JPS63196281A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養周基村上に
接着させ、増殖させるには、基材表面と細胞の接着性が
良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、細
胞の伸展、増殖に有効な形態となっていることが必要で
ある。しかしながら、従来から細胞培養用基材として用
いられている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるもの
の、上記接着性等の点に関して不適当であり、高密度か
つ長期間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十
分な成果を上げるに至っていない。

この一点を改善するため、生体高分子であるコラーゲン
やその変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布した
もの（特開昭５８−７１８８４号公報参照）や、高分子
材料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞
培養床（特開昭８１−５２２８０号公報参照）が提案さ
れている。

しかしながら、上記の従来技術は、高分子基材への糖や
蛋白質などの固定化が十分でなく容易に脱離してしまい
、細胞の接着性並びに接着した細胞の伸展性、増殖性お
よび活性維持が未だ十分でなく、高密度、長期間の細胞
培養ができないという問題点がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞の接着性、伸展および増殖に優れ、高密度かつ長期間
の細胞培養を可能ならしめる細胞培養用基材を提供する
ことを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記目的を
達成するためになされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子材料と無機材料とからなる複合体の表面上に、
糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合化合物（以下、こ
れらを糖蛋白質等と称する）が担持されていることを特
徴とするものである。

なお、上記複合体は、高分子材料に無機材料が充填され
たものでも、高分子材料上に無機材料が積層されたもの
でもよい。また複合体は、多孔性であるものが好ましく
、中空糸形状であるものがさらに好ましい。さらに、複
合体の表面に糖蛋白質等が部分的に担持されているもの
、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に糖蛋白質等が
担持されているものが好ましい。

上記のように、この発明は高分子材料と無機材料との複
合体を用いており、無機材料は親水性に富み、糖蛋白質
等との親和性が高く、基材に糖蛋白質等を安定かつ強固
に固定化することができる。

さらに、該複合体上に担持される糖蛋白質等は、細胞と
の接着性に優れ、細胞が安定した形態、配置で接着する
ことができる。すなわち、細胞表面の細胞膜の構造は、
脂質二重層の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋白質
、糖脂質等が分布をもって埋めこまれており、これらが
、上記脂質二重層の中を自由に移動でき細胞の接着に関
与している。上記糖蛋白質等は、膜内粒子と共有結合、
イオン結合、疎水結合等により結合可能な部位を有する
ので、細胞との接着性が高まると共に細胞を安定した形
態、配置で保持することができる。従って、本発明の細
胞培養用基材は、細胞の安定な接着を促すと共に接着し
た細胞の良好な伸展および増殖を可能にすることができ
る。

また、上記高分子材料が、多孔質材料であるときは、多
孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘り
細胞培養することができる。特に、前記高分子材料から
なる基材が中空糸であるものは、中空部内や中空糸の外
側に培養液等を泡流することにより、中空糸上に細胞を
高密度に育成、増殖させることができる。

さらに、複合体の表面に糖蛋白質等が部分的に担持され
ているもの、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に糖
蛋白質等が担持されているものは、接着する細胞の位置
を調整でき、細胞が所定の間隔をもって接着するので、
細胞との接着がさらに安定化し、細胞の伸展、増殖をよ
り一層増大させることができる。

以下、この発明をより詳細に説明する。

この発明の細胞培養用基材は、高分子材料と無機材料と
からなる複合体の表面上に、糖蛋白質等のいずれか１種
類以上が担持された構造を存する。

上記高分子材料としては、賦形性、機械的強度を有する
ものであればいかなるものでも使用でき、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン、アイ
オノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹脂、ポ
リスチレン等のスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレ
ート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコール、ポリ
酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアクリロニト
リル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリカー
ボネート、ボリアリレート、ポリフェニレンオキサイド
、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタ
レート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアミ
ド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系樹脂、シ
リコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合体もしく
は共重合体またはそれらのブレンド物が例示できる。

無機材料としては、種々の無機物質が使用できるが、特
に、アルミナ、二酸化ケイ素、シリカゲル、水酸アパタ
イト［Ｃａｃ　（ＰＯａ　）ｓ　（ＯＨ）２］　、リン
酸三カルシウムおよび下記の組成からなるガラス Ｎａ　２０−　　Ｃａ　０−Ｓｔ　ｏ、　−ｐ２ｏ　ｓ
　　、Ｍｅ　０−Ｃａ　０−８Ｌ　Ｏｔ　−ｈｏ　ｓ　
　、ｈｈ　２０−ＫｚＯ−Ｆ’ａ　０−Ｃａ　ｏ−ｓｔ
　Ｏｔ　−ＰｔＯ５、等は生体親和性もよ（好適に利用
される。

上記の高分子材料と無機材料との複合体は、慣用の方法
でへ造することができる。例えば、無機材料の微粉末を
高分子材料に分散させ成形することにより、高分子材料
に無機材料が充填形態の複合体が得られる。この方法に
よれば、賦形性に富む高分子材料中に無機材料が充填さ
れているので、無機材料の賦形性に劣り、中空糸状や、
物質透過性の高い多孔性成形品を得ることが困難である
という欠点を補い、種々の形状の基材とすることができ
るという利点がある。

また、所定の形状に成形された高分子材料に、無機材料
の微粉末をバインダーに分散させた分散液を塗布し乾燥
したり、または真空蒸着、イオンブレーティング、スパ
ッタリング等のドライプロセスを用いて、無機材料を蒸
着させることなどにより、高分子材料上に無機材料が積
層された形態の複合体が得られる。この場合、無機材料
は必ずしも高分子材料の全面を覆う必要はなく、高分子
材料表面に点在していてもよい。なお、この積層法でも
、予め所望形状に成形された高分子材料に積層されるの
で、種々の形状の細胞培養用基材を得ることができる。

上記の高分子材料と無機材料の使用比率は、高分子材料
や無機材料の種類、複合体の形態等により適宜変更され
るが、例えば、無機材料が高分子材料に充填された形態
にあっては、無機材料は５〜８０重量％、好ましくは２
０〜６０重量％程度添加される。また、高分子材料上に
無機材料が積層された形態の複合体にあっては、無機材
料薄膜を０．０１〜１０Ｍ、好ましくは０．０５〜０゜
５７７１１程度積層する。

この発明の細胞培養用基材は、上記の複合体の表面上に
糖蛋白質等を担持させることにより得られる。ここで用
いる糖蛋白質等は、細胞と親和性があり、基材と細胞の
接着を促進するものであればいずれも用いることができ
、例えば、ラクトース、ガラクトース等のオリゴ糖、ア
ルブミン等の蛋白質、リン脂質等の脂質、グロボシド、
ガングリオシド等の糖と脂質との複合体である糖脂質、
細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋白質との複合体であ
るリボ蛋白質、糖と蛋白質との複合体である糖蛋白質等
が挙げられ、特にオリゴ糖、コラーゲン、ゼラチン、フ
ィブロネクチン、ラミニン、コンドロネクチン、ビトロ
ネクチン、フィブリン等の糖蛋白質が好適に用いられ、
これらは２種またはそれ以上組み合せて使用することも
有用である。複合体上に糖蛋白質等を担持する方法は、
従来の技術がいずれも応用できる。一般には、所定形状
に成形された複合体を、上記の糖蛋白質等の１種類また
は２種類以上を自存する溶液に浸漬したり、該溶液を複
合体上に塗布した後、乾燥することにより行われる。こ
の際、糖蛋白質等が変性しにくい条件で乾燥するのが好
ましい。

上記糖蛋白質等の担持は、単分子層、多分子層のいずれ
でもよく、また複合体表面の全面に積層してもよいが、
複合体表面に部分的に、特にパターン化して担持したも
のが好ましく、このようにパターン化して担持すること
により、複合体上に接着する細胞の配置を制御でき、ひ
いては細胞の接着性が安定化し、細胞の伸展、増殖およ
び機能発現を有利にすることができる。さらに、糖蛋白
質等を上記のように部分的に担持する場合、特に、格子
状、縞模様、水玉模様等の微細模様に担持することによ
り、上記効果をさらに増進できる有用な表面を形成する
ことができる。複合体上に糖蛋白質等をパターン化して
担持するには、例えば、スクリーン印刷等の技術を応用
して行なうことができる。

この発明の細胞培養用基材は、種々の形態で用いること
ができ、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、
フィルム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が
例示できる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養
を行なうには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質
高分子材料が好ましく、また、高密度培養を行なうには
、チューブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代
謝が容易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高
分子材料からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用い
るとき、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流さ
せ、必要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空
部等に送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖
させることができる。なお、前記中空糸としては、種々
の大きさのものが使用でき、例えば、内径５０〜１００
０μｍ程度のものが用いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、１００〜３０
０声程度の粒径のものが用いられる。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞Ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｉｖｅｒ　ｓ　ヒト肺由来正二
倍体線維芽細胞■ＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマル
バ細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物°細胞を
培養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養
液が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の
条件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。

添付図面に示す細胞培養器は、サポートスクリーン（２
）上に載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両
端が、ポリカーボネート等からなるハウジング口）内の
両側に設けられたスペーサ（６）により保持されている
。また、上記ハウジング（３）には、増殖させる細胞懸
濁液をハウジング（３）内に満すための孔（４）が設け
られていると共に、培養液を潅流させるための管（５）
が取付られている。なお、上記孔（４）は、細菌等が侵
入するのを防止するため、フィルタ付きの蓋ので被冠さ
れている。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルタ付き
の上記蓋（７）で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管（５）を通じて所定時間潅流させることに
より行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１および比較例 ポリプロピレンに水酸アパタイト（平均粒径１．２μｍ
）を重量比率４０％で充填し、厚さ３００μｍのフィル
ムに成形した。このフィルムを４５　ｍｍφのガラスシ
ャーレにセットし、高圧蒸気滅菌後、無菌のフィブロネ
クチン（シグマ社製、牛血清より採取）のトリス緩衝溶
液（濃度０．１　■／　１１　）を塗布し、室温で乾燥
させた。これらの操作は、全て無菌的に行なった。この
シャーレでチャイニーズハムスター肺由来細胞（Ｖ−７
９）を培養した。培養液として、１０重量％牛脂児血清
を含むイーグルＭＥＭ培地を用いた。培養液１１１当り
Ｉ　Ｘ　１０４個の培養細胞を播種し、５％炭酸ガス、
９５％空気雰囲気、温度３７℃の環境下、７日間の培養
を行なったところ、培養液１１１当り、平均６．１×１
０６個の細胞数となり、良好な増殖が確認された。

一方、水酸アパタイトを充填していないポリプロピレン
フィルムを用いた他は、上記実施例１と同様に試験を行
なった比較例では、培養液１１１当り、平均８．４×１
０５個の細胞数となった。

実施例２ 四弗化エチレン樹脂からなる多孔質フィルム（住人電気
工業（株）製、フロロボアＦＰ−０２２）をスパッタリ
ング装置に置き、アルミナをターゲットとしてスパッタ
リング蒸着した。処理条件は、１３．５８　Ｍ　Ｈｚの
高周波電源を用い、窒素ガス中で、１００　Ｗ、　５分
間の処理であった。次いで、この処理フィルムにメタル
スクリーンを用いて、コラーゲン（タイプＩ、濃度０．
３％）の処理幅４０μｍ１非処理幅４０坤の縞模様を形
成した後、乾燥させて、縞模様にコラーゲンを担持した
。細胞培養用基材としての上記複合フィルムを、添付図
面に示すポリカーボネート製細胞培養器（内径４７　ｍ
ｍφ）に装着し、全体をエチレンオキサイドガス滅菌し
た後、過剰の無菌水、培養液でフラッシングし、次いで
、孔（４）からヒト胎児包皮由来細胞（Ｆｌｏｗ　　７
０００）のイーグルＭ　Ｅ　Ｍ　（１０９６牛脂児血清
添加）懸濁液（細胞数２Ｘ１０４個／厭）を満した。孔
（４）には、細菌をカットするフィルタ付きの蓋（７）
をし、管（５）を通して新鮮なイーグル培地を潅流し、
３７℃で１週間培養を行なった。培養終了後、フィルム
に付着している細胞数を測定したところ、５．２×１０
４個／　ｙｌに増殖していることがわかった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子材料と親水性に富む無機材料との複合体の表面上に
糖蛋白質等が担持されているので、糖蛋白質等との接着
性に優れた基材が得られる。

さらに、糖蛋白質等は、細胞の親和性に優れ、接着性を
高めることができると共に細胞を伸展、増殖に適した形
態、配列で接着させることができるので、高密度かつ長
期間の細胞培養が可能になるという特有の効果を奏する
。従って、この発明の細胞培養用基材は、動物細胞の培
養によるホルモン等の有用物の生産システムに利用でき
る他、例えばインスリン産生細胞を複合体表面に接着、
培養することにより人工膵臓が形成できるように人工臓
器の構築に利用できる。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の一
例を示す断面図である。 （１）・・・細胞培養用基材、■・・・サポートスクリ
ーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、（５
）・・・管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子材料と無機材料とからなる複合 体の表面上に、糖、蛋白質、脂質および それらの複合化合物のいずれか１種類以 上が担持されていることを特徴とする細 胞培養用基材。 ２、高分子材料に無機材料が充填された複 合体である上記特許請求の範囲第１項記 載の細胞培養用基材。 ３、高分子材料上に無機材料が積層された 複合体である上記特許請求の範囲第１項 記載の細胞培養用基材。 ４、複合体が多孔性である上記特許請求の 範囲第１項ないし第３項のいずれかに記 載の細胞培養用基材。 ５、複合体が中空糸である上記特許請求の 範囲第１項ないし第４項のいずれかに記 載の細胞培養用基材。 ６、複合体の表面上に、糖、蛋白質、脂質 およびそれらの複合化合物のいずれか１ 種類以上が部分的に担持されている上記 特許請求の範囲第１項ないし第５項のい ずれかに記載の細胞培養用基材。 ７、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、格子模 様に担持されている上記特許請求の範囲 第６項記載の細胞培養用基材。 ８、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、縞模様 に担持されている上記特許請求の範囲第 ６項記載の細胞培養用基材。 ９、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物のいずれか１種類以上が、水玉模 様に担持されている上記特許請求の範囲 第６項記載の細胞培養用基材。