基における種々のｐＫ値を滴定によって実験的に決定するズブチリシンのようなプロテアーゼは工業的に、特にタンパク質性の汚れを除去するのに有効であるので洗剤調製に高い有用性が見い出されている。現在のところ下記のプロテアーゼが公知であり、これらの多くが世界中の多数の国々で大量に市販されている。ズブチリシンＢＰＮ’またはＮｏｖｏ　Ｃ例えばＳ１イ＾、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、ＩＪ。Ｓ、＾が市販のもの〕ズブチリシン′Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　ｌ：　Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　ａ／ｓ（デンマーク）が市販の＾ＬＣ＾１．＾ＳＥ（登録商標）、及びＩＢＩＳ（オランダ）が市販のＮＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）〕、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＩｅｎＬｕｓズブ＋　！Ｊ　シフ　（Ｎ０ＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　Ａ／Ｓ（デンマーク）が市販のＳ＾ＶＩＮＡＳＥ（登録商標）〕、５ＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）に極めて類似の酵素〔例えばｌＢｒ５が市販）ＭＡＸＡＣＡｌ、（登Ｓｔ　商！！　）ｙ６びＭＩｌ、Ｆ！；　ＫＡ＋、Ｉ　Ｃ’ＨＥＭＩＥ（ＲＰＧ＞が市販の０ＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）〕、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓズブチリシン〔Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　ａ／ｓ（デンマーク）が市販のＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）〕、５ＨＯ−八〇ＥＮＫＯ（日本）が市販のＫＡＺＵＳＡＳＥ（登録商標）。しかしながら有効であるためにはこのような酵素は、洗濯条件下で活性を示すのみでなく、洗剤製造及び保管の間に他の洗剤成分と相溶性でもあるべきである。例えばズブチリシンは、他の基質に対する他の酵素活性と組合わせて使用することが考えられ、選択されたズブチリシンはかかる酵素に対して安定性を有するべきであり、更に好ましくは、選択されたズブチリシンは、他の酵素の分解を触媒すべきでない。更に、選択されたズブチリシンは、洗剤製剤中の他の成分、例えば漂白剤、抗酸化剤などによる作用に耐性を示すべきであり、特に洗剤製剤中に使用される酵素は、酸化力、カルシウム結合特性、及び保管の間の洗剤中及び洗濯の際の洗濯液中の非酵素成分によってつくられるｐＨ条件に関して安定であるべきである。例えば洗濯の間に清浄化されるべき対象物に存在する種を使用してこの特性を表わすこととする。天然ズブチリシンは、ｐｉのようなパラメータの変化のもとに洗濯力または洗濯能に関して適度に変化し得る特性を有することが判っている。実際のところ前述の市販の洗剤プロテアーゼの幾つかは２０年前に市販されていたものより優れた効能を有するが、各酵素は最適な酵素に対して、調製及び洗濯条件に関する特定の条件（例えばｐｉ、温度、イオン強度（−Ｉ）、活性系（界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅｓ及び５ｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、漂白剤など）、ビルダー等）を有する、結果として、低ｐＨ及び低下で望ましい特性を有する酵素は、よりアルカリ性の条件及び高■では望ましさが低下１２、高ｐｌＩ及び高■で優れた特性を示す酵素は低ｐｉｆ及び低下条件下では望ましさが低下する。組換えＯＮ＾技術の開発及び発展は、タンパク質化字の分野に多大な影響を与えた。かかる技術によって、酵素のようなペプチド及びタンパク璽やホルモンを所望の仕様に従って設計し、所望の特性を示す化合物の生産が可能となると考えられる６現在では所望のアミノ酸配列を有する酵素を構築することが可能であり、前述のごときかなり多数の研究が、改質特性を有するズブチリシンを設計することに費やされてきた。かかる提案のなかでも、欧州特許公開筒１．３０７５６号（（：ＥＮＥＮＴＥＣＵ）　（米国特許第４，７８０，０２５号（ＧＥＮＥＮＣＯＲ）及び国際特許公開第一０８７１０５０５０（にＥＮＥＸ）に記載のように多数の突然変異酵素を生産しスクリーニングする技術は、天然酵素を単離しそれらを特性によってスクリーニングする伝統的な方法に対応しているが、多数の種々の突然変異酵素の存在の知識によってより効率的となっている。ズブチリシン酵素は典型的には、各々が天然に存在し得る２０種類のアミノ酸のうちの１つである２７５のアミノ酸残基配列からなるが故に、上記方法における１つの極めて重大な欠点は、問題の用途で、例えばこの場合には特定の洗濯液条件下で優れた洗濯効能を示す洗剤組成物を調製する上で優れた特性を有する所望の酵素を得るために、どのアミノ酸残基を変更するかを決定する際の手引きが示されていないので極めて多数の突然変異が起こり、これに予備的なスクリーニングを行なってから第１のスクリーニングにおいて重要な特性を示す選択された突然変異体を更に試験せねばならないことである。前記特許出願明細書に概要が述べられている方法は結果として、長年にわたって良く知られている伝統的なランダムな突然変異方法よりわずかに優れているにすぎない。他の公知の方法は、トランスエステル化（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び加水分解速度（欧州特許公開第２６０１０５号（にＥＮＥＮＣＯＲ））、ｐＨ活性分布（Ｔｈｏｍａｓ、Ｒｕ５ｓｅｌｌ及びＦｅｒｓｈｔ　、上掲）及び基質特異性〈国際特許第一第Ｗ０８８１０７５７８号（ＣＥＮＥＮＴＥＣＩＩ））といった特定の特性を変更することに係わる。これらの公開特許のいずれも、酵素の洗濯効能を変更することには係わっていない。更に改善された方法は、所定のアミノ酸を置換したときに起こり得る結果を解析するためにタンパク質の三次元構造についてグ）詳細情報を使用する。この方法は既に使用されており、欧州特許第２６０１０５号（ＧＥＮＥＮＣＯＲ）、国際特許第一０８８１０７５７８号（ＧＥＮＥＮＴＥＣ旧、国際特許第一〇　８８１０８０２８号（ＧＥＮＥＸ）、国際特許第Ｎｏ　８８，１０８０３３号（八ＮにＥＮ）、及び国際特許第一０８８７０８１６４号（にＥＮＥＸ）に記載されている。以上に述べたように、前述のごとき酵素の全く明らかな特性と酵素の洗濯効能との関係は未だ同定されていない。未公開ノ国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ　８８１００００２号（ＮＯＶＯＩＮＤＵＳＴＲＩ＾／Ｓ）においては、突然変異のためにどのアミノ酸位置を選択すべきか、洗濯効能において所望の変更を得るためにかかる位１でどのアミノ酸にＩｆａすべきかを決定するホモロジー比較（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ＞の概念を利用することが提案されている。この方法を使用することにより、生産される突然変異体の数ははるかに少ないのでスクリーニングの作業は著しく軽減されるが、この方法では、親酵素と比較に使用した酵素との有効な特性が組合さった特徴を示す酵素が得られことが見込まれるのみである。問題点は、多くの研究が酵素活性のメカニズムを明らかにすることを目指しているにもかかわらず、洗濯効能に関する酵素の特性を決定する構造の要因及びアミノ酸残基の組合せについて未だにほんのわずかしか判っていないことであろう。従−）で、酵素を更に改良して洗濯系に適合させる必要性と、洗浄または洗剤組成物の実際の使用におけるプロテアーゼ作用のメカニズムをより一層理解する必要性とがある。このような理解は、適度の確実性で特定の洗濯液染件下で優れｔ：洗濯性能を示す酵素を生じる結果となる突然変位を選択することに適用され得る法則を生むであろう。ｆｌ−のヱー約上記問題点を更に澗査した結果、驚くべきことには、洗剤組成物中にズブチリシン酵素を使用する上で重要な要因の１つは、基質、即ち清浄化されるべき布地、硬質表面または他の材料から除去されるべき物質への酵素の吸着であるにとが判 −）な。従って本発明は、突然変異ズブチリシンが洗剤組成物中で向上された挙動を示すように、かかる突然変異遺伝子によって発現される突然変異ズブチリシン酵素の特性を変更する結果となるズブチリシン遺伝子の突然変異に係わる。突然変異は、ズブチリシン酵素中の特定の位置にある特定のアミノ酸の発現に寄与する親ズブチリシン道伝子中の特定の核酸において生起される。更に本発明は、突然変異されるべき位置及びアミノ酸を選択する方法、及びそれに必要な変更を加えて当該ズブチリシン遺伝子において変更されるべき核酸を選択する方法にも係わる。本発明は部分的に、限定的ではないが、ズブチリシン３０９及びズブチリシンＣａｒｔｓｂｅｒｇ遺伝子に係わり、種々のｐＨ値の洗濯液を生じる種々の洗剤組成物中で向上した洗濯効能を示す突然変異ズブチリシン３０９及びＣａｒｌｓｂｅｒｇ酵素を保証する。更Ｇこ本発明は、洗浄組成物中に突然変異酵素を使用することと、突然変異酵素を含有する洗浄組成物、特に突然変異ズブチリシン酵素を含有する洗剤組成物とにも係わる。１整記Ｊ二え又１＾　＝　＾１ａ　−アラニンＶ　＝　Ｖａｔ　−バリンＬ　＝　Ｌｅｕ　＝　ロイシン１　＝　Ｉｌｅ　−イソロイシンＰ　＝　Ｐｒｏ　−プロリンＦ　＝　Ｐｈｅ　−フェニルアラニンＨ＝　Ｔｒｐ　＝　トリプトファンＭ　＝　Ｎｅｔ　−メチオニンＧ　＝　ｃｒｙ　＝　グリシンＳ　＝　Ｓｅｔ　−セリンＴ　＝　Ｔｈｒ−）レオニンＮ　＝　＾ｓｎ　−アスパラギンＱ　＝　Ｇｌｎ　−グルタミンＤ　−＾ｓｐ　−アスパラギン酸Ｅ　＝　（：ｌｕ　−グルタミン酸Ｋ　＝　１．ｙｓ　ニ　リ　ジ　ンＲ＝　＾ｒＨ−アルギニンＨ＝　Ｈｉｓ　−ヒスチジン徂１１］Ｔ　−チミン　（ＤＮＡ中のみ）Ｕ　−ウラシル　（ＲＮＡ中のみ）ズ１じ（μ 本発明によって誘発または生起される種々の突然変異を記載する上で、参照が容易なように以下の記述形式を使用する・もとのアミノ酸　位置　置換後のアミノ酸これに従うと、位置１９５にあるグリシンをグルタミン酸で置換する場合には、にｌｙ　１９５　Ｇｔｕ　または　ｆ、１９５Ｅと表わし、同じ位置のグリシンの欠失は、Ｇｌｙ　１９５本　または　６１９５車と°表わし、アミノ酸残基、例えばリシンの挿入は。ｆ；Ｉｙ　１９５　Ｃ１ｙＬｙｓ　または　Ｇ１９５ＧＫと表わすことになる。表Ｉで欠失が示されているか、またはズブチリシン中の存在が表１に示されていない箇所では、かがる位置における挿入は、例えば位置３６にアスパラギン酸を挿入するのであれば、本３６Δｓｐ　または　＊３６Ｄと表わす。多重突然変異は十記号によって分けて表わす。即ち＾ｒ１１１７０　Ｔｙｒ　＋Ｃｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　または　Ｒ１７０Ｙ＋　Ｇ１９５Ｅこれは、位置１７０及び１９５においてアルギニン及びグリシンがそれぞれチロシン及びグルタミン酸に置換される突然変異を示す。訂ＩＬα二またアニゼこお（アミノ　の　１ａ−ズブチリシンＢＰＮ’　（Ｍｅｌｔｓら、＋９８３．玉揚）ｂ＝ズブチリシンａ＋ａｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ（Ｋｕｒｉｈａｒａら、１９７２．玉揚）Ｃ−ズブチリシン１８８（Ｓｔａｓ旧及びＦｅｒｒａｒ　ｉ　、　１９８４　、玉揚）ｄ−ズブチリシンｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｏｐｅｐｉｔｉｄａｓｅ（Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、１９８６、玉揚）ｅ＝ズブチリシンＤＹ（Ｎｅｄｋｏｖら、１９８５．玉揚）ｆ−ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（Ｓｍｉｔｈら、１９６８．玉揚）ｇ＝ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（Ｊａｃｏｂｓら、１９８５．玉揚）ｈ−ズブチリシン３０９（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ　８８１００００２号）ｉ−ズブチリシン１４７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ　８８１００００２号）ｎ＝　ｔｈｅｒ論ｉｔａｓｅ（Ｍｅｌｏｕｎら、１９８５．玉揚）ｋ＝プロテイナーゼに（Ｂｅｔｚｅｌら、１９８８．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、１７８：１５５ｆｆ及びＧｕｎｋｅｌら４９８９．Ｅｕｒ、Ｊ、ＢｉｏｃｈｅＬＬ７９：１８５ｆｆ）１＝ａｑｕａｌｙｓｉｎ（Ｋｗｏｎら　、１９８８．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、１７３：４９１ｆｆ）ｍ＝Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＰＢ９２プロテアーゼ（欧州特許公開第０２８３０７５号）ｎ＝プロテアーゼＴＷ７（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）（国際特許出願第ＰＣ丁／ＵＳ８８１０１０４０号）０−プロテアーゼＴＷ３（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕ＋ｍ　ａｌｂｕｍ）（ｌｌＩｌ際特許出願第ＰＣＴ／１ｌｓ８８１０１０４０号）車−欠失割当て（表Ｉ続き）Ｎｏ：　ｌ　１０ａ）　＊−☆＋嚢一会一一４−☆一人−Ｑ−５−＊−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｓ− Ｑ−エ−Ｘ一倫。★一倫−☆−鶴Ａ−Ｐ−人一ｂ）　金一会一倫一會．−＊一命 −＾−Ａ−Ｑ−Ｓ−”−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−エーＳ−Ｑ−エーｙ，−倫−＊−會− 會−＊−），−ｐ　−ｊ％@− Ｃ）　＊−愉−會−＊−嚢−会一会−Ａ−Ｑ−５−倫−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−工−ｓ −ｏ−ｘ−ｘ−＊一嚢一嚢−＊−嚢−７１−ｐ−１−ｄ）　＊一倫＋貴−☆一会一命一会一人−Ｑ−５−＊−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｓ−Ｑ−１−Ｋ−＊−＊−＊ −４ｋ−＊−）ｈ−Ｐ−ｋ。ｇ）　倫−ｄｋ−＊−貞−４”−自−４”−Ａ−Ｑ−Ｔ−貞−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｇ− Ｉ−Ｐ−Ｌ−エーＫ−貴−肴−＊−＊−＊−人−Ｄ−ｙ，−ｈ）　＊−＊−倫一＊−懺−愉−倫一人−Ｑ−Ｓ−＊−Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−１−Ｓ−Ｒ−Ｖ−Ｑ−”− 倫−愉−会−皆−Ａ−Ｐ−Ａ−ｉ）　倫−会−命−＊．，肯−嚢−一−僑−Ｑ− Ｔ−轟一Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｉ　−Ｓ−Ｆ−Ｉ−Ｎ−”−＊−４−４１−−Ｔ−Ｑ７Ｑ−１）＊一会一愉−☆一貞一貴−八一Ｔ−Ｑ−５−Ｐ−Ａ−Ｐ−ＩＪ−Ｇ− Ｌ−Ｄ−Ｒ−工−Ｄ−Ｑ−Ｒ−Ｄ−Ｌ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｎ−ｍ）　＊−嚢−＊−＊　４−＋ｋ−金−Ａ−Ｑ−５−＊−Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−Ｑ４−肴 −嚢−＊−肴−Ａ−Ｐ−Ａ−ｎ）　☆一倫−倫−青一壷一貞−八−Ｔ−Ｑ−Ｅ− Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｌ一人一Ｒ−Ｉ−５−Ｓ−Ｑ−Ｅ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ− Ｑ）　＊−會−１−僑−一−＊一人−Ｅ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ａ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ａ −Ｒ−工−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ｎｏ：　２０　４０ａ）　Ｌ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−×−Ｖ一人−Ｖ−Ｉ−Ｄ −Ｓ−Ｇ−■−Ｄ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−憾−ｂ）Ｌ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｙ −Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−Ｈ −Ｐ−Ｄ−Ｌ−愉−Ｃ）Ｌ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｘ−Ｖ −Ａ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−｝！−Ｐ−Ｄ−Ｌ−嚢一ｄ）Ｌ− Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｓ−Ｇ− ４−Ｄ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−ｅ）　Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｋ−Ｇ一人一Ｎ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｇ−工−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−１一人−λ−Ｓ−Ｈ−Ｔ−Ｄ −Ｌ−４−ｆ）Ｖ−Ｑ−人−Ｑ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ −Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−工−Ｑ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−貞−ｇ）Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｑ −Ｇ−Ｆ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｖ４−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ一１一〇−Ａ− Ｓ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−ｈ）　Ａ−｝｛−１１−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｇ −Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ一丁−”−Ｓ−Ｔ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−” −ｉ）−７＋＝ｙ−−ｎ＝ｎ−Ｇ＝，Ｔ−Ｆ−Ｇ−Ｎ＝Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｖ−Ａ−Ｖ −Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−　金−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｐ＝Ｄ−ＩＪ−＊| ｊ）　Ａ−Ｗ−’−Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｉ−λ−Ｉ−Ｖ−Ｄ −Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−Ａ−ｋ）Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｅ−Ｓ −Ａ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｃ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｔ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｓ−Ｈ −Ｐ−Ｅ−Ｆ−”−１）Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ −Ｙ−Ｖ−■ーＤ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−Ｒ−Ｔ−Ｔ−Ｈ−Ｒ−Ｅ−Ｆ一嚢一ｍ）　Ａ− Ｈ−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｋ−Ｖ一人−Ｖ−Ｌ−Ｄ　Ｔ−Ｇ− Ｉ−”−Ｓ−Ｔ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−”−ｎ）Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ− Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｙ−Ｉ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−｝１−Ｔ−Ｄ −Ｆ一貴一ｏ）　Ｙ−Ｒ−Ｙ−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｖ−Ｙ− Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｖ−Ｅ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｐ−Ｅ−Ｆ−嚢−（表■続き）Ｎｏ＝　５０　６０ａ）＊−Ｋ−Ｖ−λ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｅ−Ｔ−Ｎ−Ｐ−Ｆ− ＊−嚢−Ｑ−Ｄ−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−｝！−Ｖ−ｂ）　＊−Ｎ−Ｖ−Ｒ− Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｅ−Ｔ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−☆−☆−Ｑ−Ｄ−Ｇ− Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ａ）　＊−Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ −Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ｓ−倫−Ｙ−Ｎ−倫一☆−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ −Ｖ−ｆ）　＊−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｅ−Ａ−☆− Ｙ−Ｎ−４一命−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｇ）　＊−Ｎ−ｖ −Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ一人−Ｇ−Ｅ−Ａ−壷−Ｙ−Ｎ−愉−’−Ｔ−Ｄ −Ｇ−’Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−｝１−Ｖ−ｈ）　壷−Ｎ−Ｉ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ− Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−壷−Ｓ−Ｔ一嚢−★−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−１｛ −Ｇ−Ｔ−１｛−Ｖ−ｉ＞　轟−ｎ−ｘ−．ｈ−ｒｓ−ｃ−λ−Ｓ−Ｆ−エーＳ −Ｓ−Ｅ−Ｐ一壷−Ｓ−Ｙ−自一命−Ｈ−Ｄ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ”Ｈ−Ｖ −ｊ）　Ｇ−Ｋ−Ｖ；Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｗ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−Ｎ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｐ− ☆−☆−★−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｃ−ｋ）　＊−＊−＊−ｔ −Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｘ−Ｔ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｓ−５−４ｋ−＊−Ｒ−Ｄ− Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｃ−１）　＊−＊−貴−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｒ−Ｖ −Ｇ−Ｙ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−４−Ｑ−Ｄ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−｝｛−Ｇ− Ｔ−｝１−Ｖ−ｍ》☆−Ｎ−１−Ｒ−Ｇ−Ｇ−ｋ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ −★−Ｓ−Ｔ−☆一嚢−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−｝１−Ｖ−ｎ）　＊ −倫−＊−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｆ−Ｌ−Ｘ−Ｎ−Ｆ一人一Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｑ−Ｄ −Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−１｛−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−ｏ）　＊−倫−嚢−Ｅ−Ｇ−Ｒ −Ａ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｘ−Ｔ−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｓ−４−★−Ｒ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ −１｛−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｃ−Ｎｏ：　７０　８０　９０ａ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−”−Ｎ−Ｎ−Ｓ−エーＧ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ −Ａ−Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−ｂ）　ｋ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−ｋ− ｋ−Ｌ−會−Ｎ−Ｎ−！；−Ｘ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−ｋ−Ｐ−Ｓ−ｋ−Ｓ−Ｌ −Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−ｃ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−工−Ａ−Ａ−Ｌ−＊−Ｎ−Ｎ−Ｓ｛ −Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−ｄ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−工−Ａ−Ａ−Ｌ−＊−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ一人− Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｘ−Ｖ−ｋ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｓ一嚢 −Ｒ−會−＊−命−命−壷−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｔ−Ｑ−Ｌ−Ｆ−Ｇ −Ｖ−Ｘ−Ｖ−１）　Ａ−Ｇ−Ｔ−１−Ｇ−Ｇ−Ｖ−倫−＊−＊−＊−＊−＊− Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｋ一人−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｖ一ｍ）　Ａ−Ｇ −Ｔ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ｌ−会−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−八−１’− Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−ｎ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−金 −４−＊−４−＊−４−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｔ−Ｓ−Ｌ−Ｆ−Ａ−Ｖ −Ｋ−Ｖ−ｏ）　Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｉ−Ｇ−５−＊−Ｒ−★−＊−＊−壷−六−Ｔ− Ｙ−Ｇ−Ｖ一人一Ｋ−）Ｃ−Ｔ−Ｑ｛−Ｆ−Ｇ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−（表■続き）Ｎｏ：　１００　：ｉ．ｌＯ　１２０ａ）　Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−｝？−Ｉ一エートＧ−１−Ｅ −Ｗ−金−Ａ一工−Ａ−”−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｄ−★一ｂ）　Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｇ− Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−５−Ｗ−］：−１−Ｎ−Ｇ−工−Ｅ−Ｗ一命−Ａ−１−人−会一Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｄ−貴一ｃ）　”Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−賢一Ｘ−１−Ｎ−Ｇ−エーＥ一讐−☆−Ａ一エーλ一一トトＭ−Ｄ−☆一ｃｌ）　Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｔ−’Ｇ−５−Ｇ−Ｑ−Ｙ−’；−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｎ−Ｇ−Ｘ−Ｅ一冒一★−Ａ−１一人一命−Ｈ一トＭ−Ｄ−嚢一ａ）　Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｓ− Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｓ−八一■ーＶ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−倫−Ａ−Ｔ−Ｑ−嚢−トＧ −Ｌ−Ｄ一壷一ｆ）　Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−■ーＶ− Ｓ−Ｇ−１−Ｅ−Ｗｊ一人−Ｔ−Ｔ−”一トＧ−Ｍ−Ｄ−”−ｇ）　Ｌ−Ｎ−Ｓ −Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−工−Ｖ−Ｓ−Ｇ−エーＥ−讐一★一人−Ｔ −Ｔ一會−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｄ一轟一ｈ）　Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｖ− Ｓ−Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−”−Ａ−Ｇ−Ｎ−”−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｈ− ”−ｉ）’　Ｌ−Ｄ−Ｒ７Ｎ−Ｇ−ｓ−Ｇ−ｓ−Ｌ−Ａ−ｓ−Ｖ−Ａ−０−Ｇ４ −Ｅ−Ｗ−檎−Ａ−工−Ｎ−倫−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｈ−轟−ｊ）　Ｌ−Ｄ−Ｎ’Ｓｉ ’−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｗ−Ｔ−八−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｇ−１−Ｔ−Ｙ−”−Ａ−Ａ− Ｄ−”−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｘ−喚−ｋ）　Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−” ；−Ｔ−Ｉ−■一人〜Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ａ−５−Ｄ−Ｘ−トトＲ−Ｎ−Ｃ− １）　Ｌ−Ｄ−Ｃ−Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−１−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｄ −Ｗ−Ｖ−命−Ｔ−會−Ｒ−Ｎ−Ｈ−Ｒ−Ｒ−Ｐ−ｍ）　Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｇ− Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ｛一八−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−☆−Ａ−Ｇ−Ｎ−”−Ｎ −Ｇ−Ｍ−Ｈ−命一ｎ）　Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｎ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｖ− Ｉ−Ａ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ｔ−Ｋ−Ｄ一人−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｎ−Ｃ−ｏ）　Ｌ −Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−τ−Ｓ−Ｇ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｖ −Ａ−トＤ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｃ−Ｎｏ＝　１３０　１４０＾》　嚢一倫一＊−＊−Ｖ−１−Ｎ−Ｍ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｓ一人 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Ｄ−Ｎ一人一Ｎ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｙ−Ｓ一★一嚢−４−ｐ−λ−Ｒ−Ｖ−Ａ−ｍ）　Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−Ｓ−Ｇ一人一貴−Ｇ−５−工 −Ｓ一嚢−★−＊−ｙ−ｐ一人−Ｒ−Ｙ一人一ｎ）Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｆ−Ｉ，−Ａ− Ｖ−Ａ−Ａ７Ｇ−Ｎ７Ｅ−Ａ．−Ｔ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｓ一會一愉−貞−ｐ −八一Ｓ−Ｅ−Ｅ−ｏ）　Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ一人−Ａ−Ｇ−Ｎ−Ｎ− Ｎ−Ａ−Ｄ−Ａ−Ｒ−Ｎ−Ｙ−Ｓ−倫−嚢一橋−Ｐ一人−Ｓ−Ｅ−Ｓ−Ｎｏ：　１８０　１９０　２００ａ）　Ｓ−Ｖ−Ｉ　−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｓ　−Ｎ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｓ −Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｖ→１−Ａ−ｂ）Ｓ−Ｔ−：［−Ａ− Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｑ−Ｒ−Ａ−ｉ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−八−Ｇ−Ｓ −Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｖ−Ｍ−Ａ−ｋ）　Ｓ−Ｖ−Ｃ−Ｔ−Ｖ−Ｇ７Ａ−Ｓ−Ｄ−Ｒ− Ｙ−Ｄ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｆ−Ｇ　 −１）Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｇ一人−Ｔ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｄ−Ａ−Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｆ −Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｃ−Ｖ−Ｄ−　Ｌ−Ｆ−Ａ−ｏ）　Ｓ−Ｉ−Ｃ−Ｔ−Ｖ −Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｄ−Ｒ−Ｙ−Ｄ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｖ −Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｆ−Ａ−（表Ｉ続き）Ｎｏ＝　２１０　２２０ａ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−工−Ｑ−５−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｎ−＊−×−森−Ｙ−Ｇ− Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−５−Ｐ−Ｈ−ｂ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−Ｉ−Ｑ− ５−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−”−Ｔ−”−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ− Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｃ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−工−Ｑ−５−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−＊− Ｔ−肴−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｄ）　Ｐ−Ｇ −Ｖ−５−Ｉ−Ｑ−５−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−★−Ｔ−★−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｎ −Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ａ）　Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−Ｖ−Ｙ−５−Ｔ− Ｙ−Ｐ−５−Ｎ−★−Ｔ−食−Ｙ−’Ｊ’−！９−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ −５−Ｐ−Ｈ−ｆ）　Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｙ’；−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｔ−Ｎ−”− Ｔ−”−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−ｓ−ｐ＋Ｈ’−ｇ）　Ｐ− Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｙ−５−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｔ−５−倫−Ｔ−壷−Ｙ−人−Ｔ−Ｌ− Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−５−Ｐ−Ｈ−ｈ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｔ− Ｙ−Ｐ−Ｇ−５−”−Ｔ−☆−Ｙ−Ａ−５−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−９−Ｍ−Ａ−Ｔ− Ｐ−Ｈ−ｋ）　Ｐ−Ｇ−Ｔ−５−Ｉ−Ｌ−５−Ｔ−Ｗ−ニーＧ−Ｇ−＊−５−★ −Ｔ−Ｒ−ｓ−ｘ−ｓ−ａ−ｒ−ｓ−ｓ−ｈ−ｒ−ｐ−Ｈ−ｉ）　Ｐ−Ｇ−Ａ− ５（−Ｐ−５−Ａ−Ｗ−Ｙ−Ｔ−５−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ −５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｍ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−５−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｇ −５−４−Ｔ−４”−Ｙ−Ａ−９−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ− ｎ）Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｄ−ニーに−５−Ｔ−Ｗ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｔ−に−ニーニーＳ−☆−★−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−５−Ｐ−Ｈ−ｏ）Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｄ−ニーＬ− ５−Ｔ−Ｗ−ニーＧ−Ｇ−５−Ｔ−Ｒ−５−工−５−☆−肴−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ− Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−Ｎｏ：　２３０　２４０　２５０ａ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−■−Ｌ−Ｓ−に−Ｈ−Ｐ−Ｎ−Ｗ−Ｔ−Ｎ −Ｔ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−５−５−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ｔ−ｂ）　ｖ−人−Ｇ−Ａ−Ａ− Ａ−Ｌ−ニーＬ−Ｓ−に−Ｈ−Ｐ−Ｔ−Ｗ−Ｔ−Ｎ−Ａ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｒ− Ｌ−Ｅ−５−Ｔ−Ａｍｃ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−λ−Ａ−Ａ−Ｌ−ニーＬ−５−に−Ｈ −Ｐ−Ｔ−Ｗ−Ｔ−Ｎ−Ａ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−５−Ｔ−Ａｍｄ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ（−Ｌ−５−に−Ｈ−Ｐ−Ｔ−Ｗ−Ｔ−Ｎ−Ａ−Ｑ −Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−９−Ｔ−Ａ−ｇ）Ｖ−Ａ−Ｇ−λ−Ａ−Ａ−Ｌ−工 −Ｌ−５−に−Ｙ−Ｐ−Ｔ−Ｌ−５−Ａ−５−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｎ−Ｒ−Ｌ−５−５ −Ｔ−Ａ−ｆ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｌ−５−に−Ｈ−Ｐ−Ｎ− Ｌ−５−Ａ−５−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｎ−Ｒ−Ｌ−５−５−Ｔ−Ａ−ｇ）　Ｖ−Ａ−Ｇ −Ａ−Ａ−八−Ｌ−ニーＬ−５−に−Ｈ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−５−Ａｍ５−Ｑ−Ｖ−Ｒ −Ｎ−Ｒ−Ｌ−５−５−Ｔ−Ａ−ｈ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｖ−に− Ｑ−Ｘ−Ｎ−Ｐ−５−Ｗ−５−Ｎ−Ｖ−Ｑ−ニーＲ−Ｎ−Ｈ−Ｌ−Ｘ−Ｎ−Ｔ− Ａ−１）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｖ−に−５−Ｒ−Ｙ−Ｐ−５７Ｙ−Ｔ −Ｎ−Ｎ−Ｑ（−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｔ−Ａ−ｊ）Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｖ−へ− Ｇ−Ｌ−Ｌ−人−５−Ｑ−Ｇ−Ｒ−５−★−★−Ａ−５−Ｎ−ニーＲ−Ａ−Ａ− Ｉ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−ｋ）　Ｖ−Ａ、−Ｇ−Ｌ−人−Ａ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｔ−Ｌ− Ｇ−に−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−５−Ａ−Ｃ−Ｒ−嚢−Ｙ−Ｉ−Ａ−Ｄ−Ｔ−Ａ−１）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｐ−５−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ａ −５−Ｖ−Ａ−５−Ａ−Ｉ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ａ−ｍ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ− Ｌ−Ｖ−に−Ｑ−に−Ｎ−Ｐ−５−Ｗ−５−Ｎ−Ｖ−Ｑ−１−Ｒ−Ｎ−Ｈ−Ｌ− に−Ｎ−Ｔ−Ａ−ｎ）　Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｑ −に−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−肴−Ｃ−Ｄ−倫−Ｙ−Ｍ−Ｖ−Ｅ−に−Ｇ−ｏ）　Ｖ− Ａ−Ｇ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｔ−Ｌ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｔ−Ａ−５−Ｎ−Ａ− Ｃ−Ｒ−會−Ｙ−Ｘ−Ａ−Ｑ−Ｔ−Ａ−（表Ｉ続き）Ｎｏ＝　２６０　２７０　２７５ｃ）　Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−５−Ｆ−Ｙ−Ｙ−＊−Ｇ−に−Ｇ−Ｌ−Ｉ−Ｎ−Ｖ −Ｑ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｑｄ）　Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｇ−５−Ｓ−Ｆ−Ｙ−Ｙ−＊−Ｇ−、に−Ｇ−Ｌ−Ｉ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｑｅ）　Ｔ−Ｎ−Ｌ−Ｇ−Ｄ−Ｓ− Ｆ−Ｙ−Ｙ−★−Ｇ−に−Ｇ−Ｌ−エートＶ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｑｆ）Ｔ−Ｙ− Ｌ−Ｇ−８−Ｓ−Ｆ−Ｙ−Ｙ−★−Ｇ−に−Ｇ−Ｌ−工−Ｎ−Ｖ−Ｅ−へ−Ａ− Ａ−Ｑｇ）　Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−５−Ｆ−Ｙ−Ｙ−肴−Ｇ−に−Ｇ−Ｌ−ニーＮ−Ｖ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｑｈ）　Ｔ−ｓ−ｒ＝−Ｇ−ｓ：Ｔ−Ｎ−Ｌ−ｙ−貴 −ｃ−ｓ−ｃ−ｒ＝−Ｖ−ｈ−八−＝−八−ｈ−ｒ−Ｒｉ）　Ｔ”−Ｙ−Ｌ−Ｇ −５−Ｐ−５−Ｌ−Ｙ−＊−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｖ−）！−Ａ−Ｇ−Ｒ−八−Ｔ− Ｑｊ）へＤ−に−Ｉ−５−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｗ−Ａ−に−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｎ− Ａ−Ｙ−に−Ａ−Ｖ−Ｑ−Ｙｋ）　Ｎ−に−Ｇ−Ｄ−Ｌ−５−Ｎ−工−Ｐ−Ｆ− Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｎ−Ｙ＝Ｑ−Ａ　。ｎ）　Ｌ−に−Ｄ−Ｖ−ニーＱ−５−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｎ−Ｖ−Ｌ−■ −Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−５−Ａｏ）　Ｎ−Ｑ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−５−Ｎ−■−５−Ｆ −Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｑ−Ｇ区１し１隆」」ｄ１朋本明細書の以下の部分においては添付の図面を参照し本発明をより詳細に説明する。図１はプラスミドｐＳＸ８８の構築を示す図であり、図２はプラスミドｐＳＸ８８の制限マツプを示す図であり、図３は、本発明の酵素を発現する突然変異ズブチリシン３０９遺伝子の構築の例を示す図であり、図４はプラスミドｐＳＸ９２の制限マツプを示す図であり、図５は、本発明の突然変異酵素の最高の効能を示すｐＨと推定ｐｒとの関係を示すグラフである。見Ｗれるズブチリシン酵素の遺伝子を突然変異させることにより、アミノ酸配列を変化させた突然変異ズブチリシンに保菌類によって産生されるセリンプロテアーゼと定義される。本発明の多数の実施Ｒ様に適用可能であるズブチリシンはより狭義には、ダラム陽性菌のセリンプロテアーゼを意味する。別の定義に従えばズブチリシンは、触媒三組体におけるアミン酸残基の相対順序がＡｓｐ　−Ｈｉｓ　−５ｅｒ（位置３２．６４及び２２１）であるセリンプロテアーゼである。またより特定的な意味では、本発明の多くの実施Ｂ様は、上記表１に列挙したズブチリシンとその一次構造において実質的に明らかに類似になり得るダラム陽性菌のセリンプロテアーゼに係わる。多数の他の公知のズブチリシンのアミノ酸配列と並べて上記表■に示したズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に基づく番号体系を使用し、ズブチリシン酵素中のアミノ酸残基の位置を明確に示すことが可能である。ズブチリシン酵素中’中のアミノ酸残基番号１の前の位置には負の番号が割当てられており、例えばｔｈｅｒｍｉｔａｓｅにおけるＮ末端Ｙに対して−６が、プロテイナーゼＫにおけるＮ末端Ａに対しては０が割当てられる。ズブチリシンＢＰＮ’に対しては挿入部であるアミノ酸残基は、ズブチリシンＢＰＮ’の番号に英字をアルファベット順に添えた番号を付しており、例えばプロテイナーゼにの”　Ｓｅｒと１コＴｈｒの間では“挿入″５−Ｔ−５−Ｐ−Ｇに対しては１２ａ、１２ｂ、ｉ２ｃ、１２ｄ、１２ｅとなっている。上述の番号体系を使用すると問題の位置は以下の通りである。１，２．：ｌ、４，６，９．　１０，１２．　１＜、　１５．　１７．　１０．　１．９．２０．２１、２２，２４゜２５、２７．３Ｇ、　’３７．１Ｂ、　４０．４１．４］、　４４．４５．４Ｇ、　４９．５０．５１．５２゜５コ、５４．　５５．　５６．　５７．　５８．　５９．６０．　６１．　６２．　７５．　７６、　７７、　７Ｂ、７９゜８７、　ｓｑ、　ｑｌ、　９４．９Ｂ、　９９．　ｘｏ６．１０４．１０３．１０４．１０５．１０６．１０７．１０８゜洗濯条件下で基質が酵素のものとは反対の静電電荷を有すると仮定すると、酵素の実効静電電荷ＮＥＣを増大することにより酵素の基質への吸着、従って洗濯効能が向上するであろうことが予想される。しかしながら驚くべきことには、かかる環境における酵素のＮＥＣの低下が酵素の洗濯効能の向上をもたら１．得ることが判−）な。換言すれば、酵素の等電点１１１ｏをｐＨをより低くする方向に変化させると、酵素の最適な洗濯効能のｐｕもより低い値に変位する。このことは、酵素が低ｐＨの洗濯液中で活性となるように酵素を設計するために、より低いｐｌ。を有する突然変異酵素を得るように公知のズブチリシン酵素に対する遺伝子を突然変異させることにより、公知のズブチリシン酵素の洗濯効能を向上することができることを意味するという４＋′ＩＱが傷ちれた− この知見から、この反対のことら可能であることを示す実験も行なった。酵素の洗濯効能の最適ｐＨ値をより高いｐＨ値に変位させるようにそのｐｌｏをより高い値に変位させることにより、公知のズブチリシン酵素を高ｐＨ洗剤中に使用するように設計し得ることを意味する。従って本発明は１つには、同じｐｌｌにおいて親プロテアーゼと比較して実効靜を電荷が変更されており、そのプロテアーゼにおいて、位置１、２．３．４．６．９．１０．１２．１４．１５．１？、　ｉ８．１９．２０．２１．２２．２４゜２５、　２７．　３６．　３７．　３Ｂ、４０．　４１．　４３．　４４．　４５．　４６．　４９．　５０．　５１．　５２゜５３、５４．５５．５６．５７．５８．５９．６０．６１．６２．７５．７６、７７、７Ｂ、　７９゜８７、８９．９１．９４．９Ｂ、　９９．１００．１０１．１０３．１０４．１０５．１０６．１０７．１０ＥＩ。１０９、１１２．１１３，１１５．１１６．１１７．１１８．１２０．１２６．１２８．１２９．１：１０゜ユ３１．　”１３３．　．１３４．　１：１６．　１３７．　１４０．　１４１．　１４３．　１４４．　１４５．　１４６．　１５５゜１５６、　１５８．　１５９．　１６０．　１６１．　ユ６礼　’：ｈ６：ｌ、１６４．　１６５．　１６６、　１６７、　１７０゜１７１、１７２．１７３．１８１．　：Ｌ８２．１８：ｌ、　１１８４．１８５．１８６．１８８．１８９．１９１゜：Ｌ９２．　１９４．　１９５．　１９７．　２０４．　２０６．　２０９．　２１０．　２１１．　２１２．　２１：ｌ、２１４゜２１５、　２１６．　２１７．　２１８．　２３５．　２３６．　２コア、２３８．　２３９．　２４０．　２４１．　２４２゜２４３、２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１．２５２．２５３．２５４．２５５．２５６゜２５７、２５９．２６０．２６１．２６２．２６］、　２６５．２６９．２７１．２７２．２７５．９７゜のうちの任意の］つ以上の位置にあるアミノ酸残基のなかて゛親プロテアーゼと比較１−でより少数のもしくはより多数の正に荷電されたアミノＲ残基及び／またはより多数のもしくは上り少数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在するか２またはより多数のもしくはより少数の正に荷電されたアミノ酸残基及び／またはより少数のもしくはより多数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在し、それによってズブチリシンブ１″１テアーゼが親７０テアーゼよりもそれぞれより低いまたはより高い等電点ｐＨ（ｐｉ−）を有する突然変異ズブチリシンプロテアーゼに係わる。好ましい実施態様においては本発明は、同じｐＨにおいて親プロテア・−ゼと比較してＮＥＣが変更されており、そのプロテアーゼにおいて、位置。：ｌ、２．　３．　４．　ユ４．　Ｘ５．　１７．　１Ｂ、２０．　２フ、４０．　４１．　４３．　４４．　４５．　４６゜５１、５２．６０．６１．６２．７５．７６、７Ｂ、　７９．９１．９４．１００．１０５．１０６．１０８゜コ１２．　１１３．　１１７．　１１８．　１２９．　１３０．　１３３．　１３４．　１３６．　１３７．　：１４１．　１４３゜：Ｌ４４．１４５．１４６．１６５．１７３．１８１．１８３．１８４．　）８５．１９１．１９２．２０６゜２０９、２１０．２１１．２１２．２１６．２３９．２４０．２４２．２４３．２４４．２４５．２４７゜２４８、２４９．２５１．２５２．２５３．２５５．２５６．２５７．２５９．２６３．２６９．２７１゜２７２゜のうちの任意の１つ以」二の位置にあるアミノ酸残基のなかで親プロテアーゼと比較してより少数のもしくはより多数の正に荷電されたアミツノＭ残基及び／またはより多数のもしくはより少数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在し、または、より多数のもしくはより少数の正に荷電されたアミ７／酸残基及び／またはより少数のもしくはより多数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在し、それによってズブチリシンプロテアーゼが親プロテアーゼよりもそれぞれより低いまたはより高い等電点ｐＨ（ｐｌ。）を有する突然変異ズブチリクンプロプアーゼに係わる。別の好まＬ７い実施態様においては本発明は、同じｐｉ（において親プロテアーゼと比較して実効Ｗ？電電荷が変更されており、そのプロテアーゼにおいて、位！＝のうちの任意の１つ以上の位１にあるアミノ酸残基のなかで親プロテアーゼと比較してより少数のもしくはより多数の正に荷電されたアミノＲ残基及び／またはより多数のもしくはより少数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在するか２または、より多数のもしくはより少数の正に荷電されたアミノ酸残本及び／またはより少数のらしくけより多数の負に荷電されたアミノ酸残基が存在［１、更に位置：：！、ｒ　２ｒ　３４　４ｔ　（９＊　ＩＪ　１２．　Ｎ４ｒ　Ｘ５□　１７．　１Ｂ、：Ｌ９．　２０．　２１．　２２．　ン４．２５、２７．　：３６．３７．３Ｂ、　４０．４１．４３．４４．４５．４６．４９．５０．５１．５２゜５：１．５４．５５．５６．、５７．５Ｂ、　５９．６０．６１．６２．７５．７６、７７、７Ｂ、　７９゜８７、８９．９１．９４．９Ｂ、　９９．１００．１０１．１０３．１０４．１０５．　：ＬＯ６，１０７，１０８゜１０９、１１２．１１３．　ｌ：Ｌ５．１１６．１１７．１１８．　＞２０．１２６．１２８．１２９．１３０゜１３１、　１３３．　ｌコ４．　１３６．　１３７．　１４０．　１４１．　１４３．　１４４．　１４５．　１４６．　１５５゜１５６、１５８．１５９．１６０．　：１６１．１６２．１６ｍ１．１６４．１６５．１６６、１６７、１７０゜：Ｌ７１．１７２．１７３．１８１．、１Ｂ２．　ＬＥＤ、　１８４．１８５．１８６．１８８．１８９．１９１゜１９２、　１９４．　１９５．　１９７．　２０４．　２０６．　２０９．　２１０．　２１１．　２１２．　２１３．　２１４゜２１５、２１６．２１７．２１８．２３５．２３６．２３７．２３８．２３９．２４０．２４１．２４２゜２４３、２４４．２４５．２４７．２４８．２４９．２５１．２５２．２５３．２５４．２５５．２５６゜２５７、２５９．２６０．２６１．２６２．２６３．２６５．２６９．２刀、Ｈ２７２，２７５）　９７−からなる群から構成される装置を占有しているアミ５ノ酸残基に影響する少なくとら】−［）の更なる突然変異とが存在し、それによ・ってズブチリシンプロテアーゼが親プロテアーゼよりもそれぞれより低いまたはより高い等電点ｐＨ（ｐｌ。）を有する突然変異ズブチリシンプロプアーゼに係わる。上述のことを要約すると本発明は、突然変異プロテアーゼのｐｌ。が親プロテアーゼのｐｌ５よりも低く、最適な＆濯効能に対するｐＨ値も親プロテアーゼに最適な、Ｈ値よりも低い突然変異プロテアーゼ、または、突然変異プロテアーゼのｐｌＧが親プロテアーゼのｐｌｏよりも高く、最適な洗濯効能に対する９Ｈも親グロテアーゼに最適なｐＨ値よりも高い突然変異プロプアーゼに係わる。一般的には速度論的特性は、酵素の活性部位近傍の静電表面電荷１′７）　９　、（ヒ１−　＠、１　ｇ　；れ９５Ｚ））　宍えＬｈているが（Ｔｈｏｍａｓ、Ｒｕ５ｓｅｌｌ及びＦｅｒｓｈＬ　、止揚）、贅くべきことには、活性部位から離れた表面電荷を変えることにより酵素の速度論的特性の変化もまたもたらされ得ることが判った６従って本発明は、突然変異プロテアーゼを使用しようとする洗濯液のｐ）ｌにできるだけ近いべきである酵素の最適な洗濯効能に対してｐＨ値を変位しようとするのと同じ方向に等電点（＝ｐｌｏ）が変位されている突然変異プロプアーゼを与えるように、酵素の触媒三組体から１５Å以上の距離にある１一つ以上のアミノ酸残基がその親酵素のアミノ酸配列と比較して変更されている突然変異ズブチリシン酵素を含む。本発明の幾つかの実施Ｒ様によれば、突然変異プロテアーゼのアミノ酸配列が位Ｎ３６における挿入突然変異を含む、例えば負に荷電されたアミノ酸残基（例えばＤまたはＥ）。中性の極性残基（例えばＡ−ＱまたはＮ）または正のアミノプロテアーゼと、それらを含有する洗剤組成物とに係わる。これは特に、例えばズブチリシンプロテアーゼ３０９及び１４７及びＰＨ１０に適用可能であり、当然のことブチリシンＢＰＮ’の配列に対して位置３６のアミ、ノ酸残基が欠失しているという類似性を示す任意の他の配列にも適用可能である。位［３６における挿入突然変位は更に、例えば位置１２０．１７０．１９５．２３５及び／もしくは２５１の１力所以上、並びに／または位置７６に突然変異を有することもできる。位置）６における適当な突然変異は例えばＮ７８ＤまたはＮ７６Ｅのような負に荷電された残基である。位［３６における突然変位（特に負または極性中性の残基の挿入）と位置７６における突然変異（負に荷電された残基によるＭ換）どはしばしば突然変異プロテアーゼにおける安定効果をもたらし得、組合わせて使用することもできる。例えば位ＩＦ１２０．１７０．１９５．２３５及び２５１ｆ７）　１力所以上における突然変異は、酵素活性の増大を伴なうことが見い出された。これら後者の突然変異が個々には安定性の損失を伴なう場合でさえも、それらを位置３６及び７６の一方または両方における突然変異と組合わせることが容認可能であり有効でもあり得る。かかるプロテアーゼの突然変異体の有効な例としては以下の突然変異を有するものを挙げることができる：Ｓ−０２１）　☆３６ＤＳ、０２２）　＊３６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ’１９５Ｅ＋に２５１ＥＳ−０２３）　＊：１６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３ＳＬＳ−０２４）＊］６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒコア０Ｙ＋Ｇ：Ｌ９５Ｅ＋）Ｃ２：１５Ｌ＋に２５１ＥＳ−０２５）　懺３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５ＬＳ−２：１５）　六コロＤ＋Ｎ７６ＤＳ−０：１５）　＊’３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ：Ｌ２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５した突然変異プロテアーゼにおいて、分子中の別の箇所に正の電荷をアミノ酸残基を挿入するために追加の突然変異を設けることが有利となり得る。このことにより、例えば追加突然変異が正の電荷、例えば位Ｗ２１３で正に荷電された残基（例えば７２１３Ｋ）を与える場合には、得られた突然変異プロテアーゼの水溶性を増大し得る。本発明において突然変異ズブチリシン酵素は、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシンａ＋５ｙｌａｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ、ズブチリシン１６８、ズブチリシンｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７、ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ、Ｂａ’ｃｉｌｔｕｓ　ＰＢ９２プロテアーゼ及びプロテアーゼＫ、好まし、くけズブチリシン３０９、ズブチリミ／　：・ｉ　４７、ズブヂリーｓ　：；ＣａｒｌｓｂｅｒＨ２ａｑｕａｌｙｓｉｎ、　Ｂａｅｉｌｌｕ９　ＰＢ９２グＩ−ノーゲーアーゼ、−７゛Ｙフテアー４″ＴＷ７またはフ゛Ｌアテアービｌ′−３か＾゛７７選択る印酵素、ブ）突ｐ；′ざ：′賃を呈−は−ろのか特（こ好ま（，２雪、）。更に好ｆＬい−（繞も櫟は、　ｊ、ｉ下Ｊ）突然変異の１っｉ２Ｊ、ト、を禽むズブ升すシニ・酵素からなるＲ１．ＯＦ、　Ｒ１０Ｌ、　Ｒ：ＬＯ１１Ｒ４５Ａ＋Ｅ８９Ｓ→Ｌ１３６Ω＋Ｒ】４５八÷０１８：ＬＮ＋Ｒ’１１３６Ｐ＋Ｅ２ノＩＱ。Ｒ１０Ｆ＋Ｒ１，，９Ｑ”Ｅ８９Ｓ　十Ｆ−’ｉ、：１６Ｑ”Ｒ１４５Ａ＋Ｄ１．８１ＦＪ＋Ｅ２７１Ｑ＋Ｒ２７’５Ｑｒ　Ｑ　１２に、　`１２Ｒ。Ａ１２！（＋ｐ１１）＋Ｔ２２に一１Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅす！７ｉｓＤ十八りＢＲイ５９９Ｄイ５１５６Ｅ＋Ａ１５１ｑトＡ］、７２Ｄ→・Ｎ１７３に＋Ｔ２１．３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ÷、嬶！５６に＋Ｓ２５りＤ＋Ａ２７２Ｒ，Ａ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｎ４３Ｒ{ Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋ｓ）、５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋ｌｕ７フに＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８０１Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋入２７２Ｒ，Ａ１２に＋Ｐ］、４Ｄ４．Ｔ２２に＋Ｔ１ＢＫ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９ｒ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ４Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５１１１Ｒ＋Ａ１．７２Ｄ＋Ｎ１フ３に＋Ｔ２１：ｌＲ＋Ｎ２４８Ｄ＋−１２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９＋Ａ２７２Ｒ，０１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ１８Ｒ＋Ｎ４’３Ｒ＋Ｑ’）９Ｅ＋Ｎ’７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５１５６Ｅ＋八１．５ＢＲ（八１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ａ１２に＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２に＋ＴＩ８に＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ’７６Ｄ十八９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎｉ４０Ｄ→Ｓ１４コＲ＋５１５６Ｅ十八］、　５８　Ｒ十人１７２Ｄ＋Ｎ１．７３に＋Ｔ２１ ’ｌＲ＋Ｎ２４８ｒ）＋Ｔ２５５］ＪＳ２５６に＋５２５９Ｄ４Ａ２７QＲ。Ａ１２Ｒ＋Ｐ１４［）＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ：３８Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ十Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ〕、２０Ｄ＋Ｎ１４ｏｏ＋’Ｅ１４１Ｒ＋Ｓ：１５６Ｅ＋Ａ］、５１３Ｒ＋Ａ１’７２Ｄ＋Ｎ１７’ｌＫ＋Ｔ２１３Ｒ＋ド２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５XＤ＋Ａ２７２Ｒ，Ｒ１４ｉ）、　Ｒ１４に、　Ｒ１４に＋★３６Ｄ、　Ｒ１４に＋ｔＪ２１ＲＤ、　Ｐ］、４に＋Ｐ１２９Ｄ、　Ａ１５Ｋ。Ａ１５Ｒ，Ｒ１９Ｑ、Ｔ２２に、Ｔ２２Ｒ，Ｋ２’）！ｌ（、Ｋ２７＼’、ｒ）］２’、”１６Ｄ、”２６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＊Ｇ１．９５Ｅ＋に２５１Ｅ、　ｋ１６Ｄ＋）！１：＞ｎｐ−ｐＦｊＯＹ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ、”１６ｒ）＋Ｈｉ２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ十Ｇ１９５Ｅ４−に２：１５Ｌ＋に２５１Ｅ、”１６Ｄ（Ｎ１２０Ｄ＋ら］、９５Ｅ４−に２：１５＋−、Ｔ１８に、Ｔ］Ｒ丸　Ｄ４’ｉＥ。Ｎ４３Ｒ，Ｎ４３に、Ｒ４５Ａ、Ｅ５〕ｎ、Ｅ５１に、Ｅ５）Ｇ＋に２コＳＬ、Ｅ５４Ｇ、Ｅ５４Ｙ、Ｑ’ｉ９Ｅ。Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋５１５６Ｅ十八１５８Ｒ十八ｌｌＤ＋Ｎ１７］Ｋ＋Ｔ２’１３Ｒ＋Ｎ２４ａＤ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ、Ｄ６ＯＮ、　Ｎ７６Ｄ、　Ｅ８９Ｓ、　Ｅ８９Ｓ＋に２５１Ｎ、　Ｙ９１Ｆ。Ｋ９４Ｒ，Ｇ９７ｒｌ、　Ｇ９７Ｄ＋Ｈ１２０に、　Ａ９８に、　Ａ９ＢＲ，５９９０，５９９Ｄ＋Ｎ１４０に、　Ｅｌ１２Ｔ。Ｎ１２０に、１（１，２０Ｄ、Ｈ１２Ｏｒ）＋に２３５Ｌ、Ｈｌ、２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ４−に２：１５Ｌ、、Ｎ１２０Ｄ＋Ｒ’１７０Ｙ＋Ｇｉ９こＥ林２３５Ｌ、Ｎ１２０．Ｉ）＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ）−χ２１’３５Ｌ＋に２５１Ｅ、Ｐ）２９Ｄ、Ｅｌ４６Ｑ。 ε１３６町　Ｅ］、３６Ｒ，Ｅｌ：１６ＱＪ、ＲＩＯＬ、Ｎ１４０Ｄ、８１４０に、［１４０Ｒ，５１４１に、５１４１転Ｒ１４５Ａ、　Ｓ］、Ｓ６Ｅ、　Ｓ）、５６Ｅ十八】５８Ｒ十入１７２Ｄ＋５ｉ７３に、　５１５６Ｅ＋　Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｈ：１７３Ｋ＜Ｔ２】ＩＲ，５１５６Ｅ＋Ａ］−５８Ｒ４八１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋Ｔ１．］Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ４−人２７２Ｒ，Ａ１．５８Ｒ，Ａ１５ＢＫ、Ｙ］、６’７Ｖ、Ｒ１７０Ｙ、Ｒ１，７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ。Ｒ１７０Ｙ＋に２５１１．、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ’ｌＱ５′Ｆ、十に２５１Ｅ、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ］、９５Ｅ＋に２３５Ｌ、　Ｙ１７１Ｅ。Ｙ〕７】丁、Ａ１７２Ｄ、Ｎ１７コに、Ｄ：Ｌ８１．Ｎ、Ｎ１８４に、Ｎ１８４Ｒ，Ｎ：Ｌ８５Ｄ、ＲＩＥ１６Ｐ、Ｙ１９２Ｖ。Ｙ　］、　９２ν、八、Ｇ］９５Ｅ、Ｇ１９５Ｄ、Ｇ１９５Ｅ４−Ｔ２１：ＩＲ，Ｇ１９５Ｅ＋に２５］、Ｅ、Ｇ）、９５Ｅ−ｉ−に２］Ｓk。Ｄ１９７Ｎ、Ｄ１９７に、Ｄ１９’７Ｅ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｅ、Ｙ２Ｏ９１，、Ｔ２：Ｌ］Ｒ，Ｔ２１：３に、Ｙ２１４Ｔ。Ｙ２’１．４Ｓ、Ｎ２：Ｌ８Ｄ、Ｎ２ｘｓｓ、Ｋ′）：１５Ｌ、Ｋ２：１５Ｒ，Ｋ２：１７町　リ２４：ｌＹ、Ｌ、誓２４１Ｙ＋Ｈ２４９ＲB Ｗ２４１Ｌ＋Ｈ２４９Ｒ，Ｎ２４８Ｄ、　Ｎ２４９Ｒ，Ｋ２５１Ｒ，Ｋ２５１Ｅ、　Ｋ２５１Ｎ、　Ｔ２５５Ｅ、　５２５６Ｒ。５２５６に’、　５２５９Ｌ、　Ｓ２Ｓ’９’Ｄ、　Ｙ２６３Ｗ、　５２６５に、　５２６５Ｒ，Ｅ２７１Ｑ、　Ｅ２７１すＥ２’７’ＬＧ{ に２７Ｖ、Ｅ２７１．Ｑ、Ｇ、Ａ２７２Ｒ，Ａ２７２Ｒ，Ｒ２７５Ｑ。Ｄ１４に、Ｄ１４に＋Ｄ１２０に、Ｄ１４に＋Ｄ１２ＯＫ＋Ｄ：１４０に、Ｄ１４に＋Ｄ１２０に＋Ｄ’１４０に＋Ｄ１７２Ｋ。Ｋ２７０．　Ｋ２７Ｄ＋０１２０に、Ｅ５４Ｔ、Ｅ５４Ｙ、Ｎ９７Ｄ、Ｎ９７Ｄ＋５９８Ｄ、Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２］、３Ｄ。５９８Ｄ、５９８Ｄ＋Ｔ２１：３Ｄ、Ｄ：Ｌ２ＯＫ、Ｄ】、４０に、５１５６Ｅ、Ｄｌ’７２に、Ｔ２Ｌ３Ｄ、Ｎ２：Ｌ８Ｄ。更に特に好ましい実施Ｆ！！様は、以下の突然変異の１つ以上を含む突然変異ズブチリシ〉′グロテアーゼである：５００１）　Ｇ］、９５Ｅ５００２）　Ｇ１９５Ｄ５００３）　Ｒ１７０ＹＳＯＯリ　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５ＥＳＯＯ５）　Ｋ２５１Ｅ５００６）　Ｎ１２０Ｄ５００８）　Ｎ１２０Ｄ＋Ｇ１９５ＥＳ００９）　Ｔ７１ＤＳ０１０１　Ｔ７１Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ５０１１）　Ｒ１７０Ｙ＋に２５’１Ｅｓｏ１２）　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１ＥＳＱＬ’））　Ｔ７’ｌＤ＋Ｒ１７０Ｙ＋に２５１ＥＳ０１４）　Ｔ７１Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１ＥＳ（１１５）　Ｋ２：１５Ｌ５０１６）　Ｈｌ、２０Ｄ＋に２］５ＬＳ０１７）　Ｎ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５Ｌ５０１８１　Ｇ１９５Ｅ＋に２５１Ｅｓｏ１９　）　Ｎ１２０Ｄ＋Ｒ１’７０Ｙ＋（ｄ９５Ｅ＋に２］５ＬＳ０２０）　Ｎ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｉ、＋に２５１Ｅ５０２１）　＊コロＤＳ０２２）　＊：１６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１Ｅ５０２３）　倫コロＤ＋Ｈ１２０Ｄ４−Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ′Ｊ９５Ｅ＋に２３５Ｌ５０２４）　” ′３６Ｄ＋Ｈ１，２０Ｄ＋Ｒ１７ｏｙ＋ｃ１９５Ｅ＋に２：１５Ｌ＋に２５１？：５０２５）　＊：１６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ’１９５Ｅ＋に２］５ＬＳｎ２６）　Ｅ１３６Ｒ５０２７）　Ｅ８９５５０２８）　０１８１ＮＳ０２９）　Ｅ８９Ｓ＋Ｅｌ：１６Ｒ５Ｏ’３０）　Ｅ８９Ｓ＋０１８’１ＮＳＯ：ｌ’ｌ）　Ｄ１９７Ｎ＋Ｅ２７１ＱＳＯコ２）　０１９７Ｎ５０３３）　Ｅ２７１Ｑ５０３５；　＊３６Ｄ４−Ｎ）６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５ＬＳ０４１）　Ｇ１９５Ｆ５２０１）　Ｎ７６ＤＳ２０２）　Ｎ７６Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ５２０３）　Ｎ７６Ｄ＋Ｒ’１７０Ｙ＋ＧＬ９５ＥＳ２０４）　Ｈ：Ｌ２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｌ＋に２５’ｉＥ＄２２：ｌ）　Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｔ２１］Ｋ＋に２：１５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ＄２２４）　Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ］、４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋に２：３５Ｌ＋Ｎ、２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ９２２５）　”：３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８　Ｒ＋Ｓ　９９　Ｄ＋ＲＬ７０　ｙｅｓ　１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋１７２Ｄ＋Ｎ’ １７：ｌＲ＋に２：１５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋　Ａ２７２Ｒ５２２６）　★３６ＱＳ２２７）　＊３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ：Ｌ９５Ｅ＋に２：１５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ４−　八２７７ｑＳ２２８　）　＊３６Ｄ＋Ｑ５９　Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９　Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ　１４１Ｒ４５１５６Ｅ＋Ａ、１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋に２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２９）　Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４００４５１４１Ｊｔ＋５１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３に＋に２’ ：１５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ十八２７２Ｒ５２］４）　Ｑ２０６Ｄ５２３５）　嚢コロＤ＋Ｎ７６Ｄ５２４２）　壷］６Ｑ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２）５ＬＣｏｏｌ）　Ｄ１４ＫＣＯＯ２）　Ｄ１２０ＫＣ００３）　Ｄ’１４ＱＫＣＯＯ４）　Ｄ１ＪＫ＋０Ｌ２０に０００５）　Ｋ２７ＤＣＯＯ６）　Ｋ２７Ｄ＋０１２０ＫＣＯＯ８）　ｍ７２ＫＣＯＯ９）　Ｄ１４に＋Ｄ１２０に＋Ｄ１４０ＫＣｏ１ｙ）　Ｄ１４に＋［）１２０に＋Ｄ１４０に＋０１７２ＫＣＯ１３）　Ｎ９７ＤＣＯ１４）　５９ＢＤＣＯ１５）　Ｔ２１３ＤＣＯ１７）　５１５６ＥＣＯ１，８）　Ｎ９７Ｄ＋５９８ＤＣＯ１９）　Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２’１ｌＤＣ０２２）　５９８Ｄ＋Ｔ２１３ＤＣＯ２８）　Ｎ２１８ＤＣ１００）　Ｖ５１ＤＣＩＯＩＩ　Ｅ５４Ｔ酵素中のアミノ酸に対して欠失、置換または挿入されるべき位置及びアミノ酸を決定または選択する方法に利用し、従って、得られた突然変異酵素における推定実効靜＠電宵（＝　ＮＥＣ）が、選択された粗酵素において同じ９１１値で計算されるＮＥＣと比較して変更されているように選択を実施する方法に係わる。本発明に念まれるこの原理を発現する別の方法は、粗解素中のアミ７ノ酸において欠失、置換または挿入されるべき位置及びアミノ酸を、得られる突然変異酵素における電荷の総数または比電荷含有！（＝ＴＣＣ）及び／またはＮＥＣが、突然変異プロテアーゼは使用しようとする洗濯液のｐＨにできる限り近いべきである酵素の最適洗濯効能に対するｐＨを変位しようとするのと同じ方向に変位された等電点（−ｐｌｏ＞を有する突然変異プロテアーゼを与えるように変更されるように選択される。前述したように、酵素のような巨大分子のｐｒｏは、分子のＮＥＣがゼロとなるときのｏｎとして計算される。その方法は後述の実施例中に例Ｐ示すが、いまここでその原理をより詳細に記載する。ｐＫ値は、場合によって荷電される各アミノ酸残基に割当てられる。従って所与の９１１において荷電状態または非荷電状態のアミノ酸残基の存在比（荷電〆非荷電、　Ｃ／口（ｉ））を、負及び正・ブ）荷電の両ゴデに対（てそれぞれ−４：（ｊθ）及び＜７Ｈ）を使用して計算する：Ｃ／［１（ｉ）＝ｅｘｐ（Ｉｎ＋ｏ（ｐＨ−ｐＫ、））　（負の荷電＞　（Ｉａ）Ｃ／口（ｉ）＝　ｃｘｐ（ｌｒ＋＋ｏ（ｐＫ＋　＝ｐＨ））　（正の荷電）　（Ｉｂ）式（（ａ）及び＜Ｉｂ）から、ｐＫｉに等しいｐ＋＋においてはＣ／１１（ｉ）が１であることは明らかである。次いで相対電荷Ｑｒ（ｉ）または各荷電残基に割り当てられる電荷供与値は式（Ｉ　Ｉａ）及び（Ｉｌｂ）を使用して計算される。Ｑｒ（ｉ）−Ｃ／Ｌｌ（ｉ）／（１＋　Ｃ／Ｌｌ（ｉ）＞　（負の電荷）　（Ｉｌａ）Ｑｒ（ｉ）＝　−Ｃ／口（ｉ）／（１＋Ｃ／Ｌｌ（ｉ＞）　（正の電荷）　（Ｉｌｂ）。荷電残基かへの全ての電荷供与値の和がゼロであるｐＨ値は、十分に密なｐ＋＋ −電荷加算衣において反復法または内挿法により見い出される。又ｆじ１尺１余４ΔＬ！ｕｆｆ冒唱１或〕本発明は更に、本発明の突然変異酵素を洗浄及び洗剤組成物中に使用することと、突然変異ズブチリシン酵素を含有するかかる組成物とを含む。このような組成物は、本発明の前記内容に従う突然変異ズブチリシン酵素の任意の１種またはそれ以上を単独でまたは組合せで含む上に、当業者には公知のかかる組成物に含まれる通常の成分を任意に含有する。このような成分としては、ビルダー（例えばリン酸塩またはゼロライトビルダー）、界面活性剤（例えばアニオン（＋Ｖ、カチオイ＋ｖｔ、たは非イオン（世界面活性剤）、ポリマー（アクｐＨＦＩ整用のアルカリまたは酸、保湿剤、及び中性無機塩を挙げることができる。幾つかの有効な実施態様においては洗剤組成物は以下のように調製することができる。ａ）　リン酸塩ビルグー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル系または等価のポリマー、過ホウ酸塩漂白剤前駆体、アミノ３有漂白剤活性化物質、シリケートまたは他の構造形成体、用途に所望のｐｌ＋に調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として調製された洗剤組成物。ｂ）　ゼオライトビルダー２アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル系または等価のポリマー、過ホウ酸塩漂白剤前駆体、アミノ含有漂白剤活性化物質、シリケートまたは他の構造形成体、用途に所望のｐＨに調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として調製された洗剤組成物。Ｃ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保に調整された洗剤水溶液として調製された洗剤組成物。ｄ）実質的に直鎖状アルコキシル化第−級アルコールからなる非イオン性液体界面活性剤、トリアセチン、三リン酸ナトリウム、カセイアルカリ、過ホウ酸−水和物漂白剤〜１０の値に調整された非水性洗剤液として調製された洗剤組成物。ｅ）アニオン性及び非イオン性界面活性剤（例えばアニオン性界面活性剤とアルコキシル化の程度がそれぞれ約７及び約〕フ７）非１”：１′ン性界１ｆｉｉ活性剤の混合物）少量（゛）ま六・は実質的に七

【コシ）中性無機塩、す：、酸塩ビルダー、過ホウ酸Ｏｇ／ｅ、例えば最低で６６００．／Ｎの嵩密度を有する顆粒の形態の粉較洗削どして調製された洗剤組成物。ｆ）　アニオン竹界面活性剤及びアル−１Ｊ＋シル化の程度が（れ（れ約７及び約３の非イオン性界面活性剤の混合物、少量のまたは実質的にゼ１７の中性無機塩、ゼオライトビルダー、過ホウ酸塩漂白剤前駆体、第下級アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム、微量成分及び湿潤剤を含有する、最低でも！３００ｇ／ｌの嵩密度を存する顆粒の形態の粉末洗剤とし、て調製された洗剤組成物。ｇ）アニオン竹界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリｌ！系ポリ゛、？− ２脂ｆｆ７ｊ酸７】鹸、炭酸ナトリウム、硫酸すＩ〜リウム、アニンを古むまたはＮまないクレー粒子５過ホウ酸塩漂白剤前駆体、第五級アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸すｔ・リウム、微量成分及び湿潤剤を含有する粉末洗剤として調製された洗剤組成物。１１）　オルトリン酸で中和し、プロテアーゼと混合し、更にギ酸ナトリウノ１、ポウ砂、プロピトングリコール及び硫使用したときに洗濯液のｐＨ９以−１を与えるように調製された酵素洗剤組成物。ｋ）界面活性剤１１当たり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用したときに洗濯液のｐｌ＋８．５以下を与えるように調製された酵素洗剤組成物。１）界面活性剤１１当たり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用したときに洗濯液のイオン強度０．０３以下、例えば０．０２以下を与えるように調製された酵素洗剤組成物。ｍ）界面活性剤１１当たり０，４〜０．８ｇに対応する割合で使用したときに洗濯液のイオン強度０．０１以上、例えば０．０２以上を与えるように調製された酵素洗剤組成物。ヅノ又：ニザ〜配−含ノと窓」（突−興」Ｌ泉−Ｌ、ｔ−存−す−ゑ１１亙１１威−物驚くべきことに、洗濯条件下でズブチリシン系プロテアーゼのＷ電点ｐｉ、即ち実効電荷を低下させると、酵素の洗濯効能が向−Ｆするばかりでなく、リパーゼとの用溶性も向上し捕ることが判った。更に驚くべきことには、プロテアーゼのリパーゼとの相溶性は、ｐｉのみならず、プロテアーゼの活性部位に対して電荷が位置する場所にも影響されることが判った。活性部位により近いところに負の電荷を導入するかまたは正の電荷を取り除くと、プロテアーゼのリパーゼとの相溶性がより大きく向上する。従−）で本発明の所定の実施態様は、リパーゼを含有し、更に、アミノ酸残基を挿入、欠失または置換することにより突然変異プロテアーゼの分子実効静電電荷が親プロテアーゼと比較し２て変更されており、このプロテアーゼにおいて親プロテアーゼと比較して、より少数の正に荷電されたアミノ酸残基及び／またはより多数の負に荷電されたアミノｉＭＦ１基とが存在し、それによってズブチリシンプロテアーゼは、親プロテアーゼのものより低い等ｔｐＨ（ｐｉ。）を有する突然変異ズブチリシンプロテアーゼも含有する酵素洗剤組成物を提供する。このような使用に好ましい種類のリパーゼは、グラム陰性菌由来のものであり、例としては、所定のＰｓ、ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、ｌ上ｌ↓す」及びＣｈｒｏ輪ｏｂａｅｔｅｒ株由来のものに免疫学的に関係するリパーゼを含む欧州特許第０２０５２０８号及び第０２０６３９０号（両方ともＵｎ：Ｉｅｖｅｒ、これらの特許は参照により本明細書の一部を構成するものとする）に記載の群のリパーゼ酵素を挙げることができる。前述のごとくリパーゼと組合せて使用するのに好ましい突然変異ズブチリシンプロテアーゼ酵素の実施態様は、活性部位から約１５λ〜２〇への範囲に位置するアミノ酸残基の部位、例えば位［１７０，１２Ｌｔたは１９５に１つ以上の突然変異を有する。リパーゼは、（例えば欧州特許第２５８０６８号、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ＾／Ｓに記載のような）担持材料を含む脂肪分解酵素の粒状組成物（そうでなければ溶液またはスラリー）の形態、並びに５ａｖｉｎａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（いずれもＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ＾／Ｓの製品）で加えるのが有効である。加えるリパーゼの量は広範囲で選択し得るが、例えば界面活性剤系または洗剤組成物１ｇ当たり５０〜３０．０ＯＯＬＵ／　ｇ、多くは少なくとも１００ｆ、１７ｇ　、極めて有効には少なくとも５ＯＯＬＵ／ｇ、場合によって好ましくは１０００以上、２０００Ｌυ／ｇ以上もしくは４０００ＬＵ／　ｇ以上またはそれ以上であり、従って５０〜４０００ＬＵ／　ｇの範囲となることが極めて多く、恐らくは２００〜１０００１．０／ｇである８本明細書においてはリパーゼ単位は欧州特許第２５８０６８号のごとく定義する。脂肪分解酵素は、広範囲にわたるリパーゼのなかから選択することができる。特に例えば、欧州特許第２１４７６１号（Ｎｏｖｏ　ｉ’１ｏｒｄｉｓｋ＾／Ｓ）、欧州特許第０２５８０６８号の特にＴｈｅｒｍｏａ＋、４□」Ａ貼１む９−リＡ＾ＴＣＣ２２０７０由来のリパーゼに対して産生される抗血清と免疫学的交差反応を示すリパーゼ、欧州特許第０２０５２０８号及び欧州特許第０２０６３９０号に記載の特にＣ□ｏ□ｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ　ｖａｒ　ｉｉ　ｏｆ　ｔ　主ｃｕｍ　ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３由来のリパーゼまたは什ゴＬｉ」」工ＰＬ−８７９，＾ＴＣＣ３１３７１及びＦＥＲＮ−Ｐ　３７８３由来のリパーゼに対して産生される抗血清と免疫学的交差反応を示すリパーゼ、国際特許明細書第一０８７７００８５９号（（：１ｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及び欧州特許明細書第０２０４２８４号（Ｓａｐｐｏｒｏ　Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ）に記載のリパーゼがら選択することができる。特に適しているのは例えば市販のリパーゼ製剤Ｎｏｖｏ　Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）、＾＋ａａｎｏ　１ｉｐａｓｅｓ　ＣＥ、　Ｐ、　Ｂ、＾Ｐ、ト＾Ｐ、Ａ１、及びＣＥＳ、Ｍｅ己ｏ　１ｉｐａｓｅｓ　ＭＹ−３０、叶及びＰＬ、Ｅｓｔｅｒａｓｅ（登録商標）　８Ｎ、Ｌｉｐｏｚｙ＋ｍ（登録商標）、５Ｐ２２５．５Ｐ２８５．５ａｉｋｅｎ　１ｉｐａｓｅ、　Ｅｎｚｅｃｏ　１ｉｐａｓｅ、Ｔｏｙｏ　Ｊｏｚｏ　１ｉｐａｓｅ並びにＤｉｏｓｙｎＬｈ　１ｉｐａｓｅ（登録商樫）である。上記酵素の遺伝子工学は、適当なリパーゼ遺伝子、例えばＴｈｅｒｍｎｍｖｃｅｓ　１．ａｎｕｔ＋１ｎｏｑｕｓ＊たほその突秋変界体由来のリパーゼに対する遺伝子を抽出し、遺伝子またはその誘導体を適当な産生微生物、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中に導入し発現させることにより行ない得る。１１１際特許第− ０８８１０２７７５号（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ＾／Ｓ）、欧州特許第０２４３３３８号（Ｌａｂｏｒ　１ｎｓ）、欧州特許第０２６８４５２号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、特に欧州特許第０３０５２１６号（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｃｔｉｓｋ＾／Ｓ）または欧州特許第０２８３０７５号（（＋１ｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載の技術を適用及び適合し得る。存在し得る他の酵素の場合にも必要な変更を加えて同様の方法が適用される。制限的ではないが、アミラーゼは、洗剤組成物】ｇ当たり約１〜約１００Ｍ１１（マルト−ス単位）（才たは０．０１４〜！、４、例えば０．０７〜０．７ＫＮＵ／ｇ　（Ｎｏｖｏ単位））の量で存在する場合には使用することができる。セルラーゼは例えば、洗剤組成物１ｇ当たり約０．３〜約３５ＣＥＶＵ単位の量で存在する場合には使用することができる。洗剤組成物は更に以下の通隼の洗剤成分を通常の量で含有することができる。洗剤組成物はビルダーを含有させてもさせなくてもよく、ゼローＰ系のもの（即ちリン含有ビルダーを全く含有しない）とすることもできる、従って該組成物は、例えば１〜５０重量％、例えば少なくとも約５重量％、多くは３５〜４０重１％までの１種以上の有機及び／または無機ビルダーを凝集体で含有することができる。このようなビルダーの典型的な例としては、既に前述したものや、より広い範囲ではアルカリ金属オル■・、ピロ及びトリポリリン酸塩、アルカリ金属炭酸塩を単独でまたは方解石、アルカリ金属クエン酸塩、アルカリ金属ニトリロ三酢酸塩、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライト、ポリアセタルカルボキシレートなどと組み合わせたものを挙げることができる。更に洗剤組成物は１〜３５％の漂白剤もしくは漂白剤前駆体、または漂白剤及び／もしくはその活性化物質を含む前駆体からなる系を含有することができる。更なる任意の成分は、起泡増進剤、抑泡剤、耐食剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再沈着防止側、香料、染料、酵素のための安定剤などである。本発明の組成物は布地材料、限定的ではないが特に綿及びポリエステルベースの布地及びそれらの混合物の洗濯に使用することができる。特に適しているのは例えば、温度が約６０〜６５℃以下、例えば約３０℃〜３５℃以下で行われる洗濯過程である。この組成物は、洗濯液中の界面活性剤１１当たり約０．４〜０．８ｇを与えるのに十分な割合で使用するのが極めて適しているが、勿論、所望によりより低いまたはより高い濃度を使用することも可能である。非限定的ではあるが例えば、洗剤が先に例示したようなものである場合には約３ｇ／ｌから最高的６ｇ／ｌの洗剤製剤の量が使用に適していると言える。及工±刃シＭｉたＬ東に深Ｊ」Ｊ１Ｌ１監を泰１基遺伝子中に突然変異を生起する多くの方法は当業者には公知である。ズブチリシン遺伝子のクローニングについて簡単に述べた後に、ズブチリシン遺伝子内のランダムな部位及び特定の部位の両方において突然変異を生起する方法を記載する。ス二’ｆｌＪｉと之」Ｌ伝、子！と７ｏ二丁弘ンーグズブチリシンをコードする遺伝子は任意のダラム陽性菌または菌類から当業者には公知の種々の方法でクローニングすることができる。まず調査対象のズブチリシンを産生ずる微生物由来の染色体ＤＮＡまたはメツセンジャーＤＮＡを使用し、ＤＮＡのゲノム及び／またはｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを構築する必要がある０次いで、ズブチリシンのアミノ酸配列が既知であるならば、類縁のＷ識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使用して、細菌！ＩＮＡのゲ７ノムライブラリーまたは菌ｅＤＮ＾ライブラリー由来のズブチリシンをコードするクローンを同定することができる。或いは、別の細菌または菌の株由来のズブチリシンに類縁の配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリッド形成及びよするクローンを同定するプローブとして使用することができる。ズブチリシンを産生ずるクローンを同定する更に別の方法は、ゲノムＤＮへの断片をプラスミドのような発現ベクター中に挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーを用いてプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、形質転換細菌を、ズブチリシンに対する基質、例えばスキムミルクを含む寒天」二で平板培養することを含む、ズブチリシン担持プラスミドを含むかかる細菌は、分泌されたズブチリシンによってスキムミルクが消化されるが故に、輪状に透明な寒天に包囲されたコロニーを産生する。ズブ　リシン道−におけるランダムｔ　然　の生一旦ズブチリシン遺伝子をプラスミドのような適当なベタ−中にクローニングしたならば、幾つかの方法を使用してその？を転子内にランダムな突然？界を導入することができる。１つの方法は、ズブチリシンクローン遺伝子を回収可能なベクターの一部としてＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉのミューチーター株内に取り込むことができる。別の方法は、−重鎮形態のズブチリシン遺伝子を生成し、次いで、ズブチリシン遺伝子を含むＤＮＡ断片を別の［１８Δ断片と、ズブチリシン遺伝子の一部分が一重鎖のまま残るようにアニーリングすることを含む０次いでこの不連続の一重鎮域を、限定的ではないかに二面硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ギ酸またはヒドララジンといった多数の突然変異誘発剤（ｍｕｔａｌｅｎｉｚｉｎｇａｇｅｎｔｓ＞のいずれかに暴露することができる。ランダムな突然変異を生起するこの方法の特定の例は、５ｈｏｒＬｌｅ及びＮａｔｈａｎｓ（１９７８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾、、７５：２１．７０〜２１７４）に記載されている。５ｈｏｒｔｌｅ及びＮａｔｈａｎｓの方法によれば、ズブチリシン遺伝子を担うプラスミドは、遺伝子内で切断する制限酵素によってニックされるであろう、このニックはＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ作用を使用すると広がって、ギャップを生じるであろう、得られた一重鎖ギャップは、上述の突然変異誘発剤の任意の１つを使用して突然変異させることができる。或いは、天然プロモーターまたは他の制御配列を含むｈカーと、ヘルパーファージＩＲＩの重感染に際しての一重鎖ブラスミドＤＮＡ産生のための８１３複製起点とを含むプラスミドベクター内にクローニングする。ズブチリシンクローン遺伝子を含む一重鎖ブラスミドＤＮＡを単離し、ベクター配列を含むがズブチリシンをコードする領域を含まないＤＮＡ断片と一緒にアニーリングすると、ギャップのある二重鎖分子を生じる。突然変異はズブチリシン遺伝子内に、二面硫酸ナトリウム、亜硝酸もしくはギ酸を用いるかまたは前述のごときＥ、ｃｏｌｉミューチーター株における複製かによって導入される。二面硫酸ナトリウムは一重鎖ＯＮΔ内のシトシンと排他的に反応するので、この突然変異誘発物質によって生起された突然変異はコーディング領域にのみ制限される１反応時間及び亜硫酸塩の濃度は、種々の実験においてズブチリシン遺伝子当たり平均で１〜５つの突然変異が生起されるように変化させる。ギャップのある二重鎖ＤＮＡを、分間インキュベートすると、−重鎮域にあるシトシンの約１％が脱アミノ化される。成熟ズブチリシンのコーディング域は、ＤＮＡ鎖に従って約２００のシトシンを含む１反応時間は約４分間（２００のうち約１つの頻度で突然変異を誘発する場合）から約２０分間（２００のうち約５つの頻度で突然変異を誘発する場合）の間で変化させるのが有利である。突然変異誘発後、ギャップのある分子をＤＮＡポリメラーゼ■（クラノウフラグメント）でｉｎ　ｖｉｔｒｏ処理して完全な二重鎖分子を形成し、突然変異を固定する０次いでコンピテントＥ、ｃｏｌｉを突然変異誘発ＤＮＡで形質転換して突然変異ズブチリシンの増幅ライブラリーを生成する。増幅突然変異ライブラリーは、プラスミドＤＮＡを、エラーを起こしがちなりＮ＾ポリメラーゼに起因して突然変異の範囲を増大するし突然変異誘発物質である亜硝酸及びギ酸を使用して突然変異体ライブラリーを生成することもできる。まず、これでないので、突然変異誘発反応は以下の過程で行われる。ズブチリシン遺伝子のコーディング部分を標準的な方法によりＭ１３ファージ内でクローニングし、−重鎖ファージＤＮＡを調製する０次いで、−重鎮ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸、ｐｌ（４，３と２３℃で１５〜６０分間、または２．４Ｍギ酸と２３℃で１〜５分間反応させる。上記反応時間の範囲は、１０００中の１から１０００中の５までの突然変異の頻度を与える。突然変異誘発後、汎用プライマーを旧３　ＤＮＡにアニーリングし、ズブチリシン遺伝子のコーディング部分が完全に二重鎖となるように突然変異誘発−重鎮ＤＮＡを鋳型として使用して二重鎖ＤＮＡを合成する。そうして、コーディング域をＭ１３ベクターから制限酵素を用いて切り出し、非突然変異誘発発現ベクターに連結して、突然変異が制限断片においてのみ発生するようにできる（Ｍｙｅｒｓら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：２４２〜２５７（１９８５））。ズブ　トン　１　にｌ　、１″″ｙｍ　の一旦ズブチリシン遺伝子をクローニングし、突然変異に望ましい部位を同定したならば、かかる突然変異を合成オリゴヌクレオチドを使用して導入することができる。かかるオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に横付けされるヌクレオチド配列を含んでおり、突然変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。好ましい方法においては　ズブチリシン遺伝子を架橋するＤＮＡの一重鎖ギャップをズブチリシン遺伝子を担うベクター内に形成する１次いで、所望の突然変異を担う合成ヌクレオチドを一重鎖ＤＮＡの類縁部分にアニーリングする。残りのギャップはＤＮ＾ポリメラーゼｌ（クラノウフラグメント）によって充填し、Ｔ４リガーゼを使用して連結する。この方法の特定の例はＭｏｒｉｎａＨａら（１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２：６４ｆ３−６３９）に記載されている。　Ｍｏｒｉｎａｇａらによれば、遺伝子内の断片は制限エンドヌクレアーゼを使用して取り除かれる６次いでギャップを含むベクター／遺伝子を変性し、ギャップを含む変わりに、ギャップ内の関連領域の外側の部位で別の制限エンドヌクレアーゼを用いて切断されたベクター／遺伝子にハイブリッド形成する１次いで遺伝子の一重鎮域は、突然変異オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成が可能であり、残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩのクラノウフラグメントで充填し、挿入部はＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、１サイクルの複製の後には所望の突然変異を担う二重鎖プラスミドが産生される。　ＭｏｒｉｎａＢの方法は、新たな制限部位を横築する操作を不要にし、従って複数の部位における突然変異の生起を容易にする。米国特許第４，７６０，０２５号（Ｅｓｔｅｌｌら、１９８８年７月２６日出願）によれば、カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を少し変更することにより多重突然変異を担うオリゴヌクレオチドを導入することができるが、Ｍｏｒｉｎａｇａの方法によれば種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるが故に、はるかに多様な突然変異を常に導入することができる。ズブ　１シン　６　の本発明によれば、前述の方法または当業者には公知の別の方法によって生産される突然変異ズブチリシン遺伝子は、発現ベクターを使用して酵素の形態で発現され得る０発現ベクターは一般に、通常は典型的なりローニングベクター、即ち微生物のゲノムとは無関係に微生物中でベクターを自己複製し得るエレメントと、選別のための１つ以上の表現型マーカーとの成分を含むが故に、クローニングベクターの範晴に含まれる０発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開始信号及び必要によってはリプレッサー遺伝子または種々の活性化遺伝子をコードする制御配列を含む。発現タンパク質を分泌し得るために、“信号配列′°をコードするヌクレオチドを遺伝子のコーディング配列の前に挿入することができる。制御配列の命令下の発現するために本発明に従って処理されるべき標的遺伝子は、適当な読取りフレーム内の制御配列に操作的に連結される。プラスミドベクター内に取込むことができて突然変異ズブチリシン遺伝子の翻訳を支援し得るプロモーター配列としては、限定的ではないが、原核β −ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　７５：３４２７〜３７３１）及びｔａｅプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｅａｄ、ｓｃｉ、　ｔｌ、ｓ、＾、　８０：２１〜２５）を挙げることができる。更に、５ｉｅｎｔｉｆｉｃ　／１ｍｅｒｉｅａｎ、１９８０．２４２ニア４〜９４の”Ｕｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏ＋ｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉ、ＴＩを参照することもできる。１つの実施態様によればＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓは、突然変異ＤＮＡを担う発現ベクターによって形質転換される。　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのような分泌微生物において発現が行われる場合には、信号配列は翻訳開始信号の後で当該ＤＮＡ配列の前に置くことができる。信号配列は発現産物を細胞壁に輸送するように作用し、そこで信号配列は、分泌の際してこの産物から切断される、前述のパ制御配列 ”なる用語は、存在する場合には信号配列を含むものとする。ズブチリシン遺伝子の部位特異性突然変異は有用な化学的特性を有する突然変異体を生じる材料と方法材料と方法細菌株Ｂ、ｕｂｌｉｌｉｓ　３０９及び１４７ハ、寄託番号ＭＣＩＢ　１ｏ１４’ｌ及びＩＩｃＩＢ　ｌ０３０９として、ＭＣｌ８に寄託されたｌ１ｓｃｉｌｌｕ　１ｅｎｌａｓの変異株であって、１９７３年３月２７日に発行された米国特許第３，７２３．２５０号に記載されており、その記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする。１１．５ａｂｌｉｌｉｓ　ＤＮ　４９７は、欧州特許公開第２４２，２２０号に対応し、その記載内容も参照により本明細書中に含めるものとする１９８７年４月１７日に提出された米国特許出願第０３９゜２９８号に記載されており、Ｂｉｏｇｅｎ　のＤ「、　Ｋｉｎ　Ｈｓｔｄｙ　から入手した胞子形成及びプロテアーゼ欠損株であるＳＬ　４３＆からの染色体ＤＮＡを有するＲＵ［ｌ　２００　のａｒｏ＋形質変換株である。Ｅ、ｃｅｌｉ　ＭＣ１０００ｉ−ｍ　＋　（Ｃｘ５ｅｄｘｂａｎ、Ｍ、Ｉ、ｔＩｌｄ　Ｃｏｈｓａ。Ｓ、　Ｎ、（１９１１Ｇ）、　１．　Ｍｏ１．Ｂｉａｌ、１３Ｒ：　１７９−Ｈ？　ｌ　は、慣用的方法によってｒ−Ｉ＋を作製されたものであって、米国特許出願第０３９．２９８号に記載されている。ａ、　ｉｗｂｌｉｌｉ＋　ＤＢ　１０５　は、にｓｖｇｍｍｒｔ、Ｆ、、Ｄｏｉ、Ｒ，Ｉ（、（１９８４）、Ｃｏｎ５ｔＬｕｃｔｉｏｎ　ｏｌ　ａ　Ｂ、１ｏｂｌｉｌｉｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｍ＋目ｓａｔ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉａ　ｅｘｌ＋ｔｃｃｌ１ｗｌｕ　５Ｈｔｌｉｎｅ　ｔｎｄ　ｎｅｗ＋＋１１　ｐ＋ｏｊｅｘｓｅｉ、　Ｊ、　Ｆｈｃｌｅ＋ｔｏ１．　１６０（２）、　４４２−４４４　に記載されている。プラスミドプラスミド　ｐｓＸ５０　（米国特許出願第０３９，２９８号に記載されていて、その記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）は、プロモーターオペレータＰＩＯ１、Ｂ、ｐ＠ｍ１ｌｕ　ｘｙＩ１８遺伝子及び　８．ｓ＊ｂｌｉｌｉｉ　ｘｌｌ　Ｒ遺伝子を包含するプラスミド　ｐ　Ｄ　Ｎ　１ｏｓｅの誘導体である。ｐｓＸ６２　（米国特許出願第０３９，２９８号に記載されている。上記）は、ｐｓＸ５２　（同上）の誘導体であって、子牛プロキモシン遺伝子とｐｓＸ５０　（上記）中に挿入されたＢｐ＊ｍ１１ｍ５　ｘＢ　Ｂ遺伝子との間の融合遺伝子を包含する。ｐＳＸ６２は、ｐｓＸ５２中のプロキモシンの後ろに　！、ｃｏｌｉ　ｒｔｍＲターミネータを挿入することによって生成された。ｐｓＸ６５　（米国特許出願第０３９，２９８号に記載されている。上記）は、プラスミドｐＤＮ　１０５０の誘導体であって、プロモーターオペレータＰ２０２　％　Ｂ、ｐ＋ｖｉｌａｓ　ｘ７ｎ　８遺伝子及びＢ、ｓｗｂｌｉｌｔｓ　ｘｌｔ　Ｒ遺伝子を包含する。ｐＳＸ８８　（未公Ｎ　国際特許用ａＰｃＴ／ＤＫ　８８１００００２　（ＮＯＷｏ　１１１１１１１ｓＴＩＩＩ　Ａ／Ｓ　）　１．：Ｅ載すレテいル）ハ、スフチリシン　３０９　ａ転子を包含するｐｓＸ５０の誘導体である。ｐＳＸ９２は、Ｃ１ａ　Ｉ　及び　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　で切断されたプラスミドｐＳＸ６２　（上記）中でズブチリシン　３０９をクローニングすることによって生成され、Ｃ１ａ　Ｉは、クローン化ズブチリシン　３０９遺伝子からのＤｒａＩ−Ｎｈｅｌ及びＮｈｅｌ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片の挿入の前に充填された。ｐｓＸ９３（第３図に示されている）は、ポリリンカー配列中に挿入されるターミネータを含有するズブチリシン　３０９遺伝子の０．７ｋｂ　Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を包含するｐＵｃ　ｉ　３　（Ｖｉｔｔｒｔ　ｃｏｄ　１ｌｅｓ＋ｉａ（、ＩＨＬ　Ｇｅ＋＋ｅ　１９：　２５９−２６８）である。ｐ　Ｓ　Ｘ　１１９　（未公開国ＦＪ％特１’Ｆ出願Ｐ　ＣＴ／　ＤＫ　８８／　００００２　（ＮＯＶＯＩＮＤ［ｌ５ＴＲＩ　Ａ／Ｓ　’）　ｌ、ｍ記載サレテいル）ハ、ホＩＪリンカー中に挿入されるズブチリシン　３０９遺伝子のＥｃ。Ｒ１−Ｘｂａｌ断片を有するｐＵｃ１３である。ｐｓＸ１２０は、それによってプロテアーゼ遺伝子がａｍｙＭ　及びａｍｙ　Ｑ　プロモータによって発現されるように、ｐｓｘｓａからのズブチリシン３０９遺伝子を伴うＨｐａｌ−Ｈｉｎｄ　ＩＩ＋断片がｐＤＮ１６８１上のＥｃｏＲＶ −Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ中に挿入されるプラスミドである。ｐＤＮ１６８１は、プロモータを伴うａｍｙ　Ｑ遺伝子を有するＢ、ｒｓ７１ｏｌｉｑｌｌｔｌ＋ｃｉｅｎ＋からの挿入２．８５ｂｐ　Ｃ１ａｌ断片を伴うｐＤＮＩ　３８０　（Ｄｉ＋Ｉｕｉｃｌ＋＋Ｃｎ、Ｂ、＊ａｄ　Ｃｈ＋ｉ＋１ｉｚａ＋ｅＩｌ、Ｌ、＋１９８８゜ＦＥＭＳ　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏｌｏｇ７　Ｌｔｌｌｅ＋ｓ　５６：　５３−６０１から得られる（Ｔｌｋｋｉｎｔａ　ｃｌ　ｔｌ、　：ｌ９８３．　１．　Ｒｉｏｔ、Ｃｈｔｍ、２５８：　１Ｈ７１１，）　。ｐＵｃ１３は、Ｖｉｃｉ＋＋、１．　ｇＩｌｄ　ｌｉｅ＋ｓｉｎｇ、１．：１９８２．　Ｇｕｅ　１９＋　２５９−２６８に記載されている。ｐＵＣ１９は、Ｙ■口ｃｂ−ＰＩ＋＋ｏｎ、Ｃ，ｕｄ　Ｗｉｔ目易、１．　ＭｅｕｉａＬ］、、１９８５．　Ｇｅｎｅ　３３：　１０３１１９に記載されている。ｐＵＢ　１　１　０　は、　Ｌ＋ｃＢ、　Ｒ，Ｌ、Ｃｈｏｐ＋　＆、　１．　（１９７４）、　Ｇｅｎｅｌｉｃ　＋１ｗｄｉｃ＋　ｏｆ　Ｉｍａｌｌｉｎ＋ｉ＋ｌ＋ｎｌ　＋ｌ＋ｔｉｍ　ｏｌ　ＳＬ＋ｐｂ７１ｏｃｏｃｕ＊　１０ｎｏ＋、１．　Ｍｔｄ、　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ１．７．２８５−２９７．及びＺＮ日ｔｎ、Ｅ、。Ｍｚｌ＋１目、Ｉｔ、　（１９８６）、Ｃｈ１ｎＣ１ｅ＋ｉ＋＊１ｉａｎ　ｏｆ　＋ｉｇｎｚｌ＋　ｐ＋ｏｍｏｌｉａ１　Ｉｔｍｔ　ｕｐｒｅｕｉｏＩ＠＋＋　１ｂｅ　Ｓｌｔｐｈ７１ｏｔｏｃｃｗ＋　ｕｒｅ■ｐｌａｓｍｉｄ　ｐ１１８１１０　＊ａｄ　ｄｔｒｅｌｏｐ＊ｃｎｔ　ａｔ　＊　Ｇ＋ｓ＋＋−ｐｏｓｉｌｉｕ　ｅｘｐ＋ｅｓ＋■１ｙｃｃｌｏｒ　＋７＠ｆｅｓ、ＤＮＡ５　（３）、２＋９−２２５に記載されている。種々のズブチリシンに関する遺伝子は、上記文献を参照して得られた。特に、ズブチリシン３０９及び１４７酵素に関する遺伝子は、未公開国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ　８８１００００２　（ＮＯＹＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　Ａ／Ｓ　）（ソノ記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）に記載されているのと同様にして得られた。ズブチリシン　Ｃｘ＋ｌ＋ｂｅＢ遺伝子構築　合成遺伝子は、成熟ズブチリシンＣｓ＋Ｉ＋ｂｅ＋１　プロテアーゼ及びその転写ターミネータのコード配列に基づいて（＋＋ｃｏｂｓ、　Ｍ、Ｅｌｉｇｓｓｏａ、　Ｍ、、　ＵｈｌｅＩｌ、　Ｍ、、Ｆｌｏｃｋ、Ｉ。−１，（１９８５）、　ＣＩｏｎｉｎ（、ＩｅｑａｃｎｃｉＢ　ｕｄ　ｅｘｐｎｓｓｉｏｏ　ｏｌ　５ｉｂｌｉ１口ｉＩＩＣｇ＋ｌ＋ｂｔＢ　ｆｒｏｍ　Ｂｔｃｉｌｌｗｓ　ｌ１ｃｂｃ＋＋ｉｌｏ＋ｍｉｘ、　Ｎｗｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｔ、１３　（２４）、　Ｈ！３−８９２６）　、ズブチリシンＢＰＨのプロテアーゼのｐｒｅ及びｐｒｏ　コード配列と連結させて（Ｗ！ＩＩＩ、Ｉ、Ａ、、Ｆｅｕｕｉ、　Ｅ、、　Ｈｔ■ｅ＋、０．１．、Ｅｓ１ｅｌｌ。Ｄ、Ａ、、Ｃｂｅｎ、Ｅ、Ｙ、（１９８３１、ＣＩｏｎｉｎｇ、ｕｑｕｅｃｉＢ　ｕ＋ｄ　＋ｅｃｎｌｉｏＬｉｏｌ　Ｂｓｃｉｌｌｓｔ　５ｍ７１ｏｌｉｑａｃｌｔｃｉｕ＋ｓ　ｓＩｂ目Ｉｉ＋ｉｎ　ｉｎ　Ｂ＋Ｃ１１ｌｕ富ｍｂｌｉｌｉ息、Ｎｗｃｌｓｉ　Ａｃ１ｄ＋　Ｒｈ、Ｉｆ（２２）、７９１１−７９２５）設計した。この遺伝子を１２７〜３１３塩基対の範囲の長さの７つの断片に細分し、各断片は１６〜７７ヌクレオチドの化学的に合成されたオリゴから成っていた。２つの鎖のオリゴ間の重複は、各断片をアニールする一工程を促進するために最適化された（Ｍｗｌｌｅｎｂ＊ｃｈ、Ｇ、Ｔ、、Ｔｔｂ＋ｉ＋ｉ、＾、、Ｂｌ＋ｃｔ＋ｅｒ、Ｒ１Ｗ、、５ｌｅｉａｅｒ、Ｋ、Ｓ、（１９８６１，Ｃｂｓｍｉｃｔｌ　＋ｙｎｌｈｅ＋ｉｓ　＋ｎｄ　ｔｘｐ＋ｅｓ＋ｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｔｔｔｌｏｆ　ｓ　ｇｅｎｅ　＠ａｃｏｄｉｉｇ　ｃ　Ｏ■ｅｃｌｉｗｅ　ｌｉ＋＋ｕｅ　Ｉｃ　目ｔｔｌｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ−ＩＩＩ、Ｉ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２６１　（２１，７１９−７２２）　。各断片を集め、Ｅ、ｃｏｌｉ　クローニング及びシーケンシング　ベクター中でクローン化した。これらのクローン化断片の配列分析を実施して、各断片の配列の正しさを確証した。次に、すべての断片を集め、ベクターｐＵＢ１１０においてクローン化しくＬｓｃｃ７．　Ｒ，１，、Ｃｈｏｐｎ、１．　（１９７４）　、　Ｇｅｎｅｌｉｃｒｌａｄｉ■ｏｌ　ｇ　ｍｗｌｌｉ＋ｅｓｉｓｌ■ｌ　５ｌｎｉｎ　ｏｆ　Ｓ１ｇｐＪＩｏｃｏｅｃｏ＋　５ｕｅｉｓ、１．　Ｍｒｄ、　１ｉｉＣ＋ｏｂｉｏ１．７．２１１５−２９７１　、Ｂ、ｕｂｌｉｌｉ＋　ＤＢ１０Ｓ中に加えた（ＫＩＩＦＩＩＩＩ＋！、　Ｆ、、　Ｄｏｉ。Ｒ，Ｈ，（ｌＨ４）、Ｃｏｎ５ｔｒｉｃｔｉｏｎｏｆ畠Ｂ１ｅｉｌｌｕｔ＋＋ｂ目ｌｉｔｄｏｕｂｌｅｍｗｌ＊ａｌ　ｄｅｌｉＣｉｓｏｌ　ｉＩｌ　ｅｘｌ＋ｔｃｅｌ１ｗｌｓｒ　５ｌｋｘｌｉａ＊ｎｄ　Ｌｌｔｗｌ

【Ｉｌ　ｐ＋ｏ１ｃｕｕ　、１．　Ｂｔｅｌｅ＋ｔｏ１．　１６０（２）、　４４２−４４４）。遺伝子の転写は、ｐＵＢ１１０プラスミドベクターのＨｐａｌｌルミｌｌプロモータ開始した（２Ｆ９Ｉｉ＋＋＋、Ｅ、、　１ＪＩｌ＋ｗｎ、　Ｈ，（１９８６）、　Ｃｈ＊ｒｔｃｌｅｒｉｕ＋ｉｏｍ　ｏｌ　ｔｉｇｕｌ＋　ｐｒｏｍｏｌｉＢ　ｇｃａ＠　ｔｘｐ＋ｅ＋５ｉｏｎ　ｏｓ　ｉｂｅ　Ｓ１ｐｂ７１ｏｃｏｃｃｗｓ　 ■ｔｎｓ　ｐｌ■ａｉｄ　ｐＵＢＩｌｏ　■ｄ　ｄｓｗｅｌｏｐｍｅａｌ　ｏｌ　＊Ｇｒ＊ｉ−ｐｏｔｉｌｉｗｅ　ｅｔｐ＋ｅｓｔｉｏｎ　ｗｅｃｌｏ＋　＋ｙ＋ｌ！ｍ、　ＤＮＡ　５　（３）、　２１９−２２５）。遺伝子構築の工程においては、このどちらかといえば長い断片の集合に伴う問題を避けるために、最長断片（＃５；３１３塩基対長）はさらに断片化する必要がある（＃８及び＃９断片）ことが判明した。ヌクレオチド配列に由来するアミノ酸配列は、初期に発表された位置１２９．１５７．１６１、及び２１２でのズブチリシン　Ｃ＊ｒｌｓｂｅｒｌ配列とは異なる（Ｓｓｉｌｈ、Ｅ、Ｌ、、ＤｓＬｕｌｔ、Ｒ，Ｉ。、　Ｅｗ■ｓ、Ｗ、Ｈ，、Ｌｕｄｏｎ、Ｌ、Ｍｕｋｌ＊ａｄ、　Ｆ、Ｓ、　（１９６１１）、　Ｓ＊ｂｌｉｌｉｓｉａ　Ｃ＊ｒｌ＋ｂｅｒｆｆ　Ｖ、Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｌｔ　ｓ！ｑｓｅｍｃｇ：　ｃｏｇ＋ｐｇｒｉｓｏｃ　ｗｉｔｈ　ｔ＊ｂｌＮｉｓｉａ　ＢＰＮ’；　ｅｙｏｍｉｏｍｓｒｙ　＋ｃｌｓｌｉｏｕｈｉｐｓ、、１．Ｂｉｏｌ、Ｃｋｅｉ、　２４３（９）、　２１８４−２１９１）。１１ｃｏｂ　ｅｌ　ｔｌ　（１９８５）によって報告された５番目の変化は、本明細書に記載されたＣｏｒｌｓｂｅｒ（遺伝子のクローンにおいては確証できなかった。等電点（ｐ　１０　）の算定使用した手法を立証するために、ズブチリシン　３０９　野生型酵素（Ｓ　ＯＯＯ）の等電点の計算を、以下に例証する。同一手法は、もちろん、それが突然変異体酵素であるか否かにかかわらず、任意の酵素の算定に適用できる。ｐＫ値を、各潜在的荷電アミノ酸残基（Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧＩｕ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｎ−末端、Ｃ−末端。Ｃａ　Ｈ）に割り当てた。この場合、環境を考慮し、それによっＣその隣接物により同一アミノ酸残基に対し５て異なるｐＫ値を用いる。指定値を表１■に示す。つぎに、荷電又は非荷電形態の指定ｐ　Ｈでのアミノ酸残基の発生の比率（荷電／非荷電、Ｃ／’Ｕ　（１））を、それぞれ、Ｉａ及びＩｂ式を用いて、負及び正電荷に関して算出した。表■■においては、この比は、ｐＩｏと等しいｐｌ■ に関して示されるだけである。次に、相対電荷Ｑｒ（ｉ）、又は各荷電残基に配分される電荷分担を、Ｉｌａ及びＩＩｂ式を用いて算出したー荷電残基からの全電荷分担の合計がゼロに等しいｐＨ値が、反復によって判明した。表　１ｃ／ｕ＜ｉ）’）＆ｋ　Ｑ、（ｉ）　αｃｉ＋　ｑ、ｃｉ＋Ｔｙｒ　Ｌ９　３　２．５１Ｅ−０２−０，０７−：Ｌ、６７　−１．７７Ｔｙｒ　１．６　２　５ −０１Ｅ−０４０，００−０，０５−０−０６Ｔｙｒ　１：１５　２　６．：１ｌＥ−０５０−００−０，０１，−０，０１Ａｓｐ　３．５　５　６．］ＩＥ＋０４　−５−００　−５．００　−５．００Ｇｌｕ　４　５　２．ＯＯＥ＋０４　−５．００　−５．００　−５−Ｏ。Ｃ−ｔｅｒｍ（Ａｒｇ）３　］、　２．ＯＯＥ＋０５　−１．００　（，００（ −００Ｃｙｓ　９．３　０　１．０ＯＥ−０１０−０００−０００−００ｋｒｑ　１２．８　８　３．１６Ｅ＋０４　８．００　７Ｊ９　７．９９Ｈｉｓ　６．４　〕　〕１．２６Ｅ−０２　０．０９　（ＬＯＯＯ，００Ｌｙｓ　１０　５　５．０１Ｅ＋０１　４−９０　２．５０　２＋３４Ｃａｌｃｉｕｍ　２０　１２５　５．０１Ｅ＋１１　２−５０　２−５０　２．５ＯＮ−ｔｅｒｍ（Ａｌａ）８　１　５．０ＬＥ−０１０−３３０−０１０−０１憤かη　′宝を１　（ネｄ＋アーシ゛：”　４．７５　０．２□　ｏ−。 ★　Ｅ−０２−１０” 上記及び表ＩＩに示されるように、各アミノ酸に割り当てられたｐＫ値は、環境の局所的変異を考慮した場合、異なった。これは、計算の精度を増しただけであるが、しかし、経験的に、一定の予想ｐＫ値は、与えられた突然変異体酵素に関するｐＩＯが、親酵素のｐ　Ｉ　ｏと比較した場合にどの方向に動くかを示すのに有用であることが明示された。これは、表ＩＩＩに示されているが、この場合、予想ｐＫ値に関するｐ　Ｉ　ｏ値を示す。種々の酵素及び突然変異体酵素を比較するために、以下に詳述する洗浄試験を実施した。以下の表ＩＩＩにおいては、使用した洗液の異なるｐＨ値でのｐ　Ｉ　ａ及び洗浄性能間の相関を立証するために、親酵素、並びにズブチリシン３０９　（ＳＯＯＯ等と呼ばれる）及びズブチリシンＣ５ｒｌ＋ｂｅｒｇ　（Ｃ０００等と呼ばれる）からの突然変異体酵素を用いたこれらの試験からの結果を表にした。洗浄試験においては、洗剤実施例Ｄ７によるｐＨ８，３の低塩液体洗剤処方物、及び洗剤実施例Ｄ２によるｐ）（１０，２の正塩粉末洗剤を用いた。表ＩＩＩにおいては、結果は、野生型酵素と比較した場合の５０００　１０．０２　９．７　１　Ｌ５００１　９．８６　９．４　２．２　１Ｓ００３　９．１３６　９．４　２．０　１５００４　９．６Ｂ　９．１　３．９　１Ｓ００５　９．７１　９．１　１．５　１Ｓｏ１２　９．０９　Ｂ、８　５．０　０＋６５０１９　９．０９　８．５　５．８　０．６５０２０　６．７１　７．９　Ｂ、８　０．５５０２１　９．１３５　−　１．．８　０．７５０２２　Ｂ、０７　９．０　０．：３５０２３　Ｂ、０５　９．８　０．２５０２４　６．８６　−　９．０　０．２５０２５　８．９４　−　６．９　０．６５０２７　１０．２８　−　０．４　１．０５０２８　１０．２Ｂ　−０，９１，０５０３１１０−５３−０，４０，７５０３２１０，２８−０＋７　− ５０３３　１０．２８　０．４　− ８Ｏ３５Ｂ、０７　−　８．０　０．６５２０１　９．８５　−　２．０　０．７ＣＯＯＯ８，８７−１１ＣＱｎ３　９．３Ｂ　Ｏ，２１，５ＣＯＯ４９，６４−０＋２　１．５ＣＯＯ８９＋３８　−　０．２　１＋５表ＩＩＩから、ｐｌｏを低値に移動すると（Ｓ−シリーズ）低ｐＨ（ｐＨ＝８．３）での洗浄性能の改良が提供され、一方、ｐｌｏを上方に移動すると（Ｃ−シリーズ）高ｐ）（（ｐＨ＝１０．２）での洗浄性能の改良が提供されることが判る。したがって、等電点が粗解素におけるアミノ酸の位置を選択するのに非常に有用であることが判明したという概念は、変えるべきである。突然変異は、酵素分子の表面又は表面付近に位置するアミノ酸に対応するコドンにおいて実施すべきであり、それによって、粗解素の内部構造をできるだけ多く保持すべきであることが、一般に判明している。ズブチリシンの精製本手法は、ズブチリシン　１４７　酵素、ズブチリシン　３０９　酵素又はその突然変異体の１０リツトル規模の発酵の一般的精製に関する。約８リツトルの発酵ブロスを１リツ］・ル　ビーカー中で３５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を、１０％酢酸を用いてｐＨ６，５に調整し、５ｅｉｔｚ　５ｕｐｒａ　５１００　フィルタープレートで濾過した。濾液をＡｓ１ｃｏｎ　５ＩＹＩＯυｒカートリツジを装備した八ｍ１ｃｏｎ　ＣＨ２Ａ　ＵＦ　ユニットを用いて、約４００ｍｆに濃縮した。ＵＦ濃縮液を、ｐＨ７でバシトラシン親和性カラムで室温で吸収する前に、遠心分離し、濾過した。プロテアーゼを、０．０１Ｍジメチルグルタル酸、０．１Ｍ硼酸、及び０．００２Ｍ塩化カルシウムでｐＨ７に調整した緩衝液に溶解した２５％２−プロ／（ノール及び１Ｍ塩化ナトリウムを用いて、室温で、）＜シトラジンカラムから溶離した。バシトラシン精製工程からのプロテアーゼ活性を有する分画を併合し、ｐＨ６，５に調整された０、０１Ｍジメチルグルタル酸、０．２Ｍ硼酸及び０．００２Ｍ塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡された７５０ｍ１セフアデツクスＧ２５カラム（直径５ｃｍ）に用いた。セファデックスＧ２５カラムからの蛋白質分解活性を有する分画を併合し、ｐＨ６，５に調整された０、０１Ｍジメチルグルタル酸、０．２Ｍ硼酸及び０．００２Ｍ塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡された１５０ｍ１　ＣＭ　セファロースＣＬ　６Ｂ　陽イオン交換カラム（直径５ｃｍ）に用いた。プロテアーゼを、２リツトルの同一緩衝液に溶解した０〜０゜１Ｍ　塩化ナトリウム直線勾配（ズブチリシン１４７の場合は０〜０．２Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、溶離した。最終精製工程では、０Ｍセファロースカラムからの分画を含有するプロテアーゼを併合し、ＧＲ８１１）ｐ膜を装備したＡｍ１ｃｏｎ限外濾過セル（Ｄｔｎｉ＋ｈＳＩｌｌｓ＋　Ｆｓｃｌｏ＋ｉｕ　Ｉｎｃ、）中で濃縮した。ズブチリシン３０９及び突然変異体Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　（Ｇ１９５Ｅ　（５００１））：Ａｒｇ　１１７０　Ｔｙｒ　（Ｒ１７０Ｙ　（Ｓｏｏｔ））：Ａｒ（７１７０Ｔｙｒ　＋　ＧＩＹ　１９５　Ｇｌｕ　（Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ　（Ｓ００４）ｌ：Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ　（Ｋ２５１Ｅ　（５００５））：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　（Ｈ１２０Ｄ　（Ｓ００６））：Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋　Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ（Ｒ１７０Ｙ＋ｃ１９５Ｅ＋に２５１Ｅ　（５０１２））：Ｌｙｓ　２３５　ＩＬｅｕ　（Ｋ２ｊ５Ｌ　（Ｓ０１５））：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　＋　ｃｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２コ５　Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ　（Ｓ０１７３）：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ’　＋　Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋　ＧＩＹ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２３５Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２：１５Ｌ　（５０１９））　：Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　＋　Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋　Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　＋　Ｌｙｓ　２３５　Ｌｅｕ十　Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ　（Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７ｏｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５Ｌ＋に２５１Ｅ　（５０２０）：を、この手法によって精製した。発酵媒質は、バシトラシン親和性カラム（直径５ｃｍ　＊１５ｃｍ；　１０ｍＭトリス／ＨＣＩ緩衝液　ｐ）１７．９で平衡；流速　約５００ｍ１／時間）に直接適用するか、もしくは外部回路中の１０〜１２＋）、Ｓ、ｔ、の背圧の脱イオン水を用（１て、Ｎｅｐｈｒ…　Ａ山ｎｌｅ　Ｉ（、Ｆ、透析器（０甲…Ｔｅｃｈａｉｋｅ）　ｌこよって５００ｍ１に濃縮した。後者の場合、プロテアーゼは、６００　ｇ／　Ｉの硫酸アンモニウムを付加することによって、濃縮液から析出した。遠心分離によって沈殿物を集め、約５００ｍ１の脱イオン水中に再溶解した。上記と同様の透析器を用（１て、プロテアーゼ溶液から硫酸アンモニウムを除去した。最終容積は約３００ｍ１であり、ｐＨは６．０に調整した。プロテアーゼを、２．７Ｍ　ＮａＣ１及び１８％イソブロノくノールを含有する１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐ）１７．９）を用いて、ノ（シトラジン　カラム（上記）から溶離した。バシトラシン−精製又は濃縮プロテアーゼ物質の透析後、２００ｍ１／時間の流速を用いて、ＣＭ−トリスアクリルイオン交換カラムに適用することによって、さらに精製を行った。プロテアーゼを、燐酸塩緩衝液に溶解した０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１（２１５００ｍ１）の直線勾配を用いて、カラムから溶離１、た。プロテアーゼ活性を含有する分画をプール（１、凍結−乾燥後、緩衝塩の存在下で、 −２０℃で貯蔵した９、オリゴヌクレオチド合成全ての不整合プライマーをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｔｙ＋１ｃｍ＋　３８ＯＡ　ＤＮＡ　シンセサイザーで合成１７、ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製（７だ。蛋白質分解活性に関する検定突然変異体酵素の蛋白質分解活性を、酵素の触媒活性が保持される長さを測定するために、検定した。測定は、ＮＯマｏ−Ｎｏ＋ｄｉ＋ｋ　ｉ／ｓ　、Ｂｍｇ＋ｕ＋ｄ、Ｄｅｎｉｕｋから入手できる）ＩＯＶＯＰｔ＋ｂｌｉｃｓｌｉｏｎＡＦ　２２Ｇ−ｇｂ　（又は以後の版）に記載のジメチルカゼイン（ＤＭＣ）法によって、実施した。その記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする。洗浄性能に関する検定試験布（２，２ｃｍｘ２．２ｃｍ、約０．１ｇ）は、糊抜きした木綿（１００％綿、ＤＳ　７１）布を、草汁を含有するＴＩ（型　ＭＡｌｈｉｔ　ＷｉｔｈｉＩｌ（＋１１ｄ　ＤＢｉａＨｈｉｔ　（４ｅ＋＋ｕ＋　Ｍｓｌｈｉｔ八Ｇ、　Ｘへ＋ｉｃｈ、ＳｗＨ＋ｔ＋ｌ＋ｎｄ　）内の容器に通ずことによって、作つメ；。最後に、布を、室温で強風乾燥し、室温で３週間保存して、その後、使用するまで一１８℃に保った。試験はすべて、モデル　ミニ洗浄系で実施【、た。この系においては、６枚の試験布を、６０ｍ１の洗浄液を含有する１５０ｍ１ビーカー中で洗浄する。ビーカーは、電磁攪拌器を有する３０℃のサーモスタット水浴中に保持する。洗剤として、次の標準液体洗剤を用いた・ドラ１タノ−１し？ミン　、、Ｌ　Ａ　Ｓ　ｆ　’；　Ｍ、’Ｋ　２〕−：ｉｔ／７自ｌやレロ（ｌＬｔ−ｒ９ −六　１．５１イ’ｉ　ｐｂ　、７Ｋ　〕４−９を示されたパーセンテージは、活性含有物のパーセンテージである。ｐＩ（は、ＩＮ　ＮａＯＨで８．１４に調整した。使用した水は、約６’ｄＨ（ドイツ硬度）であった。試験は、０．１．Ｏｍｇ酵素蛋白／ｌ及び１０．０ｍｇ酵素蛋白／１の酵素濃度で実施し、突然変異体の各々に関して２組の別々の試験を実施した。次に示す結果は、これらの試験の平均である。洗浄は６０分間行い、洗浄後、布を、バケツ中で２５分間、水道水の流水で洗い流した。次いで、布を一晩空気乾燥しく日光に当たらないようにして）、規約反射率Ｒを、ＥＬＲＥＰＨＯ２０００分光計（ＤｌｌＩＣ６１ｏｔ　Ｓ、＾、、　Ｄｉｅｌｋｉｋｏａ　、５ｖｉｌ＋ｅ＋１Ｉｎｄ）で、４６０ｎｍで測定した。洗浄性能示差規約反射率の測定値デルタＲを用いる場合、デルタＲ＝付加酵素で洗浄後の反射率−酵素を付加せずに洗浄後の反射率である。Ｂ：種々の突然変異体の洗浄性能を、上記の方法によって、草汁汚染木綿布に対して試験した。２０、ｇ／ｌの市販の米国製液体洗剤を用いた。洗剤を、イオン交換水に溶解した０、００５Ｍエタノールアミンに溶かした。ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣＩで、それぞれ、ｐＨ８，０，９，０，１０，０及び１１．０に調整した。温度は、１０分間、３０℃の恒温に保った。突然変異体を、０．２５ｍｇ酵素蛋白／１で各々投与した。Ｃ：以下の洗剤実施例に例証される洗剤組成物を用いた洗浄試験を、顔料、脂肪、及び蛋白質（カゼイン）を含有する綿ベースの試験布を用いたミニ洗浄器中で実施した。その条件を次に示す：ａ）ｐＨ８，３で、６°　ｆＨ（７ランス硬度）水に溶解シタ２ｇ／ｌの洗剤Ｄ３；又はｂ）ｐＨ１０，２で、１５Ｏｆ　Ｈの水に溶解した５ｇ／Ｉの洗剤Ｄ２゜濯ぎ及び乾燥後、４６０　ｎｍでの反射を測定した。改良因子は、用量−反応曲線から算出したが、これは問題の野生型酵素（ＳＯＯＯ及びＣ００Ｏ）と比較した場合、与えられたデルタ値を得るために必要な酵素の量に関するものであり、このことは、２つの改良因子は、同一デルタＲ値を得るためには半量の酵素が必要であることを示す、ということを意味する。これらの結果は、上記表ＩＩＩに示されている。Ｄ：リパーゼ安定性の実験的試験を、例えば以下の物質を用いて実施した：ＩＬＵ／ｍｌのＰ＋ｃｕｄｏｍｏｎ＊＋　ｃ＋ｐＡｃ目　リパーゼを、０及びＷの２種類の各洗浄液（下記）中でインキュベートした。アリコートを時々採取して、リパーゼ活性に関して調べた。リパーゼ活性の保持に及ぼすプロテアーゼの効力を調べるために、プロテアーゼを用いずに、又は下記のような種々の種類のプロテアーゼを用いて、平行インキュベーションを実施した。野生型プロテアーゼは２０ＧＵ／ｍｌで試験し、変異プロテアーゼは０゜５ミクログラム／ｍ！で試験した。酵素変異体を包含する洗剤組成物洗剤Ｄ１・燐酸塩ビルダーを含有する本発明の態様による洗剤粉末は、次の物質を含有するように処方する：総括性洗剤　約１６％、陰イオン洗剤　約９％、非イオン洗剤　約６％、燐酸塩含有ビルグー　約２０％、アクリル系又は等価のポリマー約３．５％（あるいは約２％に下げる）、過硼酸塩漂白先駆物質　約６〜１８％、あるいは約１５〜２０％、アミノ含有漂白活性剤　約２％、珪酸塩又はその他の構造剤　約３．５％、あるいは約８％まで、約８グリシン単位／ｍｇ活性の酵素、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩、並びに酵素（各々約０．５％の酵素）。陰イオン洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、あるいは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム　６％、及び第一アルキル硫酸塩　３％の混合物である。非イオン洗剤は９．１モル当たり７エトキシレートを有する約Ｃｌ３ −Ｃｌ３の第一アルコールのエトキシレートである。燐酸塩ビルダーは、トリポリ燐酸ナトリウムである。ポリマーは、ポリアクリル酸、あるいはアクリル系／マレイン酸系コポリマーである。過硼酸塩漂白剤先駆物質は、テトラ硼酸ナトリウム四水化物又は−水化物である。活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミンである。構造剤は、珪酸ナトリウムである。中性無機塩は、硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異体５００１によるプロテアーゼ、あるいはプロテアーゼ８００３．８００４．５００５、Ｃ００Ｉ、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、ＣＯＯ８，５Ｏ１５，５０１７，５０２１，５２２６，５２２３，５２２４、又は５２２５を包含する。洗剤　Ｄｌａ：燐酸塩ビルダーを含有する本発明の態様による洗剤粉末は、次の物質を含有するように処方する：総括性洗剤　約１５％、陰イオン洗剤　約７％、非イオン洗剤　約６％、燐酸塩含有ビルグー　約２５％、アクリル系又は等価のポリマー約０．５％、過硼酸塩漂白先駆物質　約１０％、アミノ含有漂白活性剤　約２％、珪酸塩又はその他の構造剤　約６％、約８グリシン単位／ｍｇ等級のプロテアーゼ酵素、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩、並びに酵素（各々約０゜５％の酵素）。陰イオン洗剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。非イオン洗剤は、１モル当たり７エトキシレート残基を有する約ＣＤＣｌ３の第一アルコールのエトキシレート又はこれと１モル当たり３残基の程度までエトキシル化された対応するアルコールとの混合物である。燐酸塩ビルダーは、トリポリ燐酸ナトリウムである。過硼酸塩又は過酸漂白剤先駆物質は、テトラ硼酸ナトリウム四水化物である。活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミンである。構造剤は、珪酸ナトリウムである。中性無機塩は、硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異体５００１によるプロテアーゼ、あるいは５００３．５００４．５００５、Ｃ００Ｉ、Ｃ００２、Ｃ００３、ＣＯＯ４、Ｃ００５、Ｃ００８，５０１５，８０１７，５０２１，５２２６を包含する。洗剤　Ｄ２：ゼオライトビルグーを含有する本発明の態様による洗剤粉末は、次の物質を含有するように処方する：総括性洗剤　約１６％、陰イオン洗剤　約９％、非イオン洗剤　約６％、ゼオライト含有ビルグー　約２０％、アクリル系又は等価のポリマー約３．５％、過硼酸塩漂白先駆物質　約６〜１８％、アミノ含有漂白活性剤　約２％、珪酸塩又はその他の構造剤　約３．５％、あるいは約２．５％に下げる、約８（あるいは約１５）グリシン単位／ｍｇ等級の酵素、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩、並びに酵素（各々約０．　５％の酵素）。總イオン洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、あるいは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム　６％、及び第一アルキル硫酸塩　３％の混合物である。非イオン洗剤は、１モル当たり７エトキシレート残基を有する約ＣＤＣＩｓの第一アルコールのエトキシレートである。ゼオライトビルダーは、Ａ型ゼオライトである。ポリマーは、ポリアクリル酸である。過硼酸塩漂白剤先駆物質は、テトラ硼酸ナトリウム四水化物又は−水化物である。活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミンである。構造剤は、珪酸ナトリウムである。中性無機塩は、硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異体５ｏｏｉによるプロテアーゼ、あル１．ｌハＳ　Ｏ０３，５００４，５ＯＯ５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、ＣＯＯ５、ＣＯＯ８，５０１５，５０１７，５０２１，５２２６を包含する。洗剤Ｄ２ａ・ゼオライトビルダーを含有する本発明の態様による洗剤粉末は、次の物質を含有するように処方する：総括性洗剤　約１４％、總イオン洗剤　約７％、非イオン洗剤　約７％、ゼオライト含有ビルグー　約２５％、アクリル系又は等価のポリマー約３％、過硼酸塩又は過酸漂白先駆物質　約１０％、アミノ含有漂白活性剤　約２％、珪酸塩又はその他の構造剤　約０．　５％、約６グリシン単位／ｍｇ等級の酵素、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩、並びに酵素（各々約０．５％の酵素）。陰イオン洗剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。非イオン流剤は、１モル当たりそれぞれ７及び３エトキシレート残基を有する約ＣＤＣＩｓの第一アルコールのエトキシレートの混合物である。ゼオライトビルダーは、Ａ型ゼオライトである。ポリマーは、アクリル系／マレイン酸系コポリマーである。過硼酸塩漂白剤先駆物質は、テトう硼酸ナトリウム−水化物である。活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミンである。構造剤は、珪酸ナトリウムである。中性無機塩は、硫酸ナトリウムである。酵素は、突然変異体５ＯＯＩによるプロテアーゼ、あるいは５００３．５ＯＯ４，５ＯＯ５、ＣＯＯ１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、ＣＯＯ５、ＣＯＯ８，５０１５，５０１７，５０２１，５２２６を包含する。洗剤Ｄ３：本発明の態様による水性洗剤液は、次の物質を含有するように処方するニドデシルベンゼン−スルホン酸　１６％、７ｍ０１／ｍｏ＋の酸化エチレンと縮合するＣＩ２〜Ｃ１５直鎖アルコール　７％、モノエタノールアミン　２％、クエン酸６．５％、キシレンスルホン酸ナトリウム　６％、水酸化ナトリウム　約４．１％、プロテアーゼ　０，５％、少量物質及び水（１００％にする）。酵素は、突然変異体５０２０、あるいは５０１９．５０１２．５ＯＯ４，５００１、＄００３．５００５．５０１５．５０１７．５０２１．５０２２．５０２３．５０３５．５２０１．５２２３、又は５２３５によるプロテアーゼである。洗剤Ｄ４：本発明の態様による非水性洗剤液は、４．９ｍｏ　Ｉ／ｍｏ　＋酸化エチレン及び２．７ｍｏｌ／ｍｏ＋酸化プロピレンでアルコキシル化される３８．５％ＣＩ３〜ＣＩ５直鎖第一アルコール、５％トリアセチン、３０％三燐酸ナトリウム、４％ソーダ灰、１５．５％少量のオキソ硼酸塩を含有する過硼酸ナトリウム−水化物、４％ＴＡＥＤ、０．２５％ＥＤＴＡ　（このうち０．１％はホスホン酸）、アエロジル０．　６％、ＳＣＭＣ１％、及び０゜６％プロテアーゼを用いて処方する。酵素は、突然変異体５００１、あるいは５００３．５００４．５Ｏ２１，５０３５，５２０１，５２２５，５２２６又は５２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ５：本発明の態様による洗剤粉末は、少な（とも６００ｇ／Ｉの嵩密度を有する顆粒の形態で、約２０重量％の界面活性剤（このうち約１０％はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムであり、残りは５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ？及び５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃＡ３（約５．５％〜４．５％）の混合物である）、及びゼロ中性無機塩（例えば硫酸ナトリウム）プラス燐酸塩ビルダー　約３３％、過硼酸ナトリウム四水化物　約１６％、ＴＡＥＤ活性剤　約４．５％、珪酸ナトリウム　約６％、炭酸ナトリウムを含む少量物質　約２％、水分　約１０％を含有するよう処方する。酵素（各酵素　約０．５％）が含まれる。酵素は、突然変異体＄００１、あるいは５００３．５ＯＯ４，５００５、Ｃｏｏｌ、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、ＣＯＯ８，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６またはＳ２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ６：本発明の態様による洗剤粉末は、少なくとも６００ｇ／ｌ。あるいは５５０ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒の形態で、約２０重量％（あるいは約１６重量％に下げる）の界面活性剤（このうち約９％あるいは約７％はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムであり、残りは５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７及び５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃＡ３（又は同様のエトキシレート）（それぞれ約５％＆６％、あるいは約４％及び７％）の混合物である）、及びゼロ中性無機塩（例えば硫酸ナトリウム）プラスゼオライトビルグー　約３０％あるいは約２５％、過硼酸ナトリウム四水化物あるいは一水化物　約１４％又は１５％、ＴＡＥＤ活性剤　約３．６％、炭酸ナトリウムを含む少量物質　約９％、あるいは１５％まで、Ｄｅｑｕｅｓｔｎ　２０４７　約０．７％、水分　約１０％を含有するよう処方する。酵素（各酵素　約０．５％、あるいは約０．２％リパーゼ及び約０．７％プロテアーゼ）が含まれる。酵素は、突然変異体５００１、あるいは５００３．３００４．３００５、Ｃ００１、Ｃ００２、ＣＯＯ３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６または５２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ６ａ：本発明の態様による洗剤粉末は、少なくとも６００　ｇ／　Ｉの嵩密度を有する顆粒の形態で、約１５重量％の界面活性剤（このうち約７％は直鎖アルキルベゼンスルホン酸ナトリウムであり、２％は第一アルコールの硫酸塩、残りは５ｙｎｐｅｒｏｎｌｃＡ７、又は同様のエトキシレートである）、及びゼロ中性無機塩（例えば硫酸ナトリウム）プラス、ゼオライトビルダー　約２２％、過硼酸ナトリウム四水化物　約１５％、ＴＡＥＤ活性剤　約７％、炭酸ナトリウムを含む少量物質　約１５％、Ｄｅｑｕｅｓｔη　２０４７　約０．７％、水分　約１０％を含有するよう処方する。酵素（約１．　２％）は、突然変異体５００１、あるいは５００３．５００４．５００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６または５２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ７：本発明の態様による洗剤粉末は、次の物質を含有するように処方するニドデシルベンゼン−スルホン酸　６％、？　ｍ　ｏ　Ｉ　／ｍｏ＋の酸化エチレンと縮合するＣＩ２〜ＣＩ５直鎖アルコール５％、脂肪酸石鹸　３％、５ｏｋｏｌａｎｙ７　ＣＦ２　ポリマー　３％、ゼオライト　Ａ　２２％、炭酸ナトリウム　１０％、硫酸ナトリウム　１７％、クレイ粒子　８％、過硼酸ナトリウム四水化物　１３％、テトラアセチルエチレンジアミン　２％、プロテアーゼ　０．５％、少量物質及び水（１００％にする）。ｐＨは、９〜１０の値に調整する。プロテアーゼ酵素は、突然変異体５ｏｏｉ、あるいは５Ｏ０３，５００４，５００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６または５２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ８：本発明の態様による洗剤（石鹸）バーは、次のように処方する：完全に鹸化される８２％獣脂、１８％椰子油をベースにし、０．１５％オルト燐酸で中和され、プロテアーゼ（バー組成物の約８ＧＵ／ｍｇ）と混合され、蟻酸ナトリウム２％、ホウ砂２％、プロピレングリコール　２％、及び硫酸ナトリウム１％と混合され、次に石鹸生産ラインで圧出される石鹸。プロテアーゼ酵素は、突然変異体５００１、あるいは５００３．５００４．５００５、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８，５０２１，５０２５，５０３５，３２０１，５２０２，５２２３，５２２４，５２２５，５２２６または５２３５によるプロテアーゼを包含する。洗剤Ｄ９：明確な構造を有する液体洗剤は、例えば、本明細書に加えて、２〜１５％非イオン界面活性剤、５〜４０％総界面活性剤（非イオン及び任意に陰イオン界面活性剤を包含する）、５〜３５％燐酸塩含有又は非燐酸塩含有ビルグー、０．２〜０．８％重合増粘剤、例えば１０６以上の分子量を有する架橋アクリルポリマー、少なくとも１０％の珪酸塩ナトリウム、例えば中性水ガラス、所望のｐＨ１好ましくは９〜１０又はそれ以上の範囲の、例えばｐＨ１１以上に調整するためのアルカリを含有し、ナトリウム陽イオン　：　珪酸塩陰イオン（遊離シリカとして）の比（重量％）が０．７：１未満であり、そして０．３〜３０Ｐａｓ（２０℃ 及び２０５−１）であってもよい。好適な実施例は、１モル当たり約５ＥＯ基及び１モル当たり２．７ＰＯ基でアルコキシル化される５％非イオン界面活性剤ＣＩ３〜Ｃ１５アルコール、シリカと酸化ナトリウムの重量比が３．５である１５〜２３％の中性水ガラス、１３〜１９％ＫＯＨ，８〜２３％５ＴＰＰ、０−１．１％炭酸ナトリウム、０，５％Ｃａｒｂｏｐ。１η　９４１を含有する。プロテアーゼ（例えば０．５％）は、突然変異体５００１、あるいは５０２１．３０２５．５０３５、＄２０１．５２０２．５２２３．５２２４．５２２５．５２２６、又は５２３５を包含する。洗剤Ｄ１０洗濯用に適した、明確な構造の、粘性の、水性液体洗剤は、以下のように処方する（重量％）　：　ｙ＋＋！７？〜１０・＝？凋’ｉ！ＡＪ・Ｃ１４−Ｃｌ３　ｊｌ１７ルヤにヘンセフ入１し小ン６又１−２ヌＩＪ　Ｃ１４（５第１フル、）刀ＶｓＩｌｌ、Ｐ：μ基−６，５シン（９二・／７　Ａ３ノニ４二・／７　Ｃ１２−Ｃｌ３　３ＥＯ１，２シシ々ロニソ７　Ａ７ノー、Ｔ二〆７　Ｃ１２−Ｃｌ３　７ＥＯ３，６ｕ”、ｔ　７１　ｉ−２０デロフ了−ｚ’　ＯＪ酵素は、突然変異体５０２０によるプロテアーゼである。本洗剤の別の種類においては、酵素は５Ｏ１９，５Ｏ１２、Ｓ。０４．５００１．５００３．５００５．５０２１．５０３５．５２０１．５２２３−６、又は５２３５から洗濯される。洗剤Ｄ１１；選択用に適した等方性の、水性液体洗剤は、以下のように処ＫＯ８４，５７１しｔ＝−ｙｌ。シ２／−］し　６−５ＴＩ？４：４γ牟Φヰづ官岑コＩ（Ｃ１２−７少ｓ−＋し’　６−５　ＥＯｚｐ”（”ｙＶＡＦ）ｔ−／ｎｌ０１１ス＋ｉｑ＋ｙｙ：＋−ｗ４に、鰍ｎ雪’ｙｃ−２１０１“し４ン練　１６ヤシシ中　（Ｃ１２ｉ　石、アＡ）　１１１０１７−込”　０．５ジー１オータトｄし月＋、、　ｊｏ、１ｏｏｋｐｔ＋は、９〜１０の値に調整し得る。酵素は、突然変異体５０２０によるプロテアーゼである。本洗剤の別の種類においては、酵素は５０１９、Ｓ　０１２．５００４．５ｏｏ１．５００３．５００５．５０２１．５０２５．８０３５．５２０１．５２２３−６、又は５２３５から選択される。洗剤Ｄ１２水性液体洗剤組成物は、以下の物質を含有するよう処方される：了シヘ＋７ベ゛シτ゛ン入シ々・ン峡７ｖ”ｒつ（−、１４，’ＩＣＬＯブトＩうらジら＋７／Ｖ　２計４１ンげしり↑ＩＪ　（Ｃ１２−１ｓ　６ＥＯ）　９１１＆Ｉ柿Ｉ！軌　（イレＡン練　）　４．５７ヤケ：　ｌｌｚ、、：　ｌ　Ｊ　（ＩＬＪアトｌＩ＋４ −　１１４ｔＡＬ＋Ｊ　Ｖ・１ｉｔ２−　Ｄａｑｕａｓｔ　２０６０　０−７ｐＨは、９〜１０の値に調整し得る。酵素は、突然変異体５０２０によるプロテアーゼである。本洗剤の別の種類においては、酵素は、５０１９．５０１２．５００４．５００１．５００３．５００５．５０２１、＄０２５．３０３５．５２０１．５２０２．５２２３−６、又は５２３５から選択される。洗剤Ｄ１３水性液体洗剤組成物は、以下の物質を含有するよう処方される二アルキｌしにンセ゛ンヌルがン１９１−リ？Ａ　ｓ砂イｆ＞４１−？ｌ　ｉ、ｔｔｏ　１０りｘ；４１＋−リフＡ１９すｕｅｒｉ、ｘｏｌｏ　ｏ、ｓ７′０−ｆアー乞？　０．５ｐＨは、９〜１０の値に調整し得る。酵素は、突然変異体５０２０によるプロテアーゼである。本洗剤の別の種類においては、酵素は、５０１９．５０１２．５ＯＯ４，３００１，５Ｏ０３，５００５，５０２１，５０２５，５ｏ３５．５２０１．５２０２．３２２３−６、又は５２３５から選択サレル。洗剤Ｄ１４非水性液体洗剤組成物は、以下の物質を含有するよう処方される（重量％）：本組成物を処方する場合、液体非イオン界面活性剤及びトリアセチンを最初に付加し、その後酸化マグネシウムを、次に酵素以外の他の成分を加える。その混合物をコロイドミル中で微粉砕し、冷却して、最後に酵素及び任意のその他の感熱性少量物質を付加する。酵素は、突然変異体５０２０によるプロテアーゼである。本洗剤の別の種類においては、酵素は、５０１９．５０１２．５００４．５００１．５００３．５００５．３０２１．３０２５．５０３５．５２０１．５２０２．５２２３−６、又は５２３５から選択される。さらに、上記実施例Ｄ３に記載されているようなプロテアーゼ突然変異体に関して欧州特許第０．３４２，１７７号に例証されているような洗剤組成物も使用し得る。ズブチリシン３０９遺伝子の部位特異性突然変異の発生Ｍｏｒｉｎ＊１＊　ｃｌ　Ｉｌ、　（Ｂｉｏｌｓｃｔ＋＋＋ｏｌｏｇ７．　上記）の方法によって、部位特異性突然変異を実施した。突然変異を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた：ａ）Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ（Ｇ１９５Ｅ　（８００１））＋２７−ｍａｒ不適不適ラブライフｏｒ−２３７゜これも、新規の５ａｃｌ制限部位：を生じる。ｂ）Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　（Ｒ１７０Ｙ　（８００３））：２５−ｍｅｒ不適合プライ？−Ｎｏｒ−５７７ｏこれはＨａｅｌｌＴ部位：Ｈ但ユＵ５１　ＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣ３１Ｎｏｒ−５７７３’　ｃＧＡＴＡＧＧＣＣＧＴＡＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＣＧ　５’を破壊する。ｃ）Ｈｉｓ　１２０　Ａｓｐ　（Ｈ１２０Ｄ　（３００６１）：３２−ｍｅｒ不適合ブライ？−Ｎｏｒ−７３５゜これは５ｐｈｉ部位：を破壊する。ｄ）Ｌｙｓ　２５１　Ｇｌｕ　（Ｋ２５１ｇ　（８００５））：３２−ｍｅｒ不適合ブライｖ−Ｎｏｒ−７３６゜これはＸｈＯ■部位：を生じる。ｅ）Ｌｙｓ　２３５　Ｌｅｕ　（Ｋ２３５Ｌ（ＳＯ１５））：２４−ｍｅｒ不適合プライｖ−Ｎｏｒ７７−８５６゜これはＰＳｔ１部位：５’ＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡコ％ＧＡＡＣＣＣＡ３菅Ｎｏｒ−８５６５＋　ＧＣＣＣＴＴＧＴＴＪＡＡＧＡＡＣＣｅＡ　３’ｆ）Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ　；Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ　（Ｒ１７０Ｙ；Ｇ１９５Ｅ　（８００４））：Ｎｏｒ−５７７及びＮｏｒ−２３７の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｇ）Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ　；２５１Ｇｌｕ　（Ｇ１９５Ｅ；に２５１Ｅ　（ＳＯｌ８））Ｎｏｒ−２３７及びＮｏｒ−７３６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｈ）Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ　；Ｌｙｓ２５１Ｇｌｕ　（Ｒ１，７０Ｙ；に２５１Ｅ　（ＳＯＩＬ））：Ｎｏｒ−５７７及びＮ　ｏ　ｒ　−７３６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｉ）Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ　；ＧＩＹ１９５ＧＩｕ　；Ｌｙｓ２５１Ｇｌｕ　（Ｒ１７０Ｙ；Ｇ１９５Ｅ；に２５１Ｅ　（ＳＯ１２））Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ２３７及びＮｏｒ−７３６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｊ）ＧＩＹ１９５ＧＩ　ｕ　；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　（Ｇ１９５Ｅ　；に２３５Ｌ）：Ｎｏｒ−２３７及びＮｏｒ−８５６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｋ）Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ　；ＧＩｙ１９５ＧＩｕ　；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　（Ｒ１７０Ｙ；Ｇ１９５Ｅ；に２３５Ｌ）：Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７及びＮｏｒ−８５６の組み合わせを、上記と同様に実施した。１）Ｈｉｓ１２０Ａｓｐ；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ；に２３５Ｉ、（ＳＯｌ６））：Ｎｏｒ−７３５及びＮｏｒ−８５６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｍ）Ｈｉｓ１２０Ａｓｐ；ＧＩｙ１９５ＧＩｕ；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ；Ｇ１９５Ｅ；に２３５Ｌ　（ＳＯｌ、７））Ｎｏｖ−７３５、Ｎｏｒ２３７及びＮｏｒ−８５６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｎ）Ｈｉｓ１２０Ａｓｐ；Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ；ＧＩｙ１９５ＧＩｕ；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　（Ｈ１２０Ｄ；Ｒ１７０Ｙ；Ｇ１９５Ｅ、に２３５Ｌ　（ＳＯ１９））：Ｎｏｒ−７３５、Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７及びＮ。ｒ−８５６の組み合わせを、上記と同様に実施した。ｏ）Ｈｉ　ｓ　１２０Ａｓｐ　；Ａｒｇ１７０Ｔ）’　ｒ　；ＧＩｙ１９５ＧＩｕ　；Ｌｙｓ２３５Ｌｅｕ　；Ｌｙｓ２５１Ｇｌｕ　（Ｈ１２０Ｄ　、Ｒ１７０Ｙ　、Ｇ１９５Ｅ　；に２３５Ｌ　；に２５１Ｅ　（Ｓ０２０））：Ｎｏｒ−７３５、Ｎｏｒ−５７７、Ｎｏｒ−２３７、Ｎｏｒ−８５６及びＮ　ｏ　ｒ　−７３６の組み合わせを、上記と同様に実施した。不一致二重突然変異誘発は、鋳型としてプラスミドｐＳＸ９３、ｐｓＸ１１９、及びｐｓＸ１２０を用いて実施した。ｐＳＸ９３は、第３図に示されており、ポリリンカーに挿入されるターミネータを包含するズブチリシン３０９遺伝子の０゜７ｋｂ　ＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を有するｐ　Ｕ　Ｃ１３（Ｙｉｃｉｒａ、Ｉ　１ｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、１．　：ｊ９０．　Ｇｅ＋＋ｅ　１９：２５！ｌ−２６１１）である。酵素のＮ−末端部分における突然変異の導入に関しては、プラスミドｐｓＸ１１９を用いた。ｐｓＸ１１９は、ポリリンカーに挿入されるズブチリシン３０９遺伝子のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａｌ断片を有するｐＵｃ１３である。したがって、鋳型ｐｓＸ９３及びｐｓＸ１１９は、ズブチリシン３０９遺伝子の全体をカバーする。プラスミドｐｓＸ１２０は、ｐｓＸ８８からのズブチリシン３０９遺伝子を有するＨｐａｒ−Ｈｉｎｄ　ＬＩＴ断片がｐＤＮ１６８１上のＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ中に挿入され、そこでプロテアーゼ遺伝子がａｍｙ　Ｍ及びａｍｙＱ　プロモータによって発現されるプラスミドである。ｐＤＮ１６８１は、プロモータを伴うａｍｙ　Ｑ　遺伝子を有するＢ、　ａｍｙｌｏｌｊｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　（Ｔｉｋｋｉｎｅｅ　ｅ！　ａｌ、＋　１９０．　Ｊ、Ｂｉ。１、　Ｃｈｅｔ　２５８：　１０Ｇ７１［、）からの挿入２．８５ｂｐ　Ｃ１ａＩ断片を伴うｐ　ＤＮ　１３８０　（Ｄｉｄｅ＋ｉｃｂ＋ａｎ、Ｂ、ａｎｄ　Ｃｂ＋１ｇ１１ｍｎ５ｅｎ、Ｌ、：１９ｇｇ、　ＦＥＩｉＳ　ＭｉｃｔｏｂｉｏｌｏＢ　Ｌｅ口ｔｒｓ　５６＋５３−Ｇｏ）から得られる。ｐｓＸ１２０の構築は、第１図に示されているが、これは、ｐＤＮ１６８１がＥｃｏＲ５及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断され、そしてｐＳＸ８８がＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＨｐａｒで切断されて、その後結紮によって、ａｍｙＭ及びａｍｙ　Ｑプロモータにより調節されるｐｓＸ１２０が生じる。さらに４つのプラスミド、ｐｓＸ１７０、ｐｓＸ１７２、ｐＳＸ１７３及びｐｓＸ１８６を、ズブチリシン３０９遺伝子の不一致二重突然変異誘発のために構築したニーｐｓＸ１７０：５ｐｈｌ−Ｋｐｎｌ、ｐＵｃ１９中に挿入されるｐｓＸ１２０からの７ｏｏｂｐ。Ｓｐｈ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ、成熟ズブチリシン３０９中のアミノ酸残基１７０からターミネータまで。１）ＳＸ１７２：ＥｃｏＲＩ−８ｐｈｌ、ｐＵｃ１９中に挿入されるｐｓＸ１２０からの１３６０ｂｐ０ＥｃｏＲＴ−３ｐｈｌ、プロモータから成熟ズブチリシン３０９中のアミノ酸残基１７０まで。 −ｐｓＸ１７３　：ｐＳＸ１７０と同様。しかしＧ１９５Ｅを伴う。 −ｐＳＸ１８６：Ｐｖｕｌｌ−ＥｃｏＲＩ、ｐＵｃ１９中に挿入されるｐｓＸ１２０からの４１５ｂｐ。Ｈｉｎｃｌ−ＥｃｏＲＩ、アミノ酸残基１５から成熟ズブチリシン３０９中のアミノ酸残基２０６まで。第２図は、ｐｓＸ１２０のやや詳細な制限地図であって、プラスミドｐｓＸ１７０、ｐｓＸ１７２、ｐｓＸ１７３及びｐｓＸ１８６の構築のために断片を用いたことを示す。突然変異ａ）は、第３図に示すように、ｐ　５Ｘ９３をＸｂａＩ及びＣ１ａｌで切断することによって実施した。これは、’ＧＥＭ！ＩＩＡＴＩＯＮ　ＯＦ　５ＩＴＥ　ＤＩＲＥＣＴＥＤ　ＭＵＴＡＩＯＮＳ　Ｉｌｌ　ＴＨＥ　５ＵＢＴＩＬＩＳＩＮＧＥＮ“の項、及び未公開国際特許出願Ｐ　ＣＴ／ＤＫ　８８１０　Ｏｏ　０２　（ＮＯＹＯＩＮＤＵＳＴＲＩ　＾／ｓ）＋、：記ＩＬｔｔテｔ、１ル。突然変異ｂ）　、ｄ）及びｅ）は、同様にｐＳＸ１７０を５ｐｈｌ及びＫｐｎｌで切断することによって実施した。突然変異ｆ）及びｇ）は、上記と同様に実施したが、しかしｐｓＸ１７０の代わりにｐｓＸ１７３を用いた。突然変異Ｃ）は、同様に、ｐＳＸ１８６をＰｓｔｒ及びＥｃｏＲＩで切断することによって実施した。突然変異ｈ）〜０）は、適宜、制限部位Ｎｈｅｌ、Ｘｂａｌ。Ｃ１ａｌ、Ａｖａｌｌ及びＫｐｎｌを用いて、ＤＮＡ断片を単−又は二重突然変異ｂ）〜ｇ）と組み合わせることによって実施した。さらに、文献から公知のような同様の方法又は一般的方法を用いて、突然変異体を作った。ズブチリシンＣＩｒ１ｓｂｔ＋１突然変異体本明細書に記載のズブチリシンＣｓ＋ｌｓｂ！Ｈにおける突然変異のある実施例のために、遺伝子のヌクレオチド配列における以下の変化を導入した；八ｓｐ　１４　Ｌｙｓ　＋　Ａｓｐ　１２０　Ｌｙｓ　＋　Ａｓｐ　１４０　Ｌｙｓ　十　八ｓｐ　１７２　Ｌｙｓ（Ｄ１４１ＫＤ１２０に＋Ｄ１４０に＋Ｄ１７２Ｋ　（ＣＯｌｏ））Ｖａｌ　５１　Ａｓｐ　（Ｖ５１Ｄ　（Ｃ１００））Ｇｌｕ　５４　Ｔｈｒ　（Ｅ５４Ｔ　（Ｃ１０１））　（ＧＧＧ　−＞　ＡＣＡ）Ｇｌｕ　５４　Ｔｙｒ　（Ｅ５４Ｙ　（Ｃ１０２））　（ＧＧＧ　−＞　ＴＸＴ）これらの変化は、関連の断片中の対応するオリゴを変えることによって導入した。新しい配列の正しさは、本来のオリゴがこれらの新しい配列に置き換えられ、新ＤＮＡ断片中に集められた後に、確証した。最後に、断片を新規のズブチリシンＣ。１ｓｂｅＢ遺伝子中に再収集した。突然変異体ズブチリシンの発現正しい突然変異の配列確証後、変異ＤＮＡ断片をプラスミドｐＳＸ９２又はｐｓＸ１２０に挿入し、これを突然変異体を生成するために用いた。プラスミドｐＳＸ９２は第４図に示されており、これは、ＣＩａｌで切断され、ＤＮＡポリメラーゼ　Ｉ　のＫｌｅｎｏｗ断片で充填され、そしてクローン化Ｓｕｂ　３０９遺伝子からの断片Ｄｒａｌ−Ｎｈｅｌ及びＮｈｅ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉの挿入前にＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断されたプラスミドｐｓＸ６２中でＳｕｂ　３０９遺伝子をクローニングすることによって生成した。突然変異体を発現するために、変異断片（ＸｂａＴ−Ｃ１ａ１、ＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、又はＥｃ　ｏＲＩ−Ｘｂ　ａ　Ｔ）を適切な突然変異プラスミドｐｓＸ９３、ｐｓＸ１１９、ｐＳｘ１７０、ｐｓＸ１７２、ｐｓＸ１７３及びｐＳＸ１８６からそれぞれ切り取って、ｐＳＸ９２又はｐｓＸ１２０中に挿入して、種々の突然変異体を発現できるプラスミドを得た。次に、変異ｐＳＸ９２又はｐｓＸ１２０を用いて、Ｂ、＋口ｂｌｉｌｔ＋　ＤＮ４９７を形質転換した。つぎに、形質転換細胞を１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，６μｇ／ｍ１　クロラムフェニコール、及び０．　２％キシロースを含むＬＢ寒天平板上に広げて、プラスミドのｘｙｎ−プロモータを誘導した。平板は、さらに、１％スキムミルクを含有していたので、プロテアーゼ生成形質転換体を、スキムミルクが変性していた場合、明白なハローによって検出できた。適当な増殖後、変異酵素を回収し、精製した。ズブチリシンＣｕｌ＋ｂｅＢ種の発酵上記のように、ＢＰＮ’　に関する突然変異体遺伝子を有する微生物を基礎にしてプロテアーゼ酵素を生成するためには、８枚の羽根車を有し、有効容積が８リツトルであるＲｕ５ｈｔ。！１型Ｃｈ　ｅｍｏ　ｆ　ｅ　ｒｍ発酵器を一般に使用した。発酵器の構造は、ＶＭＴに関する安全性規回に合致するよう作られており、次のもので構成されていた・ａ）０，１ｂａｒを上回る過剰圧の空気供給を遮断する圧力調節器（４−３１２２型　Ｂｅ１ｌ　＆）ｌｏｗｅｌｌ）　。これは、排気エアフィルターの目詰まりを防ぐために行う。ｂ）底に消泡剤を有する２０１　吸引容器から構成される排気口の発泡トラップ。Ｃ）冷却水又は水道水ドレンの汚染を防止するために、封止装置のない冷却水外被。ｄ）絶対排気フィルターを使用する（Ｇｅ１ｍａｒ＋　ａｃｒｏ　５０，０．４５ミクロン）。ｅ）内部容積が小さいサンプリング　ポンプ装置によるサンプリング。制御気体流量は、質量流量ｔｔ　（Ｂ＋ｏｏｋ＋、５８５２型、範囲　０〜１０１）を用いて制御した。ｐＨは、）ｌｒｔｌｍｘａｎ　ｔｎｄ　Ｂ目ｌ　トランスミツター、及びＰｈ１ｌｉｐｓコントローラ（Ｗ自ＴＯＩＩ１１　を用いて制御した。濃Ｎ　ａ　ＯＨ（３Ｍ）は、中和剤として用いた。排気は、Ｕｎｏｒ　４Ｎ（Ｃｏ２）及びＯｘｙｇｏｒ　７Ｎ（０２）　（Ｔｏｉｈｇｋ、　１ｌＩｅ＋ｌｉｎｇｔｉｏ…）を用いて分析した。媒質中の酸素張力は、工業用ポーラログラフイーで滅菌可能な酸素プローブ（Ｉｎｇｏｌｄ　３２２７５６７０２型）を用いて測定した。媒質温度は、Ｐ　Ｔ　１．００センサー及びＨｏｎｅｙｗｅ　Ｉ　１４度制御器（等級８４）を用いて監視した。発泡は、接触電極を用いて需要可能なレベルに維持し、一方レベルスイッチは、消泡剤投入ポンプを作動させた。外部制御はすべて、Ｈｅｖｌｅｌｌ　Ｐｓｃｋ１ｒｄマイクロコンピュータ（ＨＰ２２０）の制御下におかれた。培養条件接種物は、回転振盪器（ＩＪＩ　Ｆｅ＋ｍｅｉ１１１ｉｏｎ、ＭＫ　ｘ型）中で２５０ｒｐｍで、３０℃で１６時間、振盪フラスコ培養をインキュベートして調製した。実際の発酵条件（ｐＨ７，０，３０℃、空気流速　３．５１／分、攪拌　１０００〜１５００ｒｐｍ）に調整した８Ｌ　の媒質に対して、３００ｍ１の接種物を用いた。溶解酸素濃度は、空気飽和を２５％上回るように維持した。使用した消泡剤は、シリコーン油ベースの物質（Ｒｈｏｄｏ＋ｔｉｌ　Ｒ４２Ｇ、Ｒｂｏｎｔ　Ｐｏｕｌｔｍｃ）であった。ズブチリシンプロテアーゼの生成（変異）プロテアーゼは、遺伝子構築の項に記載されているような変異遺伝子を含有するＢ、　ｎｂｌｉｌｉ＋　Ｄ　Ｂ　１０５株を用いて生成した。培地は、８ｇ／ｌ　ＮＨ４Ｃｌ、４ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，４ｇ／ｌＫ２　ＨＰＯ４，２ｇ／ｌ　ＮａＣｌ、１ｇ／］ＭｇＳＯ４，２Ｈ２０，１０ｇ／　ｌ酵母抽出物、４０ｇ／ｌシタ糖、ｐＨ７，０を含有し、４５℃で１２０分間滅菌された。滅菌後、２５ｍｇ／ｌトリプトファン、２０ｍｇ／ｌネオマイシンを加えた。発酵は、２０〜３０時間後に中止した。遠心分離によって、媒質と細胞を分けた。突然変異体ズブチリシンの蛋白質分解活性種々の突然変異体の蛋白質分解活性を、Ｊ二記の０ＭＣ法によって、蛋白質基質としてのカゼインに対して試験した。その結果を、表ＴＶに示す。この表から、突然変異体（Ｓ　Ｏ０５）は、親（Ｓ　Ｏ００）に比してわずかに強い活性を示すが、一方残りの突然変異体はわずかに低い活性を示すことが判る。Ｎｏｎｅ　（５０００）　１００ＳＯＯ５１０５ＳＯ】７　り０突然変異体ズブチリシンの洗゛Ａ：ｐＨ８，１４の標準液体洗剤における種々の突然変異体の洗浄性能を、上記に詳述した方法によって、草汁に対してモデル系で試験した。その結果を、表Ｖに示す。筒賓ダ爪　４東ま攬１０　ｍｇ／ｌ　１０．０　ｍｇ／１５０００　４．０　１０．７５００１　５．９　１２４５００３　６．０　１３．５５００４　５．８　１３．０５０１２　４．２　９．６５０１９　１０．５　１９．４Ｓ０２０　Ｃ４１８，６表から、試験した突然変異体のすべてが、野生里親酵素に比して改良された又は等しい洗浄性能を示したことが判る。突然変異体５０１９及び５０２０の洗浄性能は改良され、これらの酵素１．０ｍｇ／Ｉは大体、野生里親酵素１０．０ｍｇ／ｌに取って代わり得る。これは、本発明の突然変異体酵素に関する洗浄性能の実質的改良を示す。Ｂ：モデル系における種々のｐＨ値での改良型の市販の米国液体洗剤の酵素変異体のいくつかの試験結果を、表Ｖｌに示す。゛弘２ピま贅４察１　デ’ｐ−’ｌｉｐ工。　ｐＨ８，０９，０１０，０１１，０Ｓ０００　１０．０２　１．４　２．６　３．１　１０．１Ｓｏｏ１９．８６　２．１　４．０　６．６　１４．０６００３　９．８６　２．３　５．０　Ｂ、１　１４．１５００４　９．６Ｂ　４．１　９．７　１１．フ　１ｏ、９５００５　９．７１　２．２　４．３６．３　１３．９８０１２　９．０９　５．７　１１．９　１３Ｊ　６．３８０１９　９．０９　６．４　１０．７　１２．２　３．７５０２０　６．７１　７．８　１０＋６　８．５　２．４酵素の洗浄性能に最適のｐＨに洗液ｐＨを動かす方向に酵素のｐＴを移動すると、酵素の洗浄性能が改良されることが、結果から明らかである。Ｄ＝種々の突然変異体の洗浄性能を、検定Ａに記載の方法によって、草汁で汚した木綿布に対して試験した。２．０ｇ／Ｉの液体洗剤（洗剤Ｄ３）を用いた。洗剤は、イオン交換水に溶解した。ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣＩで、９．１に調整した。温度は、１０分間、２０℃の恒温に維持した。突然変異体は、各々、０．２５．０．５．１．０．２．ｏ；５．０；及び１０．０ｍｇ酵素／ｌで投与した。試験した突然変異体の安定性は、示差走査熱量計、ＤＳＣによって、変性温度（最大過剰加熱能力）を測定することによって、調べた。加熱率は、０．５℃／分であった。安定性は、検定へに記載されている組成物である９１％標準液体洗剤中に約２ｍｇ／ｍ＋を含有する溶液中で調べた。溶液は、１００μｍの酵素溶液（０，ＯＩＭ　ジメチルグルタル酸、０．００２Ｍ　ＣａＣ１０，２Ｍ　Ｈ３ＢＯ３及び０〜０゜２ゝＬＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６，５の緩衝液中に、約２０ｍｇ酵素／ｍ１）と、１０００μｌの標準液体洗剤とを混合して作った。ズブチリシン３０９突然変異体の群のうち、ＤＳＣによって得られた安定性結果は、伝統的貯蔵安定性試験によって得られた安定性結果と一致する。結果液体洗剤における種々の突然変異体の洗浄性能を、表Ｖｌｌに示す。結果は、改良因子が野生里親酵素に関することを示す。改良因子は、検定Ｃにおけると同様に定義される。さらに、表ＶＩＩは、ＤＳＣによる標準液体洗剤における変性温度、並びに野生里親酵素の変性温度と問題の突然変異体の５０００　１０．０６　１　６５−２　０．Ｏ５０２０１−３０７，６５８，２−７，０Ｓ　０２１　９．８５　１．３　６９＋２　＋４．０５０２２　８．０７　９．３　６１．９　−３．コＳ　０２３　８．０５　Ｃ８６３−５−Ｌ７Ｓ　０２４　Ｃ８６３−９６（Ｃ６−４，６５０２５８，９４６，７６９，１＋１９５０３５　８．０７　７．０　７２．５　÷７．３Ｓ　２０１　９．８５　１．４　６９．４　÷４．２表ＶＩＩから、試験した突然変異体はすべて、野生里親酵素に比して洗浄性能の改良を示すことが判る。最高の洗浄性能は、洗浄液のｐ　Ｈと等しいかわずかに低いＰＩ、を有する突然変異体によって達成されることが判る。表Ｖ１１に記載された一つ又はそれ以上の突然変異体に包含される突然変異の間では、とへＲ１７０ＹＫ及び２５１Ｅは野生里親酵素に関して突然変異体を不安定にし、一方突然変異Ｈ１２０ＤＳＧ１９５Ｅ及びに２３５Ｌは安定性に関しては異ならない。表Ｖ１１から、安定化突然変異が含まれている場合でも、ある不安定化突然変異を含有する突然変異体は不安定化されることが判る。＊３６Ｄ及びＮ７６Ｄの安定化効力は、付加的である。これは、突然変異体５０２５及び５Ｏ３５によって示される。５０２５は、安定性が異ならない３つの突然変異と、安定化突然変異＊３６Ｄを含有する。５０２５に関する変性温度は、野生里親酵素に関して３．９℃まで増大するが、これは、単一突然変異体＊３８ＤＳＳＯ２１に関して測定された増大と等しい。５０３５は、同一の突然変異Ｎ７６Ｄを含有する。５０３５に関する変性温度は、野生里親酵素に関【２て７．３℃まで増大するが、これは実験的誤差の範囲内で、単一突然変異体＊３６Ｄ。３０２１及びＮ７６Ｄ、５２０１に関して測定された増大の合計に等しい。Ｅ：３つの突然変異体の洗浄性能を、検定Ａに記載の方法によって、草汁汚染木綿布に対して試験した。２．０ｇ／Ｉの液体洗剤Ｄ３を用いた。洗剤は、イオン交換水に溶解した。ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣＩで、９．１に調整した。温度は、１０分間、３０℃の恒温に維持した。突然変異体は、各々、１，０及び１．Ｏ，Ｏｍｇ酵素酵素／段与した。結果市販の米国製液体洗剤における３つの突然変異体の洗浄性能を、草汁に対して試験した。その結果を、表Ｖｌｌｌに示す。Ｓ　０００　１０．０６　４．５　１３．６８００３’　９．７５　９．＜　１８．Ｏ５００４ｇ、５４　１３．７　１Ｂ、ＩＳ　００６　９．８５　６．（１１５，６表ＶＩＩＩから、試験した突然変異体はすべて、野生里親酵素に比して洗浄性能の改良を示すことが判る。さらに、最高性能は、洗浄液のｐＨに最も近いｐ　Ｉ　ｏを有する突然変異体が達成することが判る。Ｆ：２つの突然変異体の洗浄性能を、実施例Ｅに記載の条件によって、草汁汚染木綿布に対して試験した。結果洗剤Ｄ３における２つの突然変異体の洗浄性能を、草汁汚染木綿布対して試験した。その結果を、表ＩＸに示す。表ＩＸから、試験した突然変異体はすべて、野生里親酵素に比して洗浄性能の改良を示すことが判る。さらに、最高性能は、洗浄液のｐＨに最も近いｐ　Ｋ　ａを有する突然変異体が達成することが判る。Ｇ；種々の突然変異体の洗浄性能を、検定Ａに記載の方法によって、草汁で汚した木綿布に対して試験した。２．０ｇ／ｌの洗剤Ｄ３を用いた。洗剤は、緩衝液（イオン交換水中に０．００２５Ｍ硼酸及び０．００１燐酸水素二ナトリウムを溶解）に溶解した。ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣＩで、それぞれ７．０．８．０，９．０及び１０．０に調整した。温度は、１０分間、３０℃の恒温に維持した。突然変異体は、各々、０．２ｍｇ酵素／１で投与した。結果：モデル系における種々のｐＨ値での本発明の酵素変異体のいくつかの洗浄性能を、表Ｘに示す。５Ｏ１５Ｋ２コ５Ｌ　９．９５　１．コ　２．４　６．０　８−８Ｓ０２１　リ６０　９．８５　２．１　１．２　５．６８．３５０１７　Ｈ１２０Ｄ、Ｇ１９５Ｅ、に２３５Ｌ　９−４０　２．９　５．４　１０．８１４−１Ｓ０２５　☆ 〕６Ｄ、Ｈ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ。Ｋ２コ５Ｌ　８．９５　４．：１　９．５　１コ、９１）、１５０２コ　＊１６０．Ｈ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ。ｃｘ９ｓＥ；ｘ２３ｓｔ、　ａ、ｏｓ　９．６　１：１．０　１２．４９−２Ｓ０２４　★コロＤ、８１２００．Ｒ１７０Ｙ。Ｇ１９５Ｅ、に２３５Ｌ、に２５１Ｅ　６．８６　９，４　１０．４　６．７４．８表Ｘの結果は、洗浄液のｐＨに対してプロテアーゼのｐＩを移動すると、プロテアーゼの洗浄性能が改良されることを、明らかに示している。結果はさらに、試験した変異体がすべて、１０．０以下のｐＨで、野生型粗解素に比して性能の改良を有することを示す。Ｈ：種々の突然変異体の洗浄性能を、検定Ａに記載の方法によって、草汁で汚した木綿布に対して試験した。２．０ｇ／ｌの液体洗剤Ｄ３を用いた。洗剤は、イオン交換水中に調製した０、００５Ｍグリシンに溶解した。ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣＩで、それぞれ１０．０．１０．２５．１０．５０．１０．７５．１１．０．１１，５及び１２．０に調整した。温度は、１０分間、３０℃の恒温に維持した。突然変異体は、各々、０．２ｍｇ酵素／１で投与した。結果：モデル系における種々のｐＨ値での本発明の酵素変異体のいくつかの洗浄性能を、表ＸＩに示す。この場合、野生型粗解素よりわずかに高いｐｉを有する変異体を調べた。１０．〜１２゜０の範囲のｐＨを、前記実施例の場合よりさらに詳しく調べた麦×１・叉５張失　〒゛゛゛ルア０２８　ＤｌＢｌＮ　１０．２８　６．９　９Ｊ　１０．＋５Ｓ０３２　Ｄ１９７Ｎ　１０．２８　４．７　９．２　１０．８５０３３　Ｅ２７１Ｑ　１０＋２８　７．Ｉ　Ｌ７　７．８５０３１　Ｄ１９７Ｎ、Ｅ２７１Ｑ　１０．５３　４＋７　’？−２７，０Ｖａｒｉａｎｔ　Ｍｕｔａｔｊｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｒ５０２７Ｅ８９Ｓ　ｘｏ、２ａ　１１＋９１４−３　ｘ２．ａ　ｓ、。５０２８　ＤｌＢｌＮ　１０．２８　１１０　１４．４　１０．７　４．６ＳＯ３２Ｄ１９７Ｎ　１（１２８１：１．８　１１５　ｉｌｌ　５．０５０３３　、Ｅ２７１Ｑ　１０．２８　１０．４　１：Ｌ７　１３．３　Ｌ３５０３１　Ｄ１９７Ｎ、Ｅ２７１ＱＩ０．５：］　１０．７　１３−０　１４．４　８．７表ＸＩのデータは、高ｐＨ値では、最高性能は、算出されたｐｌを少し上回るｐＨ値で達成されることを示す。さら臥プロテアーゼのｐｒを増大すると、最高性能のｐＨ力（増大する傾向がある。低ｐＨ値（検定Ｂ及びＧ）で判明したように、その効力は顕著でない。 ■ニプロテアーゼの等電点と、プロテアーゼがその最高性能を有するｐＨとの相関を目で見て判るようにするために、実施例Ｂ１Ｇ及びＨからの結果を用いて、調べた変異体（及び野生型粗解素）の各々がその最高性能を有するｐＨを見つける。第５図では、このｐＨ１ＩＸは、算出されたｐＩｏの関数として示される。ｐＨ値１．０の工程でｐＨ範囲を調べることを考慮に入れれば、相関は明らかである。本発明の突然変異体とリパーゼとの組み合わせに関しては、実験結果から、次の実際的結論が引き出される：リパーゼは、３７℃での０型の洗浄液中で１時間安定であった。５ａｖｉｎａｓｅ■の存在によって、急速に脱活性化が生じた。Ｋａｚｕａａｓｅ■は、試験期間中、実質的に低いリパーゼの不活性化を生じた。プ。ティナーゼには、リパーゼに対して５ａｖｉｎａｓｅ■よりも積極的でないが、しかしＫａｚｕｓａｓｅ■より攻撃的であった。しかしながら、ズブチリシンＢＰＮ’　は、これらの条件下では、リパーゼを全熱不活性化しなかった。例えば、０型が示すような洗浄組成物中でリパーゼき結合させて用いるのに好ましいプロテアーゼは、突然変異体５００１．３００３．３００４．５０１２．５０１９．３０２０Ｓ３０２１．５０２５．５Ｏ３５及び５２３５である。Ｏ型洗浄液は、次の洗剤組成物から得られる３７℃の５ｇ／ｌ溶液であった：１イｆン濁〜彰すを周１ｆｉ７　６イｒイインｌチビＬｎす１５４雌４　１７−５例えば、０型が示すような洗浄組成物中でリパーゼと結合させて用いるのに好ましいプロテアーゼは、突然変異体５Ｏ２０，５０２１，５０２５，５０３５及び５２３５である。Ｗ型洗浄液は、以下の組成物を有する液体洗剤の２ｇ／ｌ溶液であった（重量％）二謄伺ンす１４性午１　１６チ１ｒ４４ン界信ｌ福シ１乍礫円　７ＮａＯＨ−４、１承／”Ｆ／−１）アｊ　７２尤Ｉ　Ａ　ｅ　ムレ”ｌ”＜　ｔｏ　１００゜本発明を、その種々の特定の態様と結びつけて考察し、例証してきたが、しかしこれは開示の適用可能性及び範囲を限定するものでなく、このことは、上述の特徴のすべての組み合わせ並びに添付の請求の範囲にも及ぶ。国際調査報告Ｗ＋Ｉ＋ｊｌｌ＠”ｌ　Ａ＃ｅ”１ｊ１４”　Ｍｅ　ＱｒＴ／（’：Ｑ　Ｑｌｉ　／ｒ＋Ｌ”＋ｏ”　２国際調査報告ＧＢ　９０００９８５Ｓ＾　３７ＢＳ７

Claims

【特許請求の範囲】１．突然変異ズブチリシンプロテアーゼを含有する酵素洗剤組成物であって、プロテアーゼの正味分子静電荷が、同一ｐＨで親プロテアーゼと比較すると変化していた、例えば、上記プロテアーぜにおいて、上記親プロテアーぜに関して、下記の指示位置付近の欠失、置換、又は挿入（単一又は多数）によって任意の一つ又はそれ以上の該位置１，２，３，４，６，９，１０，１２，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２４，２５，２７，３６，３７，３８，４０，４１，４３，４４，４５，４６，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，７５，７６，７７，７８，７９，８７，８９，９１，９４，９８，９９，１００，１０１，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１２，１１３，１１５，１１６，１１７，１１８，１２０，１２６，１２８，１２９，１３０，１３１，１３３，１３４，１３６，１３７，１４０，１４１，１４３，１４４，１４５，１４６，１５５，１５６，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７，１７０，１７１，１７２，１７３，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８８，１８９，１９１，１９２，１９４，１９５，１９７，２０４，２０６，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１８，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４１，２４２，２４３，２４４，２４５，２４７，２４８，２４９，２５１，２５２，２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５９，２６０，２６１，２６２，２６３，２６５，２６９，２７１，２７２，２７５，９７，でのアミノ酸残基の間に、より少数の又はより多数の正荷電アミノ酸残基及び／又はより多数の又はより少数の貧荷電アミノ酸残基が存在し、それによって上記ズブチリシンプロテアーゼが上記親プロテアーゼより低い等電ｐＨ（ｐＩｏ）を有することを特徴とする組成物。２．突然変異ズブチリシンプロテアーゼを含有する酵素洗剤組成物であって、プロテアーゼの正味分子静電荷が、同一ｐＨで親プロテアーゼと比較すると変化していた、例えば、上記プロテアーぜにおいて、上記親プロテアーぜに関して、下記の指示位置付近の欠失、置換、又は挿入（単一又は多数）によって任意の一つ又はそれ以上の該位置１，２，３，４，６，９，１０，１２，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２４，２５，２７，３６，３７，３８，４０，４１，４３，４４，４５，４６，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，７５，７６，７７，７８，７９，８７，８９，９１，９４，９８，９９，１００，１０１，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１２，１１３，１１５，１１６，１１７，１１８，１２０，１２６，１２８，１２９，１３０，１３１，１３３，１３４，１３６，１３７，１４０，１４１，１４３，１４４，１４５，１４６，１５５，１５６，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７，１７０，１７１，１７２，１７３，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８８，１８９，１９１，１９２，１９４，１９５，１９７，２０４，２０６，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１８，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４１，２４２，２４３，２４４，２４５，２４７，２４８，２４９，２５１，２５２，２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５９，２６０，２６１，２６２，２６３，２６５，２６９，２７１，２７２，２７５，９７，でのアミノ酸残基の間に、より多数の又はより少数の正荷電アミノ酸残基及び／又はより少数の又はより多数の負荷電アミノ酸残基が存在し、それによって上記スナチリシンプロテアーゼが上記親プロテアーゼより高い等電ｐＨ（ｐＩｏ）を有することを特徴とする組成物。３．さらに、プロテアーゼが、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシンアミロサッカリチクス、ズブチリシン１６８、ズブチリシン腸間膜ペプチダーゼ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７、サーミターゼ、ＢａｃｉｌｌａｓＰＢ９２プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、アクアリシン、プロテアーゼＴＷ７、及びプロテアーゼＴＷ３から選択される親酵素の突然変異を示すことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。４．さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてズブチリシン３０９をベースにすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。５．さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてズブチリシン１４７をベースにすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。６．さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてズブチリシンＣａｒｌａｂｅｒｇをベースにすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。７さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてＢａｃｉｌｌｃｓＰＢ９２プロテアーゼをベースにすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。８．さらに、プロテアーゼが、一つ又はそれ以上の突然変異：Ｒ１０Ｆ，Ｒ１０Ｌ，Ｒ１０Ｆ＋Ｒ４５Ａ＋Ｅ８９Ｓ＋Ｅ１３６Ｑ＋Ｒ１４５Ａ＋Ｄ１８１Ｎ＋Ｒ１８６Ｐ＋Ｅ２７１Ｑ，Ｒ１０Ｆ＋Ｒ１９Ｑ＋Ｅ８９Ｓ＋Ｅ１３６Ｑ＋Ｒ１４５Ａ＋Ｄ１８１Ｎ＋Ｅ２７１Ｑ＋Ｒ２７５Ｑ，Ｑｌ２Ｘ，Ｑｌ２Ｒ，Ｑ１２Ｋ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｋ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２Ｋ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｋ＋Ｔ３８Ｋ＋ｔ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ３８Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２Ｘ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｋ＋Ｔ３８Ｋ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｑ１２Ｒ＋Ｐ１４Ｄ＋Ｔ２２Ｒ＋Ｔ３８Ｒ＋Ｎ４３Ｒ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｐ１４Ｄ，Ｐ１４Ｋ，Ｐ１４Ｋ＋＊３６Ｄ，Ｐ１４Ｋ＋Ｎ２１８Ｄ，Ｐ１４Ｋ＋Ｐ１２９Ｄ，Ａ１５Ｋ，Ａ１５Ｒ，Ｒ１９Ｑ，Ｔ２２Ｋ，Ｔ２２Ｒ，Ｋ２７Ｒ．Ｋ２７Ｖ，Ｄ３２＊，＊３６Ｄ，＊３６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１Ｅ，＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２５１Ｅ，＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｔ３８Ｘ，Ｔ３８Ｒ，Ｄ４１Ｅ，Ｎ４３Ｒ，Ｎ４３Ｋ，Ｒ４５Ａ，Ｅ５３Ｒ，Ｅ５３Ｋ，Ｅ５３Ｇ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｅ５４Ｇ，Ｅ５４Ｙ，Ｑ５９Ｅ，ＱＳ９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ｄ６０Ｎ，Ｎ７６Ｄ，Ｅ８９Ｓ，Ｅ８９Ｓ＋Ｋ２５１Ｎ，Ｙ９１Ｆ，Ｋ９４Ｒ．Ｇ９７Ｄ，Ｇ９７Ｄ＋Ｈ１２０Ｋ，Ａ９８Ｋ，Ａ９８Ｒ，Ｓ９９Ｄ，Ｓ９９Ｄ＋Ｎ１４０Ｋ，Ｅ１１２Ｔ，Ｈ１２０Ｋ，Ｈ１２０Ｄ，Ｈ１２０Ｄ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２５１Ｅ，Ｐ１２９Ｄ，Ｅ１３６Ｑ，Ｅ１３６Ｋ，Ｅ１３６Ｒ，Ｅ１３６Ｑ＋Ｒ１０Ｌ，Ｎ１４０Ｄ，Ｎ１４０Ｋ，Ｎ１４０Ｒ，Ｓ１４１Ｘ，Ｓ１４１Ｒ，Ｒ１４５Ａ，Ｓ１５６Ｅ，Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ，Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ，Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｔ２１３Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，Ａ１５８Ｒ，Ａ１５８Ｋ，Ｙ１６７Ｖ，Ｒ１７０Ｙ，Ｒ１７０Ｙ＋Ｃ１９５Ｅ，Ｒ１７０Ｙ＋Ｋ２５１Ｅ，Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１Ｅ，Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｙ１７１Ｅ，Ｙ１７１Ｔ，Ａ１７２Ｄ，Ｎ１７３Ｋ，Ｄ１８１Ｎ，Ｎ１８４Ｋ，Ｎ１８４Ｒ，Ｎ１８５Ｄ，Ｒ１８６Ｐ，Ｙ１９２Ｖ，Ｙ１９２Ｖ，Ａ，Ｇ１９５Ｅ，Ｇ１９５Ｄ，Ｃ１９５Ｅ＋Ｔ２１３Ｒ，Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１Ｅ，Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ，Ｄ１９７Ｎ，Ｄ１９７Ｋ，Ｄ１９７Ｅ，Ｑ２０６Ｄ，Ｑ２０６Ｅ，Ｙ２０９Ｌ，Ｔ２１３Ｒ，Ｔ２１３Ｋ，Ｙ２１４Ｔ，Ｙ２１４Ｓ，Ｎ２１８Ｄ，Ｎ２１８Ｓ，Ｋ２３５Ｌ，Ｋ２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｗ２４１Ｙ，Ｌ，Ｗ２４１Ｙ＋Ｈ２４９Ｒ，Ｗ２４１Ｌ＋Ｈ２４９Ｒ，Ｎ２４８Ｄ，Ｈ２４９Ｒ，Ｋ２５１Ｒ，Ｋ２５１Ｅ，Ｋ２５１Ｎ，Ｔ２５５Ｅ，Ｓ２５６Ｒ，Ｓ２５６Ｋ，Ｓ２５９Ｌ，Ｓ２５９Ｄ，Ｙ２６３Ｗ，Ｓ２６５Ｋ，Ｓ２６５Ｒ，Ｅ２７１Ｑ，Ｅ２７１Ｇ，Ｅ２７１Ｇ＋Ｋ２７Ｖ，Ｅ２７１Ｑ，Ｇ，Ａ２７２Ｒ，Ａ２７２Ｒ，Ｒ２７５Ｑ，Ｄ１４Ｘ，Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｘ，Ｄ１４Ｘ＋Ｄ１２０Ｋ＋Ｄ１４０Ｋ，Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｋ＋Ｄ１４０Ｋ＋Ｄ１７２Ｋ，Ｋ２７Ｄ，Ｋ２７Ｄ＋Ｄ１２０Ｋ，Ｅ５４Ｔ，Ｅ５４Ｙ，Ｎ９７Ｄ，Ｎ９７Ｄ＋Ｓ９８Ｄ，Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２１３Ｄ，Ｓ９８Ｄ，Ｓ９８Ｄ＋Ｔ２１３Ｄ，Ｄ１２０Ｘ，Ｄ１４０Ｋ，Ｓ１５６Ｅ，Ｄ１７２Ｋ，Ｔ２１３Ｄ，Ｎ２１８Ｄ．を含有する突然変異ズブチリシンプロテアーぜであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。９さらに、プロテアーゼが、一つ又はそれ以上の突然変異：Ｓ００１）Ｇ１９５ＥＳ００２）Ｇ１９５ＤＳ００３）Ｒ１７０ＹＳ００４）Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５ＥＳ００５）Ｋ２５１ＥＳ００６）Ｈ１２０ＤＳ００８）Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５ＥＳ００９）Ｔ７１ＤＳ０１０）Ｔ７１Ｄ＋Ｇ１９５ＥＳ０１１）Ｒ１７０Ｙ＋Ｋ２５１ＥＳ０１２）Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１ＥＳ０１３）Ｔ７１Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｋ２５１ＥＳ０１４）Ｔ７１Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１ＥＳ０１５）Ｋ２３５ＬＳ０１６）Ｈ１２０Ｄ＋Ｋ２３５ＬＳ０１７）Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＳ０１８）Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１ＥＳ０１９）Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＳ０２０）Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２５１ＥＳ０２１）＊３６ＤＳ０２２）＊３６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１ＥＳ０２３）＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＳ０２４）＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２５１ＥＳ０２５）＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＳ０２６）Ｅ１３６ＲＳ０２７）Ｅ８９ＳＳ０２８）Ｄ１８１ＮＳ０２９）Ｅ８９Ｓ＋Ｅ１３６ＲＳ０３０）Ｅ８９Ｓ＋Ｄ１８１ＮＳ０３１）Ｄ１９７Ｎ＋Ｅ２７１ＱＳ０３２）Ｄ１９７ＮＳ０３３）Ｅ２７１ＱＳ０３５）＊３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＳ０４１）Ｇ１９５ＦＳ２０１）Ｎ７６ＤＳ２０２）Ｎ７６Ｄ＋Ｇ１９５ＥＳ２０３）Ｎ７６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５ＥＳ２０４）Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２５１ＥＳ２２３）Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｔ２１３Ｋ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２４）Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２５）＊３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｒ＋Ｋ２１５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２６）＊３６ＱＳ２２７）＊３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｈ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２８）＊３６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２２９）Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋Ｓ１４１Ｒ＋Ｓ１５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７３Ｋ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋Ｓ２５６Ｋ＋Ｓ２５９Ｄ＋Ａ２７２ＲＳ２３４）Ｑ２０６ＤＳ２３５）＊３６Ｄ＋Ｎ７６ＤＳ２４２）＊３６Ｑ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｋ１９５Ｅ＋Ｋ２３５ＬＣ００１）Ｄ１４ＫＣ００２）Ｄ１２０ＫＣ００３）Ｄ１４０ＫＣ００４）Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０ＫＣ００５）Ｋ２７ＤＣ００６）Ｋ２７Ｄ＋Ｄ１２０ＫＣ００８）Ｄ１７２ＫＣ００９）Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｘ＋Ｄ１４０ＫＣ０１０）Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｋ＋Ｄ１４０Ｋ＋Ｄ１７２ＫＣ０１３）Ｎ９７ＤＣ０１４）Ｓ９８ＤＣ０１５）Ｔ２１３ＤＣ０１７）Ｓ１５６ＥＣ０１８）Ｎ９７Ｄ＋Ｓ９８ＤＣ０１９）Ｎ９７Ｄ＋Ｔ２１３ＤＣ０２２）Ｓ９８Ｄ＋Ｔ２１３ＤＣ０２８）Ｎ２１８ＤＣ１００）Ｖ５１ＤＣ１０１）Ｅ５４ＴＣ１０２）Ｅ５４Ｙを含有する突然変異ズブチリシンプロテアーゼであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。１０．突然変異体プロテアーゼが位置３６で挿入突然変異を有することを特徴とする突然変異体ズブチリシンプロテアーゼを含有する洗剤組成物。１１．突然変異体プロテアーゼが、位置３６での負荷電アミノ酸残基例えば＊３６Ｄ又は＊３６Ｅを生じる挿入突然変異を有することを特徴とする請求項１０記載の洗剤組成物。１２．突然変異体プロテアーゼにおいて、挿入突然変異が中性アミノ酸残基、例えば中性極性残基、例えば＊３６Ａ、＊３６Ｑ、又は＊３６Ｎ、あるいは正荷電アミノ酸残基、例えば＊３６Ｒ又は＊３６Ｋを提供することを特徴とする請求項１０記載の洗剤組成物。１３．突然変異体プロテアーゼがさらに、任意の一つ又はそれ以上の位置１２０、１７０、１９５、２３５、及び２５１での突然変異、例えば＊３６Ｄ並びに一つ又はそれ以上のＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、及びＫ２５１Ｅ；又は＊３６Ｑ若しくは＊３６Ｅ及び一つ又はそれ以上のＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、Ｋ２５１Ｅを有することを特徴とする請求項１０記載の洗剤組成物。１４．突然変異体プロテアーゼが、例えば位置７６で貧荷電アミノ酸残基に置換するために、位置７６での更なる突然変異、例えばＮ７６Ｄ又はＮ７６Ｅを有することを特徴とする請求項１０記載の洗剤組成物。１５．突然変異体プロテアーゼが、任意の一つ又はそれ以上の位置１２０、１７０、１９５、２３５、及び２５１でさらに突然変異、例えば＊３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ並びに一つ又はそれ以上のＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、及びＫ２５１Ｅ；又は＊３６Ｑ＋Ｎ７６Ｄ若しくは＊３６Ｅ＋Ｎ７６Ｄ並びに一つ又はそれ以上のＨ１２０Ｄ、Ｒ１７０Ｙ、Ｇ１９５Ｅ、Ｋ２３５Ｌ、及びＫ２５１Ｅを有することを特徴とする請求項１４記載の洗剤組成物。１６．突然変異体プロテアーゼが、プロテアーゼ分子のどこかに、例えば位置２１３に正電荷を生じるために突然変異、例えばＴ２１３Ｋを更に有することを特徴とする請求項１０記載の洗剤組成物。１７．突然変異体プロテアーゼがズブチリシン３０９、１４７、又はＰＢ９２の配列をベースにすることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれかに記載の洗剤組成物。１８．突然変異体ズブチリシン型プロテアーゼが親プロテアーゼの場合よりも低い等電ｐＨ（ｐＩｏ）を有し、活性部位から約１５〜２０Åの範囲内に位置する少なくとも一つのアミノ酸残基の部位で、特に、例えば位置１７０、１２０、又は１９５で、親プロテアーゼに関して、正荷電アミノ酸残差の除去又は負荷電アミノ酸残基の付加と等価の一つ又はそれ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の洗剤組成物。１９．組成物が、燐酸塩ビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル系又は等価のポリマー、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質、アミノ含有漂白活性剤、珪酸塩又はその他の構造剤、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含有する洗剤粉末として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２０．組成物が、ゼオライトビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル系又は等価のポリマー、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質、アミノ含有漂白活性剤、珪酸塩又はその他の構造剤、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含有する洗剤粉末として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２１．組成物が、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、有機酸、苛性アルカリを含有し、９〜１０の値に調整されたｐＨを有する水性洗剤液として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２２．組成物が、事実上直鎖アルコキシル化第一アルコール、から成る液体非イオン界面活性剤トリアセチン、三燐酸ナトリウム、苛性アルカリ、過ホウ酸塩一水化物標白剤先駆物質、及び第三アミン漂白活性剤る含有し、約９〜１０の値に調整されたｐＨを有する非水性洗剤液として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２３．組成物が、少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒の形態であって、陰イオン界面活性剤及び、それぞれ約７及び約３のアルコキシル化度を有する非イオン界面活性剤の混合物、低又は実質的にゼロの中性無機塩、燐酸塩ビルダー、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２４．組成物が、少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒の形態であって、陰イオン界面活性剤及び、それぞれ約７及び約３のアルコキシル化度を有する非イオン界面活性剤の混合物、低又は実質的にゼロの中性無機塩、ゼオライトビルダー、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２５．組成物が、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル系ポリマー、脂肪酸石けん、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、クレイ粒子、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２６．組成物が、獣脂及び椰子油の完全鹸化混合物をベースにし、オルト燐酸で中和され、プロテアーゼと混合されて、さらに蟻酸ナトリウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール及び硫酸ナトリウムと混合されて、次に石鹸生産ライン上で圧出される石鹸を含有する洗剤（石鹸）バーとして処方されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の洗剤組成物。２７．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、９又はそれ以下の洗液ｐＨを生じるように処方されることを特徴とする請求項１記載の酵素洗剤組成物。２８．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、０．０３又はそれ以下の、例えば０．０２又はそれ以下、例えば０．０１又はそれ以下の洗液イオン強度を生じるように処方されることを特徴とする請求項１又は１８記載の酵素洗剤組成物。２９．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤リットルに相当する割合で用いられる場合に、８，５又はそれ以上の洗波ｐＨを生じるように処方されることを特徴とする請求項２記載の酵素洗剤組成物。３０．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、０．０１又はそれ以上の、例えば０．０２又はそれ以上の洗液イオン強度を生じるように処方されることを特徴とする請求項２又は２９記載の酵素洗剤組成物。３１．突然変異体プロテアーゼのｐｌが親プロテアーゼのｐＩより低く、最適洗浄ｐＨが親プロテアーぜに関する最適ｐＨより低い前記請求項のいずれかに記載の酵素洗剤組成物。３２．リバーぜを含有し、さらに、突然変異プロテアーぜの正味分子静電荷が、親プロテアーゼと比較した場合にアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換によって変化していて、そして、上記プロテアーゼにおいて、上記親プロテアーゼに関して、より少数の正荷電アミノ酸残基及び／又はより多数の負荷電アミノ酸残基が存在し、それによってズブチリシンプロテアーゼが上記親プロテアーゼよりも低い等電ｐＨ（ｐＩ）を存することを特徴とする突然変異ズブチリシンプロテアーぜを含有する酵素洗剤組成物。３３．突然変異ズブチリシンプロテアーゼを含有する酵素洗剤組成物であって、プロテアーゼの正味分子静電荷が、親プロテアーゼと比較すると変化していて、上記プロテアーゼにおいて、上記親プロテアーゼに関して、欠失又は置換によって、あるいは下記の指示位置付近でのアミノ酸残基の挿入（単一又は多数）、欠失、又は置換によって任意の一つ又はそれ以上の該位置１，２，３，４，６，９，１０，１２，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２４，２５，２７，３６，３７，３８，４０，４１，４３，４４，４５，４６，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，７５，７６，７７，７８，７９，８７，８９，９１，９４，９８，９９，１００，１０１，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１２，１１３，１１５，１１６，１１７，１１８，１２０，１２６，１２８，１２９，１３０，１３１，１３３，１３４，１３６，１３７，１４０，１４１，１４３，１４４，１４５，１４６，１５５，１５６，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７，１７０，１７１，１７２，１７３，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８８，１８９，１９１，１９２，１９４，１９５，１９７，２０４，２０６，２０９，２１０，２１１，２１２，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１８，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４１，２４２，２４３，２４４，２４５，２４７，２４８，２４９，２５１，２５２，２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５９，２６０，２６１，２６２，２６３，２６５，２６９，２７１，２７２，２７５，９７，でのアミノ酸残基の間に、より少数の正荷電アミノ酸残基及び／又はより多数の負荷電アミノ酸残基が存在し、それによって上記ズブチリシンプロテアーゼが上記親プロテアーゼより低い等電ｐＨ（ｐＩ）を有することを特徴とする請求項３２記載の組成物。３４．突然変異ズブチリシンプロテアーゼを含有する酵素洗剤組成物であって、プロテアーゼの正味分子静電荷が、親プロテアーゼと比較すると変化していて、上記プロテアーゼにおいて、上記親プロテアーゼに関して、欠失又は置換によって、あるいは下記の指示位置付近でのアミノ酸残基の挿入（単一又は多数）、欠失、又は置換によって任意の一つ又はそれ以上の該位置６，９，１１，１２，１９，２５，３６，３７，３８，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６７，７１，８９，１１１，１１５，１２０，１２１，１２２，１２４，１２８，１３１，１４０，１５３，１５４，１５６，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６８，１７０，１７２，１７５，１８０，１８２，１８６，１８７，１９１，１９４，１９５，１９９，２１８，２１９，２２６，２３４，２３５，２３６，２３７，２３８，２４１，２６０，２６１，２６２，２６５，２６８，２７５，９７，でのアミノ酸残基の間に、より少数の正荷電アミノ酸残基及び／又はより多数の負荷電アミノ酸残基が存在し、それによって上記ズブチリシンプロテアーゼが上記親プロテアーゼより低い等電ｐＨ（ｐＩ）を有することを特徴とする請求項３２記載の組成物。３５．残りの洗剤組成物が：（ａ）燐酸塩ビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル系又は等価のポリマー、過ホウ酸塩又は過酸漂白剤前駆物質、アミノ含有漂白活性剤、珪酸塩又はその他の構造剤、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含有する洗剤粉末として処方されるか；もしくは（ｂ）ゼオライトビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル系又は等価のポリマー、過ホウ酸塩又は過酸漂白剤前駆物質、アミノ含有漂白活性剤、珪酸塩又はその他の構造剤、使用中に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含有する洗剤粉末として処方されるか；もしくは（ｃ）陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、有機酸又はその他のビルダー、苛性アルカリを包含し、９〜１０の値に調整されたｐＨを有する水性洗剤液として処方されるか；もしくは（ｄ）事実上直鎖アルコキシル化第一アルコールから成る液体非イオン界面活性剤、トリアセチン、三燐酸ナトリウム、苛性アルカリ、過ホウ酸塩一水化物漂白剤前駆物質、及び第三アミン漂白活性剤を含有し、約９〜１０の値に調整されたｐＨを有する非水性洗剤液として処方されるか；もしくは（ｅ）少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒の形態であって、陰イオン界面活性剤及び、それぞれ約７及び約３のアルコキシル化度を有する非イオン界面活性剤の混合物、低又は実質的にゼロの中性無機塩、燐酸塩ビルダー、過ホウ酸塩又は過酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されるか；もしくは（ｆ）少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒の形態であって、陰イオン界面活性剤及び、それぞれ約７及び約３のアルコキシル化度を有する非イオン界面活性剤の混合物、低又は実質的にゼロの中性無機塩、ゼオライトビルダー、過ホウ酸塩又は過酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されるか；もしくは（ｇ）陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アタリル系ポリマー、脂肪酸石けん、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、クレイ粒子、過ホウ酸塩又は過酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白活性剤、珪酸ナトリウム、並びに少量物質及び水分を含有する洗剤粉末として処方されるか；もしくは（ｈ）獣脂及び椰子油の完全鹸化混合物をベースにしオルト燐酸で中和される石鹸かあるいはＣ６〜Ｃ１６アルキルベンゼンスルホン酸塩、トリポリ燐酸ナトリウム、炭酸カルシウム及び炭酸ナトリウム、並びにカルボキシメチルセルロースを含有し、プロテアーゼと混合され、さらに蟻酸ナトリウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール及び硫酸ナトリウムと混合されて、次に石鹸生産ライン上で圧出される石鹸又は合成洗剤バーとして処方される；請求項３２、３３又は３４記載の酵素洗剤組成物。３６．さらに、プロテアーゼが、ズブチリシンＢＰＮ′、ズブチリシンアミロサッカリチクス、ズブチリシン１６８、ズブチリシン腸間膜ペプチダーゼ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンサーミターゼ、プロテアーゼＴＷ７、プロテアーゼＴＷ３、及びプロテイナーゼＫ、又はアクアリシンから選択される親酵素の突然変異を示すことを特徴とする請求項３２〜３５のいずれかに記載の洗剤組成物。３７．さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてズブチリシン３０９をベースにすることを特徴とする請求項３２〜３６のいずれかに記載の洗剤組成物。３８．さらに、プロテアーゼが親ズブチリシンとしてズブチリシン１４７をベースにすることを特徴とする請求項３２〜３７のいずれかに記載の洗剤組成物。３９．さらに、プロテアーゼが一つ又はそれ以上の次の突然変異：（アミノ酸置換）【配列があります】Ｇ１９５Ｅ：Ｇ１９５Ｄ：Ｒ１７０Ｙ：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ：Ｋ２５１Ｅ：Ｈ１２０Ｄ：Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ：Ｒ１７０Ｙ＋Ｋ２５１Ｅ：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５ＩＥ：Ｋ２３５Ｌ：Ｈ１２０Ｄ＋Ｋ２３５Ｌ：Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ：Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１Ｅ：Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ：Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５５Ｌ＋Ｋ２５１Ｅ：Ｄ１４Ｋ：Ｄ１２０Ｋ：Ｄ１４０Ｋ：Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｋ：Ｋ２７Ｄ：Ｋ２７Ｄ＋Ｄ１２０Ｋ：Ｄ１７２Ｋ：Ｄ１４Ｋ＋Ｄ１２０Ｋ＋Ｄ１４０Ｋ＋Ｄ１７２Ｋ：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２５１Ｅ：Ｖ５１Ｄ：Ｅ５４Ｔ：Ｅ５４Ｙ：を有することを特徴とする請求項３２〜３７のいずれかに記載の洗剤組成物。３９．プロテアーゼが、置換、欠失、又は隣接挿入によって変化していた活性部位の約２０Å以内のアミノ酸残基の部位に一つ又はそれ以上の突然変異を有する請求頂３２〜３８のいずれかに記載の洗剤組成物。４０．プロテアーゼが、一つ又はそれ以上の次の位置：６，２７，３６−３８，４４，４５，４９，５０−５９，６１，６１，８９，９１，９８−１０１，１０３−１０９，１１２−３，１２６−１３１，１３６，１５５，１５６，１５８− １６０，１６２−１６４，１６６，１６７，１７０，１７１，１８１，１８２．１８６，１８８，１８９，１９５，１９７，２０４，２０６，２０９，２１１− ２１８．に、一つ又はそれ以上の突然変異を有する請求項３９記載の洗剤組成物。４１．プロテアーゼが、活性部位から約１５〜２０の範囲内に位置するアミノ酸残基の部位に一つ又はそれ以上の突然変異を有する請求項３９記載の洗剤組成物。４２．プロテアーゼが、位置１７０、１２０、又は１９５に位置するアミノ酸残基の部位に一つ又はそれ以上の突然変異を有する請求項３２〜４１のいずれかに記載の洗剤組成物。４３．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、９又はそれ以下の洗液ｐＨを生じるように処方されることを特徴とする請求項３２〜４２のいずれかに記載の酵素洗剤組成物。４４．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、０．０３又はそれ以下の、例えば０．０２又はそれ以下、例えば０．０１又はそれ以下の洗液イオン強度を生じるように処方されることを特徴とする請求項３２〜４３のいずれかに記載の酵素洗剤組成物。４５．洗剤組成物が、０．４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、８．５又はそれ以上の洗液ｐＨを生じるように処方されることを特徴とする請求項３２〜４４のいずれかに記載の酵素洗剤組成物。４６．洗剤組成物が、０．０４〜０．８ｇ／界面活性剤１リットルに相当する割合で用いられる場合に、０．０１又はそれ以上の、例えば０．０２又はそれ以上の洗液イオン強度を生じるように処方されることを特徴とする請求項３２〜４５のいずれかに記載の酵素洗剤組成物。