JPH04500662A - 生物活性をもつ分子の輸送に特に有効な粒子キャリヤ（輸送担体）及びその調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物活性をもつ分子の輸送に特に有効な粒子本発明は、生物活性をもつ分子の輸 送のために特に有効な新しい粒子（状）キャリヤに関する。

生物学系又は生化学系の内部に１つの化合物（有効成分）を侵入させ反応させる のに用いられる方法の中で、活性物質が中に被包されるような粒子（状）キャリ ヤを用いることが有利である場合が時としである。

特に次のような化合物の場合がそれであるニー　遊離状態では、生体内又は生物 学系又は生化学系の中でその寿命があまりにも短かすぎる化合物のこの場合、キ ャリヤはこれを保護しその一定の拡散を確保するこよができるようにする。

−１つの特定のタイプの細胞に対して作用しなければならない、戎いは成る一定 のやり方で呈示されなければならない化合物０例えば抗ガン物質及び抗原の場合 がそれである。この場合、キャリヤは、呈示及び選定された標的に向かってのタ ーゲティングを行なう。

−粘膜〔腸、ＥＮＴ　（耳鼻咽喉）系、膣又は皮ふ〕レベルで自然に吸収されな い化合物、この場合、ジャリヤは障壁を容易に通過できるようにするための被覆 として役立つ。

このような粒子キャリヤは、特にその有効装荷、その安定性、その生物代謝およ びその有効成分拡散性に関するいくつかの必要条件を満たさなくてはならない、 有効なものであるためには、このキャリヤはさらに、その特性により、生体内の 又は自然環境内で遭遇する分子の天然の輸送系統にできるかぎり近づこうとする ものでなくてはならない、これは、生理学的な平衡を乱さず、又場合にとって、 自然の生命過程に結びついた利点を利用できるようにするためである。

キャリャガ模倣しようとする天然の輸送系の中で研究の対称として最も興味深い のは、リポタンパク質である。

リポタンパク質は全て、リン脂質でとり囲まれた内部脂質核をもつ同じタイプの 構造組織を呈している。アポリポタンパク質は、リン脂質層内に最も定着させら れたものであり、リポタンパク質の案内を行なう、リポタンパク質にはさまざま な種類のものが存在し、これらはアポリポタンパク質の構造及び、輸送される脂 質の性質、サイズにより異なっている１例えばカイロミクロンは比較的大きい（ １μｍ）リポタンパク質であり、消化から生じる脂肪を輸送する役目を果たす、 低密度のりボタンバク質つまりＬ　Ｉ）　Ｌはこれよりはるかかに小さく（２０ 〜２５ｎｍ）、コレステロールの輸送を担当している。ＬＤＬはサイズが小さい ため、組織の内部に拡散することができる。

これらの天然のキャリヤに最も近い合成キャリヤは、水性液胞をとり囲むリン脂 質の二重層で構成されたりポゾームである。リボゾームは、有効成分のキャリヤ としてのその使用を開発するため数多くの研究作業の対象となった。

しかしながら、リボゾームは、薬品業界におけるその利用を妨げたいくつかの欠 点を有している。

それは特に、リボゾームの脆性、不均一性、低い輸送容量そしてその工業規模の 生産に関する問題点などである。

従って、自然のキャリヤに構造的に近いもののりポゾームにみられる欠点をもた ないようなキャリヤを入手することが望まれる。

本発明は、酵素反応、化学反応、免疫学反応、診断試Ｓ或いは又発酵のため、真 核生物又は原核生物といったさまざまな生物学系及び生化学系の中で天然１合成 、半合成又は組換え型の分子を輸送できるようにするリン脂質−糖脂質−多糖類 の性質をもつ粒子キャリヤ、又の名をＢｉ。

Ｖｅｃｔｅｕｒｓ　５ｕｐｒａ　Ｍｏ１ｅｃｕｋａｉｒｅｓ　（ＢＶＳＭ）　（ 超分子バイオキャリアヤ）に関する。

作用物質の輸送用の粒子状の系はすでに記述されてきたが、そのうちのどれも、 一定のサイズをもち、加減が可能できわめて安定性が高く、凍結乾燥、殺菌が可 能でかつ完全に代謝が可能であり、その構造及び表面が天然のキャリヤのものと きわめて良く似ているような実体を得ることを可能にする本発明に基づく粒子キ ャリヤの独特の多層構造を有してはいない。

さらに限定的に言うと、本発明は、 −液体でない親水性の核、基本的には親水性重合体例えば網状化された多糖類、 −一般に共有結合により核に結びつけられた脂質の第１の層又は環、 −　ミセルの形で組織化されつるリン脂質、生物相容性ある洗剤又は界面活性剤 といった両親媒性化合物の第２の層又は殻（なおこの層は疎水性相互作用によっ て一般に第１の層上に安定化される）親水性の核特に多糖類核はさまざまな方法 で得ることができ、特に多糖類の場合、好ましくは、線状のものであれ分岐した りのでれ生分解性の多糖類例えばデキストラン、でんぷん、セルロース又はこれ らの化合物の誘導体特に正又は負のイオン電荷をもつ誘導体といったタイプの天 然又は人工の多糖類を用いる。

これらの多糖類の分子量は、　５００００から数百万（はぼ子方）ダルトンとい うきわめて広範囲にわたり変化しつる。多糖類の網状化方法は当該技術分野にお いては既知のものであり、糖のヒドロキシル官能基と反応できる２重機能をもつ 製剤、特にエビグロルヒドリン、エビブロムヒドリン、ビス−エポキシド、ジ− カルボキシル酸の混合無水物又はオキシ塩化リン（ＰＯＣＱ　、）を用いること によって行なうことができる。

このタイプの方法の利用上の特別なパラメータは、当業者にとって既知のもので ある。

一般に、ゲルが得られる。このゲルは、直径数十ミクロンの粒子を得るべく、機 械的に粉砕される。

次に１本発明に従ったキャリヤを得るためには、新たに断片化を行なう必要があ る。この断片化【Ｌ超音波方法又はＦｒｅ’ｎｃｈプレスでの押出しといった方 法で行なわれる。

本発明に基づく粒子キャリヤについては、１゜ｎｍから５μｍのサイズの核を用 いることが好ましい、成る種の場合にはこれ以上又はこれ以下のサイズの粒子を 場合によって用いることもできるが、好ましい粒子は、２０　ｎ　ｍがら７０ｎ ｍの間。

さらに好ましくは５０ｒ＋ｍ前後の粒子である。

親水性の多糖類核の特性は、核の糖を酸性又は塩基性のイオン官能基で置換する ことにより変更できる。核の内部及び外部で均質な形で起こるこの置換は、網状 化の前、途中又は後に導入されうる。これらのイオン特性は、それ自体イオン性 であるが核のものとは反対の電荷をもつ化合物の被包の場合に特に有利である。

当然のことながら、場合によって、均等な寸法範囲をもちたいと考える場合には 適切なあらゆる方法特に分画遠心分離により、得られた粒子の直径に応じた純化 を行なうことになることが考えられる。

第１の層又は環は好ましくは、脂質試薬すなわち特にステロール、脂肪酸、脂肪 性アミン、リン脂質、疎水性アミノ酸又はアルコキシエーテルを用いて核のヒド ロキシ官能基又は誘導ヒドロキシ官能基から化学的カップリングによって得られ る。

このタイプのグラフト化は当該技術分野では既知のものであり、ジクロロメタン 、ヘキサン、トルエンといった多糖類の溶媒ではない非プロトン性媒質の中での 糖のヒドロキシ官能基の変性反応ならびに相応する脂質性化合物の疎水基のカッ プリングを用いることから成る。

第１の脂質層の合成レベルでは、たとえグラフト化の反応が当業者にとって実際 既知のものであるとしても、本発明に基づく方法は、ジクロロメタン、ヘキサン 又はトルエンといった。多糖類の非プロトン性溶媒ではない非プロトン性媒質の 中で反応を行なうことにより、好ましい実施態様に対して有利な変性をもたらし ている。実際、こうすることにより、ピリジンといった多糖類の溶媒の場合そう であるように核の質量内においてではなく表面的な誘導を行なうことができる。

この変性は、一方では親水性の中心核を保ち、他方では核の粒子状構造を維持す ることを可能にするものであることから、非常に重要である。実際この構造は、 糖のヒドロキシル官能基の間の網状化反応のみならず、網状化剤により架橋され ない糖の間の水素結合の存在のおかげで得られるものである。

こ４ｔらの結合は、ピリジンといった多糖類の溶剤を用いて質量の中で誘導を行 なうときに破壊され、同時に粒子状構造も失なわれることも示された（このとき 、酢酸セルロースタイプの繊維構造が得られる）。

第１の脂質層レベルでのイオン化合物の被包に有利に作用するため、下位のイオ ン特性を有する脂質性環を実現することが可能であるということがわかった。こ のイオン特性は、正又は負のイオン官能基及び、多糖類核の糖のヒドロキシ基と 共有結合を形成することのできるもう１つの官能基をもつ化合物との多糖類核の 部分選択性反応によりもたらされうる６例えば、遊離カルボキシル官能基をもっ コハク酸のモノエステルを得るべく、アルコール又は糖がもっているＯＨ官能基 と反応する無水コハク酸といったジカルボキシル酸の内部無水物の場合がそれで ある。イオン化合物との誘導反応は、脂肪酸とのアシル化反応の前に又はそれと 同時に行なうことができる。多糖類核の表面にイオン基が存在することにより脂 肪酸の平行なグラフト化が可能となるということがわかった。

しかしながら、リン脂質層を樹立するのに必要な疎水性を保つためには、このイ オン特性はわずかなものにとどまらなくてはならず（コハク酸についてはモル百 分率で４０％未満）又使用される脂肪酸は充分に長いものでなくてはならない（ ０１４以上）ことがわかった、グラフト化は１部分選択性を確保するため前述の ように多糖類の溶媒でない非プロトン性媒質の中で誘導反応を行なうことにより 、ただし１つは脂質性のそしてもう１つはイオン性の試薬の混合物を用いること によって、手軽に行なわれる。

！＆後に、脂質性の外部殻は、リン脂質又は前述のようにミセル状に組織されつ るイオン性又は非イオン性のあらゆる界面活性剤を用いて実現することができる 。この外殻は、好ましくは、リボゾームのＵＲ製に用いられるものと同じような 方法つまり、エーテル又はエタノールの注入、洗剤の透析、逆相調製又は最もよ く知られたフラスコ方法によって得られる。

これらの粒子、キャリヤは、層又は核の１つの中で生物活性をもつ分子を搬送す ることを特に目的とするものである。

これらの生物活性分子としては、以下のようなものえお挙げておかなくてはなら ない。

−抗生物質及び抗ウィルス剤 −タンパク質、ムコタンパク質、ヘブチド、−多糖類、リボ多糖類、 −抗体、 −殺虫剤及び殺真菌剤。

−心臓血管系に作用する化合物、 −抗ガン剤、 −抗マラリャ剤。

−抗ぜん息剤。

輸送される分子の選択については、先験的に制限はない、実際、生物活性を有す る全ての分子が、被包可能である。抗炎症剤、麻酔剤、避妊剤、ペプチド、駆虫 薬、ビタミン、プロスタグランジン、神経弛緩薬、抗うつ薬などの他の数多くの 化合物を加えることが可能である。

場合によっては、造影及び／又は診断を可能にするため、特に放射線方法又は蛍 光タイプ又はＮＭＲ（核磁気共鳴）検出タイプの方法により独特の標識づけが行 なわれた本発明に基づく粒子状キャリヤを用いることができる。

有効成分は、多糖類核の内部又は脂質環の中、或いは又リン脂質外殻の中に挿入 することができる。この挿入は、疎水結合、水素結合又はイオン結合を介して自 然発生的に、或いは又適当なリガンド（配位子）の化学的グラフト化の後に、実 施することができる。後者の場合１分子を、粒子の外部に局在化させ疎水性リガ ンドによりこれに結合させることができる。こうして、空間的に規定された４つ のゾーンが識別されることになる。

５ｕｐｒａ＋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　（超分子）という用語を採用した理由は、こ の空間的ゾーンへの分割にあるのである。

最後に１本発明は、本発明に基づく粒子状キャリヤを含む薬品化合物又は診断或 いは造影用化合物に関する。

以下に示す例においては、その特性に応じてのさまざまな物質、特に以下のよう な物質の装入について説明する。

−小さなサイズの親水性物質、アミノグリコシド族の抗生物質、ブチロジン。

−酸性を有する内部脂質環内に局在化させられた両親媒性物質、プロプラノロー ル、 −同じプロプラノロールであるが、リン脂質外殻内の局在化させられてもの、 −非常に疎水性の強い化合物、殺虫剤抗生物質、内部脂質層内に局在化させられ たデルタメトリン。

−膜タンパク質、シトクロムＣ１ −大きなサイズではあるが脂質性残基を有するー　脂肪酸鎖により変更された酸 素タンパク質。

−脂肪酸鎖により変更された単りローン性抗倣−疎水性抗生物質、エリスロマイ シン、−天然酵素タンパク質、Ｂ　Ｖ　Ｓ　Ｍの表面に定着させられたペルオキ シダーゼ、 −酸性多糖類核の内部に被包された同じペルオキシダーゼ。

本発明に基づく粒子ビーグルは特にろ過或いは又１２０℃で例えば２０分間オー トクレーブに入れることにより滅菌することができる。これは。

特別な予防措置なく凍結させることもできる。凍結乾燥は、再水和作用を可能に するため、必要不可欠ではないものの、マルトースといった凍結乾燥用添加剤が 存在する中で実施することができる。

これらのビーグルは又霧状化することもできる。

霧状化すべき懸濁液中に糖又は多糖が存在することにより、粒子間の′ａ隻現象 を避は水の中でより良く再懸濁させることができるようにする助けとなるオシド （加水分解で単糖類のみを生じる物質）フィルムで粒子を被包することが可能と なる。以下に記す例により、問題となっている粒子キャリヤのさまざまな層の中 に物質を挿入するため利用される方法のいくつかをより明確に立証することが可 能となるだろう。

その可変性の程度が大きいことに加えて、Ｂ−ＶＳＭは、有利な物理化学特性を もっている。

このタイプの微小粒子がもつ数多くの利点の中でも特に次のものを挙げることが できるニー　輸送すべき物質、その所要被包率ならびに選ばれた標的に対する適 合を可能にする多層状のモジュール構造タイプ。

−その反応性又は、その膓及び皮ふによる吸収を有利にさせるために１粒子の表 面状態を変更することができる。

−リボゾームと同じような形で、ＢＶＳＭのリン脂質外殻は細胞膜と類似性をも ち、細胞膜と相互作用することができる。

−多糖類核の重合体構造のため、化学的安定性が非常に大きい。

−完全な生体内分解及び生物代謝。

−さまざまな化学的性質の有効物質の被包能力が高い。

−サイズが定まっており２生体系及び組織の中での拡散が調整できるような小さ なサイズ（５０ｎｍ）を均等な形で得ることができる、−製造方法を工業化する ことができる。

以下に示す例により１本発明の他の特徴及び利点側より明確にすることができる だろう。

例１：網状化された多糖類の核の調製 ソーダトラップの備わった２リットル入り反応装置の中で、ＩＭのゾーン溶液１ ５０ｍｇと分子Ｊｉ２２９．０００のデキストラン１５０ｇ　を混合させる。デ キストラン溶液が均質になったところで。

力強く撹拌しなから１２ｍＱのエピクロルヒドリンを注ぎ込む０反応混合物を温 水浴により８０℃まで加熱する。１０時間８０℃に温度を維持する一方で、エピ クロルヒドリンの付加機撹拌を停止する。

やや弾性があり壊れやすいゲルが得らる。このゲルを１８５０９の水の中で懸濁 させ１次に、直径数十ミクロンの粒子を得るべく、スクリュー付き装置（ｆｌａ ｒｉｎｇ　ブレンダタイプのもの）で機械的に粉砕させる。

次に、網状デキストランの超断片化を行なって。

５０ｎｍの微小粒子を得る。この断片化は、微小粉砕を可能にするのに充分なほ ど力強いあらゆる方法で行なうことができる９例を挙げると、次のような２つの 方法がある： ａ）　超音波による超断片化。

前に得られた粗製懸濁液を３０分間超音波ゾンデ（出力２５０ワツト）を用いて 音波処理する。

直径１１００ｎ未満の粒子を２０％含む不均質な混合物が得られる。

ｂ）　Ｆｒｅｎｃｈブレスによる断片化前に得られた粗製懸濁液を、補正圧力１ ４０Ｍｐａｓｃａｌの下でＦｒｅｎｃｈブレスを用いて抽出す。

この作業を３度くり返す、このときｌ　ＯＯｎ　ｍ以上の直径をもつ粒子の比率 は５％未満である９電子顕微鏡で測定された平均直径は５０ｎｍである。

微小粒子を１０００ｇから６０００ｇ（１，５分）の差動式遠心分離により純化 させる。　２０００ｇ以下で沈降する粒子のサイズは１００ｎｒｎ以上であり、 一方２０００ｇかた５０００ｇで沈降するもののサイズは１０　ｎ　ｍから１１ ００ｎである。これらの値は可変的なものであり、網状化条件及び使用された多 糖類の性質によって左右される。

粒子のサイズは、電子顕微鏡（倍率２００００倍及び１ｏｏｏｏｏ倍）及びクル ータナノサイザーで測定する。粒子は比較的規則的な楕円体（スフェロイド）の 形をしている。

出発物質の多糖類は、不液性の網状化された形で９０％見い出され、一方１０％ は可溶性多糖類の形で見い出される。アントロン方法で秤量を行なう、網状化さ れた多糖類粒子の脱水は［３ｕｃｈｉ１９０アトマイザを用いて行なわれる０粒 子の濃度は５％、乾燥用空気の温度は２００℃である。

酸性網状化多糖類核の調製 重合化及び断片化により前段階で得ら九た多糖類核５０ｇを１Ωの精製水の中に 分散させ、ＰＨをＮａＯＨで８に調整する。２０ｇの無水コハク酸を加え、Ｍ濁 液を２時間大気温で撹拌する。ここで、変性された微小粒子を遠心分離に付し洗 浄して、可溶性反応生成物及び塩を除去する。この反応の結果、コハク酸のモノ エステルが形成される。

塩基性網状化多糖類核の：Ａ製 ５０ｇの多糖類核を前述のもの同様、ＩＱの精製水の中に分散させる。ＰＨを８ に調整し、２０ｇの塩化グリシジルトリメチルアンモニウムを加える。懸濁液を ２４時間大気温で撹拌する。変性された微小粒子を遠心分離に付し、洗浄して可 溶性反応生成物及び塩を除去する。この反応の結果。

トリメチルアミノ１．０Ｑ−２プロビロキシ−１基の糖に対するグラフト化が起 こる。

置換率は１滴定での測定によると、糖１につき約０．５当量である。同じ電荷の イオン官ＩＮ基間に存在する何カ（反発）のため、イオン置換基は粒子の体積内 に均質に分布している。

例２：例１に基づく脂質特性をもつ脂質環の調１Ｑのジクロロメタン内で懸濁状 態にある平均直径５０ｎｍの霧状化された多糖類粒子１００ｇに対し７５ｇのジ メチルアミノピリジンと１００ｇの塩化カプリル酸を加える。全体を２０時間３ 置く１反応後の粒子の回収及び洗浄は、ジクロロメタンの蒸発とそれに続く３回 のメタノール洗浄により行なわれる。各洗浄の間に、遠心分離により粒子を回収 する（５０００　ｒｐｍで２０分）。

反応の動特性を研究することにより、成分の化学量、使用溶媒及び選択された温 度に応じて、密度ならびに粒子内部の樹立深さが多少異なる脂質層を得ることが できる。

直径５０ｎｍの粒子についての作業条件に応じた脂質酸グラフト化率の変化例。

５　３７　１８　０、６ ０．５　３７　５　１．５ 多糖類核に対しグラフト化された脂肪酸をＬＡｕｗｅｒｙｓ　法により秤１ｋ【 ７た。

例３：イオン特性をもつ脂質環の調製 酸性特性： 塩化ステアリン＠（Ｃ１８）及び無水コハク酸の混合物を用いることにより、前 述のプロトコル（実験記録）を変更する。１Ｑのジクロロメタン中で懸濁状態に おかれた５０ｎｍの霧状化された多糖類粒子１００ｇに対し、７５ｇのジメチル アミノピリジンと１６０ｇの塩化ステアリン酸（０゜８当量）及び１２ｇの無水 コハク酸（０，２当量）を加える。Ｃ１８と無水コハク酸のモル比は変えること ができき、以下のようなグラフト率が得らコハク酸の　（℃）　（時間）　比率 （重量百分モル比　分率） １１０　３７４８　ｔ。

０．９１０．１　３７　４８　９．２ ０゜７５１０．２５　３７　４８　８ ０．６１０．４　３７　４８　７ 塩基性特性： 酸塩化物と塩化グリシジルトリメチルアンモニウムの混合物を用いて、類似の作 業様式を利用する。

例４：脂質外殻の調製 カゾリル酸でアシル化された粒子（３０〜１００１００ｎ脂質酸５％）１５０ｇ に対して、１．５Ｑのクロロホルム中のリン脂質（１／３）　フオスファチジル エタノールアミノ、１／３Ｐ、コリン、１／３Ｐ、イノシトール）３０ｇを加え る。５９入りフラスコ内に全体を入れ、ｒｏｔａｒａｐｏｒ　（回転蒸発器）で 減圧下で乾燥させ、その後２Ｑの精製水を付加した後、１０分に１＠撹拌しなが ら３０分間４０℃に置く。

粉体状態のリン脂質とアシル核を混合し１次に撹拌しながら必要量の水を徐々に 付加することにより、この方法の変形態様を利用することもできる。この変形態 様は、当然のことながら大量のＢＶＳＭの調製により適したものである。

ＢＶＳＭは次に、音波処理（バスで１時間３０分）により又はＦｒｅｎｃｈプレ スでの押出しにより、均質な懸濁液の形で得られる。過剰なリン脂質が存在した ため作業中に形成され得たりポゾーム（ＳＵＶ）は、遠心分１１ｄｌ　（１５０ ００ｒｐｍ、　３０分）により除去し、沈降したＢＶＳＭは回収する。

超音波バスで数分間の分散により再度懸濁液状態に置かれたＢＶＳＭは、乳状溶 液の形をしている。この懸濁液は安定したものであるが、数日後傾部で終わり、 このとき最初の懸濁液を再び得るには、あまり力を入れずに一回撹拌するだけで 充分である。

リン脂質の秤量は、ＡＭＥＳ及びＤＵＢ　Ｉ　Ｎの方法によりリンを秤量するこ とによって行われる。

５％のカプリル酸グラフト化率を示す核の場合、ＢＶＳＭに結合（随伴）された 脂質の量は１５％である。

例５：ろ過による５　０　ｎ　ｒｎのＢＶＳＭの滅菌直径が１．　ＯＯｎ　ｍ未 満のＢＶＳＭの滅菌は、酢酸セルロース又はポリカーボネートの膜（孔直径０． ２２μｍ）上でのろ過により得られる。このろ過には、高い圧力を使用する必要 があるが、閉塞現象はひきおこさない。

完全に滅菌するためには、２回の連続ろ過が必要である。ろ過の後、得られた懸 濁液は驚くほど均質であり、沈降傾向は極めて低く（数週間）、これは、Ｓの押 出し効果により誘発された懸濁液の非常に分散した状態を示すものにちがいない 。

こうして１！）られたＩｌ、　Ｖ　Ｓ　Ｍは、特別な予防措置無しに２０分間Ｊ −２０℃でオートクレーブ滅菌できる。オート・クレープ滅菌の後、Ｉ３ＶＳＭ の懸濁液は、変わらない状態にあるように見える。

ＢＶＳＭは同様に、特別の予防４ｔｌａなく凍結させることができる。解凍の後 、得られる懸濁液は、当初のものと同一である。Ｌ（ＶＳＭの直接凍結乾燥に行 うこともできるが、５％のマルトースのような凍結乾燥剤を付加することにより 、凍結乾燥及び再水和作用の後、完璧な懸濁液とより良い結果を得ることがＥ＋ 工能になる（ＡＥＤの項参照）例６　：　ＢＶＳＭの研究 陰性染色の後ＢＶＳＭを電子顕微鏡で観察すると（倍率１０００００倍）、それ が平均直径４０　ｎ　ｍの多少の差こそあれ規則的な楕円体の形を呈しているこ とがわかる。

粒子は、凝塊無く分散状態にあることが観察できる。ＢＶＳＭの粒子のまわりに ハローが存在し多糖類核のみの上にはこれが無いことは、リン脂質外殻の存在を 示唆している。

エンタルピー微分解析研究は、−シバルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰ Ｉ）Ｃ）にとり囲まれだＢＶＳＭについて、Ｄ　’Ｐ　Ｐ　Ｃのリポゾームとの 比較により行われた。この場合において、４０℃という遷移温度が１！察され、 これは文献のデータと一致する。同様な遷移温度は、脂質環内に存在する脂肪酸 の如何にかかわらず、大きなサイズ（２０−８０μｍ）の　ＢＶＳＭについてａ ｍされている（Ｃ８−４０，９℃、Ｃ１２−４０，２℃、　Ｃ１５−４０，７℃ ）。５０　ｎ　ｍ　Ｂ　Ｖ　Ｓ　Ｍの場合、カプリル酸でアシル化されたＢ　Ｖ 　Ｓ　Ｍ　（４０’Ｃ）についてのみ遷移がみられる。

これらの結果は、脂質外殻が充分にリボゾームタイプの組織立った構造を呈して いることを示している。しかし、この組織は、脂質環を構成する脂肪酸の性質及 び粒子のサイズにより左右さハる。

なお、遷移温度はＢＶＳＭの凍結乾燥により影響をうけていない。

例７　：　Ｂ　１！　Ｓ　Ｍ内へのブチロジンの装入“１６７１−１７！−一− −Ｉ―−−噌輔−−―！−自開−！−−−−聞一−―−１−−−Ｍ−−−−−〜 判−−−―−熟プチロシン（Ｐａｒｋ　Ｄａｎｉｓ）は、アミノグリコシド族の 抗生物質である。これは、グリコシド結合によりアミノ糖に結びつけられたアミ ノシリトールから成る分子である。従ってこれは、極めて極性及びイオン性が強 く、水及び水と低級アルコールＯｄＧ合物の中でのみ可溶性をもつ物質である６ まず最初に、Ｃ８でアシル化された多糖類核５０ｇ（脂肪酸０．６％）及びアゾ レクチン（Ｆ　１ｕｋａ）　１０　ｇを用いて前述のフラスコ方法によりブラン クのＨＶ　Ｓ　Ｍを調製する。

場合によって存在する汚染力あるリボゾームを除去するため洗浄した後、Ｆ３Ｖ ＳＭを２１０ｇの硫酸ブチｒ」ジン（Ｐａｒｓｋｅ−Ｄａｎｊ、ｓ）　を含むメ タノールと水（５０：　５０）の混合物２５０　ｍ　Ｑ　中で再度懸濁させる。

こうして得られた懸濁液を、回転式蒸発器を用いて減圧下で（３０℃、、３００ ｇ）で濃縮される。懸濁液がペースト状になったところで、メタノールと水の混 合物２５０　ｍ　Ｑを再度加える。

こうしてこの作業な３度くり返す、最後の′ａ縮の後、残留物を２５０　ｍ　Ｏ ，の水の中に再びとり込み、次に遠心分離させ、ブチロジンを５イオン対の高性 能液体クロマトグラフィ及び、＜−Ｅ、／−ラス°ゴ辷１ニス（ｎａｃＨｌｕｓ 　５ｕｂｔｉｌｉｓ、枯草菌）上の微生物秤量によって、上澄み液の中で秤量す る。結果は、上澄み液中に３ｇのブチロジンが存在することつまりその差からＢ ＶＳＭを含む残りかすの中には７ｇのブチロジンが存在することを示している。

こうして、アシル化された核の重量に対し１４％の装入率そして７０％の被包効 率が得られる。連続的な遠心分離による遊離ブチロジンの洗浄の後のＢＶＳＭを 含む懸濁液の上澄み液の分析によってもブチロジンの存在を明らかにできなかっ た。従って、ブチロジンはＢＶＳＭの内部に安定した形で被包されているという ことになる。　さらに、ＢＶＳＭ内に被包されたブチロジンは、ベトリ皿のバシ ラス・サチリスに対して活性をもたない。

これらの結果は全体として、ブチロジンが、多糖類核において粒子の内部に局在 化していることを実証している。

他のアミノグリコシド特にゲンタマイシンについても、同様の係合かが得られた 。

ａ）　ｎｉ性の内部脂質環内への装入 プロプラノロール（Ｉ　ＣＩ　ＰｂａｒＩｌａ）は、第２アミンの存在のため塩 基性のイオン部分と芳香族粗脂肪性部分を伴う両親媒性構造を有するベータ遮断 物質である。

前述のように塩化バルミチン酸と無水コハク酸（７５／２５）の混合物によりア シル化された核５０ｇで懸濁液を作る。核をメタノールと水（ｓｏ　：　ｓｏ） の溶液５００ｒｎＱの中に分散させる。このｉ濁液に対し塩基性プロプラノロー ルＬｏｇを加え、回転式蒸発器を用いて減圧（４０℃、３０　ｍｌ１ｇ）下で溶 媒を蒸発させる。完全に蒸発させた後、残留物を同じメタノール／水混合物３０ ０ｍＱでとり込み、再び蒸発させる。三回の蒸発サイクルの後、残留物に対しｌ ｏｇの粉末状のリン脂質（レシチン）を加える。このとき少量の分画に分けてし かも規則的に撹拌しなから５００　ｍ　Ｑの水を加える。

次に懸濁液を、まずＷａｒｉｎｇブレンダタイプの装置を用いて、そして次に音 波処理又はＦ　ｒ　ｅ　ｎ　ｃ　Ｉｔ　プレスでの押出しにより、均質化する。

懸濁液を遠心分離し、プロプラノロールを２９０ｎｍでの吸入の測定により上澄 み液中で拝呈する。上澄み液・には２ｇのプロプラノロール量がみられ、その差 よりＢＶＳＭ中には８ｇのプロプラノロールがある。従って被包効率は８０％で 、装入率は１６％である。

ｂ）　脂質外殻内へのプロプラノロールの装入ここではブチロジンの場合のよう に作業する。まず、ブランクのＢＶＳＭ　（Ｃ８）を調製し、次にメタノールと 水（５０：　５０）の溶液の中にプロプラノロールを加え、数回濃縮サイクルを 行なう（ただし乾燥にまで至ってはならない）。次に残留物を水の中に再度Ｉ＠ 濁させ、遠心分離しく５０００　ｇ　、　ｉｏ＋＋ｎ）。

上澄み液中で２．９０　ｎ　ｎｎでのＵ　Ｖ分光測定法により拝呈する。前述の ものと同量で、３０％の被包効率と６％の装入率が見られ、これは前述の値に比 べ半分以下の値である。

例９　：　ＢＶＳＭ内へのデルダメ１−リンの装入デルタメトリン（Ｒｏｕｓｓ ｌ　Ｌｌｃｉａｆ）は、ビレトリノイド族の殺虫剤である。これは極めて疎水性 げ強く、有機溶媒の中でのみ溶解する化合物である。

装入は、核Ｃ１６（グラフト化された脂肪酸８％）５０ｇから行なわれる。これ らの核を　５　ｇのデルタメトリンを含むエタノ−・ル５００　ｍ　り、中で懸 濁状態におく、溶媒は、回転式蒸発器を用いて）威圧下（３０℃、３０ｍｍ　ｌ １ｇ）で蒸発させる。残留物を３０．０ｍＱのエタノール中に再びとり込み、再 度蒸発させる。３回の蒸発サイクルの後、乾燥残留物にＬｏｇのリン脂質（アソ レクチンンを加え。

つねに撹拌しながら５００ｍＡの水を少量の分画に分けて付加する。次に懸濁液 をＷ　ａ　ｒ　ｉ　ｎ　ｇ　ミキサー及びＦ　ｒ　ｅ　ｎ　ｃ　ｂプレスで均質 化し、その後遠心分離する。デルタメトリンは水溶液中には溶解できないことか ら、秤量は上澄み液についてではなく、Ｂ　Ｖ　Ｓ　Ｍのデルタメ１へリンの除 去の後に行なわれる。数回洗浄した後（水及びメタノールと水の混合物）、懸濁 液を遠心分離する（５０００ｇ、１０分）、」二澄み液を除去し、Ｉ３ＶＳＭを 含む残りかすを無水エタノール（５００ｍ　Ｑ　）中に再び懸濁させる。３０分 間撹拌した後、＠濁液を遠心分離する（　３０００　ｇ　＋　５　ｍ　ｎ　）　 、上澄み液は回収し、残りかすは５００　ｎｉ　Ｑの無水エタノール中で再び懸 濁させる。３回の抽出の後、上澄み液を：集め、２７８　ｎ　ｍでの光学濃度を 測定することによりデルタメトリンを秤量する。

５ｇのデルタラ１〜リンが見い出される。っまり被包効率は１００％、装入率は １０％である。

被包効率の値が非常に高いのは、デルタメトリンの高い疎水性とその水中不溶性 のせいであるにちシトクロムＣは、膜タンパク質であり、従って脂質領域つまり 内部環と外殻に対し優れた親和力を有しているはずである。さまざまなプロトコ ルの効率を比較する目的で、我々は、アシル化さ肛た核についての被包、ＢＶＳ Ｍについての被包そして両方の方法を組合せたものを実施した。

適用されるプロトコルは、前に用いられたものと同一である。使用量は、Ｃ８核 ５０ｇ、アソレクチンそしてＬｏｇのシトクロムＣである。タンパク質に対し変 性力が比較的低いアセトン１−リルがメタノールに代わって用いられる。

２つの方法の組合せ： 第１の被包が核Ｃ８について行なわれる０次に。

リン脂質を加え通常の処理によりＢＶＳＭを調製する。このレベルでＢＶＳＭｔ ｉｌ−遠心分離し上澄み液中のシトクロムを秤量する代りに、アセトニトリルを さらに加えて、ｗｌ、圧下で（３０℃、　３０ｍｍ　ｌ１ｇ）２回の濃縮サイク ルをくり返す、ここで残留物を水中に再度懸濁させ、均質化させ、遠心分離し。

４０７ｎｍでの光学濃度の測定により上澄み液中でシトクロムＣを秤量する。

次のような結果が得ら九る： プロトコル　被包効率（％）　装入率（％）アシル化核　７５　１５ ＢＶＳＭ６７　１３．４ 両方法の組合せ　８２　１６．４ 両方法の組合せを使用すると、最高の結果が得られる。

例１１：　ＢＶＳＭ内へのサルモネラ・ミネソタ（Ｓ）のリポ多糖類（ＬＰＳ） の装入ＬＰＳは、−多糖類部分（又は〇−抗Ｈ）と−疎水性部分つまり脂質Ａか ら成る高分子である。

これは、細菌の外部に通常位置するグラム陰性菌の膜成分である。従ってＬＰＳ のために選ばれた場所は、リン脂質外殻である。ここでも又、ブランクＢＶＳＭ から出発して、ゲンタマイシン及びプロプラノロールについて用いられたプロト コルを採用する。

ブランクＢＶＳＭは前述のとおり調製され、メタノールと水（３０／７０）の混 合物中に懸濁した状態でＢＶＳＭに対しＬ　Ｐ　Ｓ　（Ｌ　、　２１３７．　Ｓ ｉｇｍａ）を加える。３回濃縮サイクルを行ない、水の中に再度懸濁させ、均質 化し、遠心分離し、モしてＤｕｂ。

ｉｓの方法により（アントロン）上澄み液中のＬＰＳを秤量する。５０ｇのＣ８ 核及び５ｇのＬＰＳから出発して、４ｇのＬＰＳを被包するに至る。

つまり被包効率は８０％、装入率は８％である。

１００ｍＡのリン酸塩緩衝液（１０−３Ｍ　、　０．１４５Ｍ　ＮａＣ１、及び １％のコール酸塩、ｐＨ８）に対し。

１、０　ｍ　Ｑのアセトン中に溶解させた塩化パルミチン酸５０■を加える。溶 液を超音波装置を用いて均質化する。ここで１０　ｍ　Ｑの緩衝液中に溶解させ たアルファーキモトリプシン（２５０ｓＩｇ）を加える。

４℃で２時間放置した後、遠心分離（１時間ｚｏｏ。

Ｏｇ）　により沈殿物を分離し、洗浄剤を透析する。

２ｇの０８核と４００■のアソレクチンから通常の方法でブランクＢＶＳＭの懸 濁液を調製しこのブランクＢＶＳＭ懸濁液に対し、前に得た変性アルファーキモ トリプシン溶液を加え、混合物をアセトニトリル１０％に調整し１次にｒｏｔａ ｖａｐｏｒ（回転式蒸発器）で減圧下（Ｉｍｍ　ｊｉｇ　、４℃）にて濃縮する 。作業を３回くり返し１次に残留物を５０ｍｍの水の中に再び懸濁させ、均質化 し、遠心分離する。

Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法によるＢＶＳＭ内のタンパク質の秤量は２００　ｒｒｔ　 ｇという量を示している。つまり被包効率は８０％、装入率は１０％である。

純化された１ミリグラムの抗）ｉ　Ｌ　Ａ　−８２ｍ鎖体、５ＡＦＩ、クラス］ 　（Ｂｉｏｓｙｓ）を２％のデソキシコール酸塩を含むＰＢＳ緩衝液５００μα 中パルミチル酸のＮ−ヒドロキシスクシニシドエステル２２μｇに加える。混合 物を１２時間３７℃に保温し、次に、余分なパルミチン酸を除去するため０．１ ５％のデソキシコール酸塩を含むＰＢＳ緩衝液中で５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７ ５カラム上にてクロマトグラフィに付す。免疫グロブリンを含む死体積ピークを 吸集し、透析する。

ＢＶＳＭ内への抗体のとり込み ２００μ２の水中の２０　ｍ　ｇのＣ８核に相当するブランクＢＶＳＭの懸濁液 を用いる。前に得た抗体溶液を加え、アセトニトリル１０％まで補完する。この とき混合物を５ｐｅｅｄ　Ｖａｃタイプの装置を用いて減圧下テ（４℃、０．０ １ｓ＋ｍ　ｌ１ｇ　）濃縮させる（乾燥状態にまでなってはならない、混合物を アセトニトリル／水溶液（１０：　９０）５００μＱの中に再度懸濁させ、その 後再び濃縮する。３回の濃縮サイクルの後、懸濁液を５００μＱの水中に再びと り込み、均質化させ、遠心分離する。［１ｒａｄｆｏｖｄ方法による残りかすの 中のタンパク質の杆長は、１　ｍ　ｇのタンバグ質の存在を示している。つまり 被包効率は約１００％、装入率は５％である。

Ｎ１４：　Ｉ３ＶＳＭ内へのエリスロマイシンの装入 水／メタ／−／Ｌ／（５０：　５０）　（７）混合物５００　ｍ　Ｑの中でＣＬ ２でアシル化された核５’Ｏｇ（重量百分率で５％）を用いて懸濁液を作る。こ の懸濁液に対し１．　Ｑ　ｇのエリスロマイシン（ｌＥｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ）　を 加え、回転式蒸発器で減圧下（４０ｔ：　、　３０ｍｍ＋　ｌ１ｇ）　ニて溶媒 を蒸発させる。完全に蒸発させた後、残留物を同じメタノール／水混合物２００ ｍＱによりとり込み、再び蒸発させる。

３回蒸発サイクルを行なった後、粉末状のリン脂質（アソレクチン）をＬｏｇ、 残留物に加える。

次に通常の方法に従って作業を進める。ｃ１８カラム上のＨＰ　Ｌ　Ｃにより上 澄み液中でエリスロマイシンを秤量し、２２８ｎｍ″ｒ！ＵＶ分光により検出す る。上澄み液中には、エリスロマイシンは見つからず、全ての物質がＢＶＳＭ内 に被包された。

従って被包効率は１００％で、装入率は２０％でパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｉ＋ ａ）は１分子量４００００ダルトン、等電点７．２の酵素である請求められてい る目標は、ＢＶＳＭ保持体上に変質無く酵素を安定した形で固定させることにあ る。

中性ＢＶＳＭ、サイズが１μｍから３μｍの多・糖類粒子を用いる。塩化ステア リン酸でアシル化されたこれらの粒子５０ｇを５００　ｍ　ｆ）、入りフラスコ 内に入れ、５ｇのペルオキシダーゼ及び５ｇのハロゲン化されたレシチンと密に 混合する。その後２５０ｍｇの精製水を少量の分画に分けて。

しかも強く撹拌しながら加える。得られた懸濁液を強い撹拌の下で３７℃に保温 し１次に超音波槽で１分間音波処理する。ＢＶＳＭを遠心分離し、被包さハてい ないペルオキシダーゼを、４０２０ｍでの光学濃度の測定により秤量する。上澄 み液中には２５０ｍｇのペルオキシダーゼが見い出される。すなわち差により、 被包率は９５％であ４酸性ＢＶＳＭ、上で用いたものと同じ多糖類粒子を用いる 。塩化ステアリン酸（０，８当量と無水コハク酸１０６２当量）の混合物により アシル化されたこれらの粒７５０　ｇを前述のとおり、５００ｍＱ入りフラスコ 内に入れ１．５ｇのペルオキシダーゼと５ｇの均質化されたレシチンと混合する 。

上述のものと同じ処理の後、懸濁液を遠心分離し、被包されていないキシダーゼ を、４０２ｎｍでの光学濃度の測定により上澄み液中で秤量する。３７５ｇつま り９２．５％の被包率が見られた。

例１６：　ＢＶＳＭの酸性多糖類核内へのペルー１１閤−ｍ−−１−■閾−−＋ ＋＋＋神御−中−−−啼−１−−―、２．−１１１、．７．．１、、、、ユ、、 ＋＋−−−騨−−−−甲−|−−即一一一瞥 オキシダーゼの装入 無水コハク酸と多糖類核の反応により、例１に従って、１０ｇの酸性多糖類核を 、調製する。核の直径は１ミクロンから３ミクロンの間で・あり、そのメツシュ は、５ｏｏｏｏダルトン未満の分子量のタンパク質がその内部に侵入できるよう 充分大きいものである。５ｇのペルオキシダーゼが存在する中で２４時間、ｐｉ （５，５の酢酸塩緩衝液１００ｍＱ中で穏やかに核を撹拌する。次に粒子を遠心 分離し、４０２ｎｍでの光学濃度を測定することにより上澄み液中でペルオキシ ダーゼを秤量する６５００ｍｇが見い出される。つまり被包効率は９０％、被包 率は４５％である０粒子を精製水で洗浄し、凍結乾燥させ１通常の条件下で塩化 ステアリン酸でアシル化する。アシル化された粒子を１ｇの水素化されたレシチ ンと混合させ、撹拌しながら少量の分画に分けて１５０ｍＱの精製水を加える。

３′７℃での３０分間の撹拌後、ＢＶＳＭの均質な懸濁液が得られる。アシル化 反応は核の周囲でしか起こらないが、この反応の途中でペルオキシダーゼの一部 分がアシル化された可能性もある。

例１７：　１３ＶＳＭ内に被包された物質の安定性の研究 この研究は、例７で記されているようなプロプラノロールが装入されたＢＶＳＭ について詳細に実施された。

プロプラノールの漏れは、プロプラノールが８．４％装入された酸性ＢＶＳＭの 懸濁液の上澄み液の２９０ｎｍでの光学濃度の測定により評価された。ＢＶｓＭ （核５００　ｍ　ｇ、プロプラノロール４２　ｍ　ｇ　）を２０ｍΩ中で懸濁状 態におく。

上澄み液を分析すると、遊離プロプラノロールが１．１６ｍｇつまり全体の４％ 存在することがわかった。

凍結乾燥及び霧状化は、脱水すべきＢＶＳＭの懸濁液内にマルトースを５％（重 量１体積）付加することにより行なわれた。

ｌ腋の４℃での保存 １ｍ（Ｂ数）０１２３４ ０−Ｄ　（光学＊ｌｌ）　０．２４１　０．４１５　０．２３４　０．２２８　 ０．２４１ｉ１プロプラノ ロールの調合（％）４　６，８　３．８　３．８　４凍ｌ（ゲル化）　前　後 ０・Ｄ　Ｏ，２４１０，２９５ 遊鳳プロプラノ ロールの割合（％）４　４．８ 凍　Ｍ　転　量　Ｒｌ Ｏ・Ｄ　Ｏ，２４１０，２４７ ＩＩプロプラノ ０−７１’ｌ！１ｌａ（％）　４　４．１雪　状　化　前　後 ０・Ｄ　Ｏ，２４０，１１ １Ｉプロプラノ ロールの１合（％）４　１．９ いずれの場合においても、漏洩率はきわめて低く、霧状化に伴い減少さえする。

２つの抗生物質すなわち例６に従ったブチロジンと例１３に従ったエリスロマイ シンの薬物動力学に対する被包の影響を評価するため、我々は。

遊離形態及び被包形態での投与の後のこれら２つの抗生物質に時間の経過に応じ ての血漿内秤量を注入は１体重約３ｋｇの「ホワイトニューシーラントノタイプ の雄ウサギに対して、皮下及び静脈内注射で行なう、採血は、−回につき２００ μＱの血液の割合で耳の側静脈レベルで行なう、血液を直ちに１５分間８０００ ｒｐｍで遠心分離する。

血清を採取して、使用時点まで４℃で保存する。

秤量方法 ブチロシンはエリスロマイシン同様、ノベシラス・℃で保温されたゲロース入り 媒質（ｂｉｏ　Ｍｅｒｉｅｕｘ）内で溶菌ゾーンの測定（寒天シリンダ方法）に より秤量される。ゲロース入り媒’１ｂｉｏ　Ｍｅｒｉｅｕｘは、ＩＱの精製水 に対して６ｇのｂｉｏ−Ｇｅ　１ｙｔｏｎｅ、３ｇの酵母エキス、１．５ｇの牛 肉エキスそして１５ｇのゲロースから成る。媒質はｐ　Ｉ＋　＝　９に調整され る。

プロトコール： 血清試料をゲロース入り媒質上に作られたウェル（立坑）の中に入れる（ウェル １本あたり３０μＱ）、抗生物質の既知の量を表わす基準溶液も同様にケース上 に置く。

ブチロシン 橿準レンジ−ｇ／ｍａｔ　Ｏ，５１２５１０２０５０１１１（ｍｍ）　１４　１ ７　１９　２２　２４　２６　２８皮下注射 注入量は、遊離形態又は被包形態のブチロシン９　ｍ　ｇを含む１　ｍ　Ｑであ る。

１ｍ　３０分　１時１ｆｌ　２１ｉ１　４０　６Ｈ１２ＲＩ　ＩＤＩａｌｌブチ ロｍｍ＋　２４　２３　２２　１８　１３　０　００シンμｇ／ｍｌ　９　７　 ５　２　０．１　０　０被＠型ブチΦｍｍ　０　０　０　１６　１６　１４　１ ５０シンメｇ／ｍ震　０　０　０　０．８　０．８　０．５　０．６［］ＶＳＭ １’）み−ｇ／ｍ１０　０　０　０　０　０　０遊離ブチロシンはきわめて急速 に血漿中に拡散し、６時間後に除去されることがわかる０反対に。

被包されたブチロシンは血液循環中にはるかに遅く（４時間）表われ、低いが有 意な率に保たれる。

静脈内注射 遊離型又は１００ｍｇのＢＶＳＭ中に被包された形の５ｍｇのブチロシンを含む 生理溶液４　ｘｎ　Ｑを注入する。この溶液は、　Ｎａｃｌ　８ｇハ、Ｋｃ１０ ．２ｍハ、（、ａＣ，ｚ　無水物０．１ｇ／ＬＭｇｃｉ２．０．１ｇ／ｌ　、Ｎ ａ、Ｈｐｏ、、３．１８ｇ／ｌ　、ＫＨ，ＰＯ４，０，２ｇ／ｌ　カラＵＲｖＩ ｉサレ、ｐＨハフ、４に調整されている。

注入は、温湯での血管拡張及び７０°でのエタノール消毒の後、耳の外静脈内に ゆっくりと行な時１ｔｌ　１／２時ａ　１ｒ１１１　２１Ｅｉ　３１Ｆ　２４時 局ｌｌＩ＠直径（ａ＠）　２４．３　２３　１９　１７　０１１ブチロ　１１　 ７　２　１　０ シン　（μｇ／蒙１） 時　！　１７２時ｉ　１時ｍ　２時間　３時ｍ　２４時ｎ＃ｉｌｉｌ（ａｍ）　 １９　１７　１７　１７　１７凍包ブチＵ シン　（μｇ／＊１）　２　１　１　１　］３Ｉｉ８ブチロシンは血漿中にきわ めて急速に拡散し、同様にきオ〕めで急速の除去されることがわかる。被包され たブチロシンは、同様にきオ〕めで急速に拡散しはじめるものの、その率はより 低く時間の経過中維持される。

従って、ブチロシンの遊離を導＜ＢＶＳＭの代謝は、皮下注入の場合より静脈内 注入の場合の方が急速であると思われる。抗生物質の遊離は両方の場合において 、ＢＶＳＭ内の被包により調節され安定化される。

エリスロマイシン 注入量は、遊離型又は被包型のエリスロマイシン１５’ｍｇを含む１ｍＱである 。溶解度を理由として、遊離エリスロマイシンは水とエタノールの混合物（８５ −１５）中に溶解させる。

！準しンジ（ｐｇ／ｍｌ）　１０　２５　１００　２５０　１０００直径（ｍｓ ）　２６　２９　３１　３３　’　３７ＩＩ　Ｉｌｌ　３１１　６１１　９０　 １２４１　２４０ｉｎ工リスφ腸ｗ、　３７　３５　２８　２７　２６ａＶイシ ：ｚ−ｇ／ｍｌ　１０００　５００　２５　！５　１０建包工リスΦａｍ　Ｏ３ ２２７２６２６２６０？イシ７Ｐｇ／ｍｌ　０　２５０　１５　１０　１０　１ ０ＢＶＳＭＩＩ）み＊ｍｉｍ　０　０　０　０　０　０Ｐじ／ｍｌｏ　ＯＯＯ’ ＯＯ エリスロマイシンは血漿中に比較的ゆっくりと拡散することがわかる。遊離型に よると、被包型よりも高い初期血漿率を達成することができる。

２４時間後、これら２つの形態の間には全く違いがみられなくなる。

１９：　ＢＶＳＭの表面に定着させられたペルオキシダーゼの酵素活性の研究 酵素活性はオルトフェニレンジアミンによる方法を用いて測定される。

作業方法： ２つの試薬溶液を調製する。

、溶液Ａ：クエン酸塩緩衝液（クエン酸／ジヒドロゲノーリン酸ナトリウム）（ ｐＨ５）中の３３％の商業用過酸化水素溶液の、ｏ、ｏｔｚ％（体積比）の過酸 化水素溶液。

、溶液Ｂ：クエン酸塩緩衝液中の０．０４％（重量／体禎）のオルトフェンレン ジアミンの溶液。

５ｍρの試験管の中に次の順序で注ぎ込むニー５００μｇのクエン酸塩緩衝液中 の対照の又は秤量すべきペルオキシダーゼ。

−５００μＱの溶液Ａ −５００μＱの溶液Ｂ 渦で撹拌する。大気温で３０分間保温し、緩衝液に対して４９２ｎｍでの光学濃 度を測定する。

標準レンジ 標準ｂｇ／ｍｌ）　０．５　Ｉ　１．５　２　２．５０．０（４９２ｎｓ＋）　 ０．１３５　０．３８０　０．４０５　０．５５０　０．６７５ＢＶＳＭに対し 固定されたペルオキシダーゼの酵素活性の秤量。

ペルオキシダーゼを含むＢＶＳＭを遠心分離し、洗浄し、水の中に再度懸濁させ る。アリコートを採取しこれをｔｏｏｏｏ倍に希釈し、このうち５００μａを採 取して酵素試験に付、す。

！ｉ　ＩＩ　ＢＶＳＭ　ｌａ　ＢＶＳＮＮＩ　ＮＺ　Ｎ３　ＡＩ　Ａ２　Ａ３ ［２１！１Ｋ　２．００　２．００　２．００　２．００　２．００　２．００ （ｊｇ／＋１） ０．０（４９：’ｗ）０．３９１　０．３８７　０．３９３　０．５５５　０． ５４２　０．５５３０、Ｄ　平　均　０．３９０　０．５５０ｉＪｉ＃１！ｌ　 量　１．２００４ｇ／＋＋＋１　２．００＃ｇ／ｍｌ活　性　％　５０　１００ 固定１１Ｊｌ／ｉ雇＃責 従って、ＢＶＳＭの表面に定着させられたペルオキシダーゼの酵素活性は、ＢＶ ＳＭの構造自体により大幅に左右されるように思われる。ペルオキシダーゼの定 着により不可避的にもたらされる反応動特性の減少を考慮に入」１４ると、酸性 ＢＶＳＭを用いて得られる結果は特に興味深いものである。

手続補正書

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. （１）−液体でない親水性核； −共有結合により核に結びつけられた脂質の第１の層又は環 −疎水性相互作用により第１の脂質層に結合された両親媒性化合物の第２の層又 は外部殻 を有することを特徴とする粒子キャリヤ。
2. （２）親水性核は網状化された親水性重合体で構成されていることを特徴とする 、請求の範囲第１項に記載のキャリヤ。
3. （３）網状化された親水性重合体は網状多糖類であることを特徴とする、請求の 範囲第２項に記載のキャリヤ。
4. （４）多糖類はデキストラン、でんぷん、セルロース及びその誘導体の中から選 ばれていることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載のキャリヤ。
5. （５）多糖類誘導体は核の体積内に均質に分布した酸性又は塩基性のイオン電荷 を有していることを特徴とする、請求の範囲第３項及び第４項のいずれか１項に 記載のキャリヤ。
6. （６）多糖類誘導体が、多糖のＯＨ因子と共有結合を形成することのできる化合 物の反応により得られ、正又は負のイオン分画をさらに有していることを特徴と する、請求の範囲第５項に記載のキャリヤ。
7. （７）化合物はコハク酸又はその誘導体であることを特徴とする、請求の範囲第 ５項及び第６項のいずれか１項に記載のキャリヤ。
8. （８）核の平均寸法が１０ｎｍと５μｍの間であることを特徴とする、請求の範 囲第１項乃至第７項のいずれか一項に記載のキャリヤ。
9. （９）核の平均寸法が２０ｎｍと７０ｎｍの間であることを特徴とする、請求の 範囲第８項に記載のキャリヤ。
10. （１０）第１の層は、スチロール、脂肪酸、脂肪性アミン、りん脂質、疎水性ア ミノ酸及びアルコキシエーテルならびにこれらの混合物の中から選ばれた化合物 で構成されていることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第９項のいれずか１ 項に記載のキャリヤ。
11. （１１）脂質層は、核のヒドロキシ官能基又はそれから誘導された官能基により 核に化学的に結合されていることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第１０項 のいずれか１項に記載のキャリヤ。
12. （１２）第２の疎うはリン脂質又は界面活性剤で構成されていることを特徴とす る、請求の範囲第１項乃至第１１項のいずれか１項に記載のキャリヤ。
13. （１３）層のうちの１つ又は核の中に生物活性をもつ１つの分子がさらに含まれ ていることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか１項に記載 のキャリヤ。
14. （１４）生物活性をもつ分子が、 −抗生物質及び抗ウイルス剤、 −タンパク質、ムコタンパク質、ペプチド、−多糖類、リポ多糖類、 −抗体 −殺虫剤及び殺真菌剤 −心臓血管系に作用する化合物 −抗ガン剤 −抗マラリヤ剤 −抗ぜん息剤 の中から選ばれていることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１３項のいずれ か１項に記載のキャリヤ。
15. （１５）キャリヤには標識付けが行なわれていることを特徴とする、請求の範囲 第１項乃至第１４項のいずれか１項に記載のキャリヤ。
16. （１６）キャリヤには放射性標識付けが行なわれていることを特徴とする、請求 の範囲第１５項に記載のキャリヤ。
17. （１７）滅菌されていることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第１６項のい ずれか１項に記載のキャリヤ。
18. （１８）凍結乾燥剤で凍結乾燥されているか又は微粒化された形をしていること を特徴とする、請求の範囲第１項乃至第１７項のいずれか１項に記載のキャリヤ 。
19. （１９）凍結乾燥剤が砂糖であることを特徴と、する、請求の範囲第１８項に記 載のキャリヤ。
20. （２０）ａ）約１０ｎｍから５μｍの粒子を得ることが可能となる条件の下で親 水性 重合体の網状化により核を調整するこ と、 ｂ）第１の層を形成するため脂質化合 物を核の表面において反応性ある官能 基上に化学的に結合させること、 ｃ）最後に、第２の層を作り上げるべ く両親媒性化合物を第１の層と疎水性 接触するよう導入すること、 を特徴とする、請求の範囲第１項乃至 第１９項のいずれか１項に記載の粒子 キャリヤの調製方法。
21. （２１）ａ）の段階において、粒子は断片化により得られることを特徴とする、 請求の範囲第２０項に記載の方法。
22. （２２）ｂ）段階は多糖類の溶媒ではない非プロトン性媒質内にて行なわれるこ とを特徴とする、請求の範囲第２０項又は第２１項に記載の方法。
23. （２３）ｃ）段階はリポゾームの調製方法を用いて実施されることを特徴とする 、請求の範囲第２０項乃至第２２項のいずれか１項に記載の方法。
24. （２４）当該プロセスの諸段階のうちの１つの間に或いは又終了したキャリヤの 中に生物活性をもつ分子を導入することを特徴とする、請求の範囲第２０項乃至 ２３項のいずれか１項に記載の方法。
25. （２５）請求の範囲第１項乃至第１９項のいずれか１項に記載のキャリヤを含む ことを特徴とする、生物活性をもつ化合物。
26. （２６）請求の範囲第１３項乃び第１４項のいずれか１項に記載の粒子キャリヤ を有効成分として含んでいることを特徴とする薬品化合物。
27. （２７）診断用製剤としての、請求の範囲第１５項及び第１６項のいずれか１項 に記載の粒子キャリヤ。