JPH09512434A

JPH09512434A - 減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシン３０９変異体

Info

Publication number: JPH09512434A
Application number: JP7528278A
Authority: JP
Inventors: フレデリックザ、サードブロード，フィリップ; リーバーネット，ボビー; ネルトンルービング，ドン; クマーゴウシュ，チャーンチャール
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1994-05-02
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 1997-12-16
Also published as: HUT75558A; HU9603030D0; CZ321796A3; EP0758389A1; CN1151187A; CA2189427C; WO1995030011A2; BR9507605A; US6599730B1; WO1995030011A3; CA2189427A1; AU2294495A; MX9605358A

Abstract

(57)【要約】本発明は、野生型ズブチリシン（３０９）アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有するズブチリシン（３０９）変異体に関し、野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域および第六ループ領域を含んでいて、改変アミノ酸配列は１以上のループ領域において具体的な特定の位置で野生型ズブチリシン（３０９）に存在する場合とは異なるアミノ酸（即ち、置換）を含み、それによりズブチリシン（３０９）変異体は野生型ズブチリシン（３０９）と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシン（３０９）変異体をコードするＤＮＡ配列にも関する。本発明は、このようなズブチリシン（３０９）変異体を含んでなる様々な表面のクリーニング用組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシン３０９変異体技術分野本発明は、様々なクリーニング組成物で有用な新規酵素変異体と、このような酵素変異体をコードする遺伝子に関する。背景酵素は最大類の天然タンパク質を構成している。各類の酵素は通常異なる種類の化学反応を触媒する（消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼとして知られる酵素の１種は、他のタンパク質を加水分解する（開裂される化学結合のいずれかの側における水分子のＨおよびＯＨ部分の取込みで化合物を２以上のより簡単な化合物に分解する）それらの能力について知られている。タンパク質を加水分解するこの能力は、洗濯洗剤製品への添加剤として天然およびタンパク質工学処理プロテアーゼを配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタンパク質性であり、広域特異性プロテアーゼはこのような汚れの除去性を実質上改善することができる。残念ながら、天然細菌環境下におけるこれらタンパク質の効力レベルは相対的に非天然の洗浄環境中にしばしば移行していない。特に、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性および基質特異性のようなプロテアーゼ特徴は、酵素の天然環境外での利用上必ずしも最良になっていない。プロテアーゼのアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定する。プロテアーゼのアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えるかもしれないし、あるいはアミノ酸配列における変化の位置、性質および／または大きさに応じて酵素を不活化させることさえある。洗浄環境下でプロテアーゼの効力を増加させることを目標として、それらの性質を改善する試みに際し、プロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変えるいくつかのアプローチが行われてきた。これらのアプローチには、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、アミノ酸配列を変えることを含む。当業界で記載された様々なアプローチにもかかわらず、様々な表面をクリーニングする上で有用なプロテアーゼの新たに有効な変異体に関する必要性が継続して存在している。本発明の目的本発明は、野生型の酵素と比較して改善された加水分解性を有するズブチリシン３０９酵素変異体を提供することをその目的とする。本発明は、また、これらのズブチリシン３０９酵素変異体を含んでなるクリーニング組成物を提供することをその目的とする。概要本発明は、野生型ズブチリシン３０９アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有するズブチリシン３０９変異体に関し、野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域および第六ループ領域を含んでいて、改変アミノ酸配列は１以上のループ領域において具体的な特定の位置で野生型ズブチリシン３０９に存在する場合とは異なるアミノ酸（即ち、置換）を含み、それによりズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシン３０９変異体をコードするＤＮＡ配列にも関する。本発明は、このようなズブチリシン３０９変異体を含んでなる様々な表面のクリーニング用組成物にも関する。図面の簡単な説明図１Ａおよび図１ＢはズブチリシンＢＰＮ′およびズブチリシン３０９のアミノ酸配列を表す。上列はBacillus amyloliquefaciensに由来するズブチリシンＢＰＮ′のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を表し、下列はBacillus len tus に由来するズブチリシン３０９のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を表す。ズブチリシン３０９の配列中における記号^*は、ズブチリシンＢＰＮ′ と比較して特定アミノ酸残基の不存在を表す。説明Ｉ．ズブチリシン３０９変異体本発明は、酵素をコードする様々なヌクレオチド配列を変異させて酵素のアミノ酸配列を改変することにより改変されたズブチリシン酵素、特にズブチリシン３０９に関する。本発明の改変ズブチリシン酵素（以下、“ズブチリシン３０９変異体”）は、野生型ズブチリシンと比較して、不溶性基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシン３０９変異体をコードする変異遺伝子にも関する。天然ズブチリシン３０９のアミノ酸配列（２６９アミノ酸残基を有する）に言及するとき、ズブチリシンＢＰＮ′のアミノ酸配列（２７５アミノ酸残基を有する）が標準としてしばしば用いられる。“ＢＰＮ′番号（numbering）”の使用は、すべてのズブチリシンで残基位置を特定するための常法になっている。天然ズブチリシンＢＰＮ′および天然ズブチリシン３０９のアミノ酸配列は、図１Ａおよび１Ｂで示されている。図１Ａおよび１Ｂでズブチリシン３０９の配列における記号^*は、天然ズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不存在を表す。しかしながら、本説明の目的から、アミノ酸位置に関する言及は“真の ”ズブチリシン３０９の番号に基づく（例えば、下記ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する）。本発明のズブチリシン３０９酵素は、プロテアーゼとして知られる酵素の１種に属する。プロテアーゼはペプチド結合の開裂用の触媒である。１タイプのプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基があるという事実により識別される。可溶性基質の酵素加水分解速度が酵素濃度に応じて増加するという観察は、詳しく文献に記載されている。したがって、多くのクリーニング適用例で遭遇するような表面結合基質にとり、加水分解の速度は表面濃度の増加に従い増加することはもっともらしい。これは事例として示された（Brode,P.F.III and D.S.Rauc h,LANGMUIR,"Subtilisin BPN'：Activity on an Immobilized Substrate",Vol.8 ,pp.1325-1329(1992)）。実際に、表面濃度に対する速度の直線的依存性は、酵素の表面濃度が変えられたときに不溶性基質でみられた（Rubingh,D.N.and M.D. Bauer,"Catalysis of Hydrolysis by Proteases at the Protein-Solution Inte rface",in POLYMER SOLUTIONS,BLENDS AND INTERFACES,Ed.by I.Noda and D.N.R ubingh,Elsevier,p.464(1992)）。意外にも、より良いクリーニング性能を与える変異プロテアーゼに関するサーチでこの原理を適用しようとしたとき、我々は多く吸着する酵素ほど良い性能を与えるということを見い出せなかった。実際に、我々は意外にも、基質への酵素による吸着性が減少すると基質の加水分解性が増加する（クリーニング性能が良くなる）という、反対の事例を見い出した。以下の理論に拘束されないが、ある変異体を他と比較したときに改善された性能は、少なく吸着する酵素ほど強く結合されず、したがって不溶性タンパク質基質が除去されるべき表面上においてより高度に移動性であるという事実の結果であると考えられる。匹敵する酵素溶液濃度のとき、この増加した移動性はより高濃度の酵素を表面にデリバリーすることで付与されるいかなる利点よりも十分に越えている。本明細書に記載された変異は、表面結合汚れへの酵素の吸着性を変える（即ち、減少させる）ように設計されている。ズブチリシン３０９において、あるアミノ酸は酵素分子上で外部ループ（loops）を形成している。説明の目的から、これらのループは第一、第二、第三、第四および第五ループ領域と称される。特に、５７〜６４位は第一ループ領域を形成し、９３〜１０５位は第二ループ領域を形成し、１２４〜１３１位は第三ループ領域を形成し、１５２〜１６１位は第四ループ領域を形成し、１８１〜１８５位は第五ループ領域を形成し、１９３〜２１４位は第六ループ領域を形成している（野生型ズブチリシン３０９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）でのアミノ酸配列の位置と同様の位置番号）。これらのループ領域は表面結合ペプチドへの酵素分子の吸着上有意な役割を果たして、これらのループ領域の１以上における特異的変異はこの吸着への有意な効果を有すると考えられる。以下の理論に拘束されないが、ループ領域は少くとも２つの理由からズブチリシン３０９分子の吸着にとり重要であると考えられる。第一に、ループ領域を含めたアミノ酸は分子が暴露されたいかなる表面とも密に接触することができる。第二に、ズブチリシン３０９分子の活性部位および結合ポケットに対してのループ領域の近接は、表面結合基質（ペプチド／タンパク質汚れ）への酵素の触媒生産性吸着に際して役割を有する。以下はアミノ酸を表すためにここで用いられる略号のリストである：本明細書で用いられる“変異体”とは、野生型の場合とは異なるアミノ酸配列を有した酵素を意味する。本明細書で用いられる“変異ズブチリシン３０９ＤＮＡ配列”とは、ズブチリシン３０９変異体をコードするＤＮＡ配列を意味する。本明細書で用いられる“野生型ズブチリシン３０９”とは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表される酵素に関する。ズブチリシン３０９のアミノ酸配列は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる国際特許公開第８９／０６２７９号（１９８９）で更に記載されている。Mulleners らにより１９９４年２月３日付で公開された国際特許公開第９４／０２６１８号明細書も参照。本明細書で用いられる“ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列”という用語は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と、５７〜６４位、９３〜１０５位、１２４〜１３１位、１５２〜１６１位、１８１〜１８５位および１９３〜２１４位以外のアミノ酸配列に改変を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１とを包含している。本明細書で用いられる“より親水性のアミノ酸”とは、下記親水性表で対象アミノ酸よりも大きな親水性を有するあらゆる他のアミノ酸に関する。下記親水性表（表１）は親水性増加順として下位の方からアミノ酸を掲載している（Hopp,T .P.and Woods,K.R.,"Prediction of Protein Antigenic Determinants from Ami no Acid Sequences",PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE USA,Vo l．78,pp.3824-3828,1981参照; 引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。表１はアミノ酸がどちらの電荷を有するかについて示している（この特徴は約８〜９のｐＨに基づいている）。正荷電アミノ酸はＡｒｇおよびＬｙｓであり、負荷電アミノ酸はＧｌｕおよびＡｓｐであり、残りのアミノ酸は中性である。本発明の好ましい態様において、置換アミノ酸は中性または負荷電であり、更に好ましくは負荷電（即ち、ＧｌｕまたはＡｓｐ）である。したがって、例えば、“中性であるかまたは負電荷を有する同等またはより親水性のアミノ酸でＧｌｎを置換する”という表現は、ＧｌｎがＡｓｎ（Ｇｌｎと同親水性である）あるいはＳｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐ（Ｇｌｎより親水性である）で置換されることを意味する；それら各々は中性であるかまたは負電荷を有して、Ｇｌｎと比較して大きな親水価を有している。同様に、“中性であるかまたは負電荷を有するより親水性のアミノ酸でＰｒｏを置換する”という表現は、ＰｒｏがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐで置換されることを意味する。Ａ．ループ領域６置換変異体１．少くとも１つのアミノ酸置換を含む変異体本発明の１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体はズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しており、その改変アミノ酸配列は１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうちの１以上における置換を含んでいて、それによりズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。好ましくは、置換アミノ酸を有する位置は１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６または２０９、更に好ましくは１９４、１９５、１９６、１９９または２０１である。好ましくは、１９３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒである。好ましくは、１９６位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、１９７位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＶａｌである。好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＧｌｕである。好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。更に好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３および２１４位のいずれに関する置換アミノ酸も、表１を参考にすると、中性または負荷電であり、野生型ズブチリシン３０９の対象位置にあるアミノ酸と等しいかまたはそれより親水性、好ましくはより親水性である。更に一層好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１２、２１３および２１４位のいずれに関する置換アミノ酸もＡｓｐまたはＧｌｕであり、２０３および２１１用の置換アミノ酸はＡｓｐである。２．少くとも２つのアミノ酸置換を含む変異体本発明のもう１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体はズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しており、その改変アミノ酸配列は１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうち２以上で置換を含んでいて、それによりズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。好ましくは、置換アミノ酸を有する位置は１９３、１９４、１９５、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６または２０９、更に好ましくは１９４、１９５、１９６、２１１または２１３である。好ましくは、１９３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒである。好ましくは、１９４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。好ましくは、１９６位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、１９７位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９８位用の置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＶａｌである。好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。しかしながら、２１１位がＡｓｎ、ＧｌｕまたはＶａｌで置換されているならば、２１２位はＡｓｐで置換されない。好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。更に好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のいずれに関する置換アミノ酸も、表１を参考にすると、中性または負荷電であり、野生型ズブチリシン３０９の対象位置にあるアミノ酸と等しいかまたはそれより親水性、好ましくはより親水性である。更に一層好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のいずれに関する置換アミノ酸もＡｓｐおよびＧｌｕである。３．少くとも３つのアミノ酸置換を含む変異体本発明のもう１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体はズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しており、その改変アミノ酸配列は１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうち３以上で置換を含んでいて、それによりズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。好ましくは、置換アミノ酸を有する位置は１９３、１９４、１９５、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６または２０９、更に好ましくは１９４、１９５、１９６、２１１または２１３である。好ましくは、１９３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒである。好ましくは、１９４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。好ましくは、１９６位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、１９７位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、１９８位用の置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕまたはｓｅｒである。好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌである。好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。更に好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のいずれに関する置換アミノ酸も、表１を参考にすると、中性または負荷電であり、野生型ズブチリシン３０９の対象位置にあるアミノ酸と等しいかまたはそれより親水性、好ましくはより親水性である。更に一層好ましくは、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のいずれに関する置換アミノ酸もＡｓｐおよびＧｌｕである。Ｂ．マルチループ領域置換変異体本発明のもう１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体はズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しており、その改変アミノ酸配列は第一、第二、第三、第四または第五ループ領域の１以上において１以上の位置で置換を含んでいて、それによりズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明のもう１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体は第六ループ領域に１以上の置換を更に含んでいる。本発明の好ましい態様において、１以上のループ領域で１以上の位置に関する置換アミノ酸は、表１を参考にすると、中性または負荷電であり、野生型アミノ酸配列の対象位置にあるアミノ酸と等しいかまたはそれより親水性、好ましくはより親水性である。１．第一ループ領域の置換置換が第一ループ領域で生じるとき、置換は５７、５８、５９、６０、６１、６３または６４位のうち１以上で生じる。置換が５７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕである。置換が５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が６３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が６４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。２．第二ループ領域の置換置換が第二ループ領域で生じるとき、置換は９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５位のうち１以上で生じる。置換が９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。３．第三ループ領域の置換置換が第三ループ領域で生じるとき、置換は１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１位のうち１以上で生じる。置換が１２４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が１２５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１２６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１２７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。置換が１２８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１２９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。置換が１３０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１３１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒである。４．第四ループ領域の置換置換が第四ループ領域で生じるとき、置換は１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０または１６１位のうち１以上で生じる。置換が１５２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１５３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が１５４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１５５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１５６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１５７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が１６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。５．第五ループ領域の置換置換が第五ループ領域で生じるとき、置換は１８１、１８２、１８３、１８４または１８５位のうち１以上で生じる。置換が１８１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１８２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１８３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌである。置換が１８４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が１８５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。６．第六ループ領域の置換置換が第六ループ領域で生じるとき、前記５つのループ領域のうち１以上における１以上の置換と共に、置換は１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうち１以上で生じる。置換が１９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。置換が１９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が１９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が１９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである。置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕである。置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである。置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである。Ｃ．ループ領域以外の位置における追加置換前記のように、野生型ズブチリシン３０９の第一、第二、第三、第四、第五および／または第六ループ領域に行われる１以上の置換に加えて、置換はこのようなループ領域以外の位置で行われてもよい（以下“追加置換”と称される）。本発明のもう１つの態様において、ズブチリシン３０９変異体は、上記ループ領域の１以上における１以上の位置で置換されることに加えて７４位に置換がある、ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有している。追加置換は７４位単独（好ましくは）でも、または１以上の追加置換と一緒に生じてもよい。ズブチリシン３０９変異体への追加置換が７４位単独である場合、置換はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＰｈｅまたはＰｒｏによることが好ましい。特に好ましいのは、置換がＡｓｐまたはＨｉｓによる場合である。ズブチリシン３０９変異体に２以上の追加置換がある場合、追加置換は下記残基９７、９９、１０１、１０２、１０５および１２１のうち１以上と共に７４位で生じることが好ましい。好ましい追加置換組合せには下記７４／９７、７４／９９、７４／１０１、７４／１０２、７４／１０５、７４／１２１、７４／９７／９９、７４／９７／１０１、７４／９７／１０２、７４／９９／１０１、７４／９９／１０２、７４／１０１／１０２、７４／１０２／１０５、７４／１０２／１２１、７４／１０５／１２１、７４／９７／９９／１０１、７４／９７／９９／１０２、７４／９７／１０１／１０２、７４／９９／１０１／１０２、７４／１０１／１０２／１２１、７４／１０２／１０５／１２１、７４／９７／９９／１０１／１０２、７４／９７／１０１／１０２／１２１および／または７４／９７／９９／１０１／１０２／１２１がある。最も好ましい追加置換組合せには下記７４／９７、７４／１０２、７４／９７／１０２、７４／１０１／１０２、７４／１０２／１０５、７４／９９／１０１／１０２、７４／９７／９９／１０１／１０２および７４／９９／１０２がある。好ましくは、特定のアミノ酸残基位置の各々で行われる追加置換には、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、ＰｒｏおよびＡｓｎを含めた７４位の置換；Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＧｌｙおよびＳｅｒを含めた９７位の置換；Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＧｌｕおよびＳｅｒを含めた９９位の置換；Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｒｇおよびＳｅｒを含めた１０１位の置換；Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍ、Ａｌａ、Ｗ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌを含めた１０２位の置換；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅを含めた１０５位の置換；Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＩｌｅおよびＳｅｒを含めた１２１位の置換があるが、それらに限定されない。このような各位置で置換される特に好ましいアミノ酸は下記表２で表されている。特定のアミノ酸が表２で示されているが、いかなるアミノ酸も特定の残基で置換されうると理解されるべきである。前記されたように、これらの置換は上記ループ領域のうち１以上における１以上の置換に加わるものである。Ｄ．酵素変異体の製造例１変異３０９ＤＮＡ配列野生型ズブチリシン３０９（即ち、サビナーゼ）遺伝子を含んだファージミド（ｐＪＭＡ６０２）を構築する。プラスミドｐＵＣ１１９（Vieira,J.and Messi ng,J.,"Production of Single-Stranded Plasmid DNA",153 METHODS IN ENZYMOL OGY,3-11(1989)）の２．８ＫｂｐＰｖｕII制限酵素断片をプラスミドｐＵＢ１１０（Bacillus Genetic Stock Center,Columbus,OH 1E9）のＰｖｕII部位中にクローニングする。ｐＵＣ１１９‐ｐＵＢ１１０ハイブリッドプラスミドはｐＪＭＡ６０１と命名する。ｐＪＭＡ６０１のＢａｍＨＩ制限部位中にBacillus len tus 染色体ＤＮＡ（National Collections of Industrial and Marine Bacteria Bacillus lentus 10309）からのポリメラーゼ鎖反応増幅３０９（サビナーゼ）遺伝子をクローニングして、ファージミドｐＪＭＡ６０２を得る。ファージミドｐＪＭＡ６０２をEscherichia coli ｕｎｇ株ＣＪ２３６中に組み込んで形質転換させ、一本鎖ウラシル保有ＤＮＡ鋳型をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて作製する（Kunkel,T.A.,J.D.Roberts and R.A.Zakour," Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selecti on",METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.154,pp.367-382(1987)；Yuckenberg,P.D.,F.Wi tney,J.Geisselsoder and J.McClary,"Site-directed in vitro mutagenesis us ing uracil-containing DNA and phagemid vectors",DIRECTED MUTAGENESIS -A PRACTICAL APPROACH,ed.M.J.McPherson,pp.27-48(1991)により改変；双方とも引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。ZollerおよびSmith の方法（Zoller,M.J．and M.Smith,"Oligonucleotide-directed mutagenesis using M1 3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA",NUCLEIC ACIDS RESEARCH,Vol.1 0,pp.6487-6500(1982)；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）の単一プライマー部位特異的変異誘発改変法を用いて、すべての変異体を作製する（基本的には、前掲のYuckenbergら,1991 で表されたとおり）。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystem Inc.３８０ＢＤＮＡシンセサイザーを用いて作る。変異誘発反応産物をEscherichia coli株ＭＭ２９４（American Type Culture Co llection E.coli３３６２５）に組み込んで形質転換させる。すべての変異体をＤＮＡ配列決定により確認し、単離されたＤＮＡをBacillus subtilis 発現株ＢＧ２０３６（Yang,M.Y.,E.Ferrari and D.J.Henner,(1984),"Cloning of the Ne utral Protease Gene of Bacillus subtillis and the Use of the Cloned Gene to Create an In Vitro-derived Deletion Mutation",JOURNAL OF BACTERIOLOG Y,Vol.160,pp.15-21）に組み込んで形質転換させる。一部の変異体では、対応ループにフレームシフト停止コドン変異がある改変ｐＪＭＡ６０２を用いて、ウラシル鋳型を作製する。オリゴヌクレオチドは２０３位で適正なリーディングフレームを復元するように考えて、５７、５８、５９、６０、６１、６３、６４、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３および２１４位のランダム置換についてもコードさせるにれらのコドンにおいて３つすべての塩基に関する全部で４つのヌクレオチドの等モルおよび／または可変混合物）。フレームシフト停止を訂正して機能性酵素を産生する変異は、カゼインを消化するそれらの能力により同定する。ランダム置換はＤＮＡ配列決定より調べる。例２発酵関心あるズブチリシン変異体を含んだBacillus subtilis 細胞（ＢＧ２０３６）をＬＢ‐グルコースブロスの１ｌ培養物中で中間対数期まで増殖させ、全容量１０ｌのBiostat ＥＤ醗酵槽（B.Braun Biotech,Inc.,Allentown,Permsylvania ）中に接種する。発酵培地は酵母エキス、デンプン、消泡剤、緩衝剤および微量ミネラルを含有している（FERMENTATION: A PRACTICAL APPROACH,Ed.B.McNeil a nd L.M.Harvey,1990参照）。ブロスを発酵ラン中に７．０の一定ｐＨに保つ。クロラムフェニコールを変異誘発プラスミドの抗生物質選択用に加える。細胞をＡ₆₀₀ 約６０まで３７℃で一夜増殖させて、回収する。例３精製発酵ブロスは純粋な酵素を得るために下記ステップで用いる。ブロスから遠心によりBacillus subtilis 細胞を除き、１００Ｋカットオフ膜で細かな粒子を除去することにより清澄化する。この後１０Ｋカットオフ膜で遠心し、フロー透析してイオン強度を減少させ、０．０２５ＭＭＥＳ緩衝剤（２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸）を用いてｐＨを５．５に調整する。酵素はそれを陽イオン交換クロマトグラフィーカラムまたはアフィニティ吸着クロマトグラフィーカラムにいれて、それをＮａＣｌまたはプロピレングリコール勾配でカラムから溶出させることにより更に精製する（Scopes,R.K.,PROTEIN PURIFICATION PRINCIP LES AND PRACTICE,Springer-Verlag,New York(1984)参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。ｐＮＡアッセイ（DelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick and M.C.Geokas,ANAL .BIOCHEM.,Vol.99,pp.316-320(1979)；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）を用いて、勾配溶出中に集められた画分について活性酵素濃度を調べる。このアッセイでは、酵素が可溶性合成基質スクシニル‐アラニン‐アラニン‐プロリン‐フェニルアラニン‐ｐ‐ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ）を加水分解するとｐ‐ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色の発生速度を分光光度計において４１０ｎｍで測定するが、これは活性酵素濃度と比例している。加えて、２８０ｎｍの吸光度測定も全タンパク質濃度を調べるために行う。活性酵素／全タンパク質比は酵素純度を示し、ストック溶液としてプールされる画分を確認するために用いる。貯蔵中に酵素の自己分解を避けるため、等重量のプロピレングリコールをクロマトグラフィーカラムから得られたプール画分に加える。精製操作の終了後、ストック酵素溶液の純度をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）でチェックし、絶対酵素濃度をトリプシンインヒビタータイプII‐Ｔ：Sigma Chemical Company（St.Louis,Missouri）から購入した七面鳥卵白を用いて活性部位滴定法により調べる。測定された変換ファクターは、酵素分子の様々な位置で起きるどの変化が可溶性基質ｐＮＡに対して野生型よりも増加した活性を有する酵素変異体を生じるのかについて示す。使用向け製造に際して、酵素ストック溶液は、プロピレングリコールを除去して緩衝剤を交換するために、Sephadex‐Ｇ２５（Pharmacia,Piscataway,New Jer sey）サイズ排除カラムで溶出させる。酵素ストック溶液中のＭＥＳ緩衝剤は、０．０１ＭＣａＣｌ₂を含有してＨＣｌで８．６にｐＨ調整された０．１Ｍトリス緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））と交換する。すべての実験は２５℃に恒温されたトリス緩衝液中ｐＨ８．６で行う。Ｅ．酵素変異体の特徴付け例４モデル表面作製ＣＰＧ社（Fairfield,New Jersey）から購入したアミノプロピル制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）を、Bachem,Inc．(Torrence,California)から購入したｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ基質を共有結合させるための支持体として用いる。反応はジメチルスルホキシド中で行い、１‐エチル‐３‐〔３‐（ジメチルアミノ）プロピル〕カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をカップリング剤として用いる。終了時（ｐＮＡアッセイでモニターする）、過剰溶媒を除去し、ＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および二重蒸留水ですすぐ。この後、約７０ ℃でＮ₂パージしながらオーブン乾燥させる。固定基質の反応スキームおよび製造はBrode,P.F.III and D.S.Rauch,"Subtilisin BPN'：Activity on an Immobil ized Substrate",LANGMUIR,Vol.8,p.1325-1329(1992)で記載されたように行うが、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。ＣＰＧ表面は６２，０００±７０００ｐＮＡ分子／μｍ²を有する。表面積は受け取ったＣＰＧに関してＣＰＧ社により報告された５０．０ｍ²／ｇの値から変わっていない。これはｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡをＣＰＧに加えるために用いた操作が多孔質構造にダメージを与えていないことを示唆している（平均径は４８６Å である）。例５表面加水分解アッセイＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡを用いると、酵素変異体の吸着とＣＰＧ結合ペプチドの加水分解が単一実験で測定できる。少量の酵素変異体ストック溶液を脱気されたトリス緩衝液およびＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ含有のフラスコに加える。フラスコを９０分間にわたりリスト式シェーカー上で振盪させ、その間にシェーカーを様々な時間間隔で停止させる（例えば、吸着加水分解の初期段階では２分毎に‐例えば最初の２０分間‐実験の最後では1０分毎に）。ＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡを静置して、溶液をサンプリングする。実験操作と吸着および加水分解の計算はいずれも前掲のBrode ら,1992 で記載されたようにして行う。すべての酵素は自己分解に対する安定性についてモニターされ、この実験の経過中に明らかな自己分解喪失を示さない。したがって、酵素吸着は溶液からの減少分を測定することにより調べることができる。初期酵素変異体濃度と個々の各時点に測定された濃度との差異が、吸着された酵素変異体の量を表す。表面から加水分解されたｐＮＡの量は、４１０ｎｍでサンプルの一部について吸光度読取りを行うことにより測定する。加水分解されたｐＮＡの全量は、サンプリングされた量およびフラスコに残存する量を加えることにより計算する。この値は、酵素が存在しないときｐＨ８．６でトリス緩衝液により加水分解されたｐＮＡの量を差引くことにより補正する。この塩基加水分解は、酵素の効力に応じて、全加水分解の７〜２９％である。例６可溶性基質速度論的分析可溶性基質ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡの加水分解速度は、ＤＵ‐７０分光光度計において４１０ｎｍで時間の関数として吸光度増加を測定することによりモニターする。酵素濃度は一定に保ち、６〜１０ナノモルの範囲内であるように調整するが、基質濃度は速度論的測定毎に９０〜７００μＭｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡと様々である。吸光度データポイントは９００秒間にわたり毎秒測り、データをLOTUS^TMスプレッドシート（Lotus Development Corporation,Cambridge,Massachusetts）に移す。速度論的パラメーターの分析は標準Lineweaver Burk 分析により行い、その場合にランの初期部分（通常、最初の１分間）のデータを直線的回帰曲線に合わせて、ｖ_oを求める。ｖ_oおよびｓ_oデータを標準逆関数式にプロットして、Ｋ_Mおよびｋ_catを求める。Ｆ．例ズブチリシン３０９変異体表面結合基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有する本発明のズブチリシン３０９変異体は、下記表３〜３８で例示されている。特異的変異を表す上で、野生型に存在する本来のアミノ酸が最初に、位置番号が２番目に、置換アミノ酸が３番目に示されている。 II．クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、本発明の１種以上の酵素変異体の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない（例えば、液体および顆粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；形態上制限されない（例えば、顆粒、液体および固形処方）、布帛をクリーニングするための洗剤組成物；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない（例えば、歯磨剤、練歯磨剤および洗口液処方）口腔（oral）クリーニング組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）義歯クリーニング組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）コンタクトレンズクリーニング組成物がある。ここで用いられる“酵素変異体の有効量”とは、特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な酵素変異体の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変異体、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかなどのような多くの要因に基づいている。好ましくは、本発明のクリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を約０．０００１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．０１〜約０．１％含有する。本発明の酵素変異体が用いられた様々なクリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細に記載されている。そこで用いられるすべての部、パーセンテージおよび比率は、他で指摘されないかぎり、重量による。ここで用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物およびコンタクトレンズクリーニング組成物がある。Ａ．硬質表面、皿および布帛用のクリーニング組成物本発明の酵素は、高い起泡性および良好な不溶性基質除去性が望まれるあらゆる洗剤組成物で用いることができる。このため、本発明の酵素変異体は、完全に処方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物などを提供するために、様々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒、固形物などの形をとることができる。このような組成物は３０〜６０重量％もの界面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系、ノニオン系、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性剤は、典型的には組成物の約５〜約３５％のレベルで存在する。ここで有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なＣ₁₁‐Ｃ₁₈アルキルベンゼンスルホネートと一級およびランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x （ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₃およびＣＨ₃（ＣＨ₂）_y（ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₂ＣＨ₃のＣ₁₀‐Ｃ₁₈二級（２，３）アルキルサルフェート（式中ｘおよび（ｙ＋１）は少くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムである）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルアルコキシサルフェート（特に、ＥＯ１〜５エトキシサルフェート）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルアルコキシカルボキシレート（特に、ＥＯ１〜５エトキシカルボキシレート）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ α‐スルホネート化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特に、エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ベタインおよびスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈ アミンオキシドなどがある。アルキルアルコキシサルフェート（ＡＥＳ）およびアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）がここでは好ましい（前記アミンオキシドおよび／またはベタインまたはスルタイン界面活性剤とこのような界面活性剤との併用も、処方者の希望に応じて好ましい）。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活性剤には、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、１９９３年３月１６日付で発行されたConnorらの米国特許第５，１９４，６３９号明細書で開示されたＣ₁₀‐Ｃ₁₈Ｎ‐メチルグルカミドがある。他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロープ、加工助剤、色素または顔料、液体処方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分を本組成物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、Ｃ₁₀ ‐Ｃ₁₆アルコールアミドのような起泡増進剤が典型的には約１〜約１０％レベルで組成物中に配合できる。Ｃ₁₀‐Ｃ₁₄モノエタノールおよびジエタノールアミドがこのような起泡増進剤の典型的種類である。このような起泡増進剤と前記のアミンオキシド、ベタインおよびスルタインのような高起泡性補助界面活性剤との併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄などのような可溶性マグネシウム塩が、起泡性を追加するために、典型的には約０．１〜約２％のレベルで添加できる。本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水および他の溶媒を含有することができる。メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールで例示される低分子量一級または二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキシ基を含んだもののようなポリオール（例えば、１，３‐プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリンおよび１，２‐プロパンジオール）も使用できる。組成物はこのようなキャリヤを約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％含有する。本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８〜約１１．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用量レベルでｐＨをコントロールするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に周知である。本発明の硬質表面クリーニング組成物および布帛クリーニング組成物を処方するときに、処方者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを使用できる。典型的ビルダーには１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシトレートおよびオキシジサクシネート、積層シリケート、ホスフェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。同様に、処方者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約０．００１〜約１重量％のレベルで使用できる。様々な洗浄および布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知である。ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的には約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中に使用できる。所望であれば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネートなどのようなブリーチ活性剤も含有することができ、これらも当業界で知られている。使用量レベルは、典型的には約１〜約１０重量％の範囲である。様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化剤、特にアミノホスホネートおよびエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポリアクリレートおよびポリアスパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤、様々な起泡抑制剤、特にシリコーンおよび二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、特にスメクタイトクレーなどはすべて約１〜約３５重量％範囲のレベルでこのような組成物に使用できる。標準処方集と公開された特許では、このような慣用物質の多数の詳細な記載を含んでいる。酵素安定剤も本発明のクリーニング組成物に用いてよい。このような酵素安定剤にはプロピレングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好ましくは、約０．１〜約１％）およびギ酸カルシウム（好ましくは、約０．１〜約１％）がある。１．硬質表面クリーニング組成物ここで用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイルなどのような硬質表面をクリーニングするための液体および顆粒洗剤組成物に関する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約５％、更に一層好ましくは約０．０５〜約１％の活性酵素を含有する。本発明の１種以上の酵素変異体を含有することに加えて、このような硬質表面クリーニング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品では界面活性剤が時には用いられないが、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状／すじ状残留物を形成することがあるためである。界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％と少量であるが、典型的には組成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含有する。典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄ビルダーを含有する。好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調整が必要ならば使用できる。溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテルのようなグリコールエーテルと、２，２，４‐トリメチル‐１，３‐ペンタンジオールおよび２‐エチル‐１，３‐ヘキサンジオールのようなジオールがあるが、それらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５〜約１５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。加えて、イソプロパノールまたはエタノールのような高揮発性溶媒は、表面への組成物の“フルストレンクス”適用後に表面が洗い流されるとき、表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いられる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在する。本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記例で説明される。例７〜１２例７〜１０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＴｈｒ２０７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１１〜１２において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＶａｌ１９９Ｌｅｕ＋Ｓｅｒ２１０Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１３〜１８例１３〜１６において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＧｌｎ２００Ｇｌｕ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１７〜１８において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＧｌｎ２００Ｇｌｕ＋Ｔｈｒ２０７ＧｌｕおよびＳｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。２．皿洗い組成物本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を含有している。ここで用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが顆粒および液体形を含めて、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成物に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明される。例１９〜２４例１９〜２２において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＧｌｎ２００Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ２０５Ａｌａ＋Ｓｅｒ２１０Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２３〜２４において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＧｌｎ２００Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ２０５Ａｌａ＋Ｓｅｒ２１０ＡｓｐおよびＶａｌ１９９Ｌｅｕ＋Ｓｅｒ２１０Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。３．布帛クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を含有している。ここで用いられる“布帛クリーニング組成物” とは、限定されないが顆粒、液体および固形を含めて、布帛をクリーニングするためのすべての形態の洗剤組成物に関する。ａ．顆粒布帛クリーニング組成物本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００５〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性酵素を含有する。１種以上の酵素変異体に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少くとも１種の界面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含有する。本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。例２５〜２８例２５〜２６において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＳｅｒ９９Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２７〜２８において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＳｅｒ９９ＡｓｐおよびＳｅｒ９９Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２９〜３２例２９〜３０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＧｌｎ２００Ｇｌｕ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕ＋Ｓｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３１〜３２において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＧｌｎ２００Ｇｌｕ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕ＋Ｓｅｒ２１０ＧｌｕおよびＡｓｎ７４Ａｓｐ＋Ｐｒｏ２０４Ａｌａ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３３〜３６例３３〜３４において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＬｅｕ９４Ｇｌｙ＋Ｇｌｎ２００Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３５〜３６において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＬｅｕ９４Ｇｌｙ＋Ｇｌｎ２００ＧｌｕおよびＧｌｎ５７Ｓｅｒ＋Ｌｅｕ９４Ｇｌｙ＋Ｇｌｎ２００Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３７〜４０例３７〜３８において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＡｓｎ７４Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ５７Ｓｅｒ＋Ａｓｎ６０Ｓｅｒ＋Ｌｅｕ９４Ｇｌｙ＋Ｇｌｎ２００Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３９〜４０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＡｓｎ７４Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ５７Ｓｅｒ＋Ａｓｎ６０Ｓｅｒ＋Ｌｅｕ９４Ｇｌｙ＋Ｇｌｎ２００ＧｌｕおよびＶａｌ９３Ｇｌｎ＋Ｔｙｒ１０２Ｃｙｓ＋Ｓｅｒ１５４Ｇｌｕ＋Ａｓｎ１９８Ｇｌｎ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例４１〜４２例４３〜４４例４５例４６例４７ｂ．液体布帛クリーニング組成物本発明の液体布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有効量で、好ましくは組成物の約０．００５〜約５重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性酵素を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は、典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含有する。本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。例４８〜５２例４８〜５０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＰｒｏ２０４Ａｌａ＋Ａｌａ２０９Ｔｈｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５１〜５２において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＰｒｏ２０４Ａｌａ＋Ａｌａ２０９ＴｈｒおよびＧｌｎ２００Ｇｌｕ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕ＋Ｓｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５３〜５７例５３〜５５において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＴｙｒ１０２Ｃｙｓ＋Ｉｌｅ１０５Ｖａｌ＋Ｌｅｕ１２４Ｉｌｅ＋Ｓｅｒ１５４Ｇｌｕ＋Ａｓｎ１９８Ｇｌｎ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５６〜５７において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＴｙｒ１０２Ｃｙｓ＋Ｉｌｅ１０５Ｖａｌ＋Ｌｅｕ１２４Ｉｌｅ＋Ｓｅｒ１５４Ｇｌｕ＋Ａｓｎ１９８Ｇｌｎ＋Ｔｈｒ２０７ＧｌｙおよびＡｓｎ７４Ａｓｐ＋Ｓｅｒ９７Ａｓｐ＋Ｇｌｎ５７Ｓｅｒ＋Ａｓｎ６０Ｓｅｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５８〜５９例５８および５９の各々において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＡｓｎ７４Ａｓｐ＋Ｓｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６０〜６２ｃ．固形布帛クリーニング組成物手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。例６３〜６６例６３〜６４において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＶａｌ１９７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６５〜６６において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＶａｌ１９７ＧｌｕおよびＴｙｒ２０８Ｐｈｅ＋Ｌｅｕ２１１Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６７〜７０例６７において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＡｓｎ６０Ｓｅｒ＋Ｖａｌ９３Ｇｌｎ＋Ｇｌｙ２１３Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６８において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＶａｌ９３Ｇｌｎ＋Ｔｙｒ１０２Ｃｙｓ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｙ＋Ｇｌｙ２１３Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６９〜７０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体のいずれの組合せがＡｓｎ６０Ｓｅｒ＋Ｖａｌ９３Ｇｌｎ＋Ｇｌｙ２１３ＡｓｐおよびＶａｌ９３Ｇｌｎ＋Ｔｙｒ１０２Ｃｙｓ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｙ＋Ｇｌｙ２１３Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。Ｂ．追加クリーニング組成物前記の硬質表面クリーニング、皿洗いおよび布帛クリーニング組成物に加えて、本発明の１種以上の酵素変異体は不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリーニング組成物中に配合してもよい。このような追加クリーニング組成物には口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物およびコンタクトレンズクリーニング組成物があるが、それらに限定されない。１．口腔クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、薬学上許容される量の本発明の１種以上の酵素変異体が歯または義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物に含有される。ここで用いられる“口腔クリーニング組成物”とは、歯磨剤、練歯磨剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、ロゼンジ、小包、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関する。好ましくは、口腔クリーニング組成物は組成物の約０．０００１〜約２０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好ましくは約０．０１〜約５％の本発明の１種以上の酵素変異体と、薬学上許容されるキャリヤを含む。ここで用いられる“薬学上許容される”とは、その用語が表す薬物、薬剤または不活性成分が妥当な利益／危険比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などなくヒトおよびそれより下等の動物の組織と接触する使用に適していることを意味する。典型的には、口腔クリーニング組成物の口腔クリーニング成分の薬学上許容される口腔クリーニングキャリヤ成分は、通常組成物の約５０〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５〜約９９．９９％、更に好ましくは約６５〜約９９％である。本発明の口腔クリーニング組成物に含有させてもよい薬学上許容されるキャリヤ成分と任意成分は当業者に周知である。口腔クリーニング組成物で有用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で発行されたSeibelの米国特許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で発行されたSampathkumarの米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２日付で発行されたBenedict,Bush 及びSunberg の米国特許第５，０２８，４１５号明細書で開示されており、それらはすべて引用することにより本明細書の開示の一部とされる。本発明の口腔クリーニング組成物態様は下記例で説明される。例７１〜７４例７１〜７４において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＶａｌ１９９Ｌｅｕ＋Ｐｒｏ２０４Ａｌａ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕ＋Ｓｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例７５〜７８例７５〜７８において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＳｅｒ２１０Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例７９〜８２例７９〜８２において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＴｙｒ２０８Ｐｈｅ＋Ｌｅｕ２１１Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例８３〜８６例８３〜８６において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＶａｌ１９９Ｍｅｔ＋Ｐｒｏ２０４Ａｌａ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。２．義歯クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義歯クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を含有する。このような義歯クリーニング組成物は、有効量の１種以上の酵素変異体、好ましくは組成物の約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に一層好ましくは約０．０１〜約２０％の１種以上の酵素変異体と、義歯クリーニングキャリヤを含有する。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォーマットが当業界で周知であり（例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされるYoung の米国特許第５，０５５，３０５号明細書参照）、義歯からタンパク質汚れを除去する上で１種以上の酵素変異体の配合に通常適している。本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明される。例８７〜９０例８７〜９０において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＳｅｒ２１０Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。３．コンタクトレンズクリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を含有する。このようなコンタクトレンズクリーニング組成物は、有効量の１種以上の酵素変異体、好ましくは組成物の約０．０１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約２０％、更に一層好ましくは約１〜約５％の１種以上の酵素変異体と、コンタクトレンズクリーニングキャリヤを含有する。錠剤、液体などのような様々なコンタクトレンズクリーニング組成物フォーマットが当業界で周知であり（例えば、１９８９年９月５日付で発行されたDavies,Meaken およびReesの米国特許第４，８６３，６２７号；１９８８年５月２４日付で再発行されたHuth,LamおよびKirai の米国特許Ｒｅ第３２，６７２号；１９８６年９月２日付で発行されたSchafer の米国特許第４，６０９，４９３号；１９８７年９月１日付で発行されたOgunbiyiおよびSmith の米国特許第４，６９０，７９３号；１９８６年９月３０日付で発行されたOgunbiyi,Riedham mer およびSmith の米国特許第４，６１４，５４９号；１９８１年８月２５日付で発行されたOgata の米国特許第４，２８５，７３８号明細書参照；これら各々は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）、コンタクトレンズからタンパク質汚れを除去する上で本発明の１種以上の酵素変異体の配合に通常適している。本発明のコンタクトレンズクリーニング組成物態様は下記例で説明される。例９１〜９４例９１〜９４において、特に表３〜３８で列挙されたズブチリシン３０９変異体がＶａｌ１９９Ｌｅｕ＋Ｓｅｒ２１０Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び改変が本発明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。本発明の範囲内に属するすべてのこのような改変は、請求の範囲に含まれると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:125） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ルービング，ドンネルトンアメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、シード、ロード、8224 (72)発明者ゴウシュ，チャーンチャールクマーアメリカ合衆国オハイオ州、ウエスト、チェスター、パインミル、ドライブ、7005

Claims

【特許請求の範囲】１．ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しているズブチリシン３０９変異体であって、改変アミノ酸配列が１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうちの１以上における置換を含んでおり、ａ．置換が１９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＣｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｂ．置換が１９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｃ．置換が１９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｄ．置換が１９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｅ．置換が１９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｆ．置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｇ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎまたはＳｅｒであり、ｈ．置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｉ．置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｊ．置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、ｋ．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｌ．置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｍ．置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｎ．置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、ｏ．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｐ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｑ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｒ．置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｓｐであり、ｓ．置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕであり、ｔ．置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｕ．置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、それにより、ズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有しており、好ましくはｉ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＳｅｒであり、 ii．置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iii.置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iv．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｖ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、更に好ましくは、置換が１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうち１以上で生じるとき、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のいずれに関する置換アミノ酸もＡｓｐまたはＧｌｕであり；置換が２０３位で生じるとき、２０３位の置換アミノ酸はＡｓｐであり；置換が２０７または２１２位の１以上で生じるとき、２０７または２１２位の置換アミノ酸はＧｌｕであることを特徴とする、ズブチリシン３０９変異体。２．置換がａ．２０７位でＴｈｒの代わりにＧｌｕ、ｂ．２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、またはｃ．２１０位でＳｅｒの代わりにＡｓｐである、単一アミノ酸置換を有している、請求項１に記載のズブチリシン３０９変異体。３．ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しているズブチリシン３０９変異体であって、改変アミノ酸配列が１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうちの３以上における置換を含んでおり、ａ．置換が１９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｂ．置換が１９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｃ．置換が１９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｄ．置換が１９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｅ．置換が１９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｆ．置換が１９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｈ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ｉ．置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｊ．置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｋ．置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｌ．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｍ．置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｎ．置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｏ．置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｐ．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｑ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｒ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｓ．置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ｔ．置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｕ．置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｖ．置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、それにより、３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有しており、好ましくはｉ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、 ii．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iii.置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iv．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｖ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、および vｉ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕまたはＡｓｐであることを特徴とする、ズブチリシン３０９変異体。４．置換がａ．２０７位でＴｈｒの代わりにＧｌｕ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、ｂ．１９７位でＶａｌの代わりにＬｅｕ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、ｃ．１９９位でＶａｌの代わりにＬｅｕ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＡｓｐ、ｄ．２０４位でＰｒｏの代わりにＡｌａ、および２０９位でＡｌａの代わりにＴｈｒ、ｅ．２０８位でＴｙｒの代わりにＰｈｅ、および２１１位でＬｅｕの代わりにＡｓｎ、ｆ．７４位でＡｓｎの代わりにＡｓｐ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、またはｇ．２０７位でＬｙｓの代わりにＧｌｕ、および２１０位でＡｌａの代わりにＧｌｕである、２つのアミノ酸置換を有する、請求項３に記載のズブチリシン３０９変異体。５．ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しているズブチリシン３０９変異体であって、改変アミノ酸配列が１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうちの３以上における置換を含んでおり、ａ．置換が１９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｂ．置換が１９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｃ．置換が１９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｄ．置換が１９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｅ．置換が１９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｆ．置換が１９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｈ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ｉ．置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｊ．置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｋ．置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｌ．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｍ．置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｎ．置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｏ．置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｐ．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｑ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｒ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｓ．置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、ｔ．置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｕ．置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｖ．置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、それにより、３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有しており、好ましくはｉ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、 ii．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iii.置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、 iv．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｖ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、および vi．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕまたはＡｓｐであることを特徴とする、ズブチリシン３０９変異体。６．置換がａ．２００位でＧｌｎの代わりにＧｌｕ、２０５位でＧｌｙの代わりにＡｌａ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、ｂ．１９９位でＶａｌの代わりにＬｅｕ、２０４位でＰｒｏの代わりにＡｌａ、および２０７位でＴｈｒの代わりにＧｌｕ、ｃ．７４位でＡｓｎの代わりにＡｓｐ、２００位でＧｌｎの代わりにＧｌｕ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、またはｄ．２００位でＧｌｎの代わりにＧｌｕ、２０７位でＴｈｒの代わりにＧｌｕ、および２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕである、３つのアミノ酸置換を有している、請求項５に記載のズブチリシン３０９変異体。７．下記４つの置換：２０４位でＰｒｏの代わりにＡｌａ、２０７位でＴｈｒの代わりにＧｌｕ、２１０位でＳｅｒの代わりにＧｌｕ、および７４位でＡｓｎの代わりにＡｓｐを有している、請求項５に記載のズブチリシン３０９変異体。８．下記５つの置換：１９９位でＩｌｅの代わりにＬｅｕ、２０４位でＰｒｏの代わりにＡｌａ、２０７位でＬｙｓの代わりにＧｌｕ、２１０位でＡｌａの代わりにＧｌｕ、および７４位でＡｓｎの代わりにＡｓｐを有している、請求項５に記載のズブチリシン３０９変異体。９．ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有しているズブチリシン３０９変異体であって、野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域および第五ループ領域を含んでなり、改変アミノ酸配列は１以上のループ領域において１以上の位置で置換を含んでおり、Ａ．置換が第一ループ領域で生じるとき、置換は５７、５８、５９、６０、６１、６３または６４位のうち１以上で生じ、ａ．置換が５７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｂ．置換が５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕであり、ｃ．置換が５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｄ．置換が６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｅ．置換が６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｆ．置換が６３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、およびｇ．置換が６４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；Ｂ．置換が第二ループ領域で生じるとき、置換は９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５位のうち１以上で生じ、ａ．置換が９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｂ．置換が９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｃ．置換が９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｄ．置換が９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｅ．置換が９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｆ．置換が９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｈ．置換が１００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｉ．置換が１０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｊ．置換が１０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｋ．置換が１０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｌ．置換が１０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｍ．置換が１０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；Ｃ．置換が第三ループ領域で生じるとき、置換は１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１２４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｂ．置換が１２５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｃ．置換が１２６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｄ．置換が１２７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、ｅ．置換が１２８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｆ．置換が１２９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が１３０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｈ．置換が１３１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒであり；Ｄ．置換が第四ループ領域で生じるとき、置換は１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０または１６１位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１５２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｂ．置換が１５３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｃ．置換が１５４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｄ．置換が１５５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｅ．置換が１５６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｆ．置換が１５７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が１５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｈ．置換が１５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｉ．置換が１６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｊ．置換が１６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；Ｅ．置換が第五ループ領域で生じるとき、置換は１８１、１８２、１８３、１８４または１８５位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１８１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｂ．置換が１８２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｃ．置換が１８３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌであり、ｄ．置換が１８４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびｅ．置換が１８５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり；それにより、ズブチリシン３０９変異体は野生型ズブチリシン３０９と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有していることを特徴とする、ズブチリシン３０９変異体。１０．ズブチリシン３０９野生型アミノ酸配列が第六ループ領域を更に含んでおり、改変アミノ酸配列が第六ループ領域で１以上の置換を更に含み、第六ループ領域における置換が１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４位のうち１以上で生じており、ａ．置換が１９３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、ＧＩｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｂ．置換が１９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｃ．置換が１９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、ｄ．置換が１９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｅ．置換が１９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｆ．置換が１９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｇ．置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｈ．置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｉ．置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｊ．置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｋ．置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｌ．置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、ｍ．置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｎ．置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｏ．置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、ｐ．置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｑ．置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、ｒ．置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐまたはＧｌｕであり、ｓ．置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、ｔ．置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、ｕ．置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、およびｖ．置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＳｅｒである、請求項９に記載のズブチリシン３０９変異体。１１．請求項１〜１１のいずれか一項に記載されたズブチリシン３０９変異体とクリーニング組成物担体とを含んでなることを特徴とする、硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物、コンタクトレンズクリーニング組成物および布帛クリーニング組成物からなる群より選択されるクリーニング組成物。１２．改変アミノ酸配列が７４位でＡｓｎに対して置換されたＨｉｓまたはＡｓｐを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のズブチリシン３０９変異体。１３．クリーニング組成物が硬質表面クリーニング組成物である、請求項１１に記載のクリーニング組成物。１４．クリーニング組成物が布帛クリーニング組成物であり、好ましくは組成物が液体の形である、請求項１１に記載のクリーニング組成物。１５．請求項１〜１１のいずれか一項に記載されたズブチリシン３０９変異体をコードするＤＮＡ配列３０９遺伝子。