JPH04500508A - 非グリコシル化 ヒト インターロイキン―３ 組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 非グリコジル化　ヒト　インターロイキン−３組成物理活性を持つ、ヒト　イン ターロイキン−３１［似の非グリコシＪレイ国換え体（ｒｈｕＩＬ−３）蛋白質 を含む医療組成物に関する。

ｔｏｙすることが明らかになっている、顆粒球−マクロファージコロニー重り激 因子（Ｇ？１−Ｃ３Ｐ）を含む、別のｃｓｐｔはマクロファージの選択的増殖を 誘導するマクロファージＣ５Ｆ（？１−Ｃ３Ｆ又はＣ５Ｆ−１）及び、骨髄前駆 細胞からの顆粒球幹細胞の発生を誘導する顆粒球Ｃ３Ｆ　（Ｇ−ＣＳＦ）を含む 、さらに、最初マウスの系から、より最近になってヒトの細胞源から単離された 他のＣ５Ｆは、ＩＬ−３又りま多能Ｃ３Ｆ（−ｕｌｔｉ−Ｃ５Ｐ）と呼ばれてい る。

マウスルー３は元来、Ｔ細胞に関与した酸素である２０α−ヒドロキシステロイ ド　デヒドロゲナーゼの発現を誘導する因子として、イールら（Ｉｈｌｅ　ｅｔ 　ａｌ、）、Ｊ。

していることが示された。マウスルー３に対応するｃ　ＤＮＡクロー７番よ、フ ァンらａｎｄ　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）　Ａｄｖ、　Ｉｗｕｎｏｌ、　３９　：　 １　（１９８６）はルー３の生理活性に関する発表の包括的な総説を提供してい る。

ルー３に関する臨床前の研究は、各様な細胞欠乏症の処置に於ける治療薬として の駈的育用性を示唆している。ヒトルー３活性を持つ治療用の構成物番よ、単独 又は他のリンホカイン、例えば、ＪＬ−１、ＪＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉ Ｌ−６、ＩＬ−７、Ｇ　−Ｃ５Ｆ　、　ＧガーＣ５Ｆ　、　？ｌ−Ｃ３Ｆや他の 成長因子と組み合わせて、感染性病原体への免疫反応を強めたり、或いはウィル ス怒染や放射線又は化学療法によって生じた造血細胞抑制後の正常な血液細胞集 団の再構築を援助するのに用いられ得る。

見所Ω！肯 本発明は、酵母での発現によって得た、ヒト骨髄増殖検定で少なくとも３．０Ｘ １０７ユニツト毎ミリグラム（ｔｌ／ｇ）の生理活性を示し、阻害定数（Ｋ、） で表される、ヒト単球ＩＬ−３受容体に対する結合親和力が少なくとも２．ＯＸ ＩＯ”　Ｍ−’であり、また、エンドトキシン含を量が蛋白ｆｉｇ当りＩｎｓ未 満であるような、紐換えヒトＩＬ−３蛋白質アナログ、ｒｈｕＴＬ　−３（Ａｓ ｐ”、　Ａｓｐ”）を含む医薬組成物を提供する。

凹面Ω旦単ｌ脱朋 図】はＰｒｏ”と表されている野性型ヒトルー３対立遺伝子に対するｃＤＮＡ塩 基配列の、核酸及びそれに対応するアミノ酸配列を示す、成熟蛋白質のＮ未満は ヌクレオチド１−３によってコードされるアラニン（Ａｌａ）残基から始まる。

図２は実施例で述べられる部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異生成法で用い たオリゴヌクレオチドを示す。

発盟Ｑ肛槻友説朋 ヒトＩＬ−３をコードする［１ＩｉＡセグメントは、ヒト末梢血Ｔリンパ球（Ｐ Ｈ１）からから分離したポリアデニル酸ＲＮＡの逆転写により調製したｃＤＮＡ ライブラリーから単離した。東操作のヒトゲノムＤＮＡ塩基配列のＮ末端及びＣ 末＠領域と相同な塩基配列をもつ合成オリゴヌクレオチドプローブを用い、常法 のＤＮＡハイブリダイゼーシッン技術でライブラリーのスクリーニングを行った 。プローブにハイブリダイズしたクローンの［ｌＮＡを分離し、ＩＩＪＩ］ｉ酵 素による切断、アガロースゲル電気泳動、及び電気泳動で分離した断片を用いる 他のハイブリダイゼーシッン実験（２サザンブロツ）″）により解析を行った。

それぞれのプローブとハイブリダイズしたいくつかのクローンを単離した後、ｈ ｕｌＬ−３クローンのハイブリダイズする部分をサブクローニングし、常法に従 って塩基配列を決定した。その断片はさらにｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で転写を行わせ 、生じたメツセージにキャッピング、ポリアデニル酸付加を行い、アフリカッメ ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に注入した。生した卵母細胞の翻訳産物は、 以下に記述されるヒト骨髄検定により、造血細胞の増殖を誘導する能力のテスト を行った。

ＰＢＴライブラリーから分離したいくつかのクローンの塩基配列決定は、成ｐｈ υＩＬ−３配列の８番目の位置に、いずれもプロリン残基が存在することを示唆 していた。そこで部位特異的オリゴヌクレオチド変異生成を行い、Ｎ末端に結合 したグリコジル化部位を欠くヒト比−３アナログ（Ｐｒｏ＠、Ａｓｐ　ｌ　％　 、Ａｓｐ”）をコードするｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡを用いて酵母発現 ベクターを構築し、それを用いて適当な酵母発現株を形質転換し、酵母プロモー ターの抑制解除を促進する発酵条件下で培養した。生じた蛋白質は逆相高速液体 クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせにより精製さ れ、精製産物を得た。ヒト骨髄増殖検定及びヒトルー３受容体結合検定を用いた この産物の試験から、このような分子修飾を施さないヒ）ＩＬ−３蛋白質に比較 してより高い生理活性を示す、ヒトの医薬利用に適したアナログ産物の発現が確 かめられた１本発明のその組成物は、ヒト骨髄増殖検定で少なくとも３．Ｏｘｌ Ｏ’　Ｕ／ｗｇの生理活性、及び阻害定数又はに８表される、ヒト単球ルー３受 容体に対する結合親和力が少なくとも２．０　ＸＩＯ”Ｍ−１で特徴付けられる 。さらに良いことに、本発明の組成物は少なくと６４，０×１０’　Ｕ／ｇ、及 び１は最低４．ＯＸｌ０１１１Ｍ　−’の生物学的比活性をもつ。

友−１ 「ヒトインターロイキン３」及び’ｈｕｌＬ−３Ｊは多望潜在性の造血幹細胞群 からの顆粒球、マクロファージ及び赤血球幹細胞の増殖を誘導するヒトの内生的 分泌蛋白質を称する。明細書を通じて用いられているように、この述語はルー３ 生理活性を有する蛋白質及び図１で示す配列と実質的に同一なアミノ酸配列を意 味する。「実質的に同一ノとは特定の対象となるアミノ酸配列が参照の配列と１ つ又はそれ以上の置換、欠失、或いは付加により興なり、その最終的な影響が参 照の配列との間で不利なＩ！能的相連を生じないもの及び対象となる配列が参照 の配列と少なくとも９０％同一なものである。より低い同一性、同等の生理活性 、及び同等の発現特性を有する配列は同意義とみなされる。実質的な同一性を決 定する目的で、参照の配列へのトランケージ５ン及び付加は無視される。　’ｒ ｈｕｌＬ　３ｊ（Ａｓｐ”Ａｓｐ”）」という術語は、１５及び７０の位置にア スパラギン酸（Ａｓｐ）残基を有する組換えヒトｒＬ−３ボリベフ′チドを意味 し、ここで残基１とは成Ｆ！蛋白質の最初のアミノ酸を言う（上述の図１の説明 を参照のこと）。

［変異アミノ酸配列）とは本来の配列から故意に変化させたヌクレオチド配列に よってコーｔ′されたポリペプチドを指す、「変異蛋白質」　「アナログ蛋白質 」又は「ミューティン」は変異アミノ酸配列を含む蛋白質を意味する。「本来の 配列」とは、野性型或いは遺伝子又は蛋白質の元来の型と同一の、ヌクレオチド 又はアミノ酸の配列を言う、ｒＮ−グリコジル化部位」という術語は以下で定義 される。「不活化する」という術語は、本発明の特定の点を定義するのに使用さ れているように、Ｎ−グリコジル化部位を変化させて、オリゴサンカライド部分 の特定のアミノ酸配列への共有結合を妨げることを意味する。

１組換え体」はここで用いられているように、本来の内因性の物質及び本来のホ ニュウ動物型のグリコジル化が本質的に存在しない組換え体微生物（例えばバク テリアや菌類の）発現系から導かれた蛋白質を意味する。「酵母での発現によっ て得られた」とは発現プラスミドで形質転換した酵母株の発酵により生産された 蛋白質を意味する。一般的に、酵母で発現された蛋白質はホニュウ類の細胞での 発現で得られた蛋白質とは区別し得るグリコジル化のパターンを存する。しかし ながら、本発明の医薬組成物の活性成分であるアナログ蛋白質はＮ末端に結合し た炭水化物を欠く。以下の実示例で示されるように、この修飾は、高い生理活性 とヒト・単球ルー３受容体への増進した親和性を有する蛋白質を提供する。

「開＾セグメント」とは、少なくとも一度実質的に純粋な形即ち同定、操作、及 び回収が行えるように分離されたＤＮＡより導かれた、単離された断片とより大 きなりＮＡコンストラクトの要素という形でのＤＮＡポリマー、及び例えばクロ ーニングベクターを使う標準的な生化学的手法を用いた、それに含まれるヌクレ オチド配列を言う。「ヌクレオチド配列」とは、デオキシリボヌクレオチドのヘ テロポリマーを言う、１組換え発現ベクターＪとは、（１）例えばプロモーター やエンハンサ−のような、遺伝子発現に於いて調節的役割を果たす単数又は複数 の遺伝学的因子及び（２）　ｗＲＮＡに転写されへ蛋白質に翻訳されるＩＩＩ造 上又はコーディング配列の集合体を含む転写単位を有するプラスミドを言う、転 写単位は宿主細胞で翻訳された蛋白質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を 有することがより好まＬ７い、１組換え発現系」とは発現ベクターと適当な宿主 微生物の組み合わせを意味する。それらによく利用されるサン力ロミセス・セレ ビシアエ７−競　９工ｅｖｉ＝山呼）の酵母発現系が本発明の蛋白質生産に用い られた。

ｒｈｕ　ＩＬ−２の ｒｈυルー３の生理活性測定に用いられた検定法を以下に述べる。

上−竺上骨髄増殖技定 新しく分離したヒト骨髄細胞を予め保温し、予め通気した５０ユニッｌ−／ｄの ペニシリン、団μｇ／ｄのストレプトマイシン及び新たに調製した３００μｇ／ −のし一グルタミンを含む血清非含有のＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ ｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ、ＯＲ，ＵＳＡ）　（以下「検定培地」と称する）で １ｄ当り２Ｘ１０’細胞を含むような組織培養フラスコ中で、３７℃２時間、５ ％ＣＯ□条件下で前培養を行った。前培養後、フラスコ表面上にゆるやかに培地 をビベンティングすることにより、非付着細胞を回収した。

非付着細胞は４°Ｃで１０００ｒｐｉ＋　１０分間の遠心分離により集め、１０ ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む少量の検定培地に再懸濁し、トリバンブルーを 用いて生存率を、タルク染色を用いて白血球の再生を計数した。細胞は検定用プ レートに加えられるまで、１０％ＦＢＳを含む検定培地中で、約４℃で保存した 。

５０ｐ！の検定培地を９６ウエルの平底組織培養プレートのそれぞれのウェル（ くぼみ）に入れた。それぞれの列の最初のウェルに検定培地で希釈した５０ｐ！ の試料を添加し、常法によりそれぞれの列に渡って一連の希釈を作成した０体積 １００　ａｌ中の１．２５Ｘ１０’個の骨髄細胞をそれぞれのウェルに加えた。

乾燥を防ぐため無菌蒸留水を含むプラスチック製ボックス中でプレートを３７℃ ４日間、５％ＣＯ□でインキュベートした。４日目に、５％ＦＢＳ及び８０μＣ ｉ／　ＩＩｉの［”１ｌｌ−チミジン（８０Ｃ４／■−０１）を含む２５ｐ！の 検定培地をそれぞれのウェルに添加し、プレートをプラスチック製ボックス中で ３７℃５時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベージぢン後、細胞 をグラスファイバーフィルター上に回収、洗浄し、取り込まれた放射能をンンチ レーシッンカウンターで測定した。ｈｕｌＬ−３活性の単位は、最大のチミジン 取り込みの５０％を誘導するｈｕｌＬ　３の量との比較により計算した０例えば 、もし１．００　ｐｌのある試料が１：２０の希釈で最大チミジン取り込み量の 半分を生じたならば、１ユニツトは１００μ！の１／２０即ち５ｐｌ中に含まれ る活性として定義される。従って、その試料は１０００を５で除した数、即ち２ ００ユニツト毎ミリリンドル（１１／ｅ）のｂｕｌＬ−３活性を含むことになる 。

ｌ−且上几二旦叉餐生結企挟定 ９６ウエルの丸底マイクロタイタープレートに、ＲＰＩＩＩ　１６４０培地で、 各試料のＱ、０７５μｇｏｄから始まるＷ個の２倍希釈を準備する。それぞれの 検定プレートに、ｒｂｕｌＬ−３スタンダード（１，５μｇ／ｄ）の分注５０μ ！及び陰性対照（結合培地）を３つずつ準備する。この検定法に於いて、「結合 培地」は２．５％（−／ν）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．２％（＠／ ν）、アジ化ナトリウム及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，２を含むＲＰＭＩ 　１６４０を意味する。以下（実示例３）で記述されるように調製された５０ａ ｉ！のＩ″’Ｉ　ｒｂｕ　ＩＬ−３ストツク〔結合培地中でＩ　Ｘｌ０−”Ｍ　 、比活性４−８×１０１ｓｃｐｓ／−−ｏｌｅ　）をそれぞれのウェルに加え、 次に５０ｐｌのヒト単球〔培養から遠゛心分離により回収し、ＲＰＭｌ　１６４ ０７２回洗浄し、結合培地に４Ｘ１０’細胞／Ｉ１１に再懸濁したもの〕を添加 した０次にそれぞれのプレートをロータリーシェーカー上で激しく攪拌しながら ３７℃で１時間インキュベージした。インキュベーシツン後、フタル酸油遠心分 離法により細胞及び結合した”’Ｉ　ｒｈｕ　ＩＬ　−３を非結合の”５Ｉｒｈ ｕ　ＩＬ　−３から分離する、以下のような処理を行った。最初にそれぞれのイ ンキュベージジン混合液から６５ｄの分注を２回取り出し、それぞれの分注を４ ００．１ポリエチレン遠心チユーブに入った２００　、ｌの冷フタＪＬ４ｍ油混 合物〔１，５のジブチルフタル酸に対し、１のビス（（−２−エチルヘキシル） −フタル酸（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ＋ ＵＳＡ）〕に重層し、微量遠心分離機で１分間、８℃で遠心分離した。細胞とそ れに結合した”’Ｉ　ｒｈｕｌＬ　−３はフタノＩ油混合物を通過し、沈殿する 一方、非結合の”’Ｉ　ｒｈｕｌＬ　３を含む低密度の結合培地はその表面に残 される。細胞に結合した１℃％Ｉ　ｒｈｕＩＬ　３は、チューブを中央で切断し 、上部と先端の１１１８７の割合を計数して測定する。

ＩＬ−３受容体結合検定の結果は、以下の等式（１）に従って計算される阻害（ χ）として表される： ここでＷａｘは培地のみの存在下に於ける”’］　ｒｈｕ　ＩＬ−３の結合レベ ル、Ｍｉｎは１．５μｇ／ｄの非槓＠ｒｈｕ　ｒｔ、−３存在下に於ける結合レ ベル、そしてＴｅｓ　ｔはテストしている希釈試料の存在下に於ける結合レベル である。

結果は下の等式（２）に合う非線形最小二乗法により解析を行った：等式（１） で生じたデータに対し、Ｉ’ｌ　（Ｘ）は阻害の最大値であり、Ｋ（Ｍ−’）は ＬｔＳｌｒｈｕｌＬ３の結合定数、Ｃ（Ｍ）は”’ｌ　ｒｈｕ　ＩＬ−３の濃度 、Ｉ　（Ｍ）はテスト試料の濃度、そしてに＋（Ｍ−’）はテスト試料の阻害（ 結合）定数である。

テスト試料に対するに１の値は、標準ｒｈｕＩＬ３の阻害定数がＫｓであるとき 、標準ｒｈｕｌＬ−３の値で除する（にｌ／ｂ）ことにより比較され、相対的結 合活性が得られる。

３　バクーＪアニントドキシン　のための）ムルス（ＬＩＩＩｕｌｕＳ）ノ　゛ ”定 リムルス変形細胞溶解検定化ＡＬ）検査キットを製造元の指示に従って利用し、 バクテリアエンドトキシンの存在について大量の産物を検定した０本発明の構成 物は蛋白質１■当り１０ｇより多くないエンドトキシンを含んだ。

杢米二回ルニ旦配列 以下に述べられるようにして単離されたｈｕｌＬ　３ｃＤＮＡのヌクレオチド及 びそれに対応するアミノ酸の配列は、図１に示される０図１では、ヌクレオチド １−３は本来の成熟蛋白質のＮ末端のアラニンに対応するＧＣＴコドンを示して いる０本来のポリペプチドは、分泌の際に切断され、成熟蛋白質を与えるリーダ ー配列を含む。

ｂｕｌＬ　３のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡセグメントは、適当なｃ ＤＮＡライブラリーのスクリーニング或いは人工的に合成したオリゴヌクレオチ ドの集合によって得ることができる。完全に合成されたヒトルー３　ｃＤＮＡは 今や商品となっている（Ｂｅｃｋｍａｎ　５ｐｅｃｉａｌｉｔｙ　Ｂｉｏｃｈｅ ｓｉｅａｌｓ　Ｐ、ＯＢｏｘ　１００１５　Ｐａ１ｏ　ＡＩｔｏ、ＣＡ、ｌ撃T ＩＩ　； Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　０ｘｆｏｒ ｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）　、選択の問題として、成熟配列の８番目にプロリン又 はセリンを特定するコドンを含むｈｕｌＬ　３配列を、合成オリゴヌクレオチド とｃＤＮ＾折片を用いることにより集められる。

え　、に　番る 本発明の組換え蛋白質の発現には酵母の系が用いられた。大腸菌での選択及び複 製（Ａｐ　’遺伝子及び複製起点）のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列と、 グルコースによる抑圧が可能なアルコールデヒドロゲナーゼ２　（ＡＤＨ２）プ ロモーターを含む酵母のＤＮＡ配列を持つｐＢｃ１０２・Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７ ，２５５）から好ましい発現ベクターが導き得る。　ＡＤＨ２プロモーターはラ ッセルら（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、Ｂｉｏ＋、Ｃｈｅｔ：　２５ ８：　２６７４（１９８２）及びバイアーら（Ｂｅｉｅｒ　ｊｔ　ａｌ、）Ｎａ ｔｕｒｅ　３００　：　７２４（１９８２）により記述されている。　ｐＢｃ１ ０２・Ｋ２２はまた、選択マーカーとしての丁ｒｐｌ遺伝子及び酵母の２μ複製 起点を含んでいる。プロモーターに隣接して酵母α−ファクターのリーダー配列 が存在し、酵母宿主からのヘテロな蛋白質の分泌を可能にする。α−ファクター のリーダー配列は、この配列と外来遺伝子の融合を促進するため、その３′末端 近傍にＡｓｐ　７１８制限酵母部位（Ｋｐｎ　ＩとＡｓｐ　７１８はイソシゾマ ーである）を含むように修飾されている。ブレイクら（Ｂｒａｋｅ　ｅｔ　ａり 、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｊ。

μｓａ　８１　：　４６４２（１９８４）により記述されたように、分泌蛋白質 の効率的なプロセシングを行うため、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａのアミノ 酸をコードする配列は除去された。これ以上の発現ベクターは、例えばｐＹα） Ｉｕ　ＧＭ（ＡＴＣＣ５３１５７）のようなα−ファクタープロモーターを含む 酵母ベクターで、これは野性型ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子を持つ。

これらの技術的に完成した他のものが知られている。ｐＹαＨｕＧ−の構造は　 ＥＰＡ１８３．３５０に、またｐＢＣ１０２・Ｋ２２はＥＰＡ　２４３．１５３ に記述されており、それぞれの開示は本文の参照により具体化されている。

形質転換に適した酵母の株の選択は、選択マーカー及びベクターの他の特徴によ り決定される。　ｐＢｃ１０２・Ｋ２２又はｐＹα［Ｉｕ　ＧＭから誘導された 発現ベクターによる形質転換に通したＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ樽には、イースト 　ジエネテインク　ストックセンターＣ’１ｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏ ｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳＡ　（以下を見よ）から 入手できる。　ａ　ｔｒｐｌ　ｇａｌｌ　ａｄｅｌ　ｈｉｓ２の遺伝子型を持つ χ２１８−ＩＢ　、Ｊ１７（訂ＣＣ５２６８３：　ａ　ｈｉｓ２　ａｄｅｌ　ｔ ｒｙす、　ｍｅｔＭ　ｕｒａ３）及びＩＬＩ６６−５Ｂ（ＡＴＣＣ４６１８３； 　ａ　ｈｉｓｌ囲）が含まれる。ｐＢＣ１０２・Ｋ２２の利用に特に好ましい発 現株χν２１８１はＸ２１８１−ＩＢの２つの半数体細胞の接合によりできた２ 倍体で、カリフォルニア大学イーストジェネテインクストックセンターの生物物 理学・医薬物理学部門、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ。

ＣＡ　９４７０２．ＬＩＳＡから入手でき、またＸＶ　６１７−１−３Ｂはワシ ントン大学遺伝学部門、５ｅａｔｔｌｅ、ＷＡ　９８１０５　ＵＳＡ又はＬｗｍ ｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５１　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅ ｅｔA５ｅａｔｔｌｅ。

ＭＡ　９８１０１．ｌｌ５Ａから入手できる。適当な形質転換プロトコールはヒ ネンら（Ｈｉｎｎｅｎｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ｃａｄ、ｓｃｉ、 ［ＩｓＡ　７５−１９２９（１９７８）の記述又はシェルマンら（Ｓｈｅｒｍａ ｕ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｌａｈｏｒａｔｏｒ　Ｃｏｕｒｓｅ　）Ｉａｕｕ　Ｉ　 ｆｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　’！ｅａｓ煤@Ｇｅｎｅｌ、ｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８６．１２１に８己本さ れている酢酸リチウム法で、Ｔｒｐ　”の形質転換体を選択する。

ＡＤＨ２又はα−ファクターのプロモーターを持つベクターで形質転換された宿 主株は、８０４ｇ７１１１のアデニン及び８０ｔｔｇ／Ｉ１１のウラシルを添加 した、１％酵母抽出エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースを含む完全培地 で発現のため増殖させる。　ＡＤｌ１２プロモーターの脱抑制は培地グルコース の消費により起ごる。濾過により粗製の酵母上澄を回収し、さらに精製するまで 凍結して、又は４℃で保存する。

ルニ主Ω覆製 酵母株の発酵から生じた組換えヒトルー３（ｒｂｕｌＬ−３）は、アーダルら（ Ｕｒｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、）Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、　２９６　：　１７１　 （１９８４）及びグラブスタインら（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎｅｔ　ａｌ、）　、ム 堕ム勿ム　用釘１４０５　（１９８６）により記述されたのと同様な方法で、用 意されたＨＰＬＣカラムで一度又は連続した逆相ＨＰＬＣステップにより精製し 得る。

例えば、ｒｂｕｌＬ３を含む酵母のならし培地を０．４５μのフィルターで濾過 し、１５−２０μ園の逆相シリカ（シｙｄａｃ、Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｕ ｓ　Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、ＣＡ　ＬＩＳＡ）を充填した５ｃｍＸ３（ ｋｍカラムに、流速１００　ａｆ／分で流すことができる。酵母のならし培地の 添加に先立ち、カラムは０．１％トリフルオロ酢酸を含む水（溶媒Ａ）で平衡化 させておき、培地を添加した後は、流出液の２ＢＯｎｍに於Ｉす、る光学的吸収 が基線値に達するまでこの溶媒を流した。ここで、アセトニトリル（溶媒Ｂ）勾 配をもつ０．１％トリフルオロ酢酸を、毎分２％及び流速１００　Ｍ１／分で０ がら１００％の溶媒Ｂとするように流す、勾配の開始に続く適当な時間に１分ご とのフラクションを集め、各フラクションの一部をポリアクリルアミドゲル電気 泳動及びフルオレサミン蛋白質検出により蛋白質含量を解析する。必要ならばさ らにＨＰＬＣステップを用いることができる。さらにＳ−セファロースへのアプ ライ及び溶出を含む完全精製のプロトコールが工大の実示例２に詳述されている 。

Ｎ−グリコジル　の　′ノ 多くの分泌蛋白質が翻訳後共有結合した炭水化物単位を獲得し、それはしばしば アスパラギン側鎖にＮ−グリコジル結合で結合したオリゴサンカライドの形をと る。特定の分泌蛋白質に付加されるオリゴサツカライド単位の構造及び数は非常 に多様で、単一の糖蛋白質に帰結し得る広範囲にわたる正確な分子量をもたらす ６組換えｈｕｌＬ　３はこのタイプの糖蛋白質である。組換え系で糖蛋白質を発 現する試みはこの多様な炭水化物成分による不均一性により複雑になる１例えば 、ヒト又はマウスの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ） のような＆Ｉｌ換え蛋白質の精製後の混合物は、重量の０−５０％の炭水化物か ら成り得る。ミャジマら（Ｍｉｙａｊ　ｉ＊ａ　ｅｔ　ａｌ、）　、ＥＭＢＯＪ 、　５　：　１１９３（１９８６）はＮ−グリコジル化部位が変異し、グリコジ ル化を妨げ、酵母で発現された産物の不均一性が低下した組換えマウスＧＭ−Ｃ ５Ｆの発現を報告した。

組換え分泌糖蛋白質に結合した炭水化物の可変量の存在は精製手段を複雑にし、 それにより収率を低下させる。加えて、もしその糖蛋白質が治療薬として用いら れるならば、愚者が酵母の炭水化物部分に対しアレルギーを起こす可能性も存在 し、そうなれば治療の中止が要求されよう、これらの理由から、生理学的に活性 な、低減した炭水化物を持つ免疫調節に関与する糖蛋白質の均一なアナログが治 療用には望ましい、さらに、Ｎ末端に結合した炭水化物を欠く本発明のｒｈｕ　 ｒＬ　−３（Ａｓｐ”、　Ａｓｐ”）アナログ蛋白質は、組換え酵母系で発現さ れた場合、未修飾のＮ−グリコジル化部位を存する対照物より２−４倍の生物学 的比活性及びヒト単球ルー３受容体結合親和力を示す。

真核細胞蛋白質に於けるＮ−グリコジル化部位はＡｓｎ−Ａ’−Ｚというアミノ 酸の三つ組で特徴付けられ、ここで＾１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸、ＺはＳ ｅｒ又はＴｈｒである。この配列中、アスパラギンは炭水化物が共有結合する側 鎖アミノ基を提供する。このような部位はＡｓｎ又は２残基の他のアミノ酸への 置換、Ａｓｎ又はＺの欠失、或いはＺではないアミノ酸の＾１とＺとの間への挿 入又はＡｓｎではないアミノ酸のＡｓｎとＡＩとの間への挿入により除去できる ０本発明のアナログ蛋白質は本来のヒト比−３配列に存在するＮ−グリフシル化 部位のそれぞれのアスパラギン側鎖基に替えてアスパラギン＃（Ａｓｐ）残基を 持つ。

ア　ログ　びミエーーインの 本来の配列をもつ断片への結合を可能にする制限酵素部位に隣接した、変異配列 を含む合成オリゴヌクレオチドにより特定の位置に変異を導入し得る。それにひ き続く結合の結果生じた、再構築された配列は希望するアミノ酸挿入、置換又は 欠失を有するミューティンをコードする。

他にも、オリゴヌクレオチドで誘導される部位特異的突然変異生成法を用いて、 望んだ置換、欠失、又は挿入に従つて変化した特定のコドンを持つ変化した遺伝 子を提供できる。つｆ）Ｌｔダーとウォルダー（１＋１ａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗ ａｌｄｅｒ）　％　Ｇｅｎｅ　４２　：１３３（１９８６）　；バウアーら（Ｂ ａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｇｅｎｅ　３７　：　７３（１９８５）　；クレイ ク（Ｃｒａｉｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｊｑｕｅｓ　％　１９８５年１月、１２−１ ９；スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）蝕匣■Ｌ胚厄憇−虹江Ｌ：　Ｐｒ１ ｎｃｉ　Ｉｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（ＰＩｅｎｕ＊　Ｐｒｅｓｓ、１９ ８１）　；及び米国特許４，５１８．５８S は適当な技術を開示し、本文での参照により具体化される。

いずれの手法に於いても、例えばスートら（Ｓｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、）　、Ｎｕ ｃｌ、Ａｃｊｄｓ、Ｒｅｓ。

ｉ：　２５５７（１９７７）及びヒロセら（Ｈｉｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、 Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、　２Ｂ　：　２４４９（１９７８）により開示されたトリエ ステル合成法のような在来のオリゴヌクレオチド合成技術が適している。

部位特異的突然変異生成では、変えられるべき遺伝子の鎖は、それに対応するセ ンス又はアンチセンス鎖のいずれかを含むＭ１３一本鎖ファージ或いは他の適当 な一本１（ｓｓ）ＤＮＡを提供するベクターにクローニングされる１次にこのＤ ＮＡは変えられるべきコドン周辺の配列と相補的ではあるが、置換が影響する点 に於いて新たなアミノ酸を指定するコドン（又はそのようなコドンと相補的なア ンチセンスコドン）を含むオリゴヌクレオチドブライマーとハイブリダイズされ る。もし欠失が望まれるならば、プライマーは欠失されるべきアミノ酸を指定す る特定のコドンを欠き、一方で正しいリーディングフレームを維持する。もし挿 入が望まれるならば、プライマーは配列中の適当な位置に、挿入されるべきアミ ノ酸を指定する新しいコドンを含む。置換コドン、欠失コドン、又は挿入コドン はオリゴヌクレオチドの中央又はその近くに置くのが望ましい。

用いられるオリゴヌクレオチドブライマーのサイズは、５′及び３′方向への伸 長部分がエキソヌクレアーゼによるエディティングを避けるのに十分な長さを存 し、変異部位に於いて安定でユニークなハイブリダイゼーシヨンを最適化する必 要から決定される。このように９本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチド は通常的１５から約２鴎羞を含む。

より望ましい方法（ウォルダーとウォルダー、上記を見よ）では、生じたオリゴ ヌクレオチド／ｓｓベクターハイブリッドは直接酵母に形質転換される。別の方 法では、変異生成のプライマーは変えられるべき遺伝子を含む一本鎖鋳型部分を 持つギャップのある二本鎖とハイブリダイズされる。後者の場合、プライマーは 鋳型鎖に沿ってＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）、丁４　ＤＮＡ ポリメラーゼ、又は他の適当なりＮＡポリメラーゼによる反応により伸長さね一 環状で適当な宿主株のトランスフェクトに用いられる二本鎖ＤＮＡを生ずる。い ずれの場合にも、宿主によるヘテロ二本鎖の複製は双方の鎖の子孫を生ずる。Ｌ 輩■てはトランスフェクトされた細胞はブレーティングさ狛ヘコロニーを形成し 、突然変異生成に用いたのと同一の標識オリゴヌ・クレオチドを用いて選択され る。直接酵母が形質転換された場合には、形質転換体をプールし、ＤＮＡを分離 し、ト印且を形質転換する。生したコロニーをハイブリダイゼーシヨンで選択す る。プライマーが変化したＤＮＡにはハイブリダイズするが、もとの鎖由来の子 孫にはハイブリダイズしないような結果が得られる条件を用いる０次に変化した 遺伝子を含むＤＮＡを単離し、適当な発現ベクターに再結合される。

社企蛋亘ｉΦ構繋 本発明の一つの具体化に於いて、成熟ｈｕ１１　３１Ｆ白質のＮ、を端に結合し たオクタペプチドＡｓｐ　−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　− Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含む融合構築物としてｈｕｌＬ　３蛋白 質が発現された。オクタペプチドは高い抗原性を持ち、特定のモノクローナル抗 体が再現性良く結合するエピトープを提供し、発現された組変え蛋白質の迅速な 検出と精製の促進を可能にした。この配列はまた、望まれるならばウシ粘膜エン テロキナーゼによりＡｓｐ−Ｌｙｓベアリングの直後の残基で特異的に切断でき る。

実験約考察 Ａ、　ｈｕｌＬ　３　コードしているｃＤＮ＾のフィコール・ヒパーク（Ｆｉｃ ｏ＋ｉ　ｂｙｐａｑｕｅ）密度遠心によって血液全体（ボートランドレッドクロ ス、ボートランド、オレゴン、ＵＳＡ）から調製された軟膜より、末梢血液リン パ球を単離した。Ｔ細胞を２−アミノエチルチオウロニウムブロミドで処理した ヒツジ赤血球でロゼンティング（ｒｏｓｅｔｔｊｎｇ）することにより単離した 。

細胞を、１００　ｄ　ＲＰＭＩ、１０％胎児ウシ血清（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　 ｓｅｒｕｍ）　、５０μＭβ−メルカプトエタノール、１％フィトヘマグルチニ ン（ＰＨＡ）及び１０ｎｇ／ｄホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭ Ａ）中で、１７５　ｄフラスコ内で５Ｘ１０ｈ細胞／Ｉ１１で、１８時間培養し た。グアジニウムＣｓＣｌ法によりＲＮＡを抽出し、オリ１６丁セルロースクロ マトグラフィーにより、ポリＡ’　ＲＮＡを調製した（マニアチス（Ｍａｎ　ｉ ａ　ｔ　ｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８２ j、　ｃＤＮＡは、 本質的にガブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ）により 記述されたもの（Ｇｅｎｅ２５　：　２６３−２６９（１９８３））にならって ポリＡ″ＲＮＡより調製された。　ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩを用いて２ 本鎖にし、丁４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にして、ｃＤＮＡ内のＥｃｏＲ Ｉ切断部位を保護するため、ＥｃｏＲＩメチレースでメチル化してから、Ｅｃｏ ＲＩリンカ−にライゲートした。こうした組成物をＥｃｏＲＩで消化してｃＤＮ Ａの各末端にあるリンカ−の１コピーを除いて全てを除去して、ＥｃｏＲＩで切 断し、脱リン酸化したバタテリオファージＩｇｔ　１０の腕にライゲートしてか ら、業者の指導に従ってうＬダファージエキストラクト（ストラタジーン、サン ディエゴ、カリフォルニア、ｔｌｓＡ）内にパッケージした。　５００，０００ のりコンビナンド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を、大Ｉ！菌株Ｃ６００ｈｆｌ− 上にプレートし、以下のプローブを用いて標準的なプラークハイプリダイゼーシ ッン技法により、スクリーニングした。

ｂｕｌＬ　３遺伝子の選択用５′及び３′塩基配列に相補的な塩基配列を持った ２つのオリゴヌクレオチドを合成した。５′プローブは、ｂｕＩＬ−３リーダー の一部をコードしている塩基配列に相補的で、５’−ＧＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧ ＧＡＧＧＡＧＧＡＣ−３’なる塩基配列を有した。３′プローブは、成熟タンパ ク質のアミノ酸１２３番から１３０番までをコードしている領域に相当し、５’ −ＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＧ丁−３′なる塩基配列を有した０ 合成法はスートら（Ｓｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　４　：　２５７７（１９７７））　ｈよびヒロセら（Ｈｉｒｏｓｅ　ａｔ　ａ ｌ、、丁ｅｔ、Ｌｅｔｔ、２８　：　２４４９（１９７Ｂ））により発表された ものと実質的に同様の、自動化されたトリエステル法であった０合成に次いで、 オリゴヌクレオチドをデブロツクしくｄｅｂｌｏｃｋｅｄ）　、、予備のゲル電 気泳動により精製した。

スクリーニングプローブとして使用するにあたって、オリゴヌクレオチドを、マ ニアチスらにより発表されたものと同様の技法を用いて”Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼで末端に放射性標識した。ライブラリースクリーニングに 用いた大腸菌の株はＣ６００ｈｆｌ−（ヒユーイン（Ｈｕｙｎｈ）ら、１９８５ ．５ｕｐｒａ）であった。

１３のポジティブなプラークが精製さね、２つのハイブリダイゼーシヨンプロー ブで別々に、再度調べられた。１１のコロニーが、両方のオリゴヌクレオチドに ハイブリダイズした。幾つかのポジティブな組みかえファージからのｃＤＮＡの インサートを、ユニークなＥｃｏＲ１部位、Ｂａｍ８１部位や、数多くの他のユ ニークな制限酵素切断部位を有するポリリンカーを含む標準的なりローニングベ クターであるｐＨＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断誘導体（ｐＧＥＭＢＬｌＢ）にサブ クローンした。このタイプの模範的なベクターであるｐＥＭＢＬがデンテ（Ｄｅ ｎｔｅ）らにより記述されている（Ｎｕｃｌ、ＡｅｉｄｓＲｅｓ、１１　：　１ ６４５　１６５５（１９８３））が、そこではＳＦ３及びＴ７ボリメラーゼのブ Ｃｌモーターが、マルチクローニングサイトのそばについている９選択されたク ローンの塩基配列をチェーンターミネーシッン法（ｃｈａｉｎ　ｔｅ＋ｖｉｎａ ｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）により決定した。特に、λＧＴＩＯ：　ＩＬ−３クロ ーン２．　３．　４及び５のＥｃｏＲ１部分消化は、８５０ｂｐから１　、　ｏ ｏｏｂｐの大きさの範囲にある断片を得て、それをｐＧＥ？１ＢＬ１８のＥｃｏ Ｒ１部位に別々にサブクローンした。ｐＧＥＭＢＬｌＢ：ｒｈｕ　ＩＬ　３サブ クローンのインサートを、ｐＧＥＭＢＬ　１８のマルチクローニングサイトの隣 に結合するユニバーサルブライマーと、ｈｕｌＬ−３塩基配列由来の合成オリゴ ヌクレオチドブライマーを用いて、シーフェンスした。制限地図はヒ）ＩＬ−３ で以前報告されたものに相当する制限酵素部位が存在することを示していた。ク ローン５のシーフェンシングで、成熟タンパク質の８番目の位置での、プロリン （Ｐｒｏ）をコードしているコドン（ＣＣＣ）の存在が明らかになった。更に３ つのクローン（２，３，４）から単離されたｃＤＮＡに関したシーフェンシング はヤング（Ｙａｎｇ）らにより報告された（Ｃｅｌｌ　４７　：　３　（１９８ ６））塩基配列からのこの変異を確かなものとした。成＝＋ｔ−３の２２番目の ヌクレオチドでのこの唯一のＴ→Ｃの変化は、成＝ｎ、−３の８番目の１ｙ！ｉ 基でのＳｅｒ→Ｐｒｏへのアミノ酸の置換をもたらす、幾人かが、（１）８番目 にプロリンを含むｈｕｌＬ　３が、天然にあるｈｕｌＬ　３遺伝子を表している のかを決定するため、（２＞　Ｓｅｒ”とＰｒｏ’のｈｕｌＬ　３遺伝子の相対 量を確かめるために、Ｐｒｏ　’とＳｅｒ”１Ｌ−３遺伝子をスクリーニングし た。ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らにより記述された（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉａｏｒ＋　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｊｖｅ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、Ｖｏｌ、　ＬＩ：　２６３（１９８６））ポリメラーゼ・チェーン・リア クション（ｐｏｌｙｓｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　；　ＰＣＲ ）が１３人からのＩＬ−３遺伝子の一部に含まれる（末梢血液リンパ球からの） ＤＮＡを増幅するために用いられた。８番目のアミノ酸をコードする部位を含む 増幅されたＤＮＡ塩基配列を、Ｓｅｔ”＠たはＰｒｏ”ＤＮＡ塩基配列に特異的 なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。

この分析により、試験された１３人のうち、全てが、８番目のアミノ酸にプロリ ンをもつｈｕｌＬ−３にポジティブであり、３人が、８番目のアミ人酸でのセリ ンにもポジティブであった（従って異型接合である）、従って、単離された（Ｐ ｒｏ’）　ｈｕ　ＩＬ−３ｃＤＮＡは天然にあるｈｕｒＬ−３遺伝子であり、２ つの対立遺伝子のうち、より優勢なものである。

爽施１．Ｎ末　オ　ペプチドよ　るｒｈｕｌＬ３　ム　ンバク　の−のための　 ベタ　−の ｐＢｃ１０２−　Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）をＡｓｐ　７１Ｂと５ｐｅｌ で消化し、ヒトＧ−Ｃ５Ｐの成熟配列を構成する断片を除き、以下のオリゴヌク レオチドポリリンカーをベクター断片にライゲートすることにより、酵母発現ベ クターを構成した：Ａｓｐ７１８　↓Ｎｃｏｌ　↓５ｔｕｌ↑Ｂａ＠ａｌ　５ｐ ｅｌ その結果できたベクターを、ｐＢｃ１１５とした。ｈｕｌＬ−３をコードするｃ ＤＮＡを、Ｉ）ＧＥＭ［ＩＬ１Ｂクローニングベクター（実施例Ａ参照、上述） より、成Ｐｈｔ＋ＩＬ　３の１４番目のアミノ酸から、コーディング配列の下流 の部位にわたる断片を提供するようル互ｊとＨａｓ　Ｈｌで消化することにより 切出した。

オリゴヌクレオチドを合成し、組みたてて、（１）＾５ｐ７１８より始まりＫＥ Ｘ２認識部位で終わる酵母αファクターリーダーペプチドのＣ末端５アミノ酸； （２）合成Ｎ末端“フラッグ（ｆｌａｇ）”同定ミブチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ　 ；上記参照）をコードする８コドン配列；そして（３）成ｐｈｕｌＬ−３タンパ ク質のＮ末＃Ａ１４アミノ酸を、Ｈｐａ　］平滑末端を含むところまでコードし ている短い配列；をコードしている断片を提供した。各々およそ４０ヌクレオチ ドの４オリゴマーがら構成されたこの８４塩基対のＫｐｎｌ−Ｈｐａｌ断片の塩 基配列は、以下に示しである：５’　−ＣＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡ Ａ　ＡＧＡ　ＧＡＣＴＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＧＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ　−ＧＡ 　ＡＡＣＣＴＡ　丁Ｔ丁　ＴＣＴ　ＣＴＧ　Ａ丁Ｇ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　Ｃ ＴＡ　ＣＴＧ　ＴＴＣ−Ｖｏｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａ ｓｐ　丁ｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ〈−・・−・ αファクターリ→−−・・〉１く・−・−一−−−同定ベブチド・−・−・−聞 ・−＞　１−ＣＣＴ　ＣＣＣＡ丁Ｇ　ＡＣＣＣＡＧ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＣＣＣ丁 子Ｇ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＧＧ　Ｇ丁子　−３’−ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＴＡＣ ＴＧＧ　ＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧ　ＡＡＣＴＴＣＴＧＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣＣＡ ＡＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　丁ｈｒ　Ｇｌｎ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌｌ−・・−・・・−・・−−−一・ ・−・−−−一−−・・−・・ｈｕｌＬ−３−・−・・−・−・・・曲・−・・ −・・団−・・〉前述の断片、ｐＢｃＩ１５由来のＡｓｐ７１８　Ｂａ５ａｌベ クタ一断片と、ＨｐａＴ−Ｂａｇ）ｔｌ　ｈｕｌＬ−３断片を一緒にライゲート し、発現ベクター（ｐＢＣ）２５と呼ぶ）を提供した。

ｐＢＣ１２５ベクターを含む大腸菌クローンからのプラスミドＤＮＡを単離して 、ｒｈｕＩＬ−３産物を発現させるためのＸＶ　２１８１の酵母株のトランスフ オーメーシぢンに用いた。　ＡＤ）１２プロモーターの抑制解除を促進する条件 下で、トランスフオームした酵母株を振とうフラスコ培養で増殖させた。酵母条 件済上清を遠心により集め、骨髄増殖誘導活性に対するアッセイを行なった。こ の実験により、ｒｈｕ　ＩＬ−３タンパク質の高レベル発現が示された。

実施例１： ｈｕｌＬ　３　ｃＤＮＡによ　コード　れたΣ−グ１コシレージ５ンー位Ωｎｕ ｒｈｏ　ＴＬ　−（Ｐｒｏ＠Ａｓ　１ｓＡｓ　”）の　ベクターの１−１１天然 タンパク質に存在するグリコシレージョンに関与した２つのアスパラギン（Ａｓ ｎｌ′とＡｓｒ＋′。）を、この位置のコドンをアスパラギン酸をコードするも のに変えリコシレーシッン（時にはハイパーグリコシレージョン）が阻害され、 より均一な産物が得られる。こうした変化は、ｈｕｌＬ　３ｃＤＮＡ酵母発現ベ クターｐｌＸＹ　１２０にサブクローニングするｌ！！に、以下に記述するよう に作られた０ｍ母発現ベクターｐ１λＹ　１２０は本質的には上述の実施例Ｂで 記述されたｐＢＣ１１５と同一であるがマルチクローニングサイトを含む以下に 記す合成オリゴヌクレオチドが、αファクターシグナルペプチドの３′末端近く のＡＳｐ　７１８部位（アミノ酸７９番目）から２μ頃基配列に含まれる５ｐｅ ｌ部位までに挿入されでいる二Ａｓｐ７１８　ｊ　Ｎｃｏｌ ｌ；ＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡ ＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡ丁Ｇ６＾ＴＣＣＣ，ＣＣfＧＧ＾ＣＡ ＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣ丁ＡＣＴＧＴ ＴＣＴＣＣＧＧＡＧＩＩ；ＴＡＣＣＴＡ［；ＧＧＧＧＣＣＣsＧＴＧ＾工５ ↑ＢａｍＨＩ　５ｐｅｌ 更に、複製開始点とインタージ−ニックリージョン（ｉｎｔｅｒεｅｎｉｅ　ｒ ｅｇｉｏｎ）を含む一末鎖バタテリオファージｆ１由来の５１４０ｐ　Ｉ′ｌＮ Ａ断片を、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ塩基配列のＮｒｕ１部位に挿入した。ｆｌの復製 開始点の存在は、適切な（雄の）大腸菌の株にトランスフオームして、バタテリ オファージｆ１を重複感染した時に、ベクターの一末鎖コピーを生産することが できる。この能力は、ベクターのＤＮＡシークエンジングを容易にし、ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏミュータジェネシスをすることができるようにする。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ　１２０を、αファクターリーダーペプチドの３′末 端の近く（ヌクレオチド２３７番目）で切断するＡｓｐ　７］８と、ポリリンカ ー内で切断するＲａｍ旧の制限酵素で消化した。大きなベクター断片を精製し、 以下のＤＮＡ断片とライゲートさせた＝（１）プラスミドＧＥＭ　ＢＬ１８　： 　ｈｕｌＬ　−３由来のＣｌａｌ部位（成熟ｈｕＩＬ−３のヌクレオチド５８番 目）から、Ｂａ＋＋ｌ１１部位（ポリリンカー内、ｈｕｉＬ　３ｃＤＮＡの３′ 側）までのｈｕｌＬ　３　ｃＤＮＡ断片；（２）α−ファクターリーダーペプチ ドのＣ末端をコードする塩基配列を再生し、それを、今度は成熟ｒｈｕＪＬ−３ のＮ末端に融合されるオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤににフレームを合わせて（ ｉｎ−ｆｒａ脂ｅ）融合する合成オリゴヌクレオチドリンカー（オリゴヌクレオ チドＡ、図２）、このｒｈｕ　ＩＬ−３タンパク質への融合はオクタペプチドに 特異的な抗体での検出を可能にし、ｒｈｕｌＬ−３の発現と精製を七二ターする のに最初に用いられた。このオリゴヌクレオチドはまた、このＮ結合グリコシレ ージきン部位を変える１５番目でのアミノＭ変化（Ａｓｎ　”→Ａｓｐｌ　６） もコードしている９図２での下線を引いたヌクレオチドは野性型ｃＤＮＡ＠ＩＤ ＮＡ塩基配列を表している。（成ＰｈｕｌＬ　３分子のＮ末端アラニンに相当す るコ１′ンから数えて）各々、ヌクレオチド４３番目と４彊目でＡをＧに、Ｃを Ｔに変えるだけで、アミノ酸変化（ＡｓｐｌＳ）が、起こる。他の塩基変化は、 アミノ酸配列を変えることなく有用な制限酵素部位（ＡｈａＩＩとＰｖｕＩＩ） を導入する。

その結果性じるプラスミドはｐ！ＸＹ　１３９とされ、Ｎ結合グリコツレーン、 ン共通配列を１つ残した（Ａｓｎ”）ｒｈｕｌｌ、３　ｃＤＮＡを含む。

プラスミドｐｌＸＹ　１３９を用いて、Ａｓｎ１６をＡｓρ′。に変えることで 、２つ目のＮ結合グリコシレーシラン共通配列を隊くよう、オリゴヌクレメチド 指向性ミュータジェネシスを行なった。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏミュータジェネシス はワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）とワルダーにより記述された（ｓｕｐｒａ）ものと 同様の手法により行なわれた。酵母ベクターｐｌＸＹ　１３９は一末鎖バクテリ オファージｆ１のための復製開始点を含んでおり、適合した（ａの）大！！菌株 に存在して、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ）をＲａｍ染させた 時−末鎖ＤＮＡを生産することができる。

一本ｌ１ｉＤＮＡを、大腸菌株非１０７をトランスフオームして、ヘルパーファ ージ１ｉｔ１で重複感染することにより生産した。−末鎖ＤＮＡを単離し、成熟 ｈｕｌＬ−３の７００番目のＡｓｎの代わりにＡｓｐを置換するコドンスイッチ を提供する、図２に示されたミュータジエン用オリゴヌクレオチｌ’Ｂにアニー ルさせた。アニーリングと、酵母トランスフォーメーションの条件は、ワルダー とワルグーにより記述された（ｓｕｐｒａ）ようになされた、酵母トランスフォ ーマントを、トリプトファンの欠如した培地での増殖により選択し、プールして 、ＤＮＡを、ホルム（Ｈｏ１ｍ）らにより記述された（Ｇｅｎｅ　４２　：　１ ６９（１９８６））ように抽出した。このＤＮＡは、野性型と変異型プラスミド ＤＮＡの混合物を含んでおり、大腸菌Ｒ１１１をトランスフオームしてアンピシ リン耐性を持たせるために、用いられた。その結果性じたコロニーを、標準的技 法を用いて放射性標識したオリゴヌクレオチドＢへのハイブリダイゼーシぢンに よりスクリーニングした。　ｈｕｌＬ　３Ａｓｐ”をコードするＤＮＡより成る プラスミドを、ストリンジェントな条件下での放射性標識したオリゴヌクレオチ ドＢへのハイブリダイゼーシヨンにより同定し、ヌクレオチドシーフェンシング により、確かめた。

結果として得られた酵母発現プラスミドは、ｐｌＸＹ　１３８とされ、Ａｓｐ　 ”　Ａｓｐ”のアミノ酸変化をコードしているｈｕｌＬ〜３遺伝子と、Ｎ末端に オクタペプチドＤＹＫＤＤ［ｌＯＫを含んでいた。最終的な酵母発現プラスミド は、ｐｌＸＹ　１３８と同一であるが、オクタペプチドをコードしている塩基配 列を欠如しており、従って成軌ｒｈｕ　ＩＬ　−３を産物として生産する。

最終的な酵母発現プラスミドは以下に記述されるように構成された。酵母発現ベ クターｐｌＸＹ　１２０を上述したように、制限酵素＾ｓｐ　７１８とＢａ１Ｉ Ｈ１で切断した。大きなベクター断片を、（１）（成ｐｊｈｕｌＬ　３のヌクレ オチド１９番目を切断する）Ａｈａ■部位からｃＤＮＡ３’側のＲａｍ）１１部 位にわたるｐＴＸ’ｌ　１３＆由来のｈｕｌＬ　３ｃＤＮＡ断片と、（２）Ａｓ ｐ　７１８部位からのαファクターリーダープチドの３′末＠（アミノ酸Ｐｒｏ 　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　）と、ｈｕｌＬ　３のＡｈａｎ部位 までのＮ末端７アミノ酸を再生する合成オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチ ドＣ１図２）、とで−緒にライゲートさせた。

その結果得られたプラスミドは、ｐｌＸＹ　１．５１とされた。このベクターは 、酵母に存在ｒると、ｒｈｕ　ＩＬ　−３（Ｐｒｏ”、Ａｓｐ”、Ａｓｐ”）の グルコースで制御された発現及び分泌を可能とする。

実施例２； ７ｔ＜０　ｒｈｕ　ＴＬ−３（Ｐｒｏ”、Ａｓ　’ｆ宿主株Ｘν２１８１　（Ｓ 、ｃｅｒｅν１ｓｉａｅ　２倍体株）は、ワシントン大学、ジエネテイクス　イ ースト　ストレイン　バンク部、シアトル、ワシントン、　ＵＳＡＣｌｈｅ　１ ｌｎｊνｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｊｎ５ｔｏｎ、Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　Ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｉｎ　Ｂａｎｋ、５ｅａｔｔｌｅ、Ｗ`、Ｕ ＳＡ）か う得りＸＶ−６１７−１３Ｂ　（ａ、　ｈｉｓ６．１ｅｕ２−１．　Ｖ匹」、　 ｕｒａ３．５ｔｅ５）と、イーストジェネティク　ストックセンター、カリフォ ルニア大学、バークレー、カリフォルニア、ＵＳＡ（ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ １ｉｆｏｒｎ奄＝B Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、　［ｌ５Ａ）より得たχ２１Ｂ１　１Ｂ　Ｃｒｙ、　 ｋ以ユ、　１．　ａｄｅｌ、　ｈｉｓ２）とを、接合させることにより形成され た。宿主株は、シェルマンら（Ｓｈｅｒ霞ａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｕｒｐａ）の手法により発現プラスミドでトランスフオームされた。

発現プラスミドｐ１χＹ　１５１　（上述、実施例１を参照）を含む酵母は、４ °Ｃに保存されたＹＮＢ−ｔｒｐ　Ｎ天プレート上で維持される、プレカルチャ ーは、幾つかの単離されたりコンビナンド酵母コロニーを、ＹＮＢ−ｔｒｐ培地 （６，１ｇ／Ｌイースト・ナイトロジェン・ヘース、５ｇ几カサミノ酸、４０■ ／Ｌアデニン、１６にルウラシル、２００■／Ｌチロシン）１リツトルに接種す ることで始められ、３０’Ｃで激しく振って２つの２リツトルフラスコ内でオー バーナイトで増殖させる。朝までには、培養液は飽和しており、ステージ５ナリ ーフエイズ（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ）で叩、。にして２〜７になっ ている。

醗酵槽（１０リツトルの作業体積をもつ３台の機械）を前もってきれいにし、滅 菌しておいて、作業能力の８０％まで、５Ｄ−２培地（４，０ｇ／Ｌ硫酸アンモ ニウム、３．２ｇ／Ｌ−塩基リン酸カリウム、３．０ｇ／Ｌイースト、エキスト ラクト、１．Ｏｇルクエン酸、０．１ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｄ／Ｌ２％塩化 カルシウム、２，５ｄルビタミ：／１０１溶液、０．５ｄルトレースエレメント 溶液、０．５　ｄ／Ｌ２０％硫酸マグネシウム、２．。

ｄ／Ｌグルコース）　”？’満たし、３０°Ｃテ５００６００ｒｐｍ７ジテーシ ｇンおよび１０−１６１ｐｍエアレージ目ンで維持する。接種原を加える。増殖 ２時間後、５０％グルコースの栄養供給を１０−１２時間にわたって５０Ｒ／Ｌ が加えられるような割合で始める。栄養供給は、それから、回収まで３０−４０ １１／ｈｒで加えられる５０％エタノールに変えられる。

発酵の総経過時間は、およそ２０時間で、その後光学密度（６００ｎｍ）は３ｏ がら４５の範囲にある。発酵槽はそれから２０゛ｃに冷やぎ唄酵母ビールのｐＨ は、５Ｍ　Ｎａｏ）Ｉを加えて８．０に調整され、その結果のものを０．４５μ 園フイルターカセツトをとりつけたミリボア・ベリコン（Ｍｒ　Ｉ］　１ｐｏｒ ｅ　Ｐｅｌ　Ｉ　１ｃｏｎ）フィルターシステムを透しで濾過し、滅菌済１０Ｌ 箱入り大型ガラスびん（ｃａｒｂｏｙ）に集める。

酵母ブロース中に含まれるｒｈｕｌＬ−３を１５−２１５−２０ｔＩ逆相シリカ （バイダック。

セパレージ！ンズ・グループ、ヘスベリア、カリフォルニア、　ＬＩＳＡ）をつ めた５１Ｘ　３０Ｃｌカラムに濾過した酵母ブロースを直接カラムに注入ことに より通用する。

カラムは、酵母ブロースの適用前に０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ） で平衡させ、ブロースのカラムの注入充了に続き、流出物の吸光度がベースライ ンの値に近づくまでこのｆ４媒で洗い流される。この時点で、０．１％トリフル オロ酢酸アセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）の勾配を、０％Ｂから１００％Ｂまで、 毎分２％Ｂの変化率で１００　ｍ／分の流速で設定する。勾配が３０％Ｂに達し た時、５分の中断を、勾配コントローラーにプログラムしておく、勾配開始後２ ０分より、１分毎の分画を集める０分画液を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を 標品として用いたフルロレスカミン　アッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ　 ａｓｓａｙ）により、タンパク質含有量について分析した。　ｒｈｕ　ＩＬ　− ３（Ａｓｐ”、Ａｓｐｆｆｌ′）が分画８．９．１０に溶出しているのが見出さ れた。

第１段階からのｒｈｕＪＬ−３を含む分画は、およそ１グラムの総タンパク質が 得られるまで、ポリエチレンボトルに４℃で保存される。プールに２倍量の０． １％トリフルオロ酢酸水溶液が加えられる。この溶液は、それから、溶媒Ａ（０ ，１％ＴＦＡ／水）で平衡にされた１５−２０μＣ−１８シリカ（バイダック、 セバレーシジンズ・グループ、ヘスベリア、カリフォルニア、ＬＩＳＡ　）をつ めた第２の５ＣＩＸ３−カラムに注入される。材料を注入した後、カラムを溶媒 Ａで洗い流し、それから、上述のと同一の勾配を毎分１％溶媒Ｂの変化率で１０ ０　ｍｅ／ｓｉｎの流速で設定する。

勾配をかけて２４分して０．４分毎に分画を集める。分画液をＢＳＡを標品とし て用いたフルオレスカミンアッセイによりタンパク質含有量を分析する。

Ｃ−１８カラムからのピーク分画をプールし、０．５Ｍβ−アラニンｐｔｌ　３ ．６を１１１Ｏ量加える。試料を採取してから、プールを１．（７！Ｓ−セファ ロースカラム（１ｃｍＸ１０ｃｍ、ファルマシア社製）に５ＩＩｉ／分で注入す る。試料注入後、カラムを１０ｍＭ）リス１１８７．４５０ｍで洗い、１０ｍ１ ＩトリスｐＨ７，４から２００１１Ｍ　）リスｐＨ７，４までの（２００−の総 勾配量）線型勾配でルー３を溶出させる。ｒｂｕｌＬ３のピーク分画をそれから プールし、４℃でオーバーナイトで１１００ＩＩ　）リスｐＨ７，４に対し透析 し、それから濾過滅菌する。

実施例３： ヱ土Ｐノ【−ルー３　ンパク　の　・５　の　９３つのｒｈｕルー３タンパク質 が、以下のようにして分析のために準備された。

まず、Ｎ末端オクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫより成るｒｈｕ　ＩＬ　３（Ｐｒ ｏりを上述の酵母発現プラスミドｐＢ０１２５を用いて発現させた。酵母培養ブ ロースからのこの融合タンパク質の精製を、公表されたＰＣＴ出１１ＰＣ丁／１ ｌｓ８７１０３１１３に記述されているようにしてオクタペプチドに特異的なモ ノクローナル抗体を用いて単一のアフィニティークロマトグラフィーステップで 達成された。

第２に、ｒｈｕ　ＩＬ　３　（Ｐｒｏ’、ＡｓｐＩＳ、Ａｓｐ”）を、酵母発酵 により準備して、上述した実施例２で記述したように、逆相高速液体クロマトグ ラフィーにより、酵母ブロースから精製した。第３に、オクタペプチドと１５番 目、７００番目変化との両方を含むｒｂｕｌＬ３を、上述した実施例１に記述し た発現プラスミドｐｌＸＹ　１３Ｂを含む酵母の発酵により準備し、上述したよ うにアフィニティクロマトグラフィにより精製した。精製したｒｂｕｌＬ−３タ ンパク質の濃度はアミノ酸分析により決定された。

精製されたｒｂｕｌＬ３（オクタペプチド融合タンパク質）を、本質的にはネズ ミＧＭ−ＣＳＦ（２５）に対して以前に記述されたように、エンザイモビーズ　 ラジオヨーデイネイション試薬（ｅｒｚ）＋５ｏｂｅａｄ　ｒａｄｉｏｉｏｄｉ ｎａｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ）　（ビオラド−ラボラトリーズ、リッチセンド 。カリフォルニア、　ＬＩＳＡ）を用いて放射性！８３した。

簡単に言えば、０．化グリシンＨＣＩ　ｐ）１７．４中のＩＬ−３２，５μｇを 、０．２Ｈリン酸ナトリウムｐＨ７，２で最純量５０ｐ！にする。エンザイモビ ーズ試薬５０ＪＺ、′！’＋（２■Ｃ１）２０　ｐｌ。

２．５％β−Ｄ−グルコース１０ｐ！を加え、混合液を２５゛Ｃで１０分間保温 した。アジドナトリウム（５０ｍ門をｌ０ｐ７）と、メタバイ亜硫酸ナトリウム （５℃１ｇ／ｄを１ｏｐＺ）を゛次々に加えた。２５°Ｃで５分おいてから、ヨ ー素化したｒｂｕｌＬ３を、２％ウシ血清アルブミン、２（ｂ＋Ｍ　Ｈｅｐｅｓ 緩衝液、０．２％アジドナトリウムｐｌ’１７．２　（結合媒体）を含むＲＰＭ Ｉ−１６４０で平衡した２ｉセフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラ ム上でのクロマトグラフィにより遊Ｍ１　ｔ　Ｓ　ｌより分離した。ｒｂｕｌＬ ３を含む分画をプールして、同し緩衝液で０．５μｇ／ｄの濃度に希釈し、４℃ で保存した０分離段階の間にアジドナトリウムがなくなってしまった試料に関し て上述されたヒト骨髄増殖アシセイでｌ！５Ｉ−ｒｈｕｌＬ　３の生理活性を決 定した。放射性１ａ識した調製品の比活性は３　６　Ｘｌ０Ｉｓｃｐｓ／ｍ５ｏ ｌｅと計算された。融合タンパク質のＮ末端オクタペプチドは、１つのチロシン 残基を含むが、それは、ｒｂｕｌＬ３の場合、ネイティブなＩＬ−３分子がチロ シン残基を１つしか含まないので、この分子を１１８１で高い比活性で標識する のに有用である。

上述の様々なｒｈｕｌＬ３組成物の生物学的活性（ユニット／μｇ）と結合親和 性を、その後、上述したヒト骨髄増殖及びヒト単球ＩＬ−３受容体結合アッセイ により決定した。結果は、下の表Ｉに示されている３表Ｉでは、全ての値が、２ つの別々のアッセイで３回行なわれた試料の平均値士標準偏差（ａｖｅｒａｇｅ ＋Ｓ、Ｄ、）とし。

て表されている。

表　■： えヒトＴＬ−３の　８・２　と　４ Ｓｅｔ−８ＡｓｐＩｓＡｓｐ”　すＬ／　記録ナシ５．００：ｔ３．４　ＸＩＯ ”Ｐｒｏ−８Ａｓｐ”　Ａｓｐ”　なし　４．３６±１．２５ｘｌＯ’　４．７ ４±１．３０ｘｌＯ”Ｐｒｏ−８Ａｓｐ”　Ａｓｐ”　あり　４．９３±１．９ ５ｘｌＯ’　２．２３±、４２刈０■Ｐｒｏ−８なし　あり　１．１０土０．１ ５ｘｌＯ’　８．０２＋２．９４刈０９Ｓｅｒ　−８なし　あり　２．１社１． １枢１０’　１．１２±、０２刈０″表１でまとめられたデータに示されるよう に、ヒト比−３分子の幾つがの形に対する生物学的活性と阻害定数（Ｋ、）の両 方の決定により、アミン末端へのオクタペプチドりＹＸＤＤＤＤＫの付加はこう したパラメーターのどちらも本質的には変えず、融合タンパク譬が受容体結合研 究に関して研究試薬として医薬として用いるのに合理的なヒトＩＬ−３の形であ るという証拠を提供している。更に、１５．７００番目アスパラギンをアスパラ ギン酸に変えて、Ｎ結合型炭水化物の付加を阻害すると、ヒトＩＬ−３の生物学 的活性と結合親和性の両方において有意な（２−４倍）増加を示している。

図　１ （図　２ 工ｒひジ２賢秒二へ 二広丁丞］工五Ｅミ ｓｐ 手続補正書□ 平成　３年１０月２！；日　［配

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母発現により由来する組みかえヒトＩＬ−３タンパク質アナログ、ｒｈｕ ＩＬ−３（Ａｓｐ１５，Ａｓｐ７０）を薬学的に有効な量を含む医薬組成物であ って、該医薬組成物は、 （ａ）ヒト骨髄増殖アッセイでの少なくとも３．０×１０７ユニット／ｍｇの生 物学的比活性、 （ｂ）阻害定数として表わされる、ヒト単球ＩＬ−３受容体に対する少なくとも
2. ２．０×１０１０Ｍ−１の結合活性、および（ｃ）１ｎｇ／ｍｇタンパク質未満 のエンドトキシン含有量、により特徴づけられる、上記医薬組成物。 ２．組み変えヒトＩＬ−３タンパク質アナログが、以下の配列と本質的に同一の アミノ酸配列を持つ、請求の範囲第１項に記載の組成物。 【配列があります】
3. ３．組変えヒトＩＬ−３タンパク質が、そのような配列と同一のアミノ酸配列を 持つ、請求の範囲第２項に記載の組成物。
4. ４．ヒト骨髄増殖アッセイでの少なくとも４．０×１０７Ｕ／ｎｇの生物学的比 活性と、ヒト単球ＩＬ−３受容体に対する少なくとも４．０×１０１０Ｍ−１の 結合親和性とにより特徴づけられる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
5. ５．Ｎ末端オクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫを含む、請求の範囲第１項に記載の 組成物。
6. ６．注射もしくは継続的な点滴用に、生理的に許容できる希釈液で調剤された、 請求の範囲第１項に記載の組成物。
7. ７．ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ −７，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ若しくはＴＮＦより成る グループから選択された１つまたはそれ以上の生物学的反応性変更遺伝子を薬学 的に有効な量で付加的に含む、請求の範囲第５項に記載の組成物。