JPH04500730A - 検出可能な粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 舷Ｗ 本発明は、特定の結合アッセイ、特に免疫定量法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）な どの分析結果を示す検出可能なシグナルを供与し得る、例えば、ラベルとして有 用な水不溶性の検出可能な粒子に関する０本発明は特に蛍光性であるような粒子 に関する。

蛍光性物質は、アッセイ用ラベルとして既に使用されてきた。従来の発蛍光団（ ｆ　Ｉｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ　）は、紫外光によって励起され、可視光を放射す る。予想外にも、アッセイが適用されるべき体液などの天然材料は、ＵＶ光を吸 収し発蛍光団として作用する多くの成分を含み、しかもこのような「自己蛍光体 （ｔｕｔｏｒ　１ｕｏｒｅｓｃｅｏｅｅ）Ｊは、不都合なバックグラウンドシグ ナルを発生し、アッセイの感度を下げる。この問題を避ゆしために、所謂ｒレー ザー染料」を蛍光ラベルとして使用することが例えば５ｏｉｎｉ及びＢｅ鶴−１ ｌａ、Ｃｌ１ｎ。

び［ｌｅ＋ｍｍ１ｌａによると、蛍光体プローブ（ｐｒｏｂｅ）の一般令件は、 放射波長が５００〜７００ｎｍであること、及び５Ｌｏｋｅｓシフトが５０ａｍ 、好ましくは１００ｎ−以上であることである。彼らが記載する免疫定量システ ムでは、プローブも水に非常に溶解性でなければならない。

本出願人の英国特許出願公開第２２０４３９８Ａ号に於いて、粒子状ラベルを使 用する免疫クロマトグラフ装置について記載している。ニトロセルロースなどの 多孔質Ｉ担体物質上の検出領域内に粒子状ラベルが集中すると、アッセイ結果を 検出し得る。英国特許出願公開第２２０４３９８八号で使用された粒子状ラベル は好ましくは「直接ラベル（ｄｉｒｅｃｔ　１ａｂｅｌｓ）ｊ、即ち十分な濃度 で存在すると、肉眼で検出可能な着色ラテックスの微小球、または染料ゾル粒子 などの着色粒子である。このような着色された直接ラベルを免疫クロマトグラフ 分析で使用すると、ユーザーは定性または半一定量結果を容易に観測できる。し かしながら直接ラベルは、高悪度の定量的なアッセイ結果が必要な場合には不適 当である。

一実施態様に於いて、本発明は、本質的に粒子表面にはなく、その粒子中に閉じ 込められた（　ｅｎｔｒａｐｐｅｄ　）発蛍光団を含む水不溶性の固体粒子を提 供する。

より好適な実施態様は、本質的に粒子表面になく、その中に閉じ込められた水不 溶性の発蛍光団を含むラテックス粒子である。

もう１つの実施態様は、発蛍光団を（溶液中またはゾルとして）本質的に有さな い蒸留水または水性緩衝液などの水性媒体中に、この直前の２つの段落のいずれ がで定義したような１個以上の粒子を含む試薬液である。

もう１つの実施Ｂ様は、粒子表面が特定の結合反応に関係し得る材料（例えば抗 原材料、ハプテン、抗体及びレクチンなど）で感作されたような粒子を含む、こ のような感作された粒子は水性媒体中にあってもよいし、または乾燥形態（例え ば、吸湿性の担体材料を含む乾燥した試験ストリップなどの試験装置上の乾燥さ れた、潜在的に可動性のラベルされた試薬）であり得る。

発蛍光団の光学的な特性はその化学的な環境によって影響され得るが、粒子内に 発蛍光団を包括してしまうことによりそのような４外の影響を最小にし得、且つ より一貫性のある信頼性のある放射シグナルを観測し得る０粒子表面には本質的 に存在しないが、発蛍光団を粒子内に確実に閉じ込めることによって光学的特性 が受ける外部影響の危険性がさらに減少し、且つ更に発蛍光団が粒子からその周 囲内へ浸出して蛍光感度を損失する危険性を下げ得る０発蛍光団が粒子表面にあ ると表面の有効な結合部位をブロックしてしまい、また、免疫定量中に粒子を使 用する間に発蛍光団が浸出すると例えばアッセイ中にさらに結合部位な露出し、 不都合な変化が生じてしまう。

本発明は、水性懸濁液として予め形成された粒子と、粒子材料を湿潤させ得る非 水性溶媒中の水不溶性の発蛍光団の溶液とを、粒子が発蛍光団を吸収するのに十 分な時間接触させ、非水性溶媒と水性懸濁液より除去し、粒子に浸透洗浄する、 発蛍光団を含有する粒子の製造方法を提供する。

特に、本発明は水性分散液として予め形成されたラテックス粒子と、ラテックス 粒子を湿潤させ得る水と混和しない溶媒中の水に不溶の発蛍光団溶液とを、粒子 が発蛍光団を吸収するのに十分な時間接触させ、溶媒を水性分散液から除去し、 ラテックスに浸透せずに発蛍光団を溶解し得る液体中で粒子を（必要により何回 も）洗浄する、発蛍光団を含有するラテックス粒子の製造方法な提供する。

粒子な洗浄して表面の発蛍光団と除去する操作は、好ましくは発蛍光団のレベル が検出限界以下に下がるまで、即ち洗浄液中に発蛍光団が本質的に全熱観測され 得なくなるまで継続されるべきである。

水と混和しない溶媒として、クロロホルムが好ましいが、ジクロロメタン、キシ レン、トルエン及びベンゼンも使用し得る。

洗浄液は、好ましくはアルコール／水の混合物である。

アルコール対水の割合は発蛍光団の相対溶解度に間して選択され得る。純粋なア ルコール（例えば、エタノールなど）は、ラテックスに浸透してしまうので使用 されるべきではない、エタノール対水の１：１の混合物が通常理想的である。

表面の発蛍光団と洗浄除去した後は、粒子は有機溶媒を含まない水性分散液の形 悠で簡便に貯蔵される。

好適に洗浄した後、粒子は一定の蛍光量（［１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔｙｉｅｌｄ） を示す、蛍光Ｉは標準の蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆ　Ｉｕｏｒ。

−ｍｅｔｅｒ）で測定され得るが、好適な手ｊ＾を以下に示す。

一定の蛍光量は免疫定ｌ法に於るバッチ間の一貫性のために非常に重要である。

本発明の方法によって、飽和レベルまでの任意のレベルの発蛍光団を含む粒子を 製造可能であり、種々の範囲の蛍光量を示す粒子試Ｓ／を製遺し得る。

発蛍光団は好ましくは、レーザー染料（ｌａｓｅｒ　ｄｙｅ）である、好ましい 発蛍光団は、３−＜２’−ベンゾチアゾリル）−７−ジメチルアミノスチリル（ 通常、クマリン６と称する）、１．Ｚ、４゜５．３１，８Ｈ，１０Ｂ−テトラヒ ドロ−８−トリフルオロメチル［１］ベンゾピラノ−（９，９ａ、１−ｇｈ）キ ノリジン−１０−オン（通常、クマリン１５３と称する）及び４−（ジシアノメ チレン）−２−メチル−６−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ビラン（ 通常、ＤＣＭと称する）がある。

免疫定量法に於いて使用するラテックス（ポリマー）粒子は、市販されており入 手可能である。これらはある範囲の合成ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ ビニルトルエン、ポリスチレン−アクリル酸、ポリアクロレイン及びポリ（メタ ）アクリレートエステル並びにそのコポリマー顕をベースとし得る。使用される モノマーは通常水不溶性で、水性界面活性剤中で乳化するので、モノマー液滴及 び／またはミセルが形成され、次いで乳濁液に開始剤を添加すると重合が誘発さ れる。続いて球状の単分散ポリマー粒子が生成する１条件を制御することによっ て、種々のサイズ範囲を供給し得る０本発明の目的には、このようなラテックス 粒子は好ましくは約０．５ミクロン未満の最大寸法を有する。

発蛍光団を含有する本発明の粒子は、例えばま微鏡検査では、感作していない形 態でサイズ標準として使用され得る。しかしながら、粒子は、試薬（例えば、抗 原、抗体）または他の特定の結合試薬（例えば、酵素及びその補因子、アビジン 、並びにビオチン）で３作され得、粒子は特定の結合アッセイでラベルとして広 範囲で使用され得る。

実施例のみによって、本発明に関する典型的な蛍光ラテックス粒子の調製及び特 性を以下に記載する。

゛・　゛　−−・・クス１　の・ ａ　−−・・　スの＝ 溶液Ａ・・・・・・連続相： 蒸留水　２７０ｍ１ 四硼酸ナトリウム１０水和物　０．１１４ｇドデシルＶｉ酸ナトリウム　０．４ ５０゜溶液Ｂ・・・・・・モノマー相： スチレンモノマ−９０゜ 低分子量ポリスチレン　１６５１ 溶液Ａにアルゴンガスを通気して、酸素を除去する１次いで溶液Ｂを溶液Ａに注 ぎ、ＩＪＩｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを使用して２４　、０ＯＯｒｐ −で６０秒間、均質化する。得られた乳濁液をコンデンサーとオーバーヘッド撹 拌機を備えたガラス反応フラスコ中に入れ、水浴温度を８０”Ｃに上げる０反応 混合物をほぼ２００ｒｐｍで撹拌しつつさらに５分間、アルゴンガスを通気する 。蒸留水１０１１中に過硫酸ナトリウム０．５ｇを含む開始溶液を添加し、２０ 時間重合を実施する６等量の開始剤を添加して、さらに４時間重合する。ラテッ クス懸濁液を冷却し、次いでガラスウール床を通して濾過する。残留モノマーを ロータリーエバポレーターで除去すると、粒子直径がほぼ０．２ミクロンの単分 散のラテックス懸濁液を生じる。

ドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤、開始剤残留物及び四硼酸ナトリウムを、ン ・要によりＤＯＷＥχＪｏｎ−Ｒｅｔａｒｄａｔ　ｉｏｎ樹脂でスラリー化し次 いで透析と組み合わせることによってラテックスより除去し得る。

ｂ　゛　の　ムノ仁 水性ラテックス分散液のポリマー固体含量は、既知容量を乾個するまで蒸発させ ることによって正確に定量される。

クマリン１５３のクロロホルム溶；１３．はぼ４０ｇｇ／ｍｌの濃度に調製する 。水性ラテックス分散液分ポリエチレン容器中に入れ、必要なだけ水で希釈し、 ポリマー固体約１５ｗｇ／分散液ｚｌの濃度にして、存在する各ポリマー固体１ ｙｙ当たり１マイクロリツトルであるような容量の発蛍光団溶液を添加する。５ 濁液を室温にて１８時開開−ビタル撹拌機上で穏やかに渦を巻くように撹拌し、 次いでクロロホルムをほぼ６０℃にてロータリーエバポレーターで除去する。必 要により、発蛍光団のアリコート溶液をさらに添加し、サイクルを繰り返して所 望の取り込みを得る。ラテックスを次いで沢過し、凝集したポリマー粒子を取り 出し、蒸発させて正確な固体含量を定量する。懸濁液のアリコートを希釈し、濃 度０．１＋＋ｇ＃ｉ’にして蛍光光度計で蛍光を測定する。

励起波長＝　４２３ｎ■ 放射波長＝　４８３ｎｍ　（クマリン１５３の場合）Ｃ゛　の　゛　の　、 上述の方法により取り込まれた発蛍光団を含むポリマー粒子が得られる。しかし ながら、本調製物中には水相中にゾルとして存在するかなりの量の発蛍光団を含 み、且つ発蛍光団が幾らか粒子表面に弱く結合している。

これを除去するために、上述の如く調製したラテックスを等容量の無水エタノー ルで希釈し、＾ｍ１ｃｏｎ　ＹＭ１００腹な備えたへｍ１ｃｏｎ透析ｒ過（ｄｉ ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）装置中に入れ、２７ｉ液が透明になるまでエタノール ・水（１：１）混合物に対して透析沢過する。

ポリマー粒子が膜上で詰まってしまった場合には、これらは緩やかに超音波処理 することによって再び５濁できる。

次いでエタノールを減圧下８０℃で除去する。調製物を超音波水浴中に５分間入 れていがなる弱い凝集物をも壊し、Ｗｈａｔ＋＊ａｎ　５４１Ｆ紙でＦ遇する。

蛍光性ラテックス調製物をり、アジ化ナトリウムｋ　０．０１ｇｗ＋／ｖＪＬ添 加して細菌の増殖を阻害する。

ｄ　ボ１マー　の− 蛍光性ラテックスのアリコートｌａｆを予め秤量したガラスバイアルにピペット で入れる。これを強制エアーオーブン（ｆｏｒｃｅｄ　ａｉｒ　ｏｖｅｎ）中９ ０℃で１６時閲、次いで１１０℃で２時開加熱する。バイアルを五酸化リン上で 室温に冷却し、再度秤量する。この試験を重複して実施し、固体含量をｇ／ｚ１ で表示する。

ｅ　゛の 蛍光性ラテックスの懸濁液を蒸留水で希釈し、固体含量を０．１ｇｇ／ｘｌにす る。　Ｂａ１ｒｄ　Ｎｏｖａ蛍光光度計でレンジ５、励起波長４２３ｎｍ、放射 波長４８３ｎｍにセットして蛍光を測定する。

このような装置を使用して得られた値は通常１５０〜１７０蛍光ユニツトの範囲 である。しかしながら、これらのユニットは絶対的なものではなく使用される蛍 光光度計に依存するので、これらのユニットは比較基準でのみ利用されるべきで ある。

ｆ　゛・の 得られた固体含量を使用してラテックスのテトラヒドロフラン溶液を、０．１ｇ ｇ／ｘｉ濃度に調製する。　４１０ｎ−での吸光度を分光光度計で測定し、テト ラヒドロフラン中のクマリン１５３の標準曲線とする。ラテックスの染料含量を クマリン１５３　ｘｇ／ポリマー固体１で表示する。

この方法によってＳｏｎｙ７ｇまでのクマリン１５３含量を有する粒子と調製可 能であるが、通常殆どの使用には３０ｘｉ／ｇの値が適切である。

これらの粒子のクマリン含量は、通常約３０ｘｇ／ポリマー固体２である。これ は、取り込み率がほぼ９５ｇであることを示している〔クマリン１６ＢＸ２回（ 配合）＝３２Ｈ７ｇを添加した］、我々は発蛍光団の配合回数に依存した取り込 みの度合の範囲及び使用した発蛍光団溶液の濃度を測定したが、この範囲は７０ 〜９５１である。

定量された発蛍光団の含量は、２００〜５００ｎｍの粒子直径範囲を越える粒子 サイズに対して明らかに非依存的である。

このことは、発蛍光団が洗浄した表面と除いては、粒子内に一様に分散している ことを示唆している。

マｌン　゛みの 上記段落ａ）で調製したポリスチレンラテックス分散液を、クマリン１５３のク ロロホルム溶液（０，２５ｚ１．４０ｚｇ／ａｌｌ＞と１６時間振盪する。クロ ロホルムを減圧下６０℃にて除去し、等容量の無水エタノールでサンプルを希釈 する。これをエタノール：水（１：１）に対して透析液が無色になるまで透析ｒ 通する。エタノールを蒸留水に対して透析沢過して除去する。

この操作を、発蛍光団の同一貯蔵溶液を使用して５つの別個のサンプルについて 実施した。

−１」シー ２　１２４　０．１６４ 平均１２８．４（２，８＄）　０．１５８（４，８１）注： １、蛍光光度計レンジ５　、０．１Ｂ／ｉ１懸濁液で実施した。

蛍光量は絶対値としてではなく、比較ｊ基準でのみ矛畦用されるべきである。

２、ラテックスのＴＨＦ浴液　ＯＡＨ／ｘｉを使用した。

ラテックス固体１ｇ重たりのクマリン３０！ｇの吸光度の値は、　０．１５８に 等しい、このことは、染料の取り込み重力（７５１であることを示している。

拉ｌゴど１詐− 蛍光ラテックス粒子は蛋白質、特に抗原で感作して、免疫定量法で使用する試薬 を提供し得る０例え（ｆ、約０．３ミクロンの直径のポリスチレンビーズは以下 Ｃ：記載する方法で、抗αヒト絨毛性ゴナドトロピンで感作し得る。

懸濁液０．５ｍ１（固体１２．５ｚｇ）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中で０ 、ＩＭの硼酸塩（ｐＨ８，５）　１　ｘｌで希釈する。これらの粒子を硼酸緩衝 液中で４回洗浄し、各洗浄液を室温にてＭＳＥ微量遠心分離機中１３０００ｒｐ ｍで３回遠心分離する。最終ベレットを再び硼酸ｔｌＩｒ液１ｘｌ中に懸濁させ 、抗ａ　ｈｃＧ抗体３ｏｏｕｙと混合し、次いで懸濁液を室温にて１６〜２０時 間連続的に（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回転させる。抗体−ラテックス懸濁液 を１３０００ｒｐ−で５分間遠心分離し、上清を捨て、ベレットをウシ血清アル ブミン０．５ｗｇを含む硼ａ緩衝液１．５ｍＡ’中に再び懸濁した。連続して３ ０分間室温で回転させた後、懸濁液をＢＳ＾　５Ｈ／ｗｌを含むリン酸緩衝塩水 （ｐ［１７，２）中で３回洗浄し、１３０００ｒｐ−で５分間遠心分層する。ペ レットを５ｘｇ７ｍｌ　ＢＳ＾７５ｇ　（ｗ／ｖ）グリセロールを含むリン酸緩 衝塩水（ｐＨ７，２）中に再び懸濁させ、使用するまで４℃で貯蔵する。

、□、−１，−一　、　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１０３９国際調査報告　淳７４ ヌｂ手趣向

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．発蛍光団が本質的に粒子表面にはなく、粒子内部に閉じ込められて含む、こ とを特徴とする水不溶性の固体粒子。 ２．水不溶性の発蛍光団が本質的に粒子表面にはなく、粒子内部に閉じ込められ て含む、ことを特徴とするラテックス粒子。 ３．本質的に発蛍光団を含まない水性媒体中に、請求項１または２に記載の複数 の粒子を含む、ことを特徴とする試薬。 ４．粒子が特定の結合反応に関与し得る物質で感作される、ことを特徴とする請 求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子または試薬。 ５．発蛍光団がレーザー染料であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１ 項に記載の粒子または試薬。 １０．水性分散液として予め形成された粒子と、粒子材料を湿潤し得る非水性溶 媒中の水不溶性の発蛍光団の溶液とを、粒子が発蛍光団を吸収するのに十分な時 間接触させ、非水性溶媒を除去し、次いで粒子に浸透せずに発蛍光団を溶解し得 る液体中で粒子を（必要により何回も）洗浄する、ことを特徴とする発蛍光団を 含む粒子の製造方法。 １１．水性分散液として予め形成されたラテックス粒子と、ラテックス粒子を湿 潤し得る水と混和しない溶媒中の水不溶性の発蛍光団の溶液とを、粒子が発蛍光 団を吸収するのに十分な時間接触させ、溶媒を除去し、次いでラテックスに浸透 せずに発蛍光団を溶解し得る液体中で粒子を（必要により何回も）洗浄する、こ とを特徴とする発蛍光団を含むラテックス粒子の製造方法。 ６．粒子内部に閉じ込められた発蛍光団を含み、一定の蛍光量を示す複数のラテ ックス粒子を含有する、ことを特徴とする試薬。 ７．約０．５ミクロン未満の最大寸法を有する感作されたラテックス粒子の水性 懸濁液を含み、粒子がその中に閉じ込められたレーザー染料を含み且つ粒子が一 定の蛍光量を示す、ことを特徴とする免疫定量法に於いて使用するための試薬。 ８．請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子または試薬の免疫定量法に於ける 使用。 ９．吸湿性担体物質を含む乾燥試験ストリップなどの試験装置中の乾燥された、 潜在的に移動可能なラベルされた試薬であって、ラベルが請求項１、２、４また は５のいずれか１項に記載の発蛍光団を含有する粒子である、徴とする試薬。 ことを特