JPH04500455A - 浮遊細胞培養装置と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、前記ポリオルガノシロキサンと共に硬化されている組成物が３−アミノプ ロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリメチル シリルフォーミック酸、３−（トリクロロシリル）酪酸及び１．　ｌ、　ｌ−ト リクロロ−Ｎ−（トリメチルシリル）シラン−アミンから成る群から選ばれたこ とを特徴とする請求の範囲第１３項記載の浮遊細胞培養装置。

１５．前記浮揚力を与える手段が空気充填の袋であることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。

１６、前記浮揚力を与える手段がリングであることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の浮揚細胞培養装置。

１７、前記浮揚力を与える手段がフオームリングであることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の浮揚細胞培養装置。

１８、前記浮揚力を与える手段が更に独立気泡のフオームリングを含むことを特 徴とする請求の範囲第１項記載の浮揚細胞培養装置。

１９、前記浮揚力を与える手段が更に独立気泡の発泡ポリスチレンフオームリン グを含み、前記膜が更にポリオルガノシロキサン膜を含むことを特徴とする請求 の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。

２０、前記独立気泡ポリスチレンリングがポリオルガノシロキサン膜と共に硬化 されていることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の浮遊細胞培養装置。

２１、前記共に硬化された独立気泡のポリスチレンリング及びポリオルガノシロ キサン膜が構造的に少なくとも一つのくぼみ穴を画成することを特徴とする請求 の範囲第２０項記載の浮遊細胞培養装置。

２２、前記共に硬化された独立気泡ポリスチレンリング及びポリオルガノシロキ サン膜が構造的に２個の相対するくぼみ穴を画成していることを特徴とする請求 の範囲第２０項記載の浮遊細胞培養装置。

２３、前記共に硬化された独立気泡のポリスチレンリングとポリオルガノシロキ サン膜が構造的に１個のくぼみ穴を画成していることを特徴とする請求の範囲第 ２０項記載の浮遊細胞培養装置。

２４、前記細胞培養体を生長させる手段が更に細孔を有する膜を含むことを特徴 とする請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。

２５、前記細孔を有する膜が更に微細孔を含むことを特徴とする請求の範囲第２ ４項記載の浮遊細胞培養装置。

２６、請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置の膜面に細胞を接種し、次いで 該浮遊細胞培養装置を液体細胞培養媒地目体の上に浮揚させると共に該接種細胞 を該細胞培養媒地に接触させ、液体細胞培養媒地目体は実験室容器内に収容され ていることを特徴とする浮遊細胞培養体の製作法。

２７、請求の範囲第２２項記載の２個の相対するくぼみ穴を有する浮遊細胞培養 装置の該２個の相対するくぼみ穴中に夫々細胞を接種し、浮揚細胞培養装置に重 りをつけ、実験室容器内に収容されている液体細胞培養媒地目体の表面下の位置 に沈めることを特徴とする細胞培養体の製作法。

２８、請求の範囲第２４項記載の浮遊細胞培養装置の細孔を存する膜に人間の表 皮ケラチン細胞を接種し、該装置を液体細胞培養媒地目体上に浮揚させるに際し て、この媒地をマウス３Ｔ３細胞の層上に位置させることを特徴とする人間の表 皮ケラチン細胞の生長方法。

２９、細胞培養体を生長させるのに適した膜と該膜に浮揚力を与える手段が回転 磁界をかけると浮遊細胞培養装置を回転させる手段に結合されていることを特徴 とする請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。

明細書 浮遊細胞培養装置と方法 技術分野 本発明は液体細胞培養媒地の上に浮遊する細胞培養支持体及び細胞培養支持体の 生体適合性表面に関する。

背景技術 試験管内（インビトロ）の細胞増殖に用いる従来の培養プレートや培養びんは代 表的には、ポリスチレン或いはガラスがら製造される。細胞培養の通常法として は、細胞をフラスコ、単−培養皿或いはマルチウェルプレートに接種し、栄養素 媒地を加え、条件を制御しながら細胞を培養する方法が挙げられる。試験管内細 胞培養の別の方法としては、連続して回転するガラスびん或いはプラスチックび ん内で細胞を生長させ、絶えず回転している媒地の下の培養容器の壁に細胞が付 着するようにする（代りに内表面積を大きくしたたてみぞをつけた回転びん内で 細胞を培養することもできる）、或いは細胞をガラスピーズ上、複合（コンプレ ックス）ポリサッカライドビーズ上または組織切片上で、或いは懸濁させて、適 当な培養媒地中にて培養する方法が挙げられる。これらの方法のいずれも、培養 媒地は細胞自身に変形応力を加えない。すなわち、上記方法では、鍵によって加 えられる体内応力、心臓或いは肺によりこれらの器官を構成する細胞に加えられ る周期的応力をシュミレートするような応力付加を行なわない。

Ａ、Ｊ、バーンズ（Ａ、　ｊＢａｎｅｓ　）らは「試験管内細胞に静的な、また は持続期間が可変の周期的な張力、或いは圧縮力を加える新しい真空作動応力供 給装置」　（“＾Ｎｅｗ　Ｖａｃｕｕｍ−Ｏｐｅｒａｔｅｄ　５Ｈｅｓｓ−Ｐｒ 。

ｖｉｄｉｎｇ　ｌ＋＋ｃｆ＋ｕａ＋ｅｎｆ　Ｔｈａｔ　Ａｐｐｌｉｅｓ　５ｔａ ｔｉｃ　ｏｒ　ＶａｒｉａｂｌＣＤｕｒａｔｉｏｎ　ＣＹｃｌｉｃ　Ｔｓｎｓｉ ｏｎ　ｏｒ　Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、 　”　、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、１９８５）中において、培養細胞の試験管内 油げに用いるシステムを開示している。（関連した試験管内システムは、Ｄ、ツ ムジエン（Ｄ、　Ｓｏｍｊｅｎ）らによる「プロスタグランジンＥ２に仲介され た物理的応力により誘起される骨の再構成Ｊ　（“Ｂｏｎｅ　Ｒｅｍｏｄｅｌｌ ｉｎｇ　１ｎｄｎｃｅｄ　ｂｙＰｈｙｓｉｃａｌ　５ｔｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｐ＋ｏ ｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　Ｍｃｄｉａｌｅｄ、　”　、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ ａ　Ｎ　Ｂｉｏｐｈ７ｓｉｃａ　Ａｃｊａ、６２７（１９８０）９１−１００； 　Ｄ、　Ｙ、　Ｍ、ルング（Ｄ、　Ｙ、　Ｍ、　Ｌｅｕｎｇ　）らによる「機械 的刺激に対する細胞応答研究のための新しい試験管内システム」　（“人Ｎｅｗ 　Ｉｎ　Ｖｉｌｒｏ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ ｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、　” 　、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ［ａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａ＋ｃｈ、１０９（１９７ ７）２５８−２９８；　Ｄ、　Ｙ、　Ｍ、ルング（Ｄ、　Ｙ。

Ｍ、　Ｌｅｕｎｇ　）らによる「周期的延伸は試験管内動脈平滑筋によるマトリ ックス成分の合成を刺激するＪ　（”Ｃ７ｃｌｉｃ　Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ　Ｓ ｔｉｍｕｌａｌｅｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｃｏｍｐｏｎ ｅｎｔｓ　ｂＹＡｔｌｅｒｉａｌ　Ｓｍｏｏｔｈ　ＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ　Ｉ ｎ　Ｖｉｔｒｏ”　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９１　（１９７６）４７５−４７ ７　；　ハセガヮ（）Ｉａｔｅｇａｖａ）らによる「機械的延伸はＤＮＡを合成 する培養骨細胞の数を増加し、これら細胞の蛋白質合成のパターンを変える」　 （“Ｍｅｃｈａｎｉｃａｔ　５Ｌｒｅｌｃｈｉ＋＋ｇ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔ ｈｅ　Ｎｕｍｂｅｔ　ｏｆ　Ｃｕ１ｆｕｒｅｄ　Ｂｏｎｅ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｘｉｎｇ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ａｆｔｅｒｓ　Ｔｈｅｉｒ　Ｐａｔｔｅ ｒｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５７ｎｔｈｅｓｉｓ”、　Ｃ１１ｃｉｆ　Ｔｉ５ ｓｕｅ　Ｉｎｊ、　３７（１９８５）４３１−４３６　；及びり、　Ｍ、ブルー ネット（ｐ、　Ｍ、　ＢｒｕｎｅＨｅ）らによる「機械的延伸は培養体内のＤＮ Ａを合成する上皮細胞の数を増加する」　（“Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓ４ｒｅ ｊｃｈｉｎｇ　）ｎｃｒｃ２ｓｅｓ　ｔｈｅ　Ｎｕｍｂｅ＋　Ｏｆ　Ｅｐｉｔｈ ｅｌｉａｉ　Ｃｅ１ｌｓ　５７ｎｊｌ＋ｅｓｉｘｉｎｇ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｃｎ１ ｔｕｒｅ、　”　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、５９（Ｆ９８４）３５−４５．　中に 開示されている。）Ａ、Ｊ。

バーンズ（Ａ、　Ｊ、　Ｂａｎｅｓ　）らにより１９８７年５月４日に出願され た米国特許第０４６．４４０号明細書に細胞の試験管内曲げに用いる改良システ ムが開示されていて、本明細書中に［細胞培養装置用の生体適合性ポリオルガノ シロキサン組成物Ｊ　”Ｂｉｏｃｏｍｐａｆｉｂｌｅ　Ｐｏｌｙｏｒｇａｎ。

５ｉｌｏｘａｎｅ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｌｏｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ”の引用がある。

試験管内の液体培養媒地中で細胞が曲げられると、（静的条件下で生長させられ ている同じ細胞と比較して）観察される変化が細胞生長支持体の曲げにより直接 生じるものか、このような変化が支持体の曲げにより液体培地内に起る二次的な 流れ或いは乱れにより生じるのかという疑問が生じる。明らかに、従来法による 静的細胞生長培養はこの疑問の調査に“対照試料”を与えることができない。

このようなシステムには、支持体向げも液体培地運動も存在しない。

従って、細胞を液体細胞生長媒地に入れ、その媒地は個々の細胞支持体の曲げに より撹拌されるが媒地が支持する細胞を実際には曲げないという細胞生長の“対 照試料”用装置に対する需要が依然として存在する。

発明の開示 本発明は、この調要を満足し、更に以下に述べる細胞培養の付加的改良を達成す るためになされたものであり、浮遊細胞培養装置に関し、この装置は、全体とし て、細胞培養体を生長させる手段と装置全体に浮力或いは浮揚を与える手段を有 する。本発明は装置と装置の使用法を含む。本発明の代表的実施例は生体適合性 ポリオルガノシロキサン組成物から成る（或いは同組成物を塗布した）一般的に 円形の平らな膜を含み、この膜は枠或いはリム状の構造［例えば、発泡ポリスチ レン（商品名・８４Ｈｏｆｏａｍ）のリングコにより囲まれ、この構造は膜に浮 力を与える。膜表面は細胞を接種でき、必要に応じて液体細胞培養媒地と接触で き、及び／或いは該媒地上に浮遊できる。膜が浮遊している時、液体培養媒地内 に存在する流れ或いは乱れにより引起される場合を除いて、機械的応力は細胞培 養体に伝達されない。本発明の装置は、従って細胞の試験管内曲げと結びつけた “対照試料”用の細胞生長表面を与える有用性を有する。浮遊細胞培養装置の色 々な実施例は液体媒地と空気曝露を必要とする細胞層の培養と、最初は分離して いるが、液体細胞培養媒地を共に分ち合いモして／或いは相互に移動し合う２つ の細胞培養層の維持に更に有用性を示す。

図面の簡単な説明 第１図は本発明に係る浮遊培養装置の第１実施例を示す透視図である。

第２図は第１図のｎ−ｎ線に沿った断面図である。

第３図は本発明に係る浮遊細胞培養装置の第２実施例を示す透視図である。

第４図は第３図のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図である。

第５図は本発明に係る浮遊細胞培養装置の第３実施例を示す透視図である。

第６図は第５図のＶＩ−ＶＩ線に沿った断面図である。

第７図は本発明に係る浮遊細胞培養装置の第４実施例を示す断面図である。

第８図は覆いをした実験室プレート内に収容されている細胞培養支持体に浮遊し ている第２図の浮遊細胞培養装置の断面の模式図である。

第９図は覆いをした実験室プレート内に収容されている細胞培養支持体内に沈め た第７図の浮遊細胞培養装置の断面を示す模式図である。

第１０図は本発明に係る細胞培養装置の第５実施例を示す断面図である。

発明の実施するための最良の形態 一般に、本発明は液体細胞培養媒地の表面に浮遊させられる細胞培養支持体及び この支持体を用いて細胞生長を行なういろいろな方法を含む。本発明の最初の記 述は、第り図及び第２図に示すような本発明の第１実施例を参照して行なうこと が最良である。

第１図及び第２図について述べると、浮遊細胞培養装置１ｏは薄い中央膜１２を 有する。中央膜１２の下面は細胞を接種して細胞培養体を形成させるようになっ ており、細胞を付着させ、伸展させ、増殖させるのに適している。中央膜］−２ は以下に述べるように浮遊するのに適しており、その結果、膜１２の下面上の新 生細胞培養体は液体細胞培養媒地自体の浮遊物すなわち“浮遊細胞培養体”と接 触する。

中央膜１２は一般に形状が円形であり、その周囲をリング状構造体で囲まれてい る。リング状構造体は浮揚性リング１４で、その全体は中央膜１２と同じ物質の 連続シートで被覆されており、従ってこの連続シートは浮揚性リング膜１６を与 える。この構造は例えば、発泡ポリスチレン（商品名Ｓｉｙｒｏｆｏａｍ）で作 った浮揚性リング１４を未硬化ポリオルガノシロキサン槽中を通し、かくして形 成された中央膜１２が破れる前に被覆物質を硬化させて得られる。ポリオルガノ シロキサン以外の適当なポリマーとしては、一般にポリエステル、ポリウレタン 、ポリアクリレート、ポリエーテル、ポリイソシアヌレート、ポリカーボネート 及びポリオレフィンが挙げられる。

選んだポリマーはエラストマーであって良いが、エラストマーでなければならな い訳ではない。このような製作法を実施できる未硬化ポリマーの粘度範囲や他の パラメーターについては、当業者は認識しているであろう。浮遊性材料全体をポ リマー槽中に通す利点は、形成される連続皮膜により湿分不透過性が与えられる 点にある。従って連続気泡発泡体のような水に鋭敏な浮遊性材料でも浮揚性リン グ１４に組込むことができる。従って本発明の第１の実施例に用いるのに適した 浮遊性材料としては、一般に空気充填或いはガス充填された天然の或いは合成の 袋や風船、ポリイソシアネート、ポリウレタン、ポリイソシアヌレート、ポリオ ルガノシロキサン、ポリスチレン、天然または合成ゴム、或いはポリオレフィン で製作された連続気泡または独立気泡の発泡体、織物、植物繊維毛羽、詰綿或い はマット等の天然に生じる浮遊材料が挙げられる。なお、浮揚性リングコアー１ ４は空気或いは液体媒地より軽いガスのみがらなっていても良いし、両者の混合 物から成っていても良い。

第３図及び第４図について述べると、これらの図には本発明の第２の実施例が示 してあり、本実施例では浮遊積層体細胞培養装置５０が中央膜積層体５２を装置 の中央に有している。中央膜積層体５２は生体適合性ポリオルガノシロキサン積 層シート材である。大体が平らで円形の中央膜積層体５２の周囲とその上面には 発泡ポリスチレン（商品名：Ｓｔｙｒｏｌｏａｍ）で製作した浮揚性リング５４ が接着されている。中央膜５２は共に硬化させる際に浮揚性リングと隣り合った 箇所で浮揚性リングに接着する。未硬化或いは部分的に未硬化の中央膜積層体５ ２は、浮揚性リング５４に隣接した箇所で共に硬化して接着力をもたらす。或い は未硬化、部分硬化した或いは硬化した中央膜積層体５２は未硬化物質と隣り合 った所で未硬化物質と共に硬化し、この未硬化物質は硬化の際に浮揚性リング５ ４を形中央膜積層体及び浮揚性リングは任意に細胞毒性のない接着性組成物を用 いて接着することもできる。

上記浮遊性物質の多くが本発明の第２の実施例に用いるのに適しているが、一般 にこれらの物質は少なくとも実質的には液体透過性があるか、さもなければ細胞 培養液体媒地と接触して浮揚し、使用中に液体媒地が浮揚性リング５４を濡らす と浮遊を確保しなければならない。従って、浮揚性リング５４は、ポリイソシア ネート、ポリウレタン、ポリイソシアヌレート、ポリオルガノシロキサン、ポリ スチレン、天然または合成ゴム、ポリオレフィンで製作される。

第２の実施例の浮揚性リング５４を製作するための好ましい物質は発泡ポリスチ レンである。

このような状況下で本発明の中央膜１２或いは中央膜積層体５２は、好ましくは 試験管内細胞培養体の細胞が容易に付着する生体適合性ポリオルガノシロキサン 組成物で製作される。代表例としては、この生体適合性ポリオルガノシロキサン の生体適合性は、下記４方法の中の何れかの方法による表面改質により得られる 。組成物表面に炭素粒子を埋込む、或いは第１級アミンと必要に応じて用いられ るペプチドとで表面を処理するか、第１級アミンまたはカルボキシル基を含有す るシラン或いはシロキサンと共に硬化して表面を誘導体化（＋！ｅｒｉｖｔｔｉ ｘｅ）する。誘導体化反応は未硬化或いは硬化ポリオルガノシロキサン表面に行 なう。然しながら何れの場合も誘導体化は、ポリオルガノシロキサン表面に行な う。アミノ基或いはカルボキシル基及び任意のペプチドは、存在するならばポリ オルガノシロキサン組成物の表面に配向し、生体適合性表面を形成すると信じら れている。この説によると、鎖末端及び／または存在するヒドロキシル基はポリ オルガノシロキサン表面に配向し、細胞培養体との反応に参加し得る。その結果 、生じる生体適合性の一つの重要な様相は、培養体中の細胞が液体細胞培養媒地 上に浮遊する膜の下面にさえも付着できることである。

硬化或いは未硬化ポリオルガノシロキサン膜の誘導化の第１の方法は、その表面 への多数の元素炭素粒子埋込みを含む。例えば、離型層の未硬化膜をブンゼンバ ーナーの焔と接触させ、微細な炭素粒子を表面に析出させると共に該表面を硬化 させる。得られた表面は、従来法によるポリオルガノシロキサン膜と比較して、 改善された細胞付着を示す。

硬化ポリオルガノシロキサン膜におけるアミノ化の第２の方法は、２つの基本段 階を含む。第１に、大気下に約３０分間、回転させながら膜表面をその面積１平 方センチ当り０．　５〜１ｍｌのｌＮ−ＨＣｌで処理する。その後、酸を傾瀉す る。次いで、約３０分間大気下で膜表面をその表面１平方センチ当り０．５〜１ ｍｌの１−モル／ｌの濃度のＮＨ４ＯＨで処理する。或いはその代りに、酸を傾 瀉後、ガラス鐘中で表面をアンモニア蒸気に１５分間曝す。得られた改質表面を 水洗し、乾燥させる。化学量論的に等量のＨＦＩ、ＨＢｒ（或いは他のハライド 含有酸）　、ＮＨ４Ｃｌ或いはＮＨ４ＨＣｌ３等の酸や第１級アミンでおきかえ て処理しても良い。このように処理された表面は、処理ポリオルガノシロキサン からたれ下がりポリマー表面に配向しているアミノ基が存在するために生体適合 性を示すと信じられている。この表面は細胞仲介のプロセスによるプロティンの 共有結合付加を許容し得る。この表面は負に帯電した化合物を吸着することもあ り、この化合物は引き続いて細胞の付加、付着及び伸展を容易にし、或いは更に 誘導化を容易にし、この誘導化は更に合成段階を伴ない、或いは細胞仲介されて いることがある。

ポリオルガノシロキサン表面を処理する第３の方法は、上記のアミノ化処理とさ らにそれに続くペプチド化が含まれる。酸性化とアミノ化の段階と続いて行なう 水洗の後で、表面をその表面積１平方センチ当り０．　５〜１ｍｌの量で、濃度 １ミリモル／ｌ〜１ナノモル／ｌのグルタルアルデヒドと接触させて表面処理を 行なう。当量のアセトアルデヒド或いはブチルアルデヒド等の他の反応性アルデ ヒドを代りに使用しても良い。グルタルアルデヒド処理の表面は、典型的には、 アミンとカルボキシル基の両方の官能性を持つペプチドの水溶液と接触させる。

二官能性アルデヒドは共有結合成分として作用するばかりでなく、物理的スペー サーアームとしても作用し、引続いて結合したペプチド種をポリオルガノシロキ サンベースの面上に立上らせる。通常は、選択したペプチドは直線状に配置され た２〜４０のアミノ酸を有し、その結果、ペプチドの相対向する端末にアミンと カルボキシル基の官能性を与えることになる。然しながら、分子量数千のより大 きなペプチドとプロティンを用いることもできる。最後に水洗を行なう。アルデ ヒドは結合したアミンと反応してシッフ塩基を生じ、遊離のアルデヒドが残る。

このアルデヒドはペプチドのアミノ基と反応する。得られたアミノ化／ペプチド 化ポリオルガノシロキサンは、従って生体適合性第１級アミン含有カルボキシル 基末端の表面を与える。特定の細胞培養体に対して、付着性を考慮してペプチド を選択すると、この表面の生体適合性は殊に高められる。任意の応用に対して、 公知の方法によりペプチドの適合性を決定できる。

アミノ化の第４の方法は、ポリオルガノシロキサンを第１級アミン含有或いはカ ルボキシル基含有シラン或いはシロキサンと共に硬化させることを含む（共に硬 化させるという言葉は少なくとも一つの隣接するシラン含有或いはシロキサン含 有組成物がインシトウ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で硬化されることを意味する。）。典 型的化合物としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチ ルトリメトキシシラン、トリメチルシリルフォーミック酸、３−（トリクロロシ リル）酪酸及び１．１．　Ｉ−）−リクロローＮ−（トリメチルシリル）シラン アミンが挙げられる。第１級アミン含有或いはカルボキシル基含有シラン或いは シロキサンの適当な希釈剤としては、メトキシトリメチルシラン、トリメトキシ シラン、クロロジメチルシラン及びクロロトリイソシアナートシランが挙げられ る。シラン或いはシロキサン（シラン希釈剤を伴うこともある）を水溶液或いは 実質的に中性ないし塩基性ｐＨの緩衝水溶液にして塗布し、硬化或いは部分的に 硬化したポリオルガノシロキサン表面全体を覆う。細胞培養媒端の製作に普通に 用いられる緩衝液ならば何でもシラン或いはシロキサンの溶媒或いはキャリアー として用いるのに適している。緩衝液の例としては、組織培養技術で良く知られ ている２０ミリモル／ｌの濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液と燐酸塩緩衝液が挙げられる 。燐酸塩緩衝液は、アミノシリル化合物との使用に好ましい。ＨＥＰＥＳ緩衝液 は化学的に、例えばトリエトキシシリルプロピルアミンと反応し、他方燐酸塩緩 衝液は反応しない。当業者は容易にこれらの必要性に適応でき、或いは燐酸塩緩 衝液をすべての応用に簡単に使用することもできる。得られた層は室温まで１５ 分以上２４時間以内の時間で共に硬化する。もし望むなら、高温で硬化させるこ ともできる。他の方法として、第１級アミン含有或いはカルボキシル基含有シラ ン或いはシロキサンを硬化させていないポリオルガノシロキサン上に塗布し、次 いでベースのポリオルガノシロキサン単独の場合の硬化法と同様にして二層を共 に硬化させる。硬化させた表面は、更に上記のペプチド化処理或いは炭素粉埋め 込み処理を任意に行なうこともできる。

製作成いは製造後、組成物を水或いは緩衝液で洗浄し、例えば紫外線照射処理に より滅菌し、使用前の貯蔵のために包装する。他の滅菌法としては、マイクロ波 エネルギー、ガンマ線照射及び公知の他の方法が挙げられる。

上記の方法に加えて、膜と細胞生長支持体を浮揚リング１４として用いられた上 記発泡ポリスチレンのような浮揚性を与えるポリマー等の公知のポリマー及び材 料から製作し、例えば細胞付着性、光学的透明性等を必要としない特定の応用に 用いても良い。これらの浮遊性培養装置は製作され、望むならば生体適合性ポリ マーを塗布し、滅菌され、ここに記載する他の浮遊性細胞培養装置と同様にして 使われるが、一つの明らかな相異は、膜或いは細胞生長支持体自身が浮揚力を与 える物質で作られているならば、浮揚リング或いは他の浮揚構造を必要としない （挟持可能で細胞の付着しない構造を与えなければならないカリ。

第４図について再び述べると、中央膜積層体５２は好ましくは上記第４の方法に 従って製作される。その結果、中央膜積層体５２の上層はポリオルガノシロキサ ンを含み、下層は硬化したアミン含有或いはカルボキシル基含有シラン或いはシ ロキサンを含む。

本発明の細胞培養装置の結合構造体は製作され、組立てられ、公知の方法で結合 される。ポリマー材料は、希望により成型されるか打ち抜かれ、構造体間の接着 は、接着剤によるか或いは共に硬化させる。すなわち、１つ以上の接着すべき構 造体をインシトウ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）硬化をさせて行なう。上記の如く、浮揚性 リングは一つ以上の未硬化ポリマー槽を通過させ、形成された中央膜がこわれる 前にポリマーを硬化させる。当業者にとって、これらの製作法、及び使用する鋳 型、マンドレル離型層及び他の工具はまったく明らかである。

本発明に係る上記装置は下記のようにして使われる。生体適合性膜の片面に培養 しようとする細胞を公知の方法で接種する。通常は膜の下面に接種する。次いで 装置を多量の液体培養媒地の表面におく。装置を細胞培養体の試験管内面げの“ 対照試料”用支持体として使用する時は、すでに曲げ手段に隣り合って配置し、 多量の液体培養媒地の上に装置を置く。このような装置は、先に引用した１９８ ７年５月４日出願の米国特許第０４６．４４０号明細書に述べられている。静的 （すなわち、動かない）細胞生長支持体での細胞生長を装置が支持するようにす るか、曲げ手段を用いる場合は、液体培養媒地中の流れ或いは乱れにより生じる 応力以外の応力が支持細胞上にかかるのを防ぐように装置を浮遊させる。

第５〜１０図は、本発明の付加的実施例を示す。第５図と第６図は本発明の浮遊 細胞培養装置の第３の実施例を示す。この例では、浮遊性培養装置 含む。浮揚リン・グ１０４はＳｊｙｒｏｌｏｇｍ　（商品名）のような発泡ボリ スヂレンで作られるが、第２図或いは第４図に示す浮揚性リング１４或いは５４ の曲表面とは異なり、浮揚性リング１０４は図に示すように平らな底面、上面及 び側面を持つ。中央膜１０２は生体適合性ポリオルガノシロキサンの層であり、 上記の物質から選ばれ、浮揚性リング１０４の中央内のインシトウ（ｉｎ　５ｉ ｊｕ）で硬化される。第３の実施例の浮遊性細胞培養装置１００（図示されるよ うな方向にある）を培養媒地目体の上部に浮遊させると、円筒状の空間１０６が 培養媒地と中央膜１０２の間に保持される。この閉じた空間は中央膜１０２の下 部表面上の細胞培養に有益に用いられる。第５図と第６図に示す第３の実施例の 本発明の浮遊細胞培養装置は、図示したのとは反対に逆さにしても使用でき、そ の場合は、中央薄膜は、液体細胞培養媒地目体と接触し、閉じた空間を保持し２ ない。

第７図は本発明に係る第４の実施例の浮遊細胞培養装置を示す断面図である。図 において、浮遊細胞培養装置１５０は、薄い中央膜１５２を持つ浮揚リング１５ ４を含む。中央膜１５２は、上記の物質から選ばれた生体適合性ポリオルガノシ ロキサン組成物から成り、浮揚性リング１５４とインシトゥ（ｉｎ　ｓｉ［ｕ） で共に硬化させる。

中央薄膜１５２は、浮揚リング１５４にリングの厚みの中央点で固定され、その 結果、結合された構造体は上部と下部のくぼみ穴１５６．１５８を形成する。必 要に応じ、上部くぼみ穴１５６或いは下部くぼみ穴１５８、或いは両方で細胞を 生長させる。第７図の浮揚細胞培養装置１５０を液体細胞培養媒地目体の上に浮 遊させる時、２つのくぼみがあるために、中央薄膜１５２と液体細胞培養媒地目 体との間の空間が確保される。図示の浮揚リング１５４は、発泡ポリスチレン（ 商品名：ｓｌｙｒｏｆｏａｍ）で作られる。

第８図について述べると、第２図の浮遊細胞培養装置１０が覆いをした実験室プ レート２００内の液体細胞培養媒地２０２自体の上部に浮遊している。第８図は １つのシステムを示し、このシステムは、例えば２つの別個の培養体を共に培養 するのに殊に適している。

システム内では、細胞培養体は別々に保持されるが、培養体を養う液体培養媒地 は自由に一つの培養体から他の培養体へ横断できる。

第８図の浮遊細胞培養装置が殊に適している一つの応用を以下に述べる。従来の 細胞培養装置では、人間のケラチノサイト（人間の表皮細胞）を首尾一貫してう まく生長させるのは困難であった。人間のケラチノサイトをマウス３Ｔ３細胞と 共に培養できることは知られており、このことに対する優力な学説はマウス３Ｔ ３細胞が未知の生長因子を細胞培養媒地中に放出し、人間のケラチノサイトはこ の生長因子と結びついて生長するとしている。この発見を考慮して、従来法では 人間のケラチノサイトは、一つの細胞培養層中でマウス３Ｔ３細胞と結合され、 首尾良く共に培養されている。然しなから、このようにして得られる細胞層は、 人間の上皮移植材料としては、殆どか或いは全く有用でない。これは、このよう にして製造された層中のマウス３．Ｔ３細胞の存在が、得られた移植組織の免疫 的拒絶および終局的な衰退を不可避的にもたらすからである。

第８図に示すシステムにより、人間のケラチノサイト細胞とマウス３Ｔ３細胞は 、同じ液体培養媒地中の別個の層中で増殖できる。

第８図について再び述べると、人間のケラチノサイト細胞層２０４は、浮遊細胞 培養装置１０の中央薄膜１２の生体適合性ポリオルガノシロキサン面の下面に付 着する。マウス３Ｔ３細胞層２０６は、従来通り覆いをした実験室プレート２０ ０の底部の層中で生長する。

このプレート中には従来法により、液体細胞培養媒地２０２が入れである。人間 のケラチノサイト細胞層２０４は従ってマウス３Ｔ３細胞層と共に液体媒地を分 ち合う（付随して、実際に媒地中に存在する未知の“生長因子”に曝される）が 、人間のケラチノサイト細胞層２０４が中央膜１２の生体適合性ポリオルガノシ ロキサン表面に付着しているため、夫々の細胞層は分離されている。夫々の細胞 培養体の相互汚染は、従って通常は避けられる。最悪の場合でも、ケラチノサイ トがマウス細胞層上に落下するだけで、何らの実際的な問題も生じない。

人間のケラチノサイト層を移植或いは皮膚移植する必要がある時、浮遊細胞培養 装置１２を覆った実験室プレート２００から取出しく滅菌条件下で）、表面のケ ラチノサイト細胞層と切離し、移植を受けるよう準備された患者の傷ベッドにこ の細胞層を直接当てる。

第８図には示していないが、浮遊細胞培養装置１０の中央膜１２に手を加えて微 細孔（マイクロポアー）を持たせても良い。ヌクレオボアー（Ｎｕｃｉｅｏｐｏ ｒｅ　：商品名）膜として知られる細孔を有するニトロセルロース膜等のように 、微細孔を有する膜は細胞培養技術の分野で良く知られており、また、必要に応 じた色々な大きさの微細孔を上記のようにして製作した生体適合性ポリオルガノ シロキサン膜に（公知の方法により）あけることもできる。（細孔膜は更に以下 に述べる。）第８図に示すような人間のケラチノサイト細胞層２０４の培養にお いては、支持中央膜１２に微細孔があけである時は、人間のケラチノサイト細胞 層２０４の上面は覆いをした実験室プレート２００中に存在する空気層に曝され る。この空気層曝露は、人間の上皮層中の皮膚を形成する細胞層の片側を空気に 曝し、従ってこの空気層曝露は人間の上皮層の生体内生長を刺激する。この試験 管内空気曝露は生体内移植の成功度を高める。

第９図について述べると、浮遊細胞培養装置１５０は液体細胞培養媒地２０２の 層を有する覆いをした実験室プレート２００内に沈められる。例えば２つのガラ ス重り２０９により浮遊細胞培養装置１５０は、液体細胞培養媒地２０２の層中 に沈めたままにしておく。

第９図に示すような重りを含めた配置は、取扱っている細胞培養体を最初に液体 細胞培養媒地中に沈め、次いで細胞培養媒地上に浮揚させる必要がある時に有用 である。ガラスは公知の最小の細胞毒性を持った材料である限り、このような重 りの材料として好ましい。

生物学的に不活性なステンレス鋼、チタン或いはチタン合金は、細胞毒物質を液 体細胞培養媒地中に浸出しない他の材料からなる重りと同様に、ガラスとおきか えることができよう。重りの物理的配置は本発明の要点にはなっておらず、公知 の方法によって行って良い。

第１０図について述べると、浮遊細胞培養装置３００の第５の実施例は多数の貫 通した細孔３０４を有する中央多孔膜３０２を囲み、この膜に固定された浮揚リ ング３０６を含む。第１０図に示す中央細孔膜３０２と細孔３０４は、実際の有 用な実施例より数倍大きく示しであるが、中央細孔膜３０２の代表例としては、 ヌクレオボアー（Ｎｕｃｌｅ、ｏｐｏ＋ｅ）の商品名で入手できる細孔を有する ニトロセルロー・ス膜のような微細孔膜が挙げられ、一般に約１〜１００ミクロ ンの細孔径を有している。従って、本発明の第５の実施例は、公知の細孔膜に本 発明の浮揚構造を提供する。

第１０図に示すように、浮遊細胞培養装置３００は、その表面に第１と第２の細 胞集団３０８．３１．０を保持する。第１と第２の細胞集団３０８．３１０は中 央細孔膜３０２の細孔３０４により連絡している。もし７媒地及び／或いは第１ 細胞集団３０８が第２の細胞集団３１０の細胞が移動するのを誘起する因子を含 むか或いは放出すると、このような細胞移動は細孔３１１により可能となる。移 動する細胞の数は数えることができ、この数は通常は対向する細胞集団及び／或 いは生長媒地中の移動誘起物質の濃度に比例する。このような浮遊細胞培養装置 は、広範囲かつ多くの応用が可能であるが、第１０図の装置の典型的使用法は、 移動誘起物質のバイオアッセイである。このようなアッセイはボイデンアッセイ として知られるチェンバー移動アッセイと類似性があるが、このチェンバー移動 アッセイは浮揚手段を伴なわない。

本発明を以下の実施例により更に説明する。

実施例１ ８５ｇの清浄縁エラストマー（商品名：　ＭＤＸ−４２１０、ダウコーニング社 製）と、１５ｇの該エラストマーに添えられた触媒と、１５ｇの薬品級シリコン オイルとを混合してポリオルガノシロキサン組成物を調製した。

これら成分は、プラスチック製使いすてビーカー内で計量した後、ドリル装置の 混合工具で混合した。

１０個のスチロフォーム（商品名・５ｔｙｒｏｆｏｘａ＋）リングを形成し、０ 、　５ａｏ厚さ、外径３．　Ｏａｏ、内径２ａｎとした。これらのリングは一般 に“救命具”の形状にしたが、リングの下面は実質的に平らであった（第１図、 第２図に示す浮揚性リング１４のように）。エアロゾルシリコンラバー離型剤を スプレーしたゴム手袋をつけた指で、リングは１つ１つプラスチック製使いすて ビーカー中の樹脂組成物に浸し、硬化用の離型ライナー上に注意深く置いた。リ ングを支持している離型紙を６０℃に設定したオーブン中の平らな金属ラック上 に置き、４５分間かけて硬化させた。（何らかの理由で高温での硬化処理が遅れ る場合は、リングは熱処理前に一２０℃で貯蔵した。）それからプレートをオー ブンから外して、３０分かけて室温に持って行った。ポリオルガノシロキサン樹 脂の中央薄膜がスチロフォ・−ム（商品名：Ｓｌｙｒｏｆｏａｍ）リングの内径 を完全に満たした。この硬化処理によりポリオルガノシロキサン樹脂の硬化を９ ０％行ったと推定される。この範囲の重合は本発明の必要な特色ではないが、こ の重合が後の硬化（コキュアリング）を促進すると信じられている。

９８％純度の５ｍｌの３−アミノプロピルトリエキシシランを５ｍｌの燐酸塩緩 衝液（濃度１モル／Ａ、ｐＨ７゜２）と混合し、脱イオン水を加えて２５０ｍ１ の体積とした。各リングの下面に得られた３−アミノプロピルトリエキシシラン 溶液４ｍｌを塗布し、下面をアミノ化した。リングを一定温度に保ち、離型ライ ナー上にひっくり返し、暗所に室温で１２時時間−た。各リングの下面に得られ たアミノ化したポリオルガノシロキサン表面をＨＥＰＥＳ緩衝液（濃度２０ミリ モル／７）で簡単に２回洗浄し、最後にＨＥＰＥＳ緩衝液を塗布し、アミノ化し た表面に１５分間そのままにしておいた。リングを細胞培養フード中で紫外線に より１２時間滅菌し、滅菌条件下でプラスチックオーバーラツプ中に密封した。

実施例２ 実施例１で準備した浮遊細胞培養装置の中央薄膜のアミノ化した下面上に細胞を 接種した。装置を多量の液体細胞培養媒地上に下部を下側にして置いた。リング は装置全体を浮揚させ、適当な培養条件下に細胞生長を監視した。

実施例３ アミノ化を下記の方法によって行なった点を除いて、実施例１と同様にして浮遊 細胞培養装置を製作した。各硬化中央膜の下面を１ｍｌの１Ｎ塩酸と接触させ、 次いで傾瀉し、１モル／ｌの濃度の水酸化アンモニウム１ｍｌを加えた。各試薬 は適用箇所に３０分間用いた。

洗浄、乾燥、滅菌及び包装は実施例１の方法により行なわれた。

実施例４ 水酸化アンモニウム添加と水による洗浄の後で、ウェルベースを下記のようにグ ルタルアルデヒドとペプチドで処理した点を除いては、実施例３の方法により浮 遊細胞培養装置を製作した。

各硬化中央膜の下面をｌｎｍ／７の濃度のグルタルアルデヒド１ｍｌと接触させ た。各膜は次いでアミンとカルボキシル基の両官能性を有するペプチドの十分な 量の水溶液と接触させ、表面を覆った。

選択したペプチドは１ミリモル／ｌの濃度のＮＨ２−ＲＧＤＳ−ＣＯＯＨ（Ｒ＝ アルギニン、Ｇ＝ニブリシンＤ＝アスパラギン酸、Ｓ＝セリン）の水溶液であっ た。半時間後、実施例１の方法に従って細胞培養装置を水洗し、乾燥し、滅菌し 、包装した。

実施例５ 実施例１のプラスチック製使いすてビーカー中の組成物を離型ライナー上に鋳込 み、５．０ｍｌ厚さのポリオルガノシロキサンのシートとした。支持面に超音波 を当て、空気泡を除き、次いで真空中で遠心分離を行なった。平底の３．　０ａ ｎ径のスチロフォーム（商品名：Ｓｊｙｒｏｌｏａｍ）リングを平坦面を下側に して間隔を置いてシートに沿って置いた。６０℃に設定したオーブン中でシート と隣り合ったリングを４５分間かけて硬化させた。

オーブンから取出す際に、リングをはさみで分離し、各リングに垂れ下っている ポリオルガノシロキサンをトリミングした。これらのリングをひっくり返して、 実施例１の方法に従って３−アミノプロピルトリエキシシランを積層しくアミノ 化し）、洗浄し、乾燥し、滅菌し、密封した。

本発明の核心から離れることなしに、開示した本発明に多くの変化を加えること ができよう。本明細書全体にわたり開示した一般的に円形の膜は、勿論望ましい どんな形状であっても良い。開示した装置の浮揚リング中に金属棒或いは金属片 を埋め込んで、浮遊細胞培養装置を下部に置いた実験用撹拌装置に代表例される 磁気装置で回転させることもできよう。この回転は付着している細胞への栄養素 分子の輸送を増大し、細胞分裂速度や細胞中の他の生化学的変化を刺激する。ま た、生長促進剤のような物質を中央膜やリングに組込み或いは添加し、このよう な促進剤や他の物質を直ちに放出し、或いは除放し、細胞分裂、移動或いは他の 応答を刺激する。生長促進性物質としては、雰囲気レベルでない酸素、炭酸ガス 、これらの組合せ等の特別な雰囲気も含まれる。このような化学処理は、本発明 の浮揚細胞培養装置の製作の最後の段階で行なうことができ、完成品を促進因子 や他の物質を含む加圧容器中に入れ、促進因子や他の物質を装置の高分子成分中 に入れる。

特定の物質及び特定のプロセスを挙げて本発明について述べたが、本発明は、本 願記載の請求の範囲によってのみ制限されるべきである。殊に、寸法は決して本 発明の決定的な面ではない点に留意しなければならない。

第１図 第３図 第４図 第５因 第６図 第８図 第９図 第１０１ 国際調査報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞培養体を生長させるに適した膜から成り、該膜はこれに付加して浮揚力 を与える手段を有することを特徴とする浮遊細胞培養装置。
2. ２．前記浮揚力を与える手段が、空気、気体或いはポリイソシアナート、ポリウ レタン、ポリイソシアヌレート、ポリオルガノシロキサン、ポリスチレン、天然 または合成ゴムから得られる連続気泡あるいは独立気泡の発泡体、織物繊維、植 物繊維、織物フラッフ、織物パット或いは織物マットから成る群から選ばれた物 質を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。
3. ３．膜が更に硬化ポリマーを含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載の浮遊 細胞培養装置。
4. ４．前記硬化ポリマーがポリオルガノシロキサン、ポリエステル、ポリウレタン 、合成ゴム、天然ゴム、ポリアクリレート、ポリエーテル、ポリイソシアヌレー ト、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリオレフィンプラスチックから成る 群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第３項記載の浮遊細胞培養装置。
5. ５．前記ポリマーが更に生体適合性ポリマーを含むことを特徴とする請求の範囲 第４項記載の浮遊細胞培養装置。
6. ６．前記生体適合性ポリマーが更にその表面にアミン、カルボン酸或いは元素炭 素から成る群から選ばれた物質を組込んだポリオルガノシロキサンを食むことを 特徴とする請求の範囲第５項記載の浮遊細胞培養装置。
7. ７．前記物質がアミンであり、員つ該アミンが第１級アミンであることを特徴と する請求の範囲第６項記載の浮遊細胞培養装置。
8. ８．前記ポリオルガノシロキサン組成物が更にその表面にペプチドを組込んでい ることを特徴とする請求の範囲第７項記載の浮遊細胞培養装置。
9. ９．前記ペプチドが更に末端がカルボキシル基であるペプチドを含むことを特徴 とする請求の範囲第８項記載の浮遊細胞培養装置。
10. １０．前記カルボキシル基末端のペプチドがアミン官能性を有していることを特 徴とする請求の範囲第９項記載の浮遊細胞培養装置。
11. １１．前記カルボキシル基末端のペプチドがそのアミン官能性によりポリオルガ ノシロキサンの表面に組込まれていることを特徴とする請求の範囲第９項記載の 浮遊細胞培養装置。
12. １２．前記ポリオルガノシロキサン組成物が更に清浄級のエラストマー、医薬品 級のシリコンオイル及び触媒の硬化混合物を含むことを特徴とする請求の範囲第 １１項記載の浮遊細胞培養装置。
13. １３．前記ポリオルガノシロキサンがその表面を第１級アミン含有シラン、カル ボキシル基含有シラン、第１級アミン含有シロキサン及びカルボキシル基含有シ ロキサンから成る群から選ばれた組成物と共に硬化されていることを特徴とする 請求の範囲第１２項記載の浮遊細胞培養装置。
14. １４．前記ポリオルガノシロキサンと共に硬化されている組成物が３−アミノプ ロピルトリエトキシシラン、２−アミノエチルトリメトキシシラン、トリメチル シリルフォーミック酸、３−（トリクロロシリル）酪酸及び１，１，１−トリク ロロ−Ｎ−（トリメチルシリル）シラン−アミンから成る群から選ばれたことを 特徴とする請求の範囲第１３項記載の浮遊細胞培養装置。
15. １５．前記浮揚力を与える手段が空気充填の袋であることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。
16. １６．前記浮揚力を与える手段がリングであることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の浮揚細胞培養装置。
17. １７．前記浮揚力を与える手段がフォームリングであることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の浮揚細胞培養装置。
18. １８．前記浮揚力を与える手段が更に独立気泡のフォームリングを含むことを特 徴とする請求の範囲第１項記載の浮揚細胞培養装置。
19. １９．前記浮揚力を与える手段が更に独立気泡の発泡ポリスチレンフォームリン グを含み、前記膜が更にポリオルガノシロキサン膜を含むことを特徴とする請求 の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。
20. ２０．前記独立気泡ポリスチレンリングがポリオルガノシロキサン膜と共に硬化 されていることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の浮遊細胞培養装置。
21. ２１．前記共に硬化された独立気泡のポリスチレンリング及びポリオルガノシロ キサン膜が構造的に少なくとも一つのくぼみ穴を画成することを特徴とする請求 の範囲第２０項記載の浮遊細胞培養装置。
22. ２２．前記共に硬化された独立気泡ポリスチレンリング及びポリオルガノシロキ サン膜が構造的に２個の相対するくぼみ穴を画成していることを特徴とする請求 の範囲第２０項記載の浮遊細胞培養装置。
23. ２３．前記共に硬化された独立気泡のポリスチレンリングとポリオルガノシロキ サン膜が構造的に１個のくぼみ穴を画成していることを特徴とする請求の範囲第 ２０項記載の浮遊細胞培養装置。
24. ２４．前記細胞培養体を生長させる手段が更に細孔を有する膜を含むことを特徴 とする請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。
25. ２５．前記細孔を有する膜が更に微細孔を含むことを特徴とする請求の範囲第２ ４項記載の浮遊細胞培養装置。
26. ２６．請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置の膜面に細胞を接種し、次いで 該浮遊細胞培養装置を液体細胞培養媒地自体の上に浮揚させると共に該接種細胞 を該細胞培養媒地に接触させ、液体細胞培養媒地自体は実験室容器内に収容され ていることを特徴とする浮遊細胞培養体の製作法。
27. ２７．請求の範囲第２２項記載の２個の相対するくぼみ穴を有する浮遊細胞培養 装置の該２個の相対するくぼみ穴中に夫々細胞を接種し、浮揚細胞培養装置に重 りをつけ、実験室容器内に収容されている液体細胞培養媒地自体の表面下の位置 に沈めることを特徴とする細胞培養体の製作法。
28. ２８．請求の範囲第２４項記載の浮遊細胞培養装置の細孔を有する膜に人間の表 皮ケラチン細胞を接種し、該装置を液体細胞培養媒地自体上に浮揚させるに際し て、この媒地をマウス３Ｔ３細胞の層上に位置させることを特徴とする人間の表 皮ケラチン細胞の生長方法。
29. ２９．細胞培養体を生長させるのに適した膜と該膜に浮揚力を与える手段が回転 磁界をかけると浮遊細胞培養装置を回転させる手段に結合されていることを特徴 とする請求の範囲第１項記載の浮遊細胞培養装置。