JPH04500691A

JPH04500691A - 骨疾患の治療

Info

Publication number: JPH04500691A
Application number: JP2510582A
Authority: JP
Inventors: マキンタイヤー、イアイン
Original assignee: アミリン・コーポレイション
Priority date: 1989-07-08
Filing date: 1990-07-07
Publication date: 1992-02-06
Also published as: DK0408284T3; ES2088971T3; CA2020752A1; EP0408284B1; SG46382A1; DE69026986T2; ATE137975T1; DE69026986D1; IE62625B1; GB8915712D0; EP0408284A3; CA2020752C; DK40191D0; EP0408284A2; GR3020680T3; DK40191A; WO1991000710A1; IE902494A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】骨疾患の治療発明の分野本発明は、骨疾患、特に、オステオポローシス、パジｚ７ト病、および骨番；おける悪性付着（ｄｅｐｏｓｉｔｓ）、悪性または内分泌疾患または自己免疫性関節炎疹または不動および不使用による骨消失、および低カルシウム効果（ｈｙｐｏｃａｌｃａｅ＋ｏｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）が有効である他の疾患または状態の治療にアミリンおよびアミリン作用薬を使用することに関する。

す破骨細胞（骨再吸収細胞）の作用と遺骨細胞（骨堆積細胞）の作用との間の不均衡を含む骨の過剰再吸収または再編成（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）のような骨代謝の疾患は広範囲であり、オステオポローシス、骨のパンエツト病、および家族性の突発性高ホスファターゼ血症が包含される。また、悪性腫瘍からの骨の転移はほとんどの痛症状に共通の特徴であり、激しい痛み、骨折、および高カルシウム血症を含む深刻な問題が生じている。

オステオポローシスは、ヒドロキシアパタイト（リン酸カルシウム錯体）およびタンパクマトリックス（コロイド）の両方の消失を伴う骨格の疾患である。その結果、骨が薄く弱くなり、骨折、特に、椎骨（ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）の圧迫骨折、および微小な外傷による股関節部および手首の骨折が生じやすくなる。年配の患者では、これは「老年性オステオポローシス」と呼ばれ、両性に生じる。閉経後のこの症状は「閉経後オステオポローシス」と呼ばれ、閉経後女性の約３分の１に生じる。残念ながら、定期的なレントゲン写真の検査により発見される以前に、実質的な骨消失が生じる。これらの疾患のための種々の治療が現在行なわれているが、十分に効果的なものはなく、それらの内のいくつかは著しく不利な副作用を生じさせる。オステオポローシスに時折用いられるホルモン治療薬にはアンドロゲン、エストロゲン、およびカルシトニンが包含される。

骨密度および骨物質を増大させる目的で、多くの異なる治療方法が試みられてきた。例えば、閉経後患者においては、数箇月のエストロゲン置換治療でカルシウムバランスが好転し、骨再吸収が正常に低減し得る。サラシノス（Ｔｈａｌａｓｓｉｎｏｓ）ら、Ｃｌ１ｎ、　Ｓｃｉ、　、第６２巻、第２２１〜２２６頁、１９８２年。閉経後の骨消失を防止するエストロゲンの効果は用量に関係する。そして、毎日の１５μｇの当量のエチニルエストラジオールにより閉経における血管運動症状が防止され得、毎日１５〜２５μｇの服用により骨消失の防止が期待され、そして、毎日の２５μｇ以上により骨密度の実質的な増大が得られる。（ホースマン（Ｈｏｒｓｍａｎ）ら、「閉経後前消失におけるエストロゲン服用の効果（Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｄｏｓｅ　ｏｎ　ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ　ｂｏｎｅ　１ｏｓｓ）Ｊ、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、第３０９巻、第１４０５〜１４０７頁、１９８３年。カルシウムバランスおよび骨密度に対するエストロゲンの良好な効果は、治療を中断した場合には急速に逆転する。アロイア（Ａｌｏｉａ）ら、「閉経後オステオポローシスにおける危険要因（Ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ　ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、１、Ａ＋＋＋、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、第７８巻、第９５〜１００頁、１９８５年。閉経後の女性には慢性的なエストロゲン置換療法が推奨されるようになり、そのことによりオステオポローシス骨折の頻度が低減され得る。胸骨癌の罹病率の増大という当初の懸念は現在は薄れたけれども、子宮内膜肥厚および子宮癌の危険性の増大がしばしば言及されている。

マルチンデール（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ）、Ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａ　Ｐｈａｒａｍａｃｏｐｉａ、ジエームズＥ、Ｆ、レイノルド（Ｊａｍｅｓ　Ｅ、　Ｆ、Ｒｅｙｎｏｌｄ）編、第１３８６頁（ロンドン、薬学出版（Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年。オステオポローシスは多くの場合女性に生じるので、アンドロゲンを作製する肝機能に対する不利な効果の他に男性化副作用も治療の望ましくない形態である。一部の国では、サーモン（ｓａｌｍｏｎ）カルシトニン、またはエルカトニン（Ｅ１ｃａｔｏｎｉｎＸイール（ｅｅｌ）カルシトニンの合成変異体（ｖａｒｉａｎｔ））の注射または鼻腔噴霧がオステオポローシス患者に広く用いられているけれども、その有効性は世界的に認められているわけではない。例えば、タガルト、Ｈ，Ｍ、（Ｔａｇｇａｒｔ。

Ｈ，Ｍ、）ら、Ｌａｎｃｅｔ、第１巻、第４７５頁、１９８２年；チーゲス、Ｒ −Ｄ。

（Ｔｉｅｇｓ、　Ｒ，Ｄ、）ら、ニューイングランドジャーナルオブメジシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３１２１！、第１０９７頁、１９８５年。

カルシトニン治療に対応する閉経後の老年性オステオポローシスの１つの局面は骨の痛みである。その有効性に対する疑問の他に、カルシトニン治療に伴う問題点には、悪心、刺痛、発熱（Ｈｕｓｈｉｎｇ）、胃腸障害、および味覚障害が包含される。マルチンデール、第１３３９頁、前出。さらに、抗体の形成が生じる。オステオポローシスの他の治療には、カルシウム補助薬、ビタミンＤ１およびディスホスホネート（ｄｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）がしばしば用いられる。しかしながら、これまでのところは、定着した（ｅｓｔａｂｌ　１ｓｈｅｄ）オステオポローシスにおけるそれらの有効性が確実に認められているわけではない。近年では、バグエツト病の治療薬としてサーモン力ルシトニンが選択されている。オックス７才一ドテキストブックオブメジシン（ＯｘｆｏｒｄＴｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ウユザーロール（Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ）編、レゾインガム（Ｌｅｄｉｎｇｈａｍ）＆ワレル（Ｗａｒｒｅｌｌ）、第１７．２２頁（オックスフォードメディカルパブリケーシｄンズ）（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、第２版、１９８７年）。また、サーモン力ルシトニンは骨転移に有効性を示す（スザントＪ、（Ｓｚａｎｔｏ　Ｊ、）およびサンドルＪ、（Ｓａｎｄｏｒ　Ｊ、）、Ｃ１１ｎｉｃａ１Ｔｒｉａｌｓ　Ｊ、、第２０巻、第２６６頁、１９８３年）。しかしながら、この骨または中枢神経系に対する作用はいまだ確実ではない。マツキンダイア１．（Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ　１．）、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、第４２巻、第３４３頁、１９８６年。種々の原因による高カルシウム性エピソード（ｅ柘５ｏｄｅｓ）には、カルシトニンの静脈内または筋肉内注射が有効な治療であり得る。しかしながら、その効果は、おそらくはレセプターのダウレンレギュレーシＢンのために、効果が比較的短時間である（オックスフォードテキストブックオブメジシン、第１０．６８頁、前出）。

しｔ；がって、骨およびカルシウム代謝の疾患には、それぞれ治療においてその有効性および／または副作用の点で重大な問題点が存在すると考えられる。

１９８７年、４月２７日に出願された英国特許出願第８７０９８７１号には、以下に示す配列の新規ペプチドが記載されている。

Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ− Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ｈ１ｓ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１次構造において２位および７位のシスティン残基の間Ｃ；ジスルフィドブリッジを有する未編成分子が、３′末端でアミド化され、プロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔ　１ｄｅ）が形成されている。完全な生物学的活性のためには、これらの両方の翻訳後修飾が必要である。アミリンと名付けられたこのペプチドは、最初は、第２型糖尿病患者のすし１臓番；含まれるアミロイド沈渣（ｄｅｐｏｓｉｔｓ）から単離された。クーノ＜−（ｃｏｏｐｅｒ）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｕ、　Ｓ。

Ａ、、第８４１１、第８６２８頁、１９８７年。このペプチドにつし〜て１１、肝臓のグルコース排出機能の強化、骨格筋由来のラクテートの産生の増大、および骨格筋中のインシュリンの作用を低減させること、のような新規な生物学的な効果が見出された。例えば、クーパーら、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、第１０１４巻、第２４７頁、１９８９年を参照のこと。アミリンは、例えば、２種類の食物基質のようなグルコースおよびアミノ酸による刺激に対応して、すい臓中のランゲルハンス小島のβ細胞から分泌される。アミリンはインシュリンのパートナ−同化ホルモン（ｐａｒｔｎｅｒ　ａｎａｂｏｌｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ）と言われており、その役割には、食物を炭水化物および脂肪として蓄積および放出することが含まる。

構造的には、および遺伝子レベルでは、アミリンはペプチドホルモンの特徴を有しくクーパーら、同書）、神経伝達物質、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＯＲＰ）およびホルモンカルシトニンに対シテ相同性を有する。クーパーら、同書；データＵ、に、（Ｄａｔａ　Ｈ，Ｋ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、第１６２巻、第８７６頁、１９８９年。

本発明は、構造的な相同性に加えて、アミリンがカルシトニンとある種の生物学的な効果を分担し、骨疾患および高カルシウム血症の治療に有用な破骨細胞および骨の他の局面に対する作用を有することを測定することから出発した。マッキンタイア、１．、Ｌａｎｃｅｔ１１９８９年、１０３２８日、第１０２６頁。アミリンと骨とカルシウム代謝との間の関連は未だに示唆されておらず、食物基質に応答するすい臓ホルモンと破骨細胞による骨再吸収の調節との間の関連は予測されておらず、実際には、アミリンは血漿カルシウム（ｐｌａｓｍａ　ｃａｌｃｉｕｍ）の制御に用い得る。

発明の要旨本発明は、アミリン、またはアミリン変異体、ならびにアミリン作用薬を、骨疾患、特に、オステオポローシス、パジェット病、オよび骨の悪性付着、悪性または内分泌疾患または自己免疫性関節炎疹または不動および不使用による骨消失、および、低カルシウム効果が有効である他の状態に用いることを包含する。アミリン、またはアミリンの機能性ペプチド７ラグメント、またはアミリンもしくはアミリンフラグメントの変異体は、骨またはカルシウムバランスの疾患の治療のために、可溶性アミリン、アミリンフラグメント、またはそれらの変異体、まＩ；は凍結乾燥製薬、または経口処方として、単独で、または、インシュリン（またはインシュリン刺激薬（例えば、スルホニル尿素が包含されるがこれに限定されない））およびエストロゲンのような他の薬薬と組み合わせて提供される。それらの調製法は知られている。

発明の詳細な説明本明細書には、本発明を形成する構成が明確に主張されている請求項を有するけれども、図面を伴う以下の説明により本発明をより理解することが可能である。

第１図に、５００ｐｍｏｌの、脱アミド化アミリン（ＤＡＸペニンスラ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）、アミリン（Ａ）、ａｓｕ　’　−’−イールカルシトニン（ＣＴＸ［ＳＦ）、またはヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドσ（ＣＧＲＰＸサンドズ（Ｓａｎｄｏｚ））、またはビヒクルを、５０ｇオスウィスターラット（Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔｓ）に静脈内注射しｔ；場合の血漿カルシウムレベルにおける効果を示す（グループ当にりｎ・６）（スチューデントを検定による統計値＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；略語：　Ｃａｎ一対照）０第２図に、アミリン（バケム（Ｂａｃｈｅｍ）Ｘ５００ｐｍｏｌ　ｗｉｎ−リオープンサークル（Ｏｐｅｎ　ｃｉｒｃｌｅｓ）Ｘｎ＝　５　）、またはビヒクル（クローズドスクエア（ｃｌｏｓｅｄ　ｓｇｕａｒｅｓ）Ｘｎ＝　４　）を成体ラビット（ｒａｂｂｉｔｓ）に連続注入した場合の血漿カルシウムレベルにおける効果を示す（スチューデントを検定による統計値、＊＊ｐ＜０．０１）。

第３図に、脱アミド化アミリン（ペニンスラ）（オープンスクエア）、ａｓｕ　 ’　−’−イールカルシトニン（クローズドスクエア）（ＩＳＦ）、まｔ；はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドａ（サンドズ）（オープンサークルＸｎｇｌ一つの、骨切片当りの破骨細胞再吸収の全領域に°おける効果を示す、Ｌｏｇ、。投与一応答曲線を示す（対照再吸収に対する〕（−セントとして表わす）。

アミリンは新たに発見された３７アミノ酸ポリペプチドであり、クーパーら、１９８８年、前出、により第１Ｉ型糖尿病患者から得られるすい臓小島中のアミロイド沈渣から単離精製された。アミリン遺伝子は染色体１２上に位置しており、カルシトニンペプチド科（ｆａｍｉｌｙ）の遺伝子と共に共通の祖先遺伝子を分担（ｓｈａｒｅ）　Ｌ／得ると報告されている。また、アミリンのアミノ酸配列は、カルシトニン産生ペプチド（ＣＧＲＰ）、σカルシトニン遺伝子の代替スプライス（ｓｐｌ　１ｃｅ）産物、およびカルシトニンと構造的な相同性を示す。

ＣＧＲＰが、カルシトニンの弱い作用薬として機能することが示されている。それは破骨細胞骨再吸収を抑制しくザイジ、Ｍ、（Ｚａｉｄｉ、　Ｍ、）ら、Ｑｕａｒｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、第７３巻、第４７１〜４８５頁、１９８８年）、およびカルシトニンの投与と比較して１００〜１００倍の高モル濃度で血漿カルシウムを低減させる。アミリンは以前から糖尿病関連ペプチドと呼ばれており、第２型糖尿病の進行に関連することが示唆されている。ライドン、Ｂ、（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｂ、）、クーパー、Ｇ、Ｊ、Ｓ、（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｇ、　Ｊ、　Ｓ、）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅｓ第３３５巻、第６３２〜６３５頁、１９８８年；クーパーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、第８５巻、第７７６３〜７７６６頁、１９８８年。したがって、このポリペプチドの炭水化物代謝における効果、およびインシュリン耐性の進行におけるその役割は精力的な研究の中心となっている。

２種の異なる方法により、ラットおよびラビットについてカルシウム代謝におけるアミリンおよび脱アミド化アミリンの効果を研究した。まず、５０ｇのラットにペプチドを注入した後の血漿カルシウムレベル（ｐｌａｓｍａ　ｃａｌｃｉｕｍ　１ｅｖｅｌ）を測定することにより、インビーポ低カルシウム作用を評価した。ついで、分離されたラット破骨細胞による皮質骨（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｂｏｎｅ）のインビーポ再吸収を、イメージ分析と共に電子ａ微鏡で走査することにより定量した。このことにより、アミリンおよび脱アミド化アミリンがカルシトニン類似の効果を有することが示された。両方とも破骨細胞再吸収の抑制剤であり、ラットおよびラビットの両方について血漿カルシウムを低減させる。インービーポラット低カルシウムアッセイおよびインビトロ骨再吸収系を用いるアミリンおよび脱アミド化アミリン両方の生物学的活性を示す実験を以下に記載する。

さらに、アミリンをラビットに大量注入投与した場合の血漿カルシウムレベルにおける効果全説明する。

ラットおよびラビットにおいて、アミリンおよび脱アミド化アミリンの両方が低カルシウム効果を有することは現在示されている。

また、両ペプチドは、分離ラット破骨細胞による骨再吸収を抑制する。アミリンがカルシトニンレセプタと相互作用する可能性は非常に大きい。アミリンおよび脱アミド化アミリンにより観察される応答はカルシトニンによる応答を下回り、しかしながらＣＧＲＰにより観察されるものを著しく上回る。低カルシウム作用および抗再吸収作用が低減される順序については、このペプチドは以下のように示される。ａ　ｓ　ｕ　Ｌ　ｌ−１ゝ−イールＣＴ＞ヒトＣＴ＞アミリン／アミリンアミド＞ＣＧＲＰ。

ＣＧＲＰおよびカルシトニンの両方については、インビーボ生物学的活性のｔ；めにはＣ末端の存在が必要とされる（プレイマー、Ｌ、Ｈ，（Ｂｒｅｉｍｅｒ、　Ｌ、　Ｈ，）、ザイジ１Ｍ０、マツキンタイア、■、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、第２５５巻、第３７７〜３９０頁、１９８８年）。しかしながら、アミリンは、骨におけるインビーポまたはインビトロ作用のためにアミド化を必要としない。

また、脱アミド化ペプチドは骨格筋グリコーゲンに取り込まれるグルコースを著しく低減させる活性を有する。ライドン、Ｂ１、クーパー、Ｇ、Ｊ、Ｓ、、Ｎａｔｕｒｅｓ第３３５巻、第６３２−６３５頁、１９８８年；クーパー、Ｇ。

Ｊ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、、第８５巻、＠７７６３−７７６６頁、１９８８年。脱アミド化アミリンは鯛内皮のＣＧＲＰ一応答性アデニレートサイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）を刺激しない。マクエバン、　Ｊ　、　（ＭｃＥｗａｎ　。

Ｊ、）ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第７４巻、第１２４３〜１２４７頁、１９８６年。ラビットにおける注入実験の結果、アミリンが、おそらくは破骨細胞カルシトニンレセプターにおける作用による低カルシウム効果が示唆される。Ｃ０ＲＰはラビットにおいて、少量投与で低カルシウム性である。

しかしながら、より大量投与では、ラビットおよびチック（ｃｈ　１ｃｋ）において副甲状腺ホルモン類似の高カルシウム効果をも示す。チッピンス、Ｊ、Ｒ，（Ｔｉｐｐｉｎｓ、　Ｊ、　Ｒ，）ら、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔ　１ｄｅｓ、第４巻、第４２５〜４３４頁、１９８７年。

少なくとも３種類のレセプター（破骨細胞カルシトニンレセプター、血管Ｃ０ＲＰレセプター、および筋肉中のアミリンレセプター）と相互作用する異なる効能および効力により、アミリン、カルシトニン、およびＣ０ＲＰの作用が達成される。アミリンは、健康状態および糖尿病における炭水化物代謝に中心的な役割を果たすけれども、カルシウムおよび骨代謝におけるアミリンの影響はこの場で確立される。

上述の観点より、本発明は、破骨細胞の作用を抑制する効果および／または低カルシウム効果が有効である病気の治療にアミリンおよびアミリン作用薬を用いることを提供する。特に、このような疾患には、例えば、オステオポローシス、およびパジェット病が包含される。アミリンは、インシュリンと共に共分泌され、そして両ホルモンの血漿レベルの低減により特定の生理的および病理的状態（例えば、飢餓、第１型糖尿病）が生じるので、特定の環境下において優れた治療結果を得るためにはインシュリン（まｌ；はインシュリン刺激薬）およびアミリンの両方を投与することがより効果的である。

さらに、アミリンはインシュリン耐性を引き起こし得ることが示唆されている（クーパーら、　１９８９年、前出）ので、アミリンと共にインシュリンを投与することにより、糖尿病または前糖床状態となる危険性が低減されると期待される。さらに、インシュリンについて知られているタンパク節約作用および同化作用の観点から言えば、インシュリンとアミリンとの組み合わせは上述の疾患において骨組織の有機およびミネラル成分の回復に特に効果的である。すい臓および血漿におけるアミリンに対するインシュリンの割合から、インシュリンとアミリンとの用量は、約１．：１０〜約１００：１の範囲が期待される。

本発明の好ましい局面では、骨またはカルシウム疾患の治療に用いられる組成物は、アミリンまたは機能性フラグメントまたは変異体（欧州特詐出願第８８３０３８０３．６、公報（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第０２８９２８７号；欧州特許出願第８８３０７９２７．９号、公報第０３０９１００号を参照のこと）を含有し、それらは、注入、鼻内、または、ペプチドもしくはペプチド誘導構造の経口生物学的利用能を高めるために当該技術分野で知られている経口処方により投与される。本発明の生成物は、親投与もしくは鼻腔投与のための溶液形態、または経口投与のためのカプセルもしくはサスペンションの形態で処方され得る。アミリン、アミリンフラグメント、もしくは変異体を単独で、または、例えば、骨およびカルシウム疾患の治療に部分的ｌこ効果的な上述の他の薬薬（これらに限定されない）と組み合わせた処方で提供することが好適な場合がある。用量は１日当たり０．Ｏｂｏｇ〜１０軸ｇの範囲内であることが期待され、好ましい養生法はそれぞれの患者の状態（緩和症状、例えば、痛み；生化学的指標、例えば、血漿カルシウム、または骨の密度およびモデリング（ｍｏｄｅｌ　ｉｎｇ）のＸ線もしくは他の測定）に基づいて定められる。また、低アミリン血症（ｈｙｐｏａｍｙｌ　ｉｎｅｍｉａ）に関連する疾患の治療および監視に加えて、放射性免疫アッセイもしくは他の感受性アッセイによる血漿アミリンの監視が行なわれる。

アミリン、アミリンフラグメントまたは変異体の調製は、当該技術分野で知られた方法であるポリペプチド化学合成（ダックら、前出）、まＩ；は、例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ、イースト、バキュロウィルス発現ベクター、まｔ：はチャイニーズハムスター卵巣細胞における組み換え発酵技術、または、組み換え発酵および化学もしくは酵素改変の組み合わせを含む当該技術分野で知られた方法により行なわれる。

本発明はここで説明され、請求されＩ；事項に関するけれども、興味深い付加的な説明および背景を以下に示す。アミリンとインシュリンとでは不十分（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）である第１型糖尿病（例えば、プラゲル（Ｐｒａｇｅｒ）ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　１９９０年、第３９巻、第１１６Ａ頁）は、「オステオベニア（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）Ｊと関連する（マツキンタイア！９、Ｌａｎｃｅｔ、１９８９年、前出ＨＭｏ１ｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ。

第１１＋巻、アランＲ，リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）、ニューヨーク、１９８９年、第１２３頁）、さらに、閉経後第２型糖泳病女性では、骨消失が生じる割合は対照患者の約半分でしかない（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＤｉａｂｅｔｅＳｓ第１１１巻、同書、第１１８頁）ので、アミリン過剰は第２型糖塚病の原因病理（ｅｔｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の主要な構成要因と考えられる（クーパーら、１９８９年、同書）。したがって、アミリン欠乏またはアミリン過剰の状態においては、それぞれ、オステオポローシス状態まｔ；はオステオポローシスからの防護が生じ、本発明の基本精神に関連して裏付けとなり得る。

未成熟（ｙｏｕｎｇ）ウィスターラットまたは成体（ａｄｕｌｔ）ラビットにアミリンを注入することにより、血漿カルシウムレベルは、それぞれ、２．５ｎＭから２．０５ｎＭ、および２，８から２．４ｎＭに低減された。（ダックら、１９８９年、前出）、第１図を参照のこと。また、アミリンは、ラットの破骨細胞を単離しヒト表層骨の切片上に付着させた系にお（Ｘて、用量に依存して骨の破骨細胞再吸収を低減させた（ダックら、１９８９年、同書）、第２図を参照のこと。さらに、４人の人間のパジェット病患者にアミリンを１５０ｐｍｏｌ／Ｋｇ／ｌｌ１ｉｎで１時間静脈内注入したところ、血漿カルシウムが０．０５〜００ −３７ｎの範囲の量で低減された。

細胞内第２伝達経路および単離破骨細胞の詳細な機能的応答の研究により、アミリンとカルシトニンとの細胞作用の違いが明らかにされた。アミリンはカルシトニンと同様に破骨細胞の運動性（ｍｏｔ　ｉｌ　１ｔｙ）を抑制する。しかしながら、カルシトニンが細胞質ゾルカルシウムを隆起させ、細胞退縮を引き起こすのに対し、アミリンはこのような反応を誘発させない（マツキンタイアおよびザイジ、未発表結果）。したがって、破骨細胞の作用は２種のレセプタータイプによって制限されると考えられる。カルシトニンは両方に作用し、アミリンは主に片方にのみ作用し、運動性を低減させ、再吸収を低減させ、そしておそらく第２メツセンジヤーｃＡＭＰによって作用する（ザイジら、１９９０年、Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１２６巻、印刷中）。

アミリンは、ラット破骨細胞の研究においてはヒトカルシトニンよりも１０〜３０倍効能が弱い（すなわち、より高い濃度で活性である）けれども、パジェット病の人間の患者における研究ではヒトカルシトニンと同様の効能を示した。破骨細胞におけるアミリンおよびカルシトニンの作用の異なるプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）、および他の組織におけるアミリンの同化作用により、上で概説した種々の骨疾患（特に、アミリンの欠乏が予想される老年性薄化の問題）の治療において、カルシトニンと比較してアミリンに適するプロファイルが提供される。

何故なら、アミリンは食物基質により刺激され、そしてそのような患者は、しばしば、乏しいもしくは過剰の食物を摂取し、そしてアミリンの過剰は肥満と関連するからである。プラゲルら、１９９０年、前出。

実施例１アミリンの合成および精製：ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）化学を用いて、アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）（モデル４３０Ａ）ペプチド合成装置によりアミリンの固相合成を行った。

合成は、４倍モル過剰のあらかじめ形成されＩ；保護アミン嫌の対称ンおよびアスパラギン残基を、それぞれ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で２重連結させた（ｄｏｕｂｌｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ）。このＢＯＣ基はすべてのアミノ酸について保護を与えた。すべての側鎖保護基はトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡＸ例えば、アルギニンに対するメシチレン−２−スルホン、システィンに対するＭｏｂ、アスパラギン酸に対するベンジルエーテル、セリンに対するグルタミン酸ベンジルエーテル、およびヒスチジンに対するスレオニンおよびＴｏｓ）に対して反応性であった。合成の最終段階に、この保護ペプチド樹脂をＴＦＭＳＡで清澄化し、逆相高性能液体クロマトグラフィーを用いて精製した。この合成物アミリン−アミドのアミン際配列を気相配列決定法により確認した。

実施例２動物実験：５０ｇオスウィスターラット（平均重量±ＳＥＭ、　５１±１−２ｇ５チヤールズリバース（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ）、マルゲート（Ｍａｒｇａｔｅ）、ケント（Ｋｅｎｔ））を、不断給水しながら一晩絶食させ実験に用いた。ラットのグループ（グループ当たりｎ＝６）に、ビヒクル、またはそれぞれ５００ｐｍｏｌの、アミリン、脱アミド化アミリン（バケムファルマスユーテイカル社（Ｂａｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｌｔｄ））、ａｓｕｌｌ−フィールカルシトニン（ＣＴ）、またはヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドａ　（ＣＯＲＰ）を注入した。注入の後で、この動物を、軽いエーテル麻酔のもとに背部大動脈によりヘパリン化シリンジ中に出血させた。他のセットにおいて（ジャンセンＱａｎｓｓｅｎ）、デンマーク）。側面耳静脈に挿入された１２Ｇ注射針により、それらに塩水またはアミリンアミド（５００ｐｍｏｌ　ｗｉｎ−１）を９０分間注入した。この注射針をポリエチレンカニユーレを通してポンプに連結した（ポルテックス（Ｐｏｒｔｅｘ）、　００、ハイチ（ｌｙｔｈｅ）、ケント）。注入が開始される前および後に、あらかじめ決められた時間で血液の試料を採取した。血漿を分離し、ＤＣ血漿発光スペクトロホトメトリーによりカルシウムレベルを測定した。

血漿カルシウムにおける影響：静脈内注入後の５０ｇラットについて、アミリンおよび脱アミド化アミリンの両方は顕著な低カルシウム血症を生じさせた。相対的な効能をそれらの近最大効果（ｎｅａｒ−＋ａａｘｉｍｕｍ　ｅｆｆｅｃｔ）から推論することはできないけれども、第１図に示す結果により、この反応はカルシトニンおよびＣＧＲＰにより生じる反応と同様であることが示唆される。第２図に示すように、ラビットに毎分５００ｐｍｏｌで９０分にわたってアミリンを注入することにより、血漿カルシウムの著しい低減が生じ、この傾向は３０分以内で明確であった。このカルシウムレベルは、注入の終点の後３ｏ分間低く保たれた（第２図）。

実施例３骨再吸収アッセイ：ヒト表層骨切片を上述のように調製した（ザイジら、Ｑｕａｒｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、第７３巻、第７７１頁、１９８８年）。

この切片をそれぞれ約３ｍｍ２の小片に切り分けた。新生ウィスターラットを断頭して殺し、大腿および脛骨を除去した。この骨から粘着性の柔らかい組織（ａｄｈｅｒｅｎｔ　５ｏｆｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ）を除去し、胎児子ウシ血清（Ｆｅ２．１０％、Ｖ／Ｖ）および抗生物質（フローラボラトリーズ、ＵＫ社（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＵＫ、　Ｌｔｄ、））を含む媒体１９９中で前端と垂直に切断した。それぞれのラットの骨を掻爬することにより破骨細胞を機械的に分離し、１０秒間放置し、その後、ステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）１００１８ａ＋＋ａマルチウエルデイツシユのウェル中に置いた３０〜３５個の骨切片上に、上澄を滴下した。インキューベーション（３７℃：　１５分）の後、骨切片を除去し、ＦＣＳ（１０％、ｖ／ｖ）を含む最小必須媒体（ＭＥＭ／ＦＣ３）で穏やかに洗浄し、そして分離ウェル中に置いた（それぞれのウェルは５〜６個の切片と９００μｌのＭＥＭ／ＦＣＳを有する）。１種または２種の破骨細胞のホモジニアスサンペンジョン（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）がそれぞれの実験に用いられた。２種のサンペンションを用いた場合は、実験を２ブロツクに分け、それぞれに全治療薬および１種のサンペンションを含有させた。追加のインキューベーンヨン（３７℃、１０％含湿Ｃ０２，１０分）の後、評価物質を含むＭＥＭ／ＦＣＳ　１００μｌを添加した。最後に骨切片を一晩インキユーベートしく３７℃、１０％含湿Ｃｏ８．１８時間）細胞数および骨再吸収を定量した。グルタルアルデヒド中で固定化した後、細胞をトルイジンブルーで染色し、透過光顕微鏡により試験した。毒性効果を排除するｔ；めに、破骨細胞をすべての変化（ｅｖｅｒｙ　ｖａｒｉａｂｌｅ）およびそれらの数について３個の切片でカウントし、ついで、ホルモン処理対照骨切片と比較した。この切片を、次亜塩素酸ナトリウム溶液（１０％ｖ／ｖ）に３０分浸すことにより漂白し、水性エタノール（８０％Ｖ／Ｖ）中で脱水しｔ；。次いで、この切片を金でスパッタ被覆し、無作為化し、キャンプリッジ３６０走査電子顕微鏡（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　３６０　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（キャンプリツジインスツルメント（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、キャンプリッジシア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ））で試験した。非再吸収骨の領域内の連続境界によりそれぞれ決定された破骨細胞窩をカウントした。陥凹の外形をイメージプロセッサー（サイトシステムズ（Ｓｉｇｈｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ニューブリイ（Ｎｅｗｂｕｒｙ）、バークス（Ｂｅｒｋｓ））にトレースすることにより再吸収された骨表面の面積を計算した。

第３図に示すように、アミリンおよび脱アミド化アミリンは単離された破骨細胞による骨再吸収の全領域を細胞の生存率に影響を与えることなく著しく低減させるので、破骨細胞における作用。この効果は濃度依存性であり、カルシトニンおよびＣ０ＲＰにより引き起こされる効果と同様である。しかしながら、このペプチドを同一のアッセイですべて比較したわけではないので、正確な効能の割合は得られていない。しかしながら、アミリンおよび脱アミド化アミリンが著しく異なることはない。この両者は、はぼオーダーの程度（ｏｒｄｅｒｏｆ　ｍａｇｎｅｔｕｄｅ）でヒトカルシトニンよりも効能が小さい（マツキンタイア、Ｌａｎｃｅｔ、　１９８９年、前出）が、Ｃ０ＲＰよりも効能が大きい。

第１図アミリフ　（５００ｐｍｏｌ／ｍ１ｎ）時　間（分）Ｋ　Ｏ１２３４５６対数濃度ｈｋ　−１摩オ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．骨組織の過剰再吸収または再編成に関連する骨の疾患の治療方法であって、治療に効果的な量のアミリンまたはアミリン作用薬を薬学的に許容可能なキャリアと共に投与することを包含する治療方法。
２．前記骨疾患が、オステオボローシス、バジェット病、および、悪性、内分泌疾患、自己免疫性関節炎疹、切断および骨折、および不動および不使用による骨消失、からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
３．インシュリンの投与をさらに包含する、請求項１記載の方法。
４．インシュリンの投与をさらに包含する、請求項２記載の方法。
５．前記アミリンまたはアミリン作用薬が実質的に純粋である、請求項１記載の方法。
６．治療に効果的な量のアミリンまたはアミリン作用薬を薬学的に許容可能なキャリアと共に投与することを包含する、高カルシウム血症の治療方法。
７．請求項１記載のいずれかの治療を受けている患者の血液、血清、血漿または尿に含まれるアミリンのレベルを測定することを包含する、患者監視方法。
８．前記骨疾患患者またはその疑いがある患者の血液、血清、血漿または尿に含まれるアミリンのレベルを測定することを包含する、相対的または絶対的低アミリン血症に関連する骨疾患の進行の監視方法。該方法は、置換量のアミリンまたは治療に効果的な量のアミリンまたはアミリン作用薬を薬学的に許容可能なキャリアと共に投与することを包含する。