JPH04500802A - hirudin peptide - Google Patents

hirudin peptide

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JPH04500802A
JPH04500802A JP1507630A JP50763089A JPH04500802A JP H04500802 A JPH04500802 A JP H04500802A JP 1507630 A JP1507630 A JP 1507630A JP 50763089 A JP50763089 A JP 50763089A JP H04500802 A JPH04500802 A JP H04500802A
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peptide
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hirudin
thrombin
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JP1507630A
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マラガノア，ジョン　エム
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Original Assignee
Biogen Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Abstract] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

見ｔＬｔ　９７≦１土工 １豆血１歪盈Ｉ この発明は、ヒルジンの抗凝固剤活性を示す新規な生物学的に活性なペプチドに 関する。特に、これは、ヒルジンの少なくともカルボキシ末端２６アミノ酸の部 分に相同であるペプチドに関する。この種のペプチドは改変されたチロシン残基 によっても特徴付けることができる。更にこの発明は、抗凝固剤活性を示すこれ らのペプチドのペプチドミメティックおよび共有結合性アナログに関する。また この発明は、治療、予防または診断を目的としてこの種のペプチドまたはアナロ グを使用する組成物、組合せ並びに方法に関する。更にこの発明は、ペプチドま たはポリペプチドに含まれるチロシン残基を硫酸化する新規な方法に関する。 ｉ見韮且 心筋梗塞、鼓動、肺塞栓症、深部血管血栓症、末梢動脈閉塞並びに他の血液系の 血栓症のような血管疾患は、健康に対する主要な危険を構成する。この種の疾患 は、フィブリンよりなる血液クロットによる血液導管の一部または全部の閉塞に よって起こる。 血栓疾患を処置し予防する最近の方法には、２つの異なる様式の１つに作用する 治療法が含まれる。治療法の第１の種類は、トロンビン活性またはトロンビン形 成を阻害するもので、これによってクロット形成を回避する。またこれらの薬剤 は、血小板の活性化および凝集を阻害する。治療法の第２の範鴫のものは、血栓 溶解を促進し血液凝固を溶解するものであり、これにより血液導管からこれを除 去し、血液の流れの遮断を解除する［ジェー・ビー・カゼナベら、＾ｇｅｎｔ＾ ｃｔｉｏｎ、　１５．５ｕｐｐ１．、　ｐｐ、　２４−４９　（１９８４）］　 。 前者の種類であるヘパリンは、静脈血栓栓塞症のような処置条件に広く使用され ており、この場合トロンビン活性は血栓の進展または伸張に対応する。有効では あるが、ヘパリンは多くの望ましくない副作用を与え、これには出血および血小 板減少が含まれる。このため、より特異的でより毒性の低い抗凝固剤が研究され ている。 ヒルジンは天然に存在するポリペプチドであり、吸血ヒル（旧ｒｕｄｏ信ｅｄｉ ｃｉｎａｌｉｓ）によって産生される。この化合物はヒルの唾液腺内で産生され 、公知の最も有効な天然凝固阻害剤である。ヒルジンは、１：１の化学量論複合 体をなしてトロンビンと強固に結合することにより（Ｋ−〜２Ｘ１０−”Ｍ）血 液が凝固するのを阻害する［ニス・アール・ストーンとジェイ・ホフスティング 、「ヒルジンによるトロンビンの阻害の動力学Ｊ　、ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒ ｙ、　２５．　ｐｐ、　４６２２−２８　（１９８６）］。 これは次に、トロンビンがフィブリノーゲンのフィブリン（クロット）への変換 を触媒するのを阻害する。 ヒルジンはトロンビンに対する選択的かつ特異的な阻害剤であると考えられてお り、他の凝固因子に対しては阻害活性を全く示さない、しかしながら、ヒルジン は、因子Ｘの因子ＩＸａ活性化およびプロトロンビンの因子Ｘａ活性化の両方を 阻害することが示唆されている［イー・ダブリュ・ディビーら、「血液凝固」、 ＾ｄｖ、　ＥｎＺＶｌｏｌ、、　４８．　Ｄｌｌ、　２７７−３１８（１９７９ ）　、ジェイ・ニス・ローゼンベルグら、「ヒトアンチトロンビンの存在下にお ける高度に精製されたヒト因子ＶおよびＸａによるヒト１０トロンビンの活性化 Ｊ　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、、　２５０．　ｐｐ、　１６０７１６１７　（１９７５）］　、最近 、精製されたヒルジンが培養内皮細胞からの１２１１ラベルした因子Ｘａの置換 を促進することが示された。すなわち、ｌ１ｌ　！ラベルされたヒルジンは因子 Ｘａに結合し、精製されたヒルジンは小色原体物質Ｓ　−２２２２の因子Ｘａ開 裂を阻害しない［アール・シー・フリードベルグら、［因子Ｘａ副制御おける内 皮の役割：血漿プロテイナーゼ阻害剤およびヒルジンの効果Ｊ　、　Ｂｌｏｏｄ 。 ７１、　Ｅ）Ｅ）、　１３２１−２８　（１９８ｇ）］　。 しかしながら、これらのヒルジンの研究は、因子Ｘａ阻害活性の蛋白質夾雑物が 使用した調製物中に存在する可能性を示していない、よって今日まで、ヒルジン またはヒルジン関連構造が因子ＩＸａおよびＸａを阻害するという結論的な証拠 はない、先に研究されたヒルジン調製物中の１つの可能な夾雑物はアンチスタチ ンの等個物であり、これはメキシコのヒルＨａｅｒｌｅｎｔｅｒｉａ　ｏｆｆｉ ｃｉｎａｌｉｓから精製された蛋白質であって、因子Ｘａを選択的に阻害する［ ジー・ビー・ラスジンスキーら、［アンチスタチンの単離と特徴Ｊ　、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。 ２６２、　ｐ、　９７１８　（１９８７）　］　、　Ｌかしながら、アンチスタ チンはヒルジンと異なり、因子ＸａによるＳ　−２２２２の開裂を阻害する。こ れは、ヒルジンによる因子Ｘａの阻害は、アンチスタチンによる因子Ｘａ阻害と は興なる機構を介して起こることを示す。 ヒルジンとトロンビンとの実際の結合は２段階のプロセスである。最初に、ヒル ジンは、触媒部位から離間したトロンビン分子の「低い」親和力部位（Ｋ、〜ｌ Ｘｌ０−”Ｍ＞に結合する。低い親和力による結合に続いて、ヒルジンは構造変 化を起こし、その後トロンビンの「高い」親和力部位に結合する。この後者の部 位はトロンビンの活性部位に対応する。 ヒルジンの単離、精製並びに化学組成は当業界で公知である［ビー・ウォルスマ ンとエフ・マークワード、［トロンビン阻害剤ヒルジンの生物学的および薬学的 観点」、Ｐｈａｒｎａｚｉｅ、　３６．　Ｉ）Ｉ）、　６５３−６０　（１９８ １）］　、更に最近では、このポリペプチドの全アミノ酸配列が解明されている ［ジェイ・ドツトら、「ヒルジンの全共有結合構造ニジスルフィド結合の局在化 Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　ＨＯＩ）ｌｌｅ−Ｓｅ）Ｉｌｅｒ、　３６ ６、　ｔ）Ｌ　３７９−８５（１９８５）　；ニス・ジエイ・ティ・マオら、「 ヒルジンの迅速精製および訂正したアミノ酸配列：吸血ヒルの特異的なトロンビ ン阻害剤Ｊ　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６１．　ｌ１ｌ）、　５１４− １８　（１９８７）　；並びにアール・ビー・ハーベイら、［吸血ヒル旧ｒｕｄ 。 ｍｅ　１ｃｉｎａｌｉｓに由来する抗凝固剤ヒルジンをコードするｃＤＮＡのク ローン化と発現Ｊ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ、　８３．　ｐＩ）、　１０８４−８８　（１９８６）　］　。 少なくとも２つのヒルジンの異性特異的な形態、ＨＶ−１およびＨＶ−２が配列 決定され、僅かに異なるアミノ酸配列が示されている［アール・ビー・ハーベイ ら、前記文献］。 両方の形態のヒルジンは６５アミノ酸を含有する１つのポリペプチド鎖蛋白質か らなり、そのアミノ末端は主として疎水性アミノ酸からなり、カルボキシ末端は 極性アミノ酸からなる。更に詳しくは、、全ての形態のヒルジンは、１−２．３ −５並びに４−６の半シスチニルパターンにおける３つのジスルフィド橋によっ て安定化されたＮ−末端ドメイン（残基１−３９）および高度に酸性のＣ−末端 断片（残基４０　６５）を特徴とする。更に、ヒルジンのＣ−末端断片は、硫酸 化されたアミノ酸位置６３のチロシン残基の存在を特徴どする。 動物についての研究では、ヒルから精製されたしルジンは、血管血栓、血管転流 閉塞並びにトロンビンにより誘導された転移住血管内凝固を回避するのに有効で あることが示された。 更に、ヒルジンは毒性が低く、抗原性が全くまたは殆どなく、循環系からのクリ アランス時間が極めて短い［エフ・マークワードら、「実験動物におけるヒルジ ンの抗血栓作用の薬学的研究Ｊ　、　Ｔｈｒｏｉｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ＋＊ 、　４’／、　ｐｐ、　２２６−２９　（１９８２）］　−しかしながら７、ヒ ルジンの有効性にも拘らず、研究によればヒルジンは薬量に依存する様式で出血 時間を延長することが示され、このため適切な薬量を決定し℃投薬することが非 常に重要となっている。更に、天然に存在する生成物のコストは高く供給は少な いため、その広範な使用が妨げられている。 ヒルジンの供給の□増加を実現する努力として、組換えＤＮＡ技術によりこのポ リペプチドを生産する試みがなされている、天然ヒルジンにおける〇−硫酸化チ ロジン残基の存在および微生物は同様の蛋白質修飾を行うことは不可能であるこ とから、組換えによる生物学的に活性なヒルジンを生産する観点は非常に疑わし いものとなっている。しかしながら、硫酸化されていないヒルジンは硫酸化され たものと殆ど同様に活性であるという観察［米国特許第４，６５４，３０２号］ により、イー・コリ［ヨーロッパ特許出願第１５８，５６４号、１６８，３４２ 号並びに１７１．０２４号］および酵！［ヨーロッパ特許出願第２００．８５５ 号］におけるヒルジンのクローン化および発現の道が開かれた。これらの進展に も拘らず、ヒルジンの生産はまだなお高価であり、広く市販されるに至っていな い。 最近性われた努力により、凝固時間の低減に同様に有効な天然ヒルジンのペプチ ド断片が同定された。ヒルジンの硫酸化されていない２１アミノ酸のＣ−末端断 片、Ｎ’−アセチルヒルジン４％−４８は試験管内でクロット形成を阻害する。 更に、ヒルジンのＣ−末端１１または１２アミノ酸に対応する幾つかの他の小さ い硫酸化されていないペプチド（残基５５−６５および５４−６５）も試験管内 でクロット形成を阻害するのに有効であることが示された［ジェイ・エル・クル ステナンスキーら、「合成非硫酸化Ｎ１−アセチルヒルジン４　Ｓ　−６％を使 用するヒルジンのＣ−末端の抗血栓特性」、ＦＥＢＳ　Ｌ８ｔｔ、　２１１．　 ｐｐ、　１０−１６　（１９８７）］　、　Ｌかしながらこの種のペプチド断片 は、進行しつつある治療処方において血液クロットを溶解するには十分に満足し 得るものではない０例えば、Ｎ１−アセチルヒルジン４．−０は、天然ヒルジン より４桁低い比活性を有する。 フィブリンクロットの形成を触媒することに加えて、トロンビンは幾つかの他の 生物制御を行う役割を有する［ジエイ・ダブリュ・フェントン、ＩＩ、「トロン ビンの生物制御作用」、＾ｄｖ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６．　ｐ ｐ、　１８６−９３　（１９８８）　］　、例えば、トトロピンは血小板の凝集 および放出反応を直接活性化する。これは、トロンビンが急性血小板依存性血栓 において中心的な役割を果たすことを意味する［ニス・アール・ハンソンとエル ・ニー・バーカー、「合成アンチトロンビン、Ｄ−フェニルアラニル−し−プロ リル−し−アルギニルクロロメチルケトンによる急性血小板依存性血栓の遮断」 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５．　Ｉ）Ｅ） 、　３１８４−８８　（１９８８）］　。 また、トトロピンは、内皮細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成を刺激 することにより、炎症応答を直接活性化することができる［ニス・エム・プレス コツトら、「ヒト培養内皮細胞は、トロンビンによって刺激された場合、血小板 活性化因子（１−アルキル−２−アセチル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン ）を生産するＪ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．　ＤＤ、　３５３４−３８　（１９８４）］　、　 ＰＡＦは内皮細胞の表面に露呈され、ニュートロフィルの吸着および後続する顆 粒消失のリガンドとして働＜［ジー・エム・ベルコレティち、［血小板活性化因 子はアゴニストに対するニュートロフィル応答を用意する：ニュロフィルに媒介 された内皮損傷促進における役割Ｊ　、　Ｂｌｏｏｄ、　７１．　Ｏｐ、　１１ ００−０７　（１９８８）　］　。 トトロピンが血小板および内皮細胞を活性化する機構にはレセプタが関与し、フ ィブリノーゲンの開裂に要求されるものより低い濃度で有効である［ジエイ・テ ィ・ハーモンとジー・ニー・ジャミージン、「糖蛋白質１ｂのグリコカルジン部 分は、トロンビンに対する高および中程度の親和力のレセプタ部位を発現するＪ 　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｉ、、　２８．　Ｄｌｌ、１３２２４−２９（１ ９８６）］　、ヒルジンのようなトロンビンの活性部位を遮断する試薬は、血小 板および内皮細胞の活性化を停止させる［シー・エル・クヌップ、［トロンビン により誘導された放出および凝集に対するトロンビン阻害剤の効果Ｊ　、Ｔｈｒ ｏｒ＃ｂｏｓｉｓＲｅｓ、、　４９．　Ｊｌ、　２３−３６　（１９８８）］　 、　Ｌかしながら、単にトロンビンとレセプタとの結合を遮断するのみでその活 性化を阻害するのに十分であるという証拠はない。 よって、今日までのこれらの発展にも拘らず、クロット形成、トロンビンにより 誘導された血小板活性化または内皮細胞活性化を増加された効率で阻害すること を特徴とする小さな合成ペプチドであって、商業的に適切な量で製造され得るも のに対する要求が存する。 ｌ匪立皿ｊ 本発明は、本来のヒルジンの生物学的活性を特徴とするペプチドを提供すること により、前記した問題点を解決するものである。特に、この発明のペプチドおよ びアナログ、並びにこれらを含有する組成物および組合せの両方は、血液凝固時 間の増加を生起する抗凝固剤として有効である。低薬量でこれらのペプチドは、 トロンビンにより誘導された血小板凝集および血小板放出（「血小板活性化」と 後記する）並びに内皮細胞からの炎症物質の放出（「内皮活性化」と後記する） を阻害し、凝固時間の原著な増加を伴うことはない、これらのペプチドは比較的 小さな大きさく約８〜２６アミノ酸）であるため、有利にはこれらを合成的に製 造することができる。 よって、これらは極めて高い収量で製造でき、本来のヒルジンまたはその全長の 組換え物と比較すると容易に精製することができる。 有利には、本発明のペプチドは、ヒルジンとは興なり、凝固時間に対して十分な 効果を示す、よって、これらのペプチドを治療および予防に使用することにより 、ヘパリンのような従来の抗凝固剤に随伴した過剰投与による危険かつ潜在的に 重篤な結果が回避される。またこの発明のペプチドの大きさは小さいため、これ らによって処置を受けた患者の逆行的な抗原応答の可能性が低減される。 後記する開示から理解されるように、この発明のペプチド、組成物、組合せ並び に方法は、トロンビンの所望としない効果に起因する血管疾患の処置、予防また は診断、並びに試験管内診断アッセイに有用である。 １直立１呈皇盈Ｊ 第１図は、逆相ＨＰＬＣによるスルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン５ｍ−１６４の精製 を示す。 第２図は、大量のペプチドを処理するに際し、従来の硫酸化方法（第２ａ図、２ ｂ図）と比較したこの発明（第２ｃ図）の硫酸化方法の相対的な効率を表すＨＰ ＬＣクロマトグラムを示す。 第３図は、スルホニル−Ｔｙｒｏヒルジン５Ｍ−６４およびスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ 　４１ヒルジンｌｌｌ−６４の混合物のＨＰＬＣクロマトグラフによる溶出プロ フィールを示す。 第４図は、一定範囲のペプチド濃度におけるヒルジン＠５−４４およびスルホ− Ｔ　ｙ　ｒ　ａｓヒルジンラド６４の抗凝固剤活性を示す。 第５図は、この発明によるしルジンペプチドの共有結合構造、並びにこれらの抗 凝固剤活性を示す表である。この図において、次の単一文字コードによってアミ ノ酸を示す：Ｐｈｅ：Ｆ　Ｌｅｕ：Ｌ　Ｉｌｅ：Ｉ　Ｍｅｔ：ＭＶａｌ：Ｖ　Ｓ ｅｒ：Ｓ　Ｐｒｏ：Ｐ　Ｔｈｒ；ＴＡｌａ：Ａ　Ｔｙｒ：Ｙ　Ｈｌｓ：ＨＧｉｎ ：ＱＡｓｎ：Ｎ　Ｌｙｓ：Ｋ　Ａｓｐ：Ｄ　Ｇｌｕ：ＢＣｙｓ：ＣＴｒｐ：Ｗ　 Ａｒｇ：ＲＧｌｙ：Ｇ第６図は、本来のヒルジンおよびスルホ−Ｔｙｒ４）ヒル ジン５ｊ−４４の変動する量によるトロンビンタイムの阻害を示す。 第７図は、ウシトロンビンタイムおよびヒトトロンビンタイムに対する変動する 量のスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　４）ヒルジン＄３−６４の効果を示す。 第８図は、変動する量のヘパリン単独、スルホ−Ｔｙｒｓ＊ヒルジンラド、４単 独、並びにヘパリンとスルホ−Ｔｙｒ、ｓヒルジン５トロ４との１＝１の組合せ の活性化された部分的トロンビンタイムに対する効果を示す。 第９図は、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおける薬量応答についての研究におけるスルホ −Ｔｙｒ＊ｓヒルジン５Ｎ−４４の試験管内抗凝固剤活性を示す。 第１０図は、スルホ−Ｔｙｒｏヒルジン５Ｎ−６４による因子Ｘの因子ＩＸａ活 性化の阻害を示す。 第１１図は、スルホ−Ｔｙｒｏヒルジン＊Ｍ−６４によるプロトロンビンの因子 Ｘａ活性化の阻害を示す５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す。 第１２Ａ〜１２Ｃ図は、ヒルログ−１、ヒルログ−２並びにヒルログ−３、この 発明によるペプチドのペプチドミメティックアナログの合成を示す。 第１３Ａ図は、ヒルログ−４、この発明によるペプチドのペプチドミメティック アナログの合成を示す。 第１４Ａおよび１４Ｂ図は、ヒルログ−５およびヒルログ−６、この発明による ペプチドのペプチドミメティックアナログの合成を示す。 第１５図は、ヒルログ−７、この発明によるペプチドのペプチドミメティックア ナログの合成を示す。 第１６図は、トロンビンにより誘導された血小板凝集および凝固時間に対する低 薬量スルホ−Ｔｙｒ４％しルジン５トロ４の効果を示す。 第１７図は、ＡＤＰおよびコラーゲンにより誘導された血小板凝集に対するＡｒ ｇｓｉ−ヒルジン５Ｓ−４４の効果を示す。 九１へ１１鼠盈泗 本発明は、ヒルジンのカルボキシル末端部分のアミノ酸配列に対応し本来のヒル ジンの生物学的活性を示すペプチドに関する。更に詳しくは、この発明のペプチ ドは、少なくとも本来のヒルジンのカルボキシ末端２６アミノ酸部分に相同であ る。この発明の１つの態様によれば、この種のペプチドは、負に荷電した側鎖基 を付加することにより単一のチロシン残基において誘導される。 この発明のしルジンペプチドには、限定されるものではないが、実質的に次の式 ：Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ、−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｘおよび、二のＤ−レトロ型（式中、ＸはＣ０ＯＨ，Ｌ ｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｉｎよりなる群から選択される）よりなるアミノ酸の配列 を特徴とするペプチドが包含される。更に、この発明によるヒルジンペプチドに は、実質的に次の式：％式％ Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＺおよびこのＤ−レトロ型（式中、ＹはＮｌ２　、アミノ保護 基、アミノ酸配列：Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ、ｒ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。 −Ｇｉｎ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの少なくともＣ− 末端部分、並びにアミノ酸配列：Ｖａｌ−Ｔｂｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔ ｈｒ−Ｐｒ。 −Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｙ −Ａｓ　ｐの少なくともＣ−末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣ０ＯＨ， Ｌｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｌｎよりなる群から選択され、チロシン残基は負に荷電 したｒｐＪ鎖基の存在を特徴とする）よりなるアミノ酸の配列を特徴とするもの が包含される。この種のペプチドにおいて、負に荷電した側鎖基は、スルフニー 用・、ボスフェート、カルボキシレート、スルホネート・、ホスホネ−１〜、カ ーボネート、メチルスルホネ−■・、メチルホスホネート並びにこれらの改変物 よりなる群から選択することができる。この発明の１つの態様によれば、この種 のペプチドには、ＹがＡ　ｓ　ｒｌ−Ｇｌｙ−ｆｉ、ｒ＞ｐであり、２がＬｅｕ であり、チロシン残基が硫酸化されたものが包含される。更に、本発明のペプチ ドは、アミノ末端アミノ酸におけるＮ−アセチル基の存在を特徴とし得る。 この発明のベグゴドの生産は、当業界で公知の種々の方法によっ°〔行うことが できる。例えば、特定のエンドペプチダーゼをエンドペプチダーゼ、エドマン分 解または両者と組合せて使用する蛋白質分解によりて、このペプチドを元のしル ジン分子から誘導することができる。一方この元のヒルジン分子は、従来の方法 を使用してその天然起源であるｔｌ、　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから精製するこ とができる。その他、しルジンは、ｃＤＮＡを使用する公知の組換えＤＮＡ技術 技術−アールー・ハーベイら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ｔｌｓＡ、　８３゜１）ｌ）、　１０８４−８８　（１９８６）；ジェイ・ド ツトら、１−アルカリ性ホスファターゼシグナル配列を使用するイー・コリにお けるヒルジンの発現分泌およびプロセシングＪ　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　 ２０２゜ｐｆ）、　３７３−７７　（１９８６）　］　、または化学合成遺伝子 ［シー・バーブマンら、［ヒルジン、ヒルＨｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎ　Ｉｉ ｓに由来するトロンビン特異的阻害剤をコードする遺伝子の化学合成および発現 Ｊ　、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ、　ＨＯＤＤｅ−８Ｑｙ１ｅｒ、　３６７、　Ｄ９ ．７３１−４０（１９８６）］によって製造することができる。 好ましくは、本発明のペプチドは直接製造され、したがって全ヒルジン分子を出 発材料として必要とすることが回避される。これは周知のＤＮＡ技術によって行 うことができ、その際、所望のペプチドをコードするようなりＮＡ配列のみを形 質転換宿主中で発現させる。 その他、この発明のペプチドは、従来の化学合成技術によって製造することがで きる。この発明の好適な態様では、溶液相または固相ペプチド合成によってヒル ジンペプチドを合成し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼにより消化するか （Ｃ−末端アミノ酸を除去するため）または手動エドマン分解によって分解する （Ｎ−末端アミノ酸を除去するため）。 このようにして製造したペプチドを、その後当業界で広範に知られた分離技術に よって精製するが、好ましくは逆相ＨＰＬＣを利用する。有利には溶液相合成を 使用することにより、誘導されたアミノ酸を成長するペプチド鎖に直接付加する ことができる。これにより、この発明のペプチドのチロシン残基を修飾する後続 する誘導工程の必要性が除去される。 この明細書全体および請求の範囲において、アミノ酸およびその残基について略 号を使用するが、これは命名法の一般的に許容された規則に準拠し、Ｌ−型のα −アミノ酸およびその残基に関する。しかしながら、本発明は、ここに記載する ペプチドのＤ−レトロ型にも関するものである。これらは、Ｌ型のカルボキシ末 端アミノ酸から開始して、反対方向にＤアミノ酸を用いて合成を行うことにより 製造される。 この発明のしルジンペプチドの誘導には、単一のチロシン残基の遊離フェノール 性ヒドロキシルまたはベンジルメタ炭素に対し、負に荷電した側鎖基を付加する ことを包含し得る。 この誘導は、当業界で公知の種々の負に荷電した側鎖基の付加を含む、誘導方法 には、限定されるものではないが、チロシン水酸基の硫酸化、メチルスルホン化 、リン酸化、メチルリン酸化並びにカルボキシル化、並びにチロシンベンジルメ タ炭素のスルホン化１．リン酸化並びに炭酸塩化が包含される。 これらの反応を行う技術も当業界で周知である。 最も好ましくは、この発明のペプチドはｉＫｉ！化によって誘導される。この発 明の好適なペプチドはスルホ−Ｔｙｒｏヒルジンラド６４（下付きの数は本来の ヒルジン分子における対応するアミノ酸位置を示す）であり、これは１２アミノ 酸のペプチドであって、硫酸化された千ロジン残基を有し、本来のヒルジンの残 基５３−６４と相同である。他の好適なペプチドはスルホニル−Ｔｙｒｅｓヒル ジン！３−４４であり、これはスルポン化されたチロシン残基を有する。このス ルホン化ペプチドは、その硫酸化されたものより長い生物学的半減期を有し得る 。 この発明のヒルジンペプチドの硫酸化は、生物学的（酵素的）方法によっても化 学的方法によっても行うことができる。 この発明の好適な態様では、この発明の精製したペプチドを、有機溶剤中でジシ クロへキシルカルボジイミドおよび硫酸と共に同時に反応させる。メタ炭素のス ルホン化は、この硫酸化プロセスの副反応同様の結果となる。 大スケールの硫酸化のため、硫酸化方法を改変し、ダラム量のペプチドを有機溶 媒（好ましくはジメチルホルムアミド）に最初に溶解し、その後脱水Ｍ（好まし くはジシクロへキシルカルボジイミド）と反応させる。ペプチドの脱水されたチ ロシン残基をその後硫酸によって硫酸化する。この反応は、不溶性のジシクロヘ キシル尿素塩の形成によって完了する。 この改変により、大スケールで高収量の硫酸化されたペプチドが結果的に与えら れる。この新規な硫酸化技術は、単離され精製された場合であっても、粗製調製 物として存在する場合であっても、全ゆるペプチドまたはポリペプチドのチロシ ン残基のに酸化に使用することができる。いずれかの硫酸化反応の後、硫酸化ペ プチドは、ＨＰＬＣ，ＤＥＡＲクロマトグラフィまたは幾つかの他の従来の分離 技術のいずれかにより、全ゆるスルホン化ペプチド並びに未反応のペプチドから 分離することができる。 硫酸化は、ピリジン中でこの発明のペプチドと二酸化イオウ−トリエチルアミン 塩とを反応させることによっても行うことができる。更に、チロシルトランスフ ェラーゼ活性（粗製調製物でも精製酵素でもいずれでもよい）を使用して、チロ シン残基を硫酸化することができる［アール・ダブリュ・エッチ・リーとダブリ ュ・ビー・フットナー、ｒＰｃ−１２フエオクロモサイトーマ細胞のチロシン０ 硫酸化蛋白質およびチロシル蛋白質スルホトランスフェラーゼによるその硫酸化 −＋　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８．　ｐｐ、　１１３２６−３ ４　（１９８３）］　、この発明のしルジンペプチドのリン酸化またはカルボキ シル化は、硫酸化について前記したものと類似する反応によって行うことができ 、硫酸をそれぞれリン酸またはギ酸で置換する。これらの反応において、リン酸 化または炭酸化は、それぞれ副反応として生起する。その他、この発明のしルジ ンペプチドのカルボキシル化またはリン酸化に酵素的方法を用いることができる 。 この発明のしルジンペプチドのメチルスルホン化およびメチルリン酸化は当業界 で周知の方法によって行うことができ、これには、限定されるものではないが、 それぞれクロロスルホン酸またはタロロリン酸を用いるアルキル化が包含される 。 ［酸化の程度は、分光光度計によって追跡することができる。硫酸化されたペプ チドの吸収スペクトルは、約２７５ｎｒｒｔから約２５０〜２６５ｎｍへの最大 吸収の移動を示す。 ６０℃で３０分間３０％トリフルオロ酢酸を用いてペプチドを脱硫酸化すること により誘導の確認を得ることができる。 これは結果的に２７５　ｎｍへ戻る最大吸収の増加を与える。 この発明の他の態様によれば、ヒルジンペプチドは、Ｎ−アセチル基を付加する ことにより、そのアミノ末端において誘導することもできる。Ｎ−アセチル化は 、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって行うことができる。好ましくは 、アセチル化は、この発明のペプチドの合成において、Ｎ−アセチルアミノ酸誘 導体を使用することにより行うことができる。その他、Ｎ−アセチル化は、ペプ チドと無水酢酸とを反応させることにより行うことができる。この発明のＮ−ア セチル化しルジンペプチドは、有利にはアセチル化されていない対応するべ１チ ドのものと比較すると増加した生物学的安定性を示す。 この発明のしルジンペプチドの抗凝固剤活性は、いずれかの従来技術を使用して アッセイすることができる。好ましくはこのアッセイはペプチドのトロンビン阻 害活性の直接決定を含む、この種のアッセイは、発色性物質のトロンビン触媒に よる開裂の阻害、または更に好ましくは活性化部分トロンビンタイム（ＡＰＴＴ ）の増加およびトロンビンタイム（ＴＴ）の増加を測定するものである。後者の アッセイは、凝固の「固有の」経路の因子を測定するものである。その他、用い 得るアッセイでは精製したトロンビンおよびフィブリノーゲンを使用することが でき、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡによってフィブリノペプチドＡま たはＢの放出の阻害を測定する。 この発明のペプチドの抗凝固剤効力は、ある部分その生体内半減期に依存する。 よって、この発明は、共有結合または非共有結合のいずれもの薬学的組成物にも 関し、これはこれらのペプチドの生物学的半減期を増加させる薬学的に許容し得 る重合体と共役したしルジンベブチドからなる０例えば、この発明のヒルジンペ プチドは、従来の技術を使用して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化 誘導体と共役させることができる。好ましくは、ＰＥＧＮ−スクシニミジルスク シネートをこのペプチドのα−アミノ部分に付着させる。 この種の付着は、有機溶剤または約７．０より大きいＰＨを有する緩衝液中でペ プチドとＰＥＧＮ−スクシニミジルスクシネート試薬（ＳＳ−ＰＥＧ）とを反応 させることにより行う、最も好ましくは、約５０倍モル過剰の５Ｓ−ＰＥＧ（平 均ＭＷ＝５，０００ダルトン）とペプチドとを、ｐＨ９，０の２０ｍＭホウ酸ナ トリウム緩衝液中で反応させる。 この発明のしルジンペプチドは単独、組成物、組合せとして、また血液系血栓に 起因する血管疾患を処置または予防する方法に有用である０例えば、この発明の ペプチド、組成物並びにこれらを含有する組合せは、予防を目的としたヘパリン 置換、血小板減少症の処置におけるヘパリン置換、転移血管向凝固の処置並びに いずれかの疾患状態で起こる血管血栓の処置に使用することができる。この発明 のヒルジンペプチド、並びにこれらを含有する組成物および組合せは、哺乳動物 、特にヒトを含む患者の血管疾患の処！または予防に使用することができる。 その他、この発明のヒルジンペプチドは、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンと組 合せて投薬することができる。この種の組合せは、いずれかの化合物を単独で使 用する場合に所望の抗凝固剤効果を得るのに要求される＾、バリンまたは低分子 蓋ヘパリンの薬量を有利に減少させる。更に、これらの組合せ゛は、ヘパリンの 使用にしばしば随伴する出血性併発症の可能性を有利に低減させる。またこの種 の組合せは背くべきことに、個々の成分のいずれかを基剤とする単独治療で示す ものより大きい抗凝固剤活性を示す、ここに特定するように、「組合せ」という 用市は、本発明の少なくと＃Ｊ１つのペプチドおよびヘパリンまたは低分子ｌヘ パリンを含有する単独投与形態、２つの薬剤を別々にただし同時に投薬する多段 投与形態、または２つの薬剤を別々にただし順次に投薬する多段投与形態を包含 する。 この発明のしルジンペプチドは、薬学的に有用な組成物および組合せを開裂する 従来の方法を使用して処方することができる。この種の組成物は、好ましくは少 なくとも１つの薬学的に許容し得るキャリヤを含む０例えば、レミントンズ・フ ァルマシューティカル・サイエンス（イー・ダブリュ・マーチン）を参照すると よい０本発明の薬学的組成物は、典型的には、しルジンベブチドに加えて、薬学 的に許容し得る緩衝液、好ましくはリン酸ｔＩｌ衝塩類、更に浸透圧を調整する 薬学的に許容し得る化合物、例えば塩化ナトリウム、マンニトールまたはソルビ トールを含有する。また本発明の組成物は、前記成分に加えて、低薬量のヘパリ ンまたは低分子１ヘパリンを、好ましくは約２．５００〜５，０００単位含有す ることができる。 種々の投与形態を用いて、この発明のヒルジンペプチド含有組成物および組合せ を投薬することができる。これらには、限定されるものではないが、腸管投与、 経 tLt 97≦1 Earthwork 1 Blood 1 Strain related. In particular, this indicates that at least the carboxy-terminal 26 amino acid portion of hirudin Concerning peptides that are homologous to min. Peptides of this type can also be characterized by modified tyrosine residues. Furthermore, this invention provides anticoagulant activity. concerning peptidomimetics and covalent analogs of the peptides of et al. The invention also provides for the use of peptides or analogs of this type for therapeutic, prophylactic or diagnostic purposes. The present invention relates to compositions, combinations, and methods using the same. Furthermore, this invention The present invention relates to a novel method for sulfating tyrosine residues contained in polypeptides or polypeptides. Vascular diseases such as myocardial infarction, heart attack, pulmonary embolism, deep vessel thrombosis, peripheral artery occlusion and other thromboses of the blood system constitute a major health risk. This type of disease is caused by blockage of some or all of the blood vessels by blood clots made of fibrin. Therefore it happens. Current methods of treating and preventing thrombotic diseases include therapies that act in one of two different ways. The first type of therapy is thrombin activity or thrombin form This prevents clot formation. These drugs also inhibit platelet activation and aggregation. The second category of treatments is those that promote thrombolysis and dissolve blood clots, thereby removing them from the blood vessels. [J.B. Kazenabe et al., ＾gent＾ ction, 15.5upp1. , pp. 24-49 (1984)]. The former type, heparin, is widely used for procedural conditions such as venous thromboembolism, where thrombin activity corresponds to the development or extension of the thrombus. Although effective, heparin has many undesirable side effects, including bleeding and blood clots. Includes board reduction. Therefore, more specific and less toxic anticoagulants are being investigated. Hirudin is a naturally occurring polypeptide produced by the blood-sucking leech (formerly Rudo sinalis). This compound is produced within the salivary glands of leeches and is the most effective natural clotting inhibitor known. Hirudin binds tightly to thrombin in a 1:1 stoichiometric complex (K-~2X10-''M). inhibits the liquid from coagulating [Niss R. Stone and Jay Hofsting, "Dynamics of Inhibition of Thrombin by Hirudin J, Bioche IIstry, 25. pp, 4622-28 (1986)]. This is followed by , inhibits thrombin from catalyzing the conversion of fibrinogen to fibrin (clot). Hirudin is thought to be a selective and specific inhibitor of thrombin. However, it has been suggested that hirudin inhibits both factor IXa activation of factor X and factor Xa activation of prothrombin [E. W. Diby et al., “Blood Coagulation”, ^dv, EnZVlol, 48. Dll, 277-318 (1979), J. Nis Rosenberg et al., “In the presence of human antithrombin. Activation of human 10 thrombin by highly purified human factors V and Xa. J, J, Biol. Chew,, 250. pp, 16071617 (1975)], it has recently been shown that purified hirudin promotes the displacement of 1211-labeled factor Xa from cultured endothelial cells. In other words, l1l! Labeled hirudin binds to factor Xa, and purified hirudin binds factor Xa to the small chromogen S-2222. [R. C. Friedberg et al., [Internal factor Xa subregulation] The role of skin: effects of plasma proteinase inhibitors and hirudin J, Blood. 71, E)E), 1321-28 (198g)]. However, these hirudin studies did not indicate the possibility that protein contaminants of factor There is no conclusive evidence that one possible contaminant in the previously studied hirudin preparations is antistatin. It is a protein purified from the Mexican leech Haerlenteria offi cinalis that selectively inhibits factor Xa [G.B. Ruszynski et al. Features J, J, Biol, Chem,. 262, p. 9718 (1987)], while anti-static Tin, unlike hirudin, inhibits the cleavage of S-2222 by factor Xa. child This indicates that inhibition of factor Xa by hirudin occurs through a mechanism different from that of factor Xa by antistatins. The actual binding of hirudin to thrombin is a two-step process. First, Hill Jin binds to a “low” affinity site (K, ~l It then binds to the “high” affinity site of thrombin. This latter part The position corresponds to the active site of thrombin. Isolation, purification and chemical composition of hirudin are well known in the art [B.Walsma et al. N. and F. Markward, [Biological and pharmaceutical aspects of the thrombin inhibitor hirudin], Pharnazie, 36. I) I), 653-60 (1981)], and more recently, the entire amino acid sequence of this polypeptide has been elucidated. J, Biol, Chell, HOI)lle-Se)Iler, 366, t)L 379-85 (1985); specific thrombi Inhibitor J, Anal, Biochem, 161. 111), 514-18 (1987); and R. B. Harvey et al., [Vampire Hill Old Rud. A clone of the cDNA encoding the anticoagulant hirudin derived from P. melcinalis. Loanization and Expression J, Proc, Natl, Acad, Sci. USA, 83. pI), 1084-88 (1986)]. At least two isospecific forms of hirudin, HV-1 and HV-2, have been sequenced and show slightly different amino acid sequences [R. B. Harvey et al., supra]. Both forms of hirudin are one polypeptide chain protein containing 65 amino acids. Its amino terminus consists primarily of hydrophobic amino acids, and its carboxy terminus consists of polar amino acids. More specifically, all forms of hirudin are composed of three disulfide bridges in a 1-2, 3-5 and 4-6 semi-cystinyl pattern. It is characterized by a highly acidic C-terminal fragment (residues 40 to 65) and a highly acidic C-terminal fragment (residues 40 to 65). Additionally, the C-terminal fragment of hirudin is characterized by the presence of a sulfated tyrosine residue at amino acid position 63. Studies on animals have shown that leugin purified from leeches is effective in avoiding vascular thrombosis, vascular diversion occlusion, and thrombin-induced translocation intravascular coagulation. Additionally, hirudin has low toxicity, has no or little antigenicity, and eliminates clearance from the circulation. Alignment time is extremely short [F. Markward et al. Pharmaceutical research on the antithrombotic effect of anti-thrombotic agents J, Throib, Haemostas+*, 4'/, pp, 226-29 (1982)] -However, 7, Human Despite the effectiveness of hirudin, studies have shown that hirudin prolongs bleeding time in a dose-dependent manner, making determining the appropriate dose and dosing difficult. has always been important. Additionally, the cost of naturally occurring products is high and supply is low. This prevents its widespread use. In an effort to increase the supply of hirudin, recombinant DNA technology has 〇-sulfated thiol in natural hirudin, for which attempts have been made to produce repeptides. The presence of rosin residues and the inability of microorganisms to perform similar protein modifications Therefore, the idea of producing biologically active hirudin through recombination is highly questionable. It has become a thing. However, the observation that unsulfated hirudin is almost as active as its sulfated counterpart [US Pat. No. 4,654,302] led to the use of E. , No. 342 and No. 171.024] and Ko! This paved the way for the cloning and expression of hirudin in [European Patent Application No. 200.855]. Despite these advances, hirudin is still expensive to produce and has not yet become widely commercially available. stomach. Recent efforts have shown that peptides of natural hirudin, which are equally effective in reducing clotting time, have been developed. A fragment was identified. C-terminal truncation of 21 unsulfated amino acids of hirudin N'-acetylhirudin 4%-48 inhibits clot formation in vitro. Additionally, several other small proteins corresponding to the C-terminal 11 or 12 amino acids of hirudin Unsulphated peptides (residues 55-65 and 54-65) were also shown to be effective in inhibiting clot formation in vitro [J.L.C. Stenanski et al., “Using synthetic unsulfated N1-acetylhirudin 4S-6% "Antithrombotic properties of the C-terminus of hirudin for use", FEBS L8tt, 211. pp. 10-16 (1987)]. However, peptide fragments of this type are not fully satisfactory for dissolving blood clots in advanced therapeutic regimens. For example, N1-acetylhirudin 4. -0 has a specific activity 4 orders of magnitude lower than native hirudin. In addition to catalyzing the formation of fibrin clots, thrombin has several other bioregulatory roles [J.W. Fenton, II, "Thrombin" "Biological control effect of bottle", ^dv, Cl1n, Enzymol, 6. pp, 186-93 (1988)], for example, totropine directly activates platelet aggregation and release reactions. This means that thrombin plays a central role in acute platelet-dependent thrombosis [Nis R Hanson and El Nie Barker, “Synthetic antithrombin, D-phenylalanyl-propylene "Blocking of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by Ly-Arginyl Chloromethyl Ketone", Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 85. I)E), 3184-88 (1988)]. Totropine can also directly activate inflammatory responses by stimulating the synthesis of platelet activating factor (PAF) by endothelial cells [Nis. Kotsuto et al., ``Human cultured endothelial cells produce platelet activating factor (1-alkyl-2-acetyl-5n-glycero-3-phosphocholine) when stimulated by thrombin, J. Proc. Natl., Acad. Sci. , USA, 81.DD, 3534-38 (1984)], PAF is exposed on the surface of endothelial cells and is susceptible to adsorption of neutrophils and subsequent condylar Acts as a ligand for granule disappearance. The offspring mount a neurotrophic response to agonists: a role in promoting neurophil-mediated endothelial damage J, Blood, 71. Op, 11 00-07 (1988)]. The mechanism by which totropine activates platelets and endothelial cells involves receptors. It is effective at concentrations lower than that required for fibrinogen cleavage [J.T. G. Harmon and G. N. Jamijin, “Glycocaldin part of glycoprotein 1b” Minutes express high and moderate affinity receptor sites for thrombin J, J. Biol, Chei, 28. Dll, 13224-29 (1 986)], reagents that block the active site of thrombin, such as hirudin, Stopping activation of plate and endothelial cells [C. L. Knup, [Effect of thrombin inhibitors on thrombin-induced release and aggregation J, Thror#bosisRes, 49. Jl, 23-36 (1988)], L However, simply blocking the binding between thrombin and the receptor can inhibit its activity. There is no evidence that it is sufficient to inhibit sexualization. Therefore, despite these developments to date, there are no commercially available small synthetic peptides characterized by inhibiting clot formation, thrombin-induced platelet activation or endothelial cell activation with increased efficiency. can be manufactured in suitable quantities There are demands for The present invention solves the above problems by providing a peptide characterized by the biological activity of original hirudin. In particular, the peptides and and analogs, as well as compositions and combinations containing them. It is effective as an anticoagulant, causing an increase in blood pressure. At low doses, these peptides inhibit thrombin-induced platelet aggregation and platelet release (hereinafter referred to as “platelet activation”) and the release of inflammatory substances from endothelial cells (hereinafter referred to as “endothelial activation”). However, because of the relatively small size of these peptides (approximately 8 to 26 amino acids), they are advantageously not produced synthetically, without a significant increase in clotting time. can be built. Therefore, they can be produced in extremely high yields and easily purified when compared to native hirudin or its full-length recombinant product. Advantageously, the peptides of the present invention are different from hirudin and exhibit a sufficient effect on clotting time, so that the therapeutic and prophylactic use of these peptides can reduce the effects of conventional anticoagulants such as heparin. Dangerous and potentially serious consequences of drug-associated overdose are avoided. Also, since the size of the peptide of this invention is small, this The likelihood of a retrograde antigen response in patients treated with this method is reduced. As will be understood from the disclosure below, the peptides, compositions, combinations and The method is directed to the treatment, prevention or are useful in diagnosis as well as in vitro diagnostic assays. Figure 1 shows the purification of sulfo-Tyr, hirudin 5m-164 by reverse phase HPLC. Figure 2 shows the relative efficiency of the sulfation method of the present invention (Figure 2c) compared to conventional sulfation methods (Figures 2a and 2b) in processing large quantities of peptides using HPLC. A chromatogram is shown. FIG. 3 shows the HPLC chromatographic elution profile of a mixture of sulfonyl-Tyrohirudin 5M-64 and sulfo-Tyr 41hirudin 1ll-64. Show the feel. FIG. 4 shows the anticoagulant activity of hirudin@5-44 and sulfo-Tyr as hirudinrad 64 over a range of peptide concentrations. FIG. 5 is a table showing the covalent structures of the lugin peptides according to the present invention and their anticoagulant activities. In this diagram, the following single-letter code indicates that Phe:F Leu:L Ile:I Met:MVal:V Ser:S Pro:P Thr;TAla:A Tyr:Y Hls:HGin :QAsn:N Lys:K Asp:D Glu:BCys :CTrp:W Arg:RGly:G Figure 6 shows native hirudin and sulfo-Tyr4) hirudin. Figure 3 shows inhibition of thrombin time by varying amounts of Jin5j-44. Figure 7 shows the effect of varying amounts of sulfo-Tyr4) hirudin $3-64 on bovine and human thrombin time. Figure 8 shows varying amounts of heparin alone, sulfo-Tyrs*hirudinrad, 4 monomers. Figure 3 shows the effect of a 1=1 combination of heparin and sulfo-Tyr, s-hirudin 5-tro4 on activated partial thrombin time. Figure 9 shows the in vitro anticoagulant activity of sulfo-Tyr*s hirudin 5N-44 in a dose response study in Balb/c mice. Figure 10 shows the activation of factor IXa of factor X by sulfo-Tyrohirudin 5N-64. Indicates inhibition of sexualization. FIG. 11 shows a 5DS-polyacrylamide gel showing inhibition of factor Xa activation of prothrombin by sulfo-Tyrohirudin*M-64. Figures 12A-12C depict the synthesis of peptidomimetic analogs of Hirulog-1, Hirulog-2 and Hirulog-3, peptides according to the present invention. Figure 13A shows the synthesis of Hirulog-4, a peptidomimetic analog of the peptide according to the invention. Figures 14A and 14B depict the synthesis of peptidomimetic analogs of Hirulog-5 and Hirulog-6, peptides according to the invention. FIG. 15 shows Hirulog-7, a peptidomimetic agent of the peptide according to the present invention. Showing analog synthesis. Figure 16 shows the effect of low dose sulfo-Tyr4% and Luzin5 Toro4 on thrombin-induced platelet aggregation and clotting time. Figure 17 shows the effect of Ar gsi-hirudin 5S-44 on platelet aggregation induced by ADP and collagen. 91 to 11 鼠盈沙 The present invention is directed to the amino acid sequence of the carboxyl-terminal portion of hirudin, which corresponds to the amino acid sequence of the original hirudin. The present invention relates to peptides exhibiting biological activity of gin. More specifically, the peptide of this invention is homologous to at least the carboxy-terminal 26 amino acid portion of native hirudin. Ru. According to one aspect of the invention, such peptides are derivatized at a single tyrosine residue by adding a negatively charged side group. The sludin peptides of this invention include, but are not limited to, substantially the following formula: Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-I 1e-Pro-Glu, -Glu-Tyr- Included are peptides characterized by a sequence of amino acids of the form X and two D-retro forms, where X is selected from the group consisting of COOH, Leu, and Leu-Gin. Furthermore, the hirudin peptide according to the invention has substantially the following formula: Glu-Tyr-Z and its D-retro form, where Y is Nl2, an amino protecting group, and the amino acid sequence: Val-Thr- At least the C-terminal part of Gly-Glu-Gly-Th, r-Pro-Lys-Pr.-Gin-3er-His-Asn-Asp-Gly-Asp, and the amino acid sequence: Val-Tbr-Gly-Glu- selected from the group consisting of at least the C-terminal portion of Gly-Thhr-Pr.-Asn-Pro-Glu-3er-His-Asn-Asn-G1y-Asp, and Z is COOH, Leu and Leu- selected from the group consisting of Gln, wherein the tyrosine residue is characterized by the presence of a negatively charged rpJ chain group). In this type of peptide, the negatively charged side groups are sulfuric acid, bosphate, carboxylate, sulfonate, phosphonate-1, carbonate, etc. methyl phosphonate, methyl sulfone carbonate, methyl phosphonate, and modified versions thereof. According to one aspect of the invention, such peptides include those in which Y is Asrl-Gly-fi, r>p, 2 is Leu, and the tyrosine residue is sulfated. be done. Furthermore, the peptide of the present invention may be characterized by the presence of an N-acetyl group on the amino-terminal amino acid. Production of the beggod of this invention can be carried out by various methods known in the art. For example, certain endopeptidases are called endopeptidases, Edman's This peptide can be converted back to its original form by proteolysis using either a solution or a combination of both. can be derived from the gin molecule. On the other hand, this original hirudin molecule cannot be purified from its natural source, Tl medicinalis, using conventional methods. I can do it. In addition, silugin has been described using known recombinant DNA technology using cDNA - Earl Harvey et al., Proc, Natl., Acad. Tsuto et al., in E. coli using a 1-alkaline phosphatase signal sequence. Expression, Secretion and Processing of Hirudin J, FEBS Lett, 202゜pf), 373-77 (1986)], or a chemically synthesized gene [C. Barbman et al. Chemical synthesis and expression of genes encoding inhibitors J, Biol, Chel, HODDe-8Qyler, 367, D9. 731-40 (1986)]. Preferably, the peptides of the invention are produced directly, thus eliminating the entire hirudin molecule. The need for it as a starting material is avoided. This is done using well-known DNA technology. In this case, only the NA sequence can be shaped so that it encodes the desired peptide. Expressed in a transformed host. Additionally, the peptide of this invention can be produced by conventional chemical synthesis techniques. Wear. In a preferred embodiment of the invention, the peptides are The gin peptides are synthesized and optionally digested with carboxypeptidase (to remove the C-terminal amino acid) or degraded by manual Edman degradation (to remove the N-terminal amino acid). The peptides thus produced are then subjected to separation techniques widely known in the art. Therefore, purification is performed, preferably using reverse phase HPLC. Derived amino acids can be added directly to the growing peptide chain, advantageously using solution phase synthesis. This eliminates the need for a subsequent derivatization step to modify the tyrosine residues of the peptides of this invention. Throughout this specification and in the claims, amino acids and their residues are abbreviated. which conforms to generally accepted conventions of nomenclature and relates to L-form α-amino acids and their residues. However, the present invention also relates to the D-retro form of the peptides described herein. These are L-type carboxy terminal It is produced by starting with the terminal amino acids and performing the synthesis in the opposite direction with the D-amino acids. Derivation of the siludine peptides of this invention may involve the addition of negatively charged side groups to the free phenolic hydroxyl or benzyl metacarbon of a single tyrosine residue. This derivatization may be accomplished by any derivatization method known in the art including, but not limited to, the addition of various negatively charged side groups, such as sulfation of the tyrosine hydroxyl group, methyl sulfonation, phosphorylation, and methyl phosphorylation. Oxidation and carboxylation, as well as tyrosine benzyl methane Sulfonation of carbon 1. Includes phosphorylation as well as carbonation. Techniques for conducting these reactions are also well known in the art. Most preferably, the peptide of the invention is iKi! induced by This issue A preferred peptide is sulfo-Tyrohirudinrad 64 (the subscript number indicates the corresponding amino acid position in the native hirudin molecule), which has 12 amino acids. It is an acidic peptide with a sulfated rosin residue, homologous to residues 53-64 of the original hirudin. Other suitable peptides are sulfonyl-Tyres leech gin! 3-44, which has a sulponated tyrosine residue. This space Sulfonated peptides may have longer biological half-lives than their sulfated counterparts. Sulfation of the hirudin peptide of this invention can also be carried out by biological (enzymatic) methods. It can also be done by scientific methods. In a preferred embodiment of this invention, purified peptides of this invention are distilled in an organic solvent. React simultaneously with chlorhexylcarbodiimide and sulfuric acid. Metacarbon carbon Sulfonation results in similar side reactions of this sulfation process. For large-scale sulfation, we modified the sulfation method to transfer Durham amounts of peptides to organic solvents. first dissolved in a medium (preferably dimethylformamide) and then dehydrated M (preferably or dicyclohexylcarbodiimide). Dehydrated titanium of peptides The rosine residue is then sulfated with sulfuric acid. This reaction Completed by formation of xylurea salt. This modification results in high yields of sulfated peptides on a large scale. It will be done. This novel sulfation technique allows the tyrolysis of all peptides or polypeptides, whether isolated and purified or present as crude preparations. It can be used for the oxidation of carbon residues. After either sulfation reaction, the sulfated compound Peptides can be separated from any sulfonated peptides as well as unreacted peptides by HPLC, DEAR chromatography, or any of several other conventional separation techniques. Sulfation can also be carried out by reacting the peptide of the invention with a sulfur dioxide-triethylamine salt in pyridine. Furthermore, tyrosyl transfer chelase activity (either crude preparation or purified enzyme) can be used to Syn residues can be sulfated [R.W.H.L. and D.W. B. Huttner, Tyrosine 0 sulfated protein in rPc-12 pheochromocytoma cells and its sulfation by tyrosyl protein sulfotransferase −+, J. Biol, Chew, 258. pp. 11326-34 (1983)], the phosphorylation or carboxylation of the lucidine peptide of this invention. Sylation can be carried out by reactions similar to those described above for sulfation, replacing sulfuric acid with phosphoric acid or formic acid, respectively. In these reactions, phosphoric acid Carbonation or carbonation each occur as a side reaction. Other features of this invention Enzymatic methods can be used to carboxylate or phosphorylate peptides. Methyl sulfonation and methyl phosphorylation of the siludine peptides of this invention can be carried out by methods well known in the art, including, but not limited to, alkylation using chlorosulfonic acid or talolophosphoric acid, respectively. is included. [The extent of oxidation can be followed spectrophotometrically. sulfated pep The absorption spectrum of Tide shows a shift of the absorption maximum from about 275 nrrt to about 250-265 nm. Confirmation of induction can be obtained by desulfating the peptide with 30% trifluoroacetic acid for 30 minutes at 60°C. This results in an increase in absorption maximum back to 275 nm. According to another aspect of the invention, the hirudin peptide can also be derivatized at its amino terminus by adding an N-acetyl group. N-acetylation can be performed by any of a number of techniques known to those skilled in the art. Preferably, acetylation is carried out in the synthesis of the peptides of the present invention using N-acetylamino acid inducers. This can be done by using a conductor. In addition, N-acetylation is This can be carried out by reacting tide with acetic anhydride. N-A of this invention The acetylated ludin peptide is advantageously combined with the corresponding non-acetylated ludine peptide. It exhibits increased biological stability when compared to that of The anticoagulant activity of the ludin peptides of this invention can be assayed using any conventional technique. Preferably, the assay is based on a peptide that inhibits thrombin. This type of assay, which involves the direct determination of harmful activity, or, more preferably, an increase in activated partial thrombin time (APTT) and an increase in thrombin time (TT). The latter assay measures factors of the "intrinsic" pathway of coagulation. Other available assays can use purified thrombin and fibrinogen, and fibrinopeptide A or fibrinogen can be determined by radioimmunoassay or ELISA. or inhibition of the release of B. The anticoagulant efficacy of the peptides of this invention depends in part on their in vivo half-life. The invention thus relates to pharmaceutical compositions, either covalent or non-covalent, that increase the biological half-life of these peptides. For example, the hiruzin peptide of the present invention is The peptides can be conjugated with activated derivatives of polyethylene glycol (PEG) using conventional techniques. Preferably, PEGN-succinimidyl sulfate Cinate is attached to the α-amino portion of the peptide. This type of adhesion may occur if the resin is removed in organic solvents or buffers with a pH greater than about 7.0. 5S-PEG (SS-PEG), most preferably by reacting PEGN-succinimidyl succinate reagent (SS-PEG) with about a 50-fold molar excess of 5S-PEG average MW = 5,000 daltons) and the peptide in 20mM sodium borate at pH 9.0. React in thorium buffer. The lugin peptides of the present invention are useful alone, as compositions, in combination, and in methods for treating or preventing vascular diseases caused by blood clots.For example, the peptides of the present invention, compositions containing them, The combination can be used for heparin replacement for prophylactic purposes, heparin replacement in the treatment of thrombocytopenia, treatment of metastatic vascular procoagulation as well as treatment of vascular thrombosis occurring in any disease state. The hirudin peptides of this invention, as well as compositions and combinations containing them, are useful for treating vascular diseases in patients, including mammals, especially humans. Or it can be used for prevention. In addition, the hirudin peptide of the present invention is combined with heparin or low molecular weight heparin. Can be administered together. This type of combination refers to the use of either compound alone. This advantageously reduces the amount of valine or low molecular weight heparin required to achieve the desired anticoagulant effect when used. Furthermore, these combinations advantageously reduce the potential for bleeding complications that often accompany the use of heparin. Additionally, combinations of this type should also exhibit anticoagulant activity that is greater than that exhibited by monotherapy based on either of the individual components; as specified herein, the term ``combination'' refers to , at least one peptide of the present invention and heparin or small molecule Includes single dosage forms containing parin, multi-dose forms in which the two drugs are administered separately but simultaneously, or multi-dose forms in which the two drugs are administered separately but sequentially. The lugin peptides of this invention can be formulated using conventional methods to cleave pharmaceutically useful compositions and combinations. Compositions of this type preferably contain 0 containing at least one pharmaceutically acceptable carrier, such as Remington's Pharmaceutical compositions of the present invention typically contain, in addition to siluzine peptide, a pharmaceutically acceptable buffer, preferably phosphate. Acid tIl buffer salts, as well as pharmaceutically acceptable compounds to adjust the osmotic pressure, such as sodium chloride, mannitol or sorbitol. Contains toll. In addition to the above-mentioned components, the composition of the present invention also includes a low dose of heparin. or low molecular weight heparin, preferably about 2,500 to 5,000 units. can be done. A variety of dosage forms can be used to administer the hirudin peptide-containing compositions and combinations of this invention. These include, but are not limited to, enteral administration,

【］投与並びに局所適用が包含される。投与および投薬の速さは、特定の組成 物、処置の目的、すなわち治療または予防、並びに処置担当医の判断のような種 々の因子に依存し得る。 注射用組成物は凍結乾煉物または溶液の形態とすることができる０局所適用に処 方する組成物は、例えば水性ゼリー、油状懸濁物または乳化軟膏の形態とするこ とができる。結果的に得られる処方物は、血液凝固を予防または低減するのに有 効な量のヒルジ〉・ベブチｆ　を含有するものである。 注射による投薬のためには、ｈ療五の、二の発明のペプチドは、通常は約０．２ へ−７５１ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重、好ましくはり（）、５〜１０　ｍ　ｇ　／ 　ｋ　ｇ体重の１日の薬量範囲とし得る。有効な薬量を決定する方法は、当業者 に公知である。しかしながら、こノ１らの薬量は、はぼ他の血栓溶解剤について か、近使用されたしの、例えば約３−５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重以下とし、そ の後維持薬員を約７・−１０口について７ｍｇ／ｌｖｒ　ｉ　、ｖ。 とする。この発明のＰＥＧ誘導】；ルミ、−二ベグチドは、本来のしルジン並び に非誘導ペプチドと比較するとより長い半減期を示すため、これらの投＋ｉは、 有利には非誘導ペプチドについて前記特定し、たものより十分低いものである。 この発明の組成物および組合せは、フィブリン溶解治療に有効な他の成分を更に 含有する。これらには、限定されるものではないが、ティシュ・プラスミノーゲ ン・アクナベータ、ウロキナーゼ並びにス）・レプトキナービが包含される６、 ：れらの他の化合物は２、ｉの発明のヒルジ〉゛ベプチ１シ含有組成物中て゛、 別の成分とｌ、′ξ存在し得る。その他２．−のしルジンベブチドはこの種のフ ィブリン溶解剤と共Ｖさぜるごとがで゛きる。共役は当業界で公知のいずれかの ｊ〕−法によ−フて行）ことができる、しルジンベプヂドおよびクイプリン溶解 １４４Ｊ　（Ｉ、単独分子として、ずなわぢ紐換えＤＮＡ技術または試＠管内合 戒によって製造される融合蛋白質の形態で存在し得る。 またこの発明は、この発明のしルジンペプチドを含有する組成物、およびこの種 の組成物を腫瘍転移の処置に使用する方法に関する。転移性生育の阻害を介する 腫瘍転移の処置に対するこの発明のヒルジンペプチドの有効性は、ある種のガン 細胞中に存在する予備凝固酵素の存在に基く［ニー・ファ　゛ランガとニス・ジ ー・ゴートン、「ガン予備凝固剤の単離と特徴：悪性組織に由来するジスティン グロチアーゼ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４．　ｐｐ、　５５５８−６ ７　（１９８５）；ニス・ジー・ゴートンら、［アミニオンーコリオンに由来す るシステインプロテイナーゼ予６１凝固剤Ｊ　、Ｂｌｏｏｃｔ、　６６、　ｐｐ 、　１２６１−６５　（１９８５）　；並びにニー・ファランゲら、［急性ロイ ケミアにおける新しい予備凝固剤Ｊ　、Ｂｌｏｏｄ、　７Ｌ　ｐｐ、　８７０− ７５　（１９８８）］　、この酵素は、凝固カスケードにおいて因子Ｘの因子Ｘ ａへの変換を活性化し、この結果フィブリンが沈澱し、次に腫瘍生育の基質とし て働く、シ、たかって、因子）（ａ、トロンビンまたは両者の阻害を介してフィ ブリンの沈澱を阻害することにより、。 本発明のしルジンベブチドは、有効な抗転移腫瘍剤として働く。この発明のペプ チドによって処置され得る転移性腫瘍の例には、限定されるものではないが、脳 のカルシノーマ、肝臓のカルシノーマ、肺のカルシノーマ、骨カルシノーマ並ひ ゛に新生ブラスマ細胞カルシノーマが包含される。 またこの発明は、低薬量のこの発明のペプチドおよびアナログを用いてトロンビ ン誘導血小板活性化およびトロンビン誘導内皮細胞活性化を阻害する方法および 組成物に関する。 この発明の方法および組成物によって行われる内皮細胞活性化の阻害には、これ らの細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）合成の抑制が包含される。この阻害 の機構は、トロンビン誘導炎症（ＰＡＦによって媒介されると考えられている） を特徴とする疾患の処置において重要な意味を有する。 また本発明は、低薬量のこの発明のペプチドおよびアナログからなる組成物、お よびトロンビン誘導炎症を特徴とする疾患に罹患した患者の処置にこれらを用い る方法に関する。この種の疾患には、限定されるものではないが、成人呼吸困難 症、敗血ショヅク、敗血症並びに局所再潅流障害が包含される。 低薬量のヒルジンペプチドを使用することにより、驚くべきことに期せずして、 抗凝固剤活性を最少としつつ、前記した阻害活性を処置した患者において達成す ることができる。 よつζ、ヒルジンペプチドの低薬量の使用は、血小板および内皮細胞の活性化の 阻害またはトロンビン誘導炎症を特徴とする疾患の処置が、随伴する抗凝固剤効 果を伴うことなく望ましい状況の場合に有利である。 この発明による血小板および内皮細胞活性化を阻害する好適な組成物は、約０． ０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０９９ｍｇ／ｋｇ体重からなる。更に好ましく は、これらの組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ体 重からなる。 またこの発明は、体外血液の抗凝固剤として、ヒルジンペプチドまたはこれらを 含有する組成物の使用に関する。この出願で使用されるように、用語「体外血液 」には２．導管を介して患者から除去され、体外処置に供せられ、その後透析手 順または血液ろ過または手術の際の血液バイパスのような方法で患者に戻される 血液が包含される。またこの用語には、患者に対する最終的な投与のため体外に 保存される血液製品も包含される。この種の製品には、全血、血漿または凝固が 望まれるいずれかの血液画分が包含される。この種の組成物は、前記した注射し 得る調製物に類似するものである。これらの種類の活性ペプチドの量または濃度 は、処置される血液の容量、またはより好ましくはそのトロンビン含量を基礎と し得る。 まなこの発明は、ヒルジンペプチドの生物分析的使用、または血液サンプルにお いて因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビン、またはこれらの混合物を測定するため のこれらを含有する組成物に関する。これらのペプチドおよび組成物は、従来の アッセイにおいて用いられた試薬に類似する様式で使用することができる。更に 、この発明のペプチドは、因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビン、またはこれらの 混合物を検出するために設計された現在利用可能な方法およびキットに利用する ことができる。 更に、本発明のペプチドは、ヒトおよび他の動物における生体外血栓イメージン グに使用することができる。この発明の１つの態様では、しルジンペグチドをラ ジオアイソトープにより放射能ラベルする。ラジオアイソトープの選択は、周知 の多数の因子、例えば毒性、生物学的半減期並びに検出性に基く、好適なラジオ アイソトープには、限定されるものではないが、Ｉ２％ｌ、Ｉ”Ｉ並びに１１１ 　Ｉｎが包含される。ペプチドをラベルする技術は当業界で周知である。最も好 ましくは、ラジオアイソトープを１２３１とし、１２１１−ポルトン・フンター 試薬を使用してラベルを行う、好ましくは静脈内経路によりラベルしたペプチド を患者に投与し、フイブリンクロヴトに含有されるトロンビンに対する結合を行 う、このクロッ１〜を、その後周知の検出手段、例えばコンピュータ・イメージ ング・システムに接続した放射活性を検出し得るカメラを利用することにより観 察する。またこの技術は、血小板結合）・ロンビンおよびメイゾトロンビンのイ メージを与える。 またこの発明は、ここに記載するしルジンペプチドのペプチドミメティックアナ ログに関する。ペプチドミメティックアナログは、親ペプチドに含有される活性 部位の三次元構造を模倣するものである。これらのアナログは、その対応するペ プチドと同様の活性を示すと考えられる０本発明のＷ様によれば、しルジンペプ チドのアナログは、性状において半ペプチド性または非ペプチド性とすることが できる。これらのペプチドミメティックアナログは、親化合物と比較した場合、 有利には増加した保存寿命および生物学的安定性を示す、更に、本発明のペプチ ドミメティックアナログの生物学的利用性は、経口または局所経路で投薬した場 合、対応するペプチドより大きいものとなり得る。更に、これらのアナログは、 増加した抗凝固剤活性を示す。 またこの発明は、トロンビンと共有結合を形成し得るこの発明のしルジンペプチ ドのアナログに関する。１つの態様によれば、これらのアナログは、ペプチドの アミノ末端に付着したジニトロフルオロベンジル基の存在を特徴とする。他のＷ ！Ａ様によれば、これらのアナログは、チロシンまたは誘導チロシンの置換、並 びに他のいずれかのよりカルボキシ末端残基にトロアニソールによる）を特徴と する０両方のアナログの種類は、トロンビンと共有結合を形成する能力を有し、 したがってその分子についてより大きい親和力を有する。このより大きい親和力 の結果として、これらのヒルジンペプチドアナログは、イオン性相互作用を介し てトロンビンに結合するこの発明の他のヒルジンペプチドより実質的に大きい効 力を有する。 この発明のペプチドミメティックおよび共有結合アナログは、ここに記載するヒ ルジンペプチドのものと同様の生物学的活性を特徴とすることを理解すべきであ る。よって、この発明のペプチドと同一の様式で、これらのアナログを組成物、 組合せ並びに診断、治療および予防の方法に用いることができる。 まなこの発明は、アルギニン残基につきに５ｐｑｓまたはＡｓｎ５ｉの置換を特 徴とする以外は前記したペプチドと同一のヒルジンペプチドに関する。これらの ペプチドは、血小板表面糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに結合し、阻害するＡＩ−ｇ ｓ３−Ｇ　１　ｙ　ｓじ−ＡＳｐｓｓ配列を含有する。これらのペプチドは、驚 くべきことに期せずして、全ゆるアゴニストによって誘導された血小板活性化に 対する阻害活性、並びに抗凝固剤活性の両方を示す、更に、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ配列の存在は、血小板が豊富なりロットの部位に対しこれらのペプチドを標 的とするよう働く、ペプチドがこの標的に一旦到達したならば、これらは付加的 な血小板凝集およびフィブリンの生成の両方を阻害する。この作用により、血液 クロットの仲襲が回避され、この結果増加したクロット溶解が有効に与えられる 。 これらの新規なペプチドは、凝固時間を増加させ血小板活性化を阻害する二元的 な効果を達成する組成物および方法に用いることができる。 本発明の他の態様によれば、ヒルジンペプチドまたはアナログの１つまたはいず れかの組合せを、患者に挿入する侵入器具を被覆する組成物および方法に使用す ることができる。 これらの組成物および方法は、結果的にこの種の器具を受容する患者の血栓合併 症の危険を低減する。この発明の方法および組成物によって被覆され得る表面と して、プロテーゼ、人工バルブ、血管移植片、ステント並びにカテーテルのもの が例示される。これらの表面の被覆を行う技術は当業界で公知である。これらに は、しルジンベブチドまたはアナログ含有組成物の器具表面への化学的架橋結合 または物理的吸着が包含される。 この発明がより十分に理解されるべく、以下の実施例を記載する。これらの実施 例は説明の目的のためのみであり、如何なる様式によってもこの発明を限定する ものとして解釈すべきでないことを理解すべきである。 後記するペプチド合成の全ての例において、合成ペプチドのアミノ酸分析を行っ た。アミノ酸加水分解物は、６Ｎ塩酸中真空下にて１１０℃で２４時間処理し、 そめ後ベックマン・システム６３００アナライザを用いるイオン交換クロマミー グラフィを行うことによって調製し、た。 通常は逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより合成ペプチドの純度を分析し、た。 特に示さない限り、それぞれベックマン液体クロマトグラフシステムまたはアプ ライド・バイオシステムス１５０Ａクロマトグラフシステムを使用し１、バイダ ックＣ４カラム（０，４６Ｘ２５ｃｒｎ）＊たはアクアボアＲＰ　−３００Ｃ＠ カラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ＞に対し、ペプチドサンプル（２０・〜１００μ ｇ）を適用した。バイダックＣ４カラムは、ｏ、ｉ９５トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）を含有する水中で平衡化し、同一のＴＦＡ含有溶媒中における０〜８０％の 増加するアセトニトリル濃度によるグラジェントを用いて展開した。 このグラジェントは、１．０ｍｌ／分の流速で３０分間に渡って展開した。溶出 流は吸光度について２１５ｎ、ｍでモニタ１７た。アクアボアＣ８カラムは０． １％ＴＦＡを含有する水中で平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ溶媒中のＯ・〜７０ ％のアセトニトリルの増加するグラジェント・を用いて展開した。このグラジエ ンＩ−は、０．５ｍＪ−／分の流速で４５分間に渡って展開１２な、その後溶出 流は吸光度について２１４　ｎ　ｒｒｔでモニタ１．た。 犬■皿−１ 亘、ルジン５！−６４およびヒル吐４１−４４　（工鉦或ヒルジンＳ！１−４４ はアミノ酸式：　Ｈ２Ｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ− Ｇｌ　ｕ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｉ　ｕ　−’ｒｙ　ｒ−Ｌ　ｅ　 ｕ　−ＣＯＯＨを有する。 ヒルジンクト、、はアミノ酸式；Ｈ＞　Ｎ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｉ　ｓ　−Ａ、 　ｓ　ｎ　−Ａ　ｓ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｇ　 ｌ　ｕ−Ｇｉｕ−・Ｔ　ｍｅ−Ｐｒｏ−ＧＸｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅ　ｕ　 −Ｃ，００Ｈを有する。ごれ１．、のペプチドを単一合成の部分と）、７て、ア プライド・バイオシステムス４３０Ａペプチド合成装置（アプライド・バイオシ スｊムス、フォスター・シティ、シーニー・）を用いる固相ペプチド合成によっ て調製した。 特に、０．２５９ｍｅｑのＢｏａ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ジビニルベンゼン樹 脂（ＤＶＢ））を順次に２ｍｍｏｌの保護アミノ酸と反応させた。　ｉ　ｉ、　 ？イクルの合成の後、０．４２ｇの湿潤樹脂を反応容器から除去した。残留する ０、４３ｇの湿潤樹脂の両分な・１サイクルについで２ｍｍｏｌの保護アミノ酸 と２回反応させた。このように［２て合成したヒルジン。１４およびＩニルジン ４１１−６４は十分Ｃ：脱保護され、無ホＨＦ：Ｐ−クレゾール：エチルメチル 硫酸（１０：　１　：　ｉ、ｖ／ｖ、’ｖ）を用いる処理によ−フて樹脂から開 裂された。ペプチドの収量は、；ｆｉｌ−ぞれしルジン４？−４４およびピルジ ン５ト。４について５６％および５３％であっ、た。 ペプチドを別個にＨＰ　Ｌ　Ｃ分析することにより、高度の純粋性およびそれぞ れヒルジン４１−６４およびヒルジン’Ｊ）−１！４について、１６．１分およ び１６．３分に溶出する２１４ｎｍＫ１且ユ ース　Ｔｒ＝Ｌｅｕ　ヒルジン５トロ２の４デス（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン９ Ｍ−６２はアミノ酸式二Ｈ２Ｎ−Ａ、５ｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　Ｐｈｅ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−Ｘ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＣＯＯＨを有する。デス（Ｔｙｒ −Ｌｅｕ）ヒルジン１１−６２を次のようにして調製した： 最初に、カルボキシペプチダーゼＡを調製した。主としてアール・ビー・アンブ ラー、［カルボキシペプチダーゼによる酵素的加水分解Ｊ　、Ｈｅｔｈｏ、ｄｓ 　ＥｎｚｙＩｌｏｌ、、　２５．パートＢ、ｐｐ、　１４３−５４によった。酵 素（１，Ｏｎｎｇ）４℃で１．Ｑｍｌの脱イオン水に懸濁し、ミクロ遠心装置で 遠心分離した。上澄を排液し、１００μｍの１％重炭酸ナトリウムを沈澱に加え た。その後、沈澱が溶解するまで０．ｌＮＮａＯＨを滴下した。その後０．１． ＮＨＣｌを滴下添加することによりＰＨを８．０に調整した。０．１ＭＮ−エチ ルモルフォリン酢酸、ｐＨ８，２５を添加することにより酵素の濃度を１ｍｇ／ ｍ１に調整した。 実施例１で調製した１、３ｍｇのヒルジン５３−６４を２５０μｌのＮ−エチル モルフォリン酢酸、ｐＨ８，２５（１，０ＭＮａＣｌを含有する）に溶解した。 その後前記調製した３０μｍ（３０μｇ）のカルボキシペプチダーゼＡを添加し 、反応系を２時間３７℃でインキュベートした。 アクアボアＲＰ　３００Ｃ＊カラム（０，４６ｘ３．Ｏｃ　ｍ　）およびアプラ イド・バイオシステムス１５０Ａ液体クロマトグラフィツクシステムを用いる逆 相ＨＰＬＣによってペプチド断片を精製した。０．１％ＴＦＡを含有する水中で カラムを平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ含有溶媒中で０．５ｍｌ／分の流速で４ ５分間に渡り０〜３５％の増加するアセトニトリル濃度のグラジェントを用いて 展開した。溶出流は２１４　ｎｍの吸光度についてモニタした０手動で両分を集 め、真空下で乾燥し、アミノ酸組成およびヒト血漿の凝固時間に対する効果につ いて分析した。デス（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン％５−６２は、残留する元のヒ ルジンラド鴫、のいずれよりも先に溶出することが認められた。 衷豊■ユ ヒルジン、７４４のム ヒルジン５７−４４はアミノ酸式：Ｈ２Ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨを有する。ヒルジンＳ？−６４を 合成するため、実施例１に概説した手順に従った。ただし、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０ −樹脂（１％ＤＶＢ）の代りに０．５５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｅｕ　０ＣＨ２Ｐ ＡＮ樹脂（１％ＤＶＢ）（アプライド・バイオシステムス）を使用した。その後 、共役のそれぞれのサイクルで２ｍｍｏ　１の保護アミノ酸を添加した。粗製ペ プチドの収量は１７．９％であった。ＨＰＬＣ分析により、グラジェントにおい て１４．２分で溶出する単一の主要ピークが明らかとなった。 Ｘ豊［４ ヒルジン４５−４４二査羞 ヒルジン４％−６４はアミノ酸式：Ｈｔ　Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｌ　５−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨを 有する。０．２５９ｍｅｑのＢｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用し てヒルジンＡ％−４４を合成した２実施例１に概説した手順に従った。ただし、 最初の１３サイクルの合成につき、それぞれの共役工程で２ｍｍｏ　１の保護ア ミノ酸を使用した。残る６サイクルの合成につき、２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を ２回使用した。無水ＨＦ：ｐ−クレゾール：エチルメチル硫酸（１０：１：１、 ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）で処理することにより、ペプチドを十分に脱保護し、Ｄ ＶＢ樹脂から脱共役させた。３０％酢酸で樹脂を抽出することにより約１００ｍ ｇのペプチドを回収した。ヒルジン４％−１６４の収率は１７％であった。 ＨＰＬＣ分析により、生成物における高度の純度（〉９０％）およびアセトニト リルグラジェントにおける１４．４分の２１４ｎｍ吸収物質の単一の主要ピーク が明らかとなった。 尺１五二 ヒルジン％％−６４のム ヒルジンｓ％−６４はアミノ酸式：Ｈｚ　Ｎ−ＡｓＰ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ ｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅ　ＩＩ−ＣＯＯＨを有 する。実施例１に概説した手順によってヒルジン５Ｓ−６４を調製した。０．０ ２５９ｍｅｑのＢｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用した。その後、 それぞれの共役サイクルで成長するペプチドに２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を添加 した。先の例と同様にして脱保護および樹脂からの開裂を行った。このペプチド の回収率は３０％であった。 ＨＰＬＣ分析により、サンプルにおける高度の純度（〉９５％）およびアセトニ トリルグラジェントにおける１６．１分の単一主要ピークが明らかとなった。 尺腹■玉 ヒルジン６４−４％の４ ヒルジン６４−４５はアミノ酸式：Ｈｔ　Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓ ｎ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨを有 する。実施例１に概説した手順によってヒルジン６４−４８を合成した。ただし 、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）の代りに０．２５９ｍｅｑのＢｏｃ −０−ベンジル−し−Ｔｈｒ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用した。最初の６サ イクルの合成について、それぞれの共役工程にお（１て２ｍｍｏｌの保護アミノ 酸を使用した０合成の残りのサイクルについて、２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を２ 回使用した。ペプチドは、十分に脱保護し、無水ＨＦを用いる処理によってＤＶ Ｂ樹脂から脱共役させた。３０％酢酸を用いる抽出の後、１２０ｍｇのペプチド を回収し、ヒルジン６４−４１の収率は１９．９％であった。 ペプチドのＨＰＬＣ分析により、調製物中の高程度の純度（〉９０％）およびア セトニトリルグラジェントにおいて１３．７分で溶出する単一の主要ビークが明 らかとなった。 この発明の種々のペプチドの抗凝固剤活性を測定する対照としてヒルジン４４− ４％を使用した。 Ｘ１孤ｌ ヒルジン＄４−４４のム ヒルジン５４−６４はアミノ酸式：　Ｈ２Ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ　−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯ ＯＨを有する。実施例１に概説したのと同様の手順によりヒルジン５４−６４を 合成した６合成のそれぞれの共役サイクルにおいて２ｒｎｍｏ　Ｉの保護アミノ 酸を使用した０合成後、ペプチドを十分に脱保護し、先の例と同様にＤＶＢ樹脂 から脱共役させた。 ＨＰＬＣ分析により、生成物における高程度の純度（〉６０％）および２１４　 ｎｍ吸収物質の単一主要ビークが明らかとなった。 火ｌ自Ｉ旦 ＨＰＬＣによるヒルジンベプ　ドの　を活性分析の目的のため、前記調製したヒ ルジン４％−６４、ヒルジン４９−６４並びにヒルジンｌ５−６４を、ウォータ ーズ・アソシエート（ミルフォードＭＡ＞液体クロマトグラフィシステムを用い 、調製用逆相ＨＰＬＣによって均一にまで精製した。 粗製ペプチド（それぞれ２５ｍｇのヒルジン４％−６４、ヒルジン４９−６４お よび３０ｍｇのヒルジン５Ｍ４４　）を水中の０．１％ＴＦＡの２．０ｍｌに溶 解した。更に１．０ｍｌの６Ｍ塩、化グアニジウムをヒルジンｌｌ−４４および ヒルジン５３−４４の粗製サンプルに添加して溶解度を増加させた。予め水中の ０．１％ＴＦＡ中で平衡化したバイダックＣ１，カラム（２２ｍｍＸ２５ｃｍ） にサンプルを別々に注入した。４．０ｍ１Ｚ分の流速で同一のＴＦＡ含有溶媒中 にて４５分間に渡り０〜８０％の増加するアセトニトリル濃度のりニヤグラジェ ントを用いてカラムを展開した。溶出流を２２９　ｎｒｎでモニタし、手動で画 分を集めた。 この発明による他のヒルジンペプチドも同様に調製し精製することができる。 尺施１Ｊ。 Ｎニー乙セチノしζ四ニ２ｚ上ヒ幻−ヱと含羞この発明のしルジンベグチドのＮ −アセチル化は、ペプチド合成の際に直接行った０例えば、Ｎ−アセチルヒルジ ン９％−１６４は、実施例１に記載したヒルジン＄１−４４を合成するのに使用 した基本的手順によって合成した。しかし、Ｎ−アセチル化を行うため、手順を 改変し、ペプチド合成の最終サイクルにおいて２ｍｍ、ｏｌのアスパラギ〉・に つき２ｍｍｏｌのＮ−アセチルアスパラギン１ｌｌｆ換を行った０本発明の他の ペプチドは、同様に、ペプチド合成の最終サイクルにおいて非アセチル化形態に つきアミノ末端アミノ酸のＮ−アセチル形態に置換することによって行うことが できる。 Ｘ凰正」１ 見肚乏ヱ△１１−二タ１Ｊ自Ｌ ヒルジン＄３−１１４をチロシン残基で〇−硫酸化してスルホ−Ｔｙｒ、、ヒル ジン＄３−４４を調製した。タナ力ら、「非硫酸化ペプチド前駆体からのチロシ ン−〇　［）ＩＳ］硫酸化コレシストカイニンオクタペプチドの調製Ｊ　、　Ａ ｎａｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、。 １５４、　ｐＩ）、　１９４−９９　（１９８６）の化学修飾手順を使用した。 実施例９で調製した１、５ｍｇのヒルジン５ｊ−４４を５０μｌのジメチルボル ムアミドに溶解し、この溶液をＮ２下で乾燥し２だ。 その後ペプチドを、２Ｘ１０−’モルの硫酸を含有する４０μｌのジメチルボル ムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、た、Ｓれに、４０μＩＤＭＦ　（７，０ＸＩＯ− ’モル）中に５０μｇのＮ。 Ｎ−ジシクロへＡジルカルボジイミドを含有するＩ　Ｑ　）ｉ、　ｌの溶液を添 加した。約５〜１０分間２５℃て′反応を行わせた後、７５０μｍの脱イオン水 を添加した。更に精製する前に、ミクロ遠心装置を用いる遠心分離によって全ゆ る不溶性反応生成物を除去し、た７ スルホーＴｙｒ、ｚヒルジン１１−４４を他のペプチドおよび反応成分から精製 した。バ、イダックＣ１，カラム（４，６Ｘ２５ｃｍ）およびアプライド・バイ オシステムス社液体クロマトグラフシステムを用いるＨＰＬＣによった。カラム を０，１％ＴＦＡ−水溶媒で平衡化１２．０．０８５％ＴＦＡ含有溶媒を用い、 ０．８ｍ！／分の流速で、９０分間に渡り０〜３５％の増加するアセト二ｌ・リ ル潰度のりニヤグラジェントによって展開した９両分を集め、スピード・バック 装置で乾燥し、脱イオン水に再懸浬した。第１図に示すように、２１４ｎｒｎ吸 収物質の多数のビークが解析された。 抗凝固剤活性についてビークのアッセイを行うことにより、２つの有効なスルホ −Ｔ　ｙ　ｒ　ｓｓヒルジン、、−〇含有画分くビークＡおよびＢ、第１０）を 同定した。中性ｐ、　ＨにおけるビークＡ、の紫外線スベクＩ−ル分析により、 ２５８〜２６４ｎｍの最大吸収が明らかとなり、修飾されたチロシン残基の存在 が示されたやビークＡのペプチドのアミノ酸分析により、ヒルジン！１Ｂ−１４ の補遺が確認された。データは、ビークＡがスルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン、４． を含有することを示１７た。 スルボー・Ｔ　ｙ　ｒ　＆！ヒルジン’３＄−６４の存在を確認した、ビークＡ のペプチドを、３０％ＴＦＡで６０’Ｃにて１時間処理して硫酸基を除去するこ とによった６ぞの捗ペプチドを乾燥し、これを水に再懸濁し、逆相ＨＰＬＣに供 した７脱硫酸化スルボーＴ　３’　ｒ　ｉｉ、’Ｌヒルジンｍ−６４のＨＰ　Ｌ 　Ｃ分析を行った。アクアボアＲＰ−３００Ｃ，カラム（０−４−６Ｘ　３−　 Ｏｃ　ｍ　）およびアプライドバイオシステムス１５０ＡＨＰＬＣ装置を使用し た。０．１％ＴＦＡを含有する水中でカラムを平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ含 有溶媒中で０．５ｍｌ／分の流速で４５分間に渡り０〜７０％の増加するアセト ニトリル濃度のグラジェントを用いて展開した。このペプチドは、非硫酸化ヒル ジン１Ｂ−４４のものと同一のＨＰＬＣクロマトグラフ挙動を示した。更に、処 理したペプチドのピーク吸収は２７５〜２８０ｎｍに戻り、これは非修飾チロシ ン残基を含有するペプチドに典型的なものであった。 その後前記した硫酸化手順を、対応する大量のＮ−アセチル化ペプチドに適用し た。第２ａ図のＨＰＬＣクロマトグラムに示すように、ナカハラ法による２５ｍ ｇのＮ−アセチル−ヒルジンラド４４（実施例９で調製）の処理によって、８０ ．１％の収率で所望のＴｙｒ−ＫＨ化主生成物製造した。 しかしながら、反応を比例的に５０ｍｇのＮ−アセチル−ヒルジンラド６４に広 げる試みは、結果的に４８．５％の収量でよって、ナカハラ法の化学を顕著に改 変し、大スケール硫酸化反応において高収量のＴｙｒ−ＩＦＥｎ化誘導体を達成 した。 更に詳しくは、５．０ｍｌのＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，２ ｇ１０．１６ｍ１ジメチルホルムアミド）の存在下で４０ｍ１のジメチルホルム アミド中に１ｇのＮ−アセチル−ヒルジン５３−４４を溶解した。この混合物を Ｏ’Ｃで攪拌し、０．５ｍｌの濃硫酸を、沈澱が生成するまで反応混合物に滴下 添加した。５分後、４０ｍ１の水を添加することにより反応を停止した０反応混 合物の逆相ＨＰＬＣ分離（第２ｃ図）により、８１．７％の収量の硫酸化ペプチ ド、スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｏ−Ｎ−アセチル−ヒルジン９ｓ−６４が示された。 ！ｕ化しルジンペプチドの大スケール精製をその後、１工程の陰イオン交換クロ マトグラフィによって行った。詳しくは、粗製スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｉｊ−Ｎ− アセチル−ヒルジン１ｊ−４４を、ＤＥＡＥセファ０−ス（２５０ｍｌ湿潤樹脂 １５ｇ粗製ペプチド）上で精製した。カラムを予備平衡化し、２０ｍＭ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，０中でサンプルを装填した。リニヤＮａＣｌグラジェント（０ 〜０．４Ｍ）によりカラムを展開した。スルホ−Ｔ７ｒａｓＮ−アセチル−ヒル ジン９Ｂ−６４は、約０．２〜０．３ＭＮａＣ１に溶出し、非硫酸化ペプチドの 後、ただし硫酸化副生物スルホ−Ｔｙｒｅｓ−Ｎ−アセチル−ヒルジン５ｓ−６ ４の前であった。 この発明の他のしルジンペプチドは、前記したのと同一の手順により、硫酸化し 精製し分析することができる。 Ｎ−アセチル−ヒルジン５Ｎ−６４を修飾して、実施例１０に記載したように、 スルホ−Ｔｙｒ、、−Ｎ−アセチル−ヒルジンラド４４の調製の際に、そのＴｙ ｒ−スルホン化誘導体、スルホニル−ＴｙｒｓｓＮ−アセチル−ヒルジン５ト４ ４とした争スルホニルー’ｒｙｒ、、Ｎ−アセチル−ヒルジン！＋１−４４は、 その実施例に記載した大スケール硫酸化反応の際に得られる副反応生成物である 。よって、スルホニル−Ｔ’５’ｒ＊ｓＮ−アセチル−ヒルジン１，４４は３０ 〜４０％の収率で得られ、逆相ＨＰＬＣ分Ｍ（第３図参照）においてスルホ−Ｔ 　ｙ　ｒ　ｉｓ−ヒルジン＄３−６ｆｆの前に溶出することが認められる。 犬１部［Ｌｌ ゞ　の−アッセイ この実施例は、この発明のヒルジンペプチドのトロンビンに対する阻害活性を示 す、活性化部分的トロンビンタイム（ＡＰＴＴ）の阻害により測定するものとす る。抗凝固剤活性は、コアグーＡ−メタ２００１装置（ジェネラル・ダイアグノ スティクス社、モリス・ブレインス、ニュー・シャーシー）を用い、プールした 正常ヒト・血漿（ジョージ・キング・バイオケミカル社、オーバーランド・パー ク、カンサス）（４：１、ｖ　／　ｖ、血漿：水で希釈）のＡＰＴＴをアッセイ することにより測定した。詳しくは、希釈した血漿をヒルジンペプチドの保存溶 液と混合した。濃度は水中にて７５０ＪＪ、ｇ／ｍｌ（非硫酸化ヒルジンペプチ ドについて）〜水中にて３５μｓ／ｍｌ（［酸化したヒルジンペプチドについて ）の範囲とした。血漿とヒルジンペプチドとを、それぞれのＡ　Ｐ　Ｔ　Ｔ測定 の前に最終容量１２５μｌで混合した。 ＡＰＴＴ測定毎にコアグーＡ−メタディツシュ（ジェネラル・ダイアグノスティ クス）のそれぞれの穴に対し、９２ｔｘ　ｌの粗製トロンポプラスティン溶液（ ジェネラル・ダイアクノスティクス）および１００μｌの０．３Ｍ塩化カルシウ ム試薬を添加することによりＡＰＴＴアッセイを開始した。 塩化カルシウムは、それぞれのアッセイの前に新鮮なものを調製した。活性化時 間は１８０秒で一定とした。ヒルジン５３−６４およびスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｉ ｓ−ヒルジン＠Ｍ−４４のＡＰＴＴを比較するこのようなアッセイの結果を第４ 図に示す、第４図は、硫酸化したしルジンベブチドは、対応する非硫酸化ペプチ ドより増加した凝固におけるより高いレベルの活性を有利に示すことを示す、ス ルホン化したペプチド、スルホニル−’ｒｙｒ、、ヒルジン１Ｂ−４４は、スル ホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン５トロ４について認められたもめど同様のＡＰＴＴを示 した。 第５図は、この発明の種々のヒルジンペプチドのＭ　ＣＴ　ｓ　。 （凝固時間をＡＰＴＴアッセイにおいて観察される最大正味増加の５０％に増加 させるのに要求される１２５μｌの希釈血漿当りのペプチドのｎｍｏ　１　）の 比較を示す、ヒルジン５ト、４は０．７７のＭ　ＣＴ　ｓ　ｏを示す、このペプ チドの硫酸化対応物、スルホ−７３’　ｒ　ｏヒルジン５１−６４は、Ｍ　ＣＴ 　ｓ。における約１０倍の増加を有利に生起した。アスパラギン残基（ＡＳｎｓ ｓ）を欠損する非硫酸化ペプチド、ヒルジン５γ−６４は、陰性対照ペプチドし ルジン６４−４５と比較すると、増加する凝固時間に対して効果はなかった。同 様に、チロシン残基を含有しないペプチド、デス（Ｔｙｒ　Ｌｅｕ）しルジン■ −６２は、凝固時間において比較し得る増加を示さなかった。 アスパラギン残基の存在（公開されたＨＶ−２配列のＡ　Ｓ　ｉｌ　ｓｓに対応 する）および千ロジン残基（ヒルジン配列のＴｙｒ６ｓに対応する）は、この発 明のペプチドの抗凝固剤活性に重要であると考えられる。 Ｍ　ＣＴ　ｓｏの減少を生起するしルジンペプチドの全ては、二相薬量依存様式 で同様の挙動を示し、この場合、第１に狭い範囲のペプチドの濃度によりＡＰＴ Ｔの２０秒の増加が与えられ、第２により広い範囲のペプチドの濃度により凝固 時間において１かに付加的な１０〜１５秒の増加が結果的に与えられた。 トロンビンに対するこの発明のしルジンペプチドの特異性を解析するため、トロ ンビンタイム（Ｔ　Ｔ　）の増加に対するその効果を検討し、た、トロンビンタ イムはチルトチューブ法を使用して測定した。詳しくは、２．５Ｕ／ｍｌの濃度 で０゜ｉ　５ＭＮａＣ！および１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２を含有する０、０ １Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ’７゜４中にヒトα−ニトロンビン（ダイ°アゲ、７ ノヌテイカ・スタガ、アスニエレ、フランス）を溶解し、た、　Ｏ”□　１０　 μｇ　／　ｍ　ｈのスルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン５Ｎ−藝４　（）’ロンビンの ０．８Ｕ／ｍｌ最終濃度）と予備混合しｌ′：＝２００μＩの正常ヒト血漿（ジ ョーシア・キング・バイオメディカル社、ＫＡ）と１００μｌのトＵンビン溶液 とを混合した７正常血漿のトロンビンタイムは典型的には１５秒であった。 算６図は、しルジン（シグマ、セン１−ルイス、ＭＯ）およびスルホ−Ｔｙｒ４ ｓヒルジン□−□によるトロンビンタイムの増加の比較を示す。３．３ｘｔｏ− ”Ｍスルホ−Ｔ　ｙ’　ｒ　ｉｓヒルジン５１〜６．の濃度はＴ　Ｔを１Ｓ〜５ ５秒増加させた。しルジンに対する比較により、スルホ−Ｔ’ｙｒ＊ｓヒルジン ５１−６４は、トロンビンに対する約５０倍大きいモル特異的阻害活性を示した 。これらは、ＡＰＴＴアヅセイにおいて認められた相対阻害活性と同じである。 前記したように、アッセイした非硫酸化ペプチドの最大抗凝固剤能力はヒルジン ５４−４４によって示された。ｉｋ少の２倍の阻害活性における減少は、ＡＳｎ ｓ３に対応するアスパラギン残基の除去に際して結果的に得られたものである。 ヒルジンｌｆｆ−４４からＣ−末端１”ｙｒおよびＬｅｕ残基を除去すると、妥 当な阻害活性を有さないペプチド、ヒルジン５トロ２が与えられた・硫酸化しル ジン９Ｎ−６４＜スルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン５ｍ−６４）は、その非硫酸化対 応物と比較すると１０倍の凝固時間の増加を示し、た３ これらの観察に基き、９元のしルジンペプチドのＣ−末端アミノ酸残基は、少な くとも一部は２蛍白質の抗トロンビン活性において作用すると考えられる。また 、元のヒルジンにおいでごれらのＣ−末端残基内に含有される断片（ヒルジンペ プチド鎖に対して反対方向、すなわちＣ００１−ｆからＮ１（２末端）は、ヒト のトロンボモチニリンの提案されなト・ロンンビン結合ドメイン内に含有される 断片と相同であることを認めた「ディ・ウェンら、［シトの）　ｃＺンボモデ、 ２す〉・′：仝二ｃＤＮＡ配列および遠伝子の染色体＠在化Ｊ　、　Ｂｉｎｃｈ ｅｆｆｉｓ↑ｒｙ。 ２Ｇ、　ＤＩ］、　４３０５−５７　（１９８７）］　。 トロンボモモチリンは内皮細胞人血糖蛋白質であり、こ７′（はトｔ：Ｚンビン と化Ｔ量論複合体を形成するＬシー　・アイ・ニスマン、「自然抗凝固経路の制 御Ｊ　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５．　ｐｐ。 １３４８−５２　（１９８７川、ヒルジンにおけるＣ−末＠断片とトロンボカデ ユリン前駆体の残基１５０〜１５５との相同性の同定は、このトロンボカルモデ ユリン中の断片はトロンビンとの複合体形成に寄与することを示唆する。しルジ ンートロンビン［ジエイ・エル・クルステナンスキイとニス・ジエイ・テ／−７ オ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　２１１．　ｉｌ＋）、　１０−１６　（１９８７ ）　：ｌおよびトロンボカルモデユリン−１へロンビン複合体形成の両者は、触 媒部位によりプロテイナーゼを与えることが先に示された。 また、これらの観察は、フィブリノペプチド（生産モードにおける）および１− ロンボモデコ６りンおよびヒルジンの両者（阻害モードにおける）の構造成分は 、トロンビンにおいて基質認識部位と相互作用し、これによりフィブリノーゲン の結合が適合されることを示唆する。しルジンペプチドのトロンビンへの結合が 蛋白質Ｃの活性化を生起し２、これにより更に（の因子Ｖａおよび■ａの蛋白質 Ｃを介する生体内抗凝固剤特性が促進されると考えられる。またヒルジンはトロ ンビンの触媒活性を低減させるため、これがこの特性を共有する可能性は低い、 よって、この発明のしルジンベグチドの抗凝固剤活性は、トロンビンの非触媒的 部位に対するペプチドの結合から誘導され得、したが−Ｊてフィブリノーゲンの トロンビン触媒加水分解についての増加したに、、が与えられると考えられる。 艮菫遭」ユ ヒト１へ旦乙互−２刃」ｊ」已ｄ１とヒ五乙九上９−竺１１しトα−トロナビン に対するしルジンペプチドの特異性を、ＴＴアッセイにおけるし！・α−トロン ビンおよびウシα−トロンビンの両方に対するその相対阻害活性を比較すること により測定した。第７図は、スルホ−Ｔ　ｙｒ　＆！ビーＮ−アセチルーヒルジ ンＳ！１−４４は、ウシα−トｌ′２ンビンよりヒトα−トロンビンの阻害剤と して４〜．５倍活性である、−とを示す。しトα−トロンビンおよびウシα−・ トロンビンは構造においては極めて類似し２ている。Ｉ、二だし７、ヒト分子の β−鎖の１．４９位丁の独特のりジン残基の存在は別て゛ある。この残基は、７ ・−自己触媒分解の部位を特定しでいも。ヒトα−トランビンのＬｙｓ・−１４ ９は、この発明のしルジンペプチドがトロンビンに結合する重要な構造決定基で あると考え八〆する。 火見、１４ ヒルジンとトロンビンとの相互作用は、ヘパリン／アンチトロンビンＩＩＩＩＴ によって返断されることが示されている［ニス・アール・スト・−・ンとジエイ ・ホフステリツジ、１トロンビンとしルジンとの間の相互作用に対するヘパリン の効果Ｊ、Ｅ旧′１．．ｉ、　Ｂ１０ＣｈｅｌＩ１．、１６９．　Ｄ！］、　３ ７３−３−／６．　（’ｔ９８７）］　１．この結果は、ヒルジンおよびヘパリ ン／アンチトロンビンＸＮＩの双方がその酵素の触媒部位を遮断ずεトロンビン と複合体を形成することに帰せら４する。この発明のヒルジンペプチドは、トロ ンビシのフィブリノーゲン溶解性は阻害するが、アミド溶解性活性は阻害し、′ ｆＪ、いことが認められた。よつて、ヒルジンペプチドが、抗凝固ヒト血漿に対 しヘパリンと付加的または共同的いずれに作用するか決定するアッセイを行った 。プールした正常ヒト血漿を使用し、ＡＰＴＴアッセイにおいて、しルジンペプ チドとヘパリンとの共同作用が認められた。 第８図は、しルジンペプチドスルホーＴ　ｙ　ｒ　ａｓヒルジン＄３−４４単独 、ヘパリン単独、またはこのペプチドとヘパリンとの組合せを使用した投与量依 存性ＡＰＴＴアッセイの結果を示す、ＡＰＴＴアッセイは、実施例１２と同様に して行った。ヘパリン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）およびスルホＴｙｒａｓ ヒルジンｌ５−６４　（実施例１０と同様に調製）の両者を１０μｇ／ｍｌの濃 度で使用した。結果は、スルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン１１−１４およびヘパリン の組合せは、いずれかの分子単独またはこれらを組合せた抗凝固剤活性の予想合 計効果より大きい正味の凝固時間の増加を与えたことを示す。 ヘパリン使用は出血合併症を伴うため、この種の組合せは、低薬量のヘパリンを 使用し抗凝固剤効果を達成するのに有利である。 犬ｌ」ＬＬ旦 トロンビンゝ　の トリペプチジルｐ−ニトロアニリド基質トシル−Ｃ，ＩＪ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　ｐ −ニトロアニリド（クロモシムＴＨ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ ポリス、Ｉｎ）のトロンビン触媒加水分解の阻害について、この発明のピルジン ペプチドを、キャリイ２１９ダブルビーム分光光度計により４２０ｎｍで分光光 学的に分析した。１０μｌのトロンビン溶液（ウシ血漿トロンビン、カルビオゲ ム、ベージング・ダイアグノスティクス、ラジョラ、ＣＡ、Ｏ，１Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７，４，０，１５ＭＮａＣ１中、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ）と１．０ｍｌの ０．１Ｍ）リス−）（ＣＩ、ｐＨ１，４，０，１５ＭＮａＣ１１衝液とを混合す ることにより反応物を調製した。その後２５μｍの基質溶液（前記緩衝液中の４ ｍｇ／ｍｌトシルーＧｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ−ニトロアニソール）および １．０ｍｇ／ｍｌ保存溶液から変動する量のヒルジン４１６４　（実施例４と同 様に調製）を添加し、最終固定容量を１．０３５ｍ１、トロンビンおよび基質の 最終濃度をそれぞれ２．８Ｘ１０−”Ｍおよび１．４Ｘ１０−’Ｍとした。 ４．２Ｘ１０−’Ｍ〜２．ｌＸ１０−’Ｍの濃度で、ヒルジン４１−４４は、人 工基質のトロンビン触媒加水分解に対して測定し得る阻害効果を示さなかった。 これに対し、１．２および２．４Ｘ１０−”Ｍ濃度の元のヒルジンは、４８％お よび７３％の阻害効果を与えた。これらの観察に基き、ヒルジンのＣ−末端２１ アミノ酸に対応するペプチド、およびその類似する誘導体は、小さい合成基質の トロンビン開裂を阻害しないと考えられる。これは、本発明のペプチドはトロン ビンの触媒部位に結合しないという我々の考えと完全に合致する。よって、この 発明のペプチドによって示される凝固時間に対する阻害効果は、触媒部位以外の トロンビンの部位に対するその親和力によるものと考えられる。 Ｋ腹且１互 ゝの その後、スルホ−Ｔｙｒ、ｊビルジ２９Ｍ−６４のＢ　ａ　Ｉ　ｂ　／　ｃマウ ス（チャーレス・リバー・ラボラトリイス、ボストン、マス）への静脈注射によ り、この発明のしルジンベブチドの生体内における凝固時間の投与依存性の増加 を測定した。 １０．１００並びに２５０μｇのスルホＴｙｒａｓヒルジン！３−４４を含有す る投与物を動物に注射した。５分後、動物から採血した。クエン酸処理した容器 に血液を集め、遠心分離によって血漿を単離した。実施例１２に記載した方法に より、活性化部分トロンビンタイム（ＡＰＴＴ）についてマウス血漿をアッセイ した。第９図は、スルホ−Ｔ’ｙｒｓｓヒルジン５Ｍ−６４はマウス血漿のＡＰ ＴＴにおいて生体内で投与依存性増加を与えることを示す。 Ｋ１豆工ｌ スルホＴ　ｒ６．ヒルジン５ｊ−６４のポリエ　ジングリコ：」」１文量−α皿 ｌこの発明のヒルジンペプチドと薬学的に許容し得る重合体とを共役させ、ペプ チドの半減期の増加を図った。更に詳しくは、ポリエチレングリコール、ポリエ チｌ／ングリコールＮ−スクシンイミドスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ、平均ＭＷ ＝５．０００）の誘導体を調製した。従来の方法［アブチョウスキイら、Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　７．　ｏｐ、　１７５−８６ （１９８４）］によった、その後、実施例１０で調製した１００μｇのスルホ− Ｔｙｒｏヒルジン５Ｂ−６４を２００μｌの２０ｍＭホウ酸ナトリウム、ＰＨ９ ，０に溶解し、これを５０倍モル過剰Ｓ　Ｓ−Ｐ　Ｅ　Ｇと反応させた０反応系 を室温で一夜放置し、その後逆相ＨＰＬＣに装填して精製および特徴付けを行っ た。 逆相ＨＰＬＣは、アプライド・バイオシステムス１５０Ａクロマトグラフィクシ ステムを使用し、アクアボアＲＰ−３００Ｃａカラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ） を使用して行った。０．１％ＴＦＡを含有する水中でカラムを平衡化し、０．５ ｍｌ／分の流速で４５分間に渡り０．０８５％ＴＦＡ溶媒中で０〜５０％の増加 するアセトニトリルのグラジェントを用いて展開した。溶出流は吸光度につき２ １４ｎｍでモニタした。スルホ−Ｔ　Ｖ　ｒ　＊ｓシルジン５トロ４の５Ｓ−Ｐ ＥＧ誘導体は、非誘導形態より前に溶出され、ブロードなピークに含有されてい ることが認められた。スルホ−Ｔｙｒｉｓヒルジン８３−６４の誘導および非誘 導形態の両者の抗凝固剤活性の比較により、ＡＰＴＴの増加における同一の投与 依存性が明らかとなった。よって、８３−ＰＥＧ−スルホ−Ｔｙｒ＊ｓヒルジン ５ト４４は、その非誘導対応物と比較した場合、循環半減期における予想された 増加を有利に示す本発明のペプチドの活性誘導体である。 尺１皿１１ ａお　ａの　へ二二皇ま 因子ｒＸａは因子Ｘの因子Ｘａへの活性化を触媒し、スルホＴｙｒｏヒルジン＄ １−４４は因子Ｘａによる小さい発色基質Ｓ　−２２２２のｒＷｉ裂を阻害しな いというｉｓに基き、スルホ−′Ｉ″Ｖｒ６ｊヒルジン５ｊ−４４による因子Ｉ Ｘａの阻害を測定した。 コアデスト・ファクター■アッ七イキット（カビビトルム、ヘレナ・ラボラ）− リイス、ビ、ｌ−モンＹ・、′ｒＸ）により因子ＩＸ　ａ　／因子Ｘ　、／リン 脂質混合物を調製した。製造業者の指示により、実施例１０で調製した種々の濃 度のスルホ−Ｔ′、ｒｒｓｓヒルジン９３−６４　（０−６６−７μｓ／　ｍ、 　１　）の存在下とした。製造業者によって推奨されたようにして、２５＋ｎＭ ＣａＣ１２および正常し１′・血漿の内分を添加することにより、ｉの混合物を 活性化した。サンプルを３７℃で１０分間インキュベートした後、それぞれのサ ンプルに１００μｍのＳ　２２２２ｆ４’４（カビビトルム、ヘレナ・ラボラト リイス、ビューモント、′「Ｘ）を添加１−２な、酸性にすることにより５分後 に反応髪停止１．た。Ｓ−２２２２開裂の程度は４０５ｒｔ　ｍで分光光度的に 追跡しな。、 第１０図は、スルホ−”　’１’　ｙｒ　６３ヒルシ゛ン、ｊ−□は、このア・ ・Ｉセイにおいて投与依存性Ｓ−２２２２開裂の阻害を示ずことを示ず、このペ プチドは３−２２２２の因’Ｆ　Ｘ　ａ開裂を阻害しないため、この結果は、ペ プチドの増加する里により因子Ｘａの減少する生産が起ることを示す。したがっ て、スルボーＴ　ｙ　ｒ　＊ｓヒルジン５ｍ−４４は因子Ｘの因子ＩＸａ活性化 を阻害する筈である。因子ｌＸａの阻害は、ペプチドの６×１０″６濃度で完全 であった。 ５ＤＳ−ＰＥＧＥを使用し、スルホＴｙｒｅｓヒルジン５ト４４によるプロトロ ンビンの因子Ｘａ活性化の阻害をアッセイした。先のアッセイ同様、カルシウム リン脂質および希釈血漿の存在下に因子ＩＸ　ａ　／　Ｘから因子Ｘａを生成し た。このようにして謝製した因子Ｘａを、スルホ−Ｔ）ｒｒａｓヒルジン８１− ６４　（０〜９５μｓ／ｍ貞）またはしルジン（０〜２５ｔ、Ｊ　／　ｍ　１　 ）を含有する３　１５　ｉｔ　１の０．０５Ｍ＋−リス−ＨＣｌ、ｐｉ（，７， ５，０，１ＭＮａＣ１中で、ニー・・アール・トンプソン、）、　Ｃｌ１ｎ、１ ｎｖｅｓｔ、、　５９．　Ｄｏ、　９００−ｉ）５　（ｉ９７７）の方法により 、ｊ１常し３ト血漿から精Ｉｉ！！、たプロ１−ロンビン（１３０μｇ／ｍｌ＞ とイン六ユベー１−シた。３７℃“での６０分のインキュベートの後、３０μｌ の両分を取り、これを４ＸＸ非凡ＳＤＳナンプル綬衝液ど混合［７、Ｓ　１’） 　５−ＰＡＧＥによりごのザ゛／グルを１０％アクリルアＳドゲルで分析した、 電気′Ａ肋の後５、このゲＡ。・をコーマシー・ブリリアント・ブルーで染色し た１、グ１コｌ−ｒｘンビンの因子）（ａ活性化の＠宵は、ゲル土、で反Ｖ）生 成物を＠討ζる。：、とにより視覚的に評価）−４ノζ。第１１図は、増加す“ るｆ４度のスルボーＴ、　３’　ｒ　６！１１；ルジン、５Ｍ−１４による７− ｏンビンノ＼のＩ−電”２′ピ〉の変換の投手依存性阻害を示す。 その他、前記したように副製しまたサンプルを、基質と１゜、てクロモシム゛ｒ Ｊ４（ベーリンガー・マンハイム、・インディアナポリス、ＸＮ）を使用し、結 果的に得らノするト・ロンピン活性について分析しｊ二。それぞれの→ｊノンル の５　）ｔ　１の両分を、１．０ｍｌのトリス−ＭＣＩ、ＰＨ７，５，０，１５ ＭＮａＣｌ並びに４μｇ　／　ｒｎ　ＫクロモシムＴＨを含有するキコベ・ソト に添加した。トロンビン活性は４２０　ｒｉ　ｍで連続的にモニタした。この様 式によるトロンビン活性の分析は、１′０ノＪｇ　／　ｍ　ｘのスルボーＴ　３ ｒｒ　４ｍヒルジン、−６，濃度でプロト１７ンビンの因子Ｘａ活性化を介して 生成されるエステル分解活性の４倍の減少を示した。 また、こｔ′Ｌらのデ・−夕は、スルホ−Ｔ　５’　ｒ　６ｓ１：、ルジン５ｍ −６４は、因子Ｘの因子ＩＸ　ｔ４活性化、４並びにプロトロンビンの因子Ｘａ 活性化を、共に両者の場合非触蝋部位との相互作用により阻害することを示す、 しかしながら、因子■ａおよびＸａの阻害のレベルは、トロンビンの阻害より約 １０倍少ない。これらの結果は、因子ＩＸａおよびＸａと相互作用するしルジン の構造は、Ｃ−末端断片に局在する、すなわち、阻害は非触媒部位との相互作用 を介した後に起ることを示唆する。またこれらは、硫酸化Ｔｙｒｇｓ残基を欠損 する種々の形態のし、ルジンは、天然し、ル蛋白質のノンアンチトロンビン抗凝 固剤特性を示し得ないことを意味する。 ヒルジンペプチド、好ｉｔ、＜はスルボー’！’　３’　ｒ　ａｓヒルジ／リエ ー、、の抗転移活性は、ザルコーマ’ｉ”　’、ｒ　４　’、ｉ糾胞［エル・コ ニ−・リオッタら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４．　ｐｐ、　６７−６８　（１９８ ０）　］および共同作用Ｃ５７Ｂ　Ｉ、７７６マウス（ジャクソシ・ラボラトリ イスる。実施例１０により調製したＯ・−２５０ｇ　／　ｋ　ｆｉｃのスルホＴ ’１ｒｉｓヒルジン５Ｎ−４４を用いてマウスを静脈まかは皮下注射し、その後 １０４〜１０’Ｔ２４１腫痛細胞の静脈注射を行った。１５日後。動物を層殺し 、肺腫瘍コ！ノニーを計量１．７な。ヒルジンペプチドの抗転狂・活性は、ブラ シーボ処置対暇と比較した＃癌コロニーの％減少として測定した。 大Ｊ１例２０ 堕と旦至、ン二１−一じＲイＳ、二こ九、Ｆ　；　＞仁土ユニ乙≦ζ二２：ｊＪ ス」乙゛この発明のペプチド、舒マ１１、くけスルホ−Ｔｙｒｓｓヒルジン、ト 、、を使用１．で、半ベプチ１ζ性または非ペプチド性ペプチドミメティックア ナログ、アンチトロンビンおよび抗凝固剤活性を示す合成分子を製造することが できる。これ溝、のペプチドミメティックアナログは、この発明のヒルジンペプ チドを特徴＋１けるフィブリノ−タンのトロンビン加水分解、因子Ｘの因子ＩＸ ａ活性化並びにブ′ｏ）−ロンビンの目子Ｘａ活性化に対する阻害活性を示ゴ。 「ヒルログ」と＠記するこの発明のペプチドミメテイツクアＦログは、次の化学 梢遣によって示される：ｈ」−１グーニス １丑」し乙ニュ ＣｏｏＦ！　Ｃｏ０ＦＥ 見垂ｊし乙二ヱ この発明のしルジンペプチドの半ペプチド性ペプチドミメティックアナログは、 親ペプチドのループ、ターン、または螺旋構造を安定化すべく調製することがで きる０例えば、ループｍ造は、ネルホーＴｙｒｅｓヒルジン＄トロ、のＮ−およ びＣ−末端端部の両者でシステイニルまたはリジル残基を付加することによって 作製する。末端システイニル残基を架橋結合するが、酸化によってヒルログ−１ （第１２ａ図）を製造し、脂肪族ジチオールによる酸化によってヒルログ−２を 製造しく第１２ｂ図）、または脂肪族ジハロアセテートまたはプロピオネートに よるアルキル化によってヒルログ−３を製造する（第１２ｃ図）、末端リジル残 基を架橋結合するが、スペーサの長さが異なる多数のイミデート試案のいずれか を用いるか、またはジヒドロキシスクシニミジル脂肪族試薬を用い、この結果と してヒルログ−４を製造する（第１３図）。 スルホ−ＴＶｒ４ｓヒルジン、ト、、のＰｒｏ−３の周囲の構造に対し、クロロ アラニンを用いるｌ１ｅ−７の置換を行い、（Ｌ）または（Ｄ）−七リンを用い るＧｌｕ−９またはＧｌｕ−１０の随伴する置換を行うがまたは行わない、クロ ロアラニン単独を含有するペプチドミメティックアナログは、ゲトン結合により Ａｔａ−７に対するＧｌｕ−９またはＧｌｕ−１０の架橋結合を生成し、ヒルロ グ−５を生成し得る（第１４ａ図）０位置９または１０におけるセリンを用いる 誘導体は、エーテル結合を介して架橋結合を与えることができ、ヒルログ−６を 生成する（第１４ｂ図）。 この発明のペプチドミメティックアナログの螺旋構造は、ヒルジンペプチドの位 置（ｎ）および（ｎ＋３）のシステイニル残基を置換し、直接酸化、脂肪族ジチ オールを用いる酸化、または脂肪族ジハロアセテートを用いるアルキル化による 架橋結合により行うことができる０例えば、システイニルを用いるスルホ−Ｔｙ ｒ６ｓヒルジン！！−４４のＡ　ｓ　ｎ、　−１およびＰｈｅ−４の置換および エタンジチオールを介する酸化（第１５図）は、誘導体のＮ　Ｈ２−末端側にお ける螺旋ターンを与え、これによりペプチド誘導体における安定な螺旋構造に寄 与する。これはヒルログ−７によって例示される。 この発明に属する完全非ペプチド性ペプチドミメティックアナログも製造するこ とができ、与えられたペプチド化合物に関する前記した戦略を考慮する。 尺土呵ｌユ 血栓イメージングニ扛番るヒルジンベプ　ドのスルホ−ＴｙｒａｓヒルジンＳ％ −６４のようなヒルジンペプチドを、＋２３１．１２１　ｉまなはｌ１ｌｉｎ含 有化学基の共有結合付着により改変することができる１例えば、（実施例１０で 調製された）スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジンラド４４のα−アンモニウム基をＯ， ＩＭホウ酸ナトリウム、ＰＨ９，０中で１２５■−ポルトン・フンター試薬（二 ニー・イングランド・ヌクレア、ボストン、ＭＡ）と反応させることができる。 その後１２５■ラベルしたペプチド（〉５μＣ１／μｇの比放射能を有する）を リン酸緩衝塩類で平衡化したバイオゲルＰ２のカラムにより脱塩する　１２５　 ■ラベルしたペプチドを、その後抗トロンビン活性におけるいずれかの損失をモ ニタするトロンビンタイムおよびＡＰＴＴアッセイで試験することができる。 実験血栓の生体外イメージングは、主としてティ・エム・パラブリ力ら、「活性 化血小板の外膜蛋白質に特異的な抗体を用いる初歩モデルによる血栓イメージン グＪ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．　ｌ）０．１０３６−４０　（１９８ ９）に提出された原稿に記載されたようにして行う、詳しくは、イメージングは ししにおいて大腿部動脈と大腿部静脈との間の外部チコフレックス分流を用いて 行う、実験血栓は、予備凝固した分流におけるダクロン移植片の断片の置換によ って形成する　Ｉ２’Ａ　Ｉラベルしたスルホ−’ｒ３’ｒ、３ヒルジン５．− 〇をチコフレックス分流の静脈部分に注射する。その後一連の前方イメージを０ ．５〜１時間について得る。ＰＤＰ−１１／３４コンピユータを備えたオハイオ ・ヌクレア・シリーズ１００ガンマ・カメラを使用する。移植片および血液プー ルにより１．２８■−しルジンペプチドの取り込みの動力学は、このようにして 得られた放射性核種イメージから誘導される。 同じ技術を使用し７て、ヒヒの大腿部静脈の血行停止によって得られる深部静脈 血栓の生体外イメージを得ることができる。スルホ−Ｔｙｒｂｓヒルジン５ｊ− ６４は高い特異性でトロンビンと結合するため、放射能ラベルしたヒルジンペプ チドを使用することにより、実験血栓の正確な生体外イメージが可能となる。ま た、元のしルジンまたはトロンビンに対する抗体に対して小さい大きさのしルジ ンベブチドは、放射能ラベルしたペプチドが、血小板結合トロンビンおよびメイ ゾトロンビン並びにブイプリンクロットに含有されるトロンビンのイメージを与 え得る可能性を提供する。 尺土旦２２ 膨五欠■」ユＩＩＩ豆二旦並１玉 匹匪圧２−へブユー上−（Ｆ）　−＋ニル碧血小板豊富血票および血小板欠乏血 漿を調製しな。ジェイ・エイ・ジャクボウスキイどエヌ・ジー・ア・−ドリー、 ［飽和またはポリ不飽和脂肪における食餌富化によるヒト血小板作用の改変Ｊ　 、　ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒＯｓｉｓ、　３１．　ｌ１１１．３３５−４４　（ １９７Ｂ）ノ方法にＪっか、詳しくは、２１ゲージのバタフライカニユーレを介 し、て健康なヒト志願者から血液を３．８％クエン酸三すトリウムの１／１０最 終容量に集めた。全ての供与者は、血液採梨の前少なくと＜１２週間は全ゆる種 類の治療の使用を行わなかった。血小板豊富化血漿は、ツルバール・ローター内 で１１００Ｘで１５分間クエン酸処理全血の室温遠心分離Ｃごよって調製した。 血小板に乏しい血液は、クエン酸処理全血を１２．ＯＯＯＸｇで１５分間遠心分 離することによって１製［、た。 ０〜０．５５μｇ　／　ｍ　ｉの濃度範囲に渡り、スルポーＴｙｒａｓＮ−アセ チル−しルジン＠９．−６４の抗凝固剤および抗血小板活性の両者を分析した。 抗凝固剤活性は、実施例１２に記載したようにＡＰＴＴを測定することによって ′Ｔ・ツセイした。血小板凝集は、０．０５ｍ１の水を含有するスルホ−Ｔｙｒ 、ｊ　Ｎ−アセチル−ヒルジン５，１４を３７℃に予め加温した０、４ｍｌの血 小板豊富血漿に添加することにより測定した。混合物を３７℃で１分間撹拌り２ 、その後トロンビンを添加し°〔最終濃度を０．４１Ｊ、／ｍｌとｌ〜た。バイ オデータＰＡＰ４の４−チャンネル血小板分析装置（バ・ｆオデータ、ハツトボ ロ、ＰＡ）を使用し、４分間に渡り濁度的にモニタした。 このアッセイで使用しノ゛こスルホ−Ｔ　ｙｒ　６ｓ　Ｎ−アセチル−しルジン ５１−６４の最も高い濃度の抗凝固剤活性は、通常の血清のものより１２５％少 ないＡ　Ｐ　ｒＴ値を饗えた。これに対し、スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｓｓ−’Ｐ” ｌ−アセチル−ヒルジン５ｍ−４４は、０．１５〜０６２５μｇ／爪１（第１６ 図）の濃度て゛租小板凝集を５０％阻害した。、：ｉは、この発明のしルジンペ ７″チドの低投与量は、治療的に凝固を行わない条件干て′血小板活性化を遮断 するのに有効であるこＳ；を示す（すなわち１、夕′４照の１５０−２００％） ＼のＡ　Ｐ　Ｔ　Ｔの増加）。 ｘ１例−２，、−３、 ｄ−にｎ−ｔｉ−’：−イ；−ミニーー二、ｚ＝、、；４ルｔ−７７二ｎ、、　 ６５見配延乙１３−６４　”Ｉ：、’ｔＦり一に±、オｉ、ｓ４１ユ月−１左力 １．立比玉培養しｈ　Ｉｉ！！Ｉｎｉ内皮ｔｔＭ胞（ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ）　ヲ（ を用Ｌ、ｍｌ　小板活性化因子（ＰＡＦ）のトロンビン誘導合成を阻害するヒル ジン＄３−６４またはスルホＴｙｒｅｓヒルジン＄３−４４の能力をアッセイし た。確立された手順に従いコラ−ゲナーゼ消化によりヒト鯛の緒からＨＵＶＥＣ を抽出しな［エム・ニー・ギンブロー・ン・ジュニア、［血管内皮細胞の培＊１ ．　Ｐｒｏｇ。 Ｈｅ１ｏｓｔ、　Ｔｈｒｃｉｂ、、　３．　ｐｐ、　１−２８　（１９７６）　 ］。［］’Ｈ］−アセ７−１の存在下に９６穴マイクロタイタブレート中でＨｔ 、Ｊ　Ｖ　Ｅ　Ｃを群集に生育させた７この様式で培養した細胞は［３Ｈ］−ア セチル−ＰＡＦを生産し、これはＨＵ　Ｖ　Ｅ　ＣＪｌｌリン脂質の抽出によっ て定量することができる。 ヒルジン（０〜Ｉ　ＪＪｇ　／　ｒｒ＋、　１　）　、ヒルジン５ｓ−ａ４（０ ”２００μｇ／ｍｌ）またはスルホ−Ｔｙｒａｉヒルジン＄３−４４（０〜・８ μｇ／ｍｌ）を、トロンビンの添加（最終濃度はＩＵ／ｍｌ）の１分前に、［’ 　Ｈ］−アセテート担持ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに添加した。細胞を５分間インキュベ ートシ、その後上澄を除去した６その後ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに対し、０．１％ゼラ ーナン、メタノール中の５０ｍＭ酢酸（２：ｌ　ｖ／ｖ）を含有する培地を添加 した。標準的技術を使用してＰＡＦを抽皐し定量Ｉ、た［ティ・エム・マクイン チ１／ら、「培養内皮細胞は１、ヒスタミン、ブラジカイニン並びにアデノシン トリリン酸に応答して血小板活性化因子およびプロスタサイクリンの両者を合成 する＋　１．Ｊ、　Ｃ１１ｒ＋、　１ｎｖｅｓｔ、、　７Ｇ、　ｐｐ、　２７１ −８０（１９８５）］　、　３つの阻害剤についてのＩＣ５ｏ値は次のように与 ノられる： １豊ｌ　上二二ＬＬ１Ｍニー しルジン　１４ しルジンＳフ−，４ｉｌ、３６４ スルホ−Ｔ：Ｙｒ＊ｓヒルジン＝、５−ｔｈ４２８１；上た、ＨｌＪＶＥＣへの トロンビン誘導多形態核白血球（ＰＭＮ）付着に対重るスルホ−”ｒ　Ｖ　ｒ　 ６墨−Ｎ−アセチル−ヒルジン９３−ｔｈ４の効果を検討した。１２６子つ゛シ 血清を含有するＭ　Ｅ　Ｍ中でＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃを２４人培養グレー訃に′（群 集になるまで生育させた３培地を除去し、新鮮な血清を含有しない培地で細胞を ２回洗浄し、同じ培地中で３７℃で１０〜・３０分間インキュベートシて血清生 成物を除去した。それぞれの穴に、予め３７℃で平衡化しな１ｒｎｌのＰＭＮ　 （２，５Ｘｉ　Ｏ’　、／　ｒｎ　ｌ　）を添加した。ｉ（Ｕ　Ｖ　Ｅ　Ｃモ、 ルイヤに２分間Ｐ　Ｍ　Ｎを沈降させた。その後、それぞれの穴にスルホ−Ｔ３ ’ｒａ３　Ｎ−アセチル−”ヒルジンｓｓ−＊４＜　５　ＪＡ　ｇ　／　ｍ、　 １　）または塩類を添加し１、その後直ちに１ヘロンビン（０，１または１゜Ｏ Ｕ／ｒｎｌ）を添加した。ａｍを５分間３７℃でイン吉ユベー■・シ、２回洗浄 しｔ−後、位相差頴微鏡て゛検討した。 付着したＰＭＮを直接計数した。結果は、Ｐ　Ｍ　Ｎ付着は、２天ルホーＴ　ｙ Ｙ６ｓ　Ｎ−アセ・ブルーヒルジン’１１１−４１４および０、ＩＵ／ｒｎｌ） ロンビンを含Ｍするナンブルでは完全に除去され、ｉ　、　Ｏｔ、Ｊ／ｍ　ｔ　 ト１ｔン・ビンを含有するナンブルでは７５％阻害されたことを示しな。 犬、ｔｆ！！Ａ−■λ」。 且ｊ　」ｍｚｔ−久１１人男ユｊ Ｎ−アセ　ルーＡｒ５ｓ−しルジンラト６４のＮ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒルジ ン％ｍ−６４を面相ペプチド合成によって調製し、実施例１に記載した手順によ り〉９５％純度に単離した。このペプチドは、血小板糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ と相互作用する多数の付着性蛋白質においても優勢なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配 列を含有する［エム・ディ・ピエルシュハッヘルとイー・ルオスラチ、「フィブ ロネクチンの細胞付着活性は分子の小さい合成断片によって倍増される」Ｍａｔ ｕｒｅ、　３０９．　ＥＩＥｌ、　３０−３３　（１９８４）　］　。 実施例１２に記載したＡＰＴＴアッセイを使用して、Ｎ−アセチル−Ａｒｇ＠ｍ ヒルジンｍ５−ｍ５の抗凝固剤活性を評価した。Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒル ジン＄ト４４は、Ｎ−アセチル−ヒルジンラド６４の７８．９％の抗凝固剤活性 を示した。 また、実施例２２に記載したのと同一のアッセイを使用し、Ｎ−アセチル−Ａｒ ｇｓｓヒルジン５Ｍ−６４による血小板活性化の阻害を測定した。ただし、血小 板凝集を、コラーゲン（４０μｇ／ｍｌ）またはＡＤＰ（１０μｌ）の添加によ って刺激した。第１７図は、Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒルジン５トロ４は投与 量依存様式で血小板凝集を阻害し、コラーゲン誘導凝集について約１９０μｇ　 ／　ｍ　１のＩｃｅ。およびＡＤＰ誘導凝集について４９０μｇ　／　ｍ　１を 有することを示す。 これらの結果は、Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓしルジンラト４４はトロンビン媒介 血栓を遮断でき、これはフィブリノーゲンの開裂または血小板の活性化のいずれ かを介し、また、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンボキサンＡ２また は血小板を活性化する他のいずれかの化合物についても同様であることを示す、 更に、Ａｒｇ　Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列は、このペプチドが血栓を標的とするよう作 用することができ、これによりその部位におけるトロンビン阻害剤の局所濃度を 増加させる。 Ｋ１且１１ 化学量論量のスルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン！４−１４とジニトロジフルオロベン ゼン（ＤＮＤＦＢ）とをジメチルホルムアミド中で反応させることにより、ヒル ジンアナログジニトロフルオロベンジル−スルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン１４−６ ４（ＤＮＦＢ−スルホＴｙｒ、、ヒルジン５４−６４　）を合成した。 反応混合物を２４時間２２℃でインキュベートし、その後これを真空下で乾燥し 、水中の０．１％ＴＦＡに再溶解した。 アクアボアＲＰ　３００　Ｃ＃オクタシリルカラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ）を 用い、得られた生成物をＨＰＬＣクロマトグラフィによって分離した。最初にカ ラムを水中の０．１％ＴＦＡ　（溶１ＸＡ）で平衡化した。サンプルを装填後、 ４５分間に渡り０〜５０％の溶媒Ｂ　（０，０８５％ＴＦＡ／７０％アセトニト リル）のりニヤグラジェントによりカラムを展開した。流出流は２１４ｎｍの吸 収についてモニタした。 ＤＮＦＢ−スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジン５．−〇は４８％溶媒Ｂで溶出した。 ２工程の方法でヒルジンアナログニトロアニソール４ｓヒルジン５５−ｍ５を合 成した。最初に、実施例１に記載したように、固相合成技術によりメトキシチロ シル、、しルジン５ト４１を合成した０合成において、Ｂｏｃ−０−Ｌｅｕ樹脂 をＢｏｃ−０−メトキシチロシン樹脂に代えた。ＷＭ脂からペプチドを取り、第 １図に示したようにバイダック０４カラムによるＨＰ［、Ｃによッテ精製した０ 次に、２０ｍＭトリス−ＨＣ１、ｐＨ８，０中でこれに過剰のテトラニトロメタ ンを添加することにより、精製したメトキシチロシル、Ｓヒルシフ８％−４５を ニトロ化した０反応物を２７℃で４時間インキュベートした。 得られた生成物を凍結乾燥し、２０ｍＭの重炭酸アンモニウムに再溶解し、予め 平衡化したバイダック０４カラム（ＩＸ３０ｃｍ）により脱塩し、２０ｍＭ重炭 酸アンモニウムにより溶出させた。ニトロアニソール４ｓヒルジン５ト４ｓの分 離は、前記したようにアクアボアＲＰ−３００Ｃ８オクタシリルカラム（０，４ ６Ｘ３．Ｏｃｍ）によるＨＰＬＣによって行った。 Ｋ立■ユ玉 トロンζ乙り四虹りしニシヒ辷二りヨ二バ」」シュ、１との　ム　ム　り　の一 実施例２５に記載した手順に従い、ＤＮＦＢ−［′ｓＳ］　−スルホＴｙｒ、、 しルジンロ−６４を調製した。出発物質として、硫酸化手順（実施例１ｏ参照） の際にＨｔ　［”Ｓ］　０４を使用して硫酸化したスルホ−Ｔｙｒ、ｓヒルジン ラド−４４を使用した。 １０倍モル過剰のＤＮＦＢ−［”Ｓ］−スルホＴｙｒ、、ヒルジン！４−４４を 、リン酸緩衝塩類中に０．３５ｎｍｏｌのヒトトロンビンを含有する溶液に添加 した。この混合物を３時間インキュベートした後、サンプル上で５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（１２，５％アクリルアミド）を行った。オートラジ オグラフィの後、トロンビンの大きさに対応するバンドを視覚化した。５０ｔた け５００倍過剰の非ラベルＮ−アセチル−スルホ−Ｔｙｒｂｓヒルジン！４−４ ４の存在下で結合工程を行うと、共有結合複合体の形成は遮断された。 この発明の多数の態様を前記したが、その基本的な構成を改変して、この発明の 方法および生成物を利用する他の態様を提供し得ることは明らかである。したが って、この発明の範囲は、ここに添付する特許請求の範囲の記載により特定され 、例として前記した特定の態様によらないことが理解されよう。 ２ざ　ア−ｔ：ｔ＝ｎｌｔｙ Ｆ７θ　２どσノ　Ｆ／θ　２とｂノ ＦＩＧ、２とＣノ ＦＩｏ、　３ Ａ、ｃ＞ｒｒ（ｓ’。 Ｎ　吐 十子信−ｒ五ム（４ｂａ＆”ｊか尿 ＦＩ６．９ １０　１００　７５０２００２５０　ＸＸ）ヌ＋ｂｄ−吾／６３　ヒルノン　ｓ ：ｔ−ｂ４　（メツ９）ｌｚ（１＞ｔ　・１４　（％） Ｉ：ｌ（′：１２ Ｌｙｓ−ｋｓｎ４１ｙ−ｋｓｐ−ｔｈｅ−Ｇｌｕ−にＬｕ−！１ｍ−Ｐｒｏ−（ ：１ｕ−Ｇｉｓｓ−丁ｙｒ（５０３）−Ｌ＊ｕ−Ｌｙｓ＾５ｎ−Ｇｌｙ−＾５ｐ −ｙｈ＊−０１ｕ−Ｇｌｕ−人１ａｌ（：１）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−丁ｙ ｒｌｓＯ３）−Ｌ＊ｕ入ａｎ−Ｇｌｙ−人５ｐ−Ｐｈ＊−Ｇｌｕ−ＧＬｕ−人１ ａ（ＣＬ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−５ａｒ−テｙｒ（５口、）−ＬｅｕＣｙｓ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＧＬｕ−ＧＬｕ４Ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃ１ｕ−（Ｌｕ−丁ｙｒ （Ｓｏ、）−ＬｅｕＦＩＧ　／６ 〃−凡七し　−　スＪ、−７）’／”６３　Ｅ：＋ｋ）’＞　５３−５４（Ｂ１ ７ｇ＜９′４″７５３　ヒ１しジ°’５３−６４　（ｐＭ）国際調査報告 ] administration as well as topical application. The rate of administration and dosing will depend on the particular composition, the purpose of the treatment, i.e., therapeutic or prophylactic, and the judgment of the treating physician. may depend on various factors. Injectable compositions may be in the form of freeze-dried solids or solutions for topical application. The composition may be in the form of an aqueous jelly, an oily suspension or an emulsifying ointment, for example. I can do it. The resulting formulation is useful for preventing or reducing blood clotting. It contains an effective amount of Hiruji〉・Bebuti f. For administration by injection, the peptides of the second invention are usually administered at a dosage of about 0.2 to 751 ng/kg body weight, preferably 5 to 10 mg/kg body weight. There may be a range of daily dosages. Methods for determining effective dosages are known to those skilled in the art. However, the dosage of these drugs is lower than that of other thrombolytic agents or those recently used, for example, about 3-5 mg/kg body weight or less. Post-maintenance dose of 7 mg/lvr i , v for about 7·-10 doses. shall be. PEG derivatization of this invention; lumi,-nibegutide is a combination of the original These doses are advantageously much lower than those specified above for the non-induced peptides since they exhibit a longer half-life when compared to the non-induced peptides. The compositions and combinations of this invention further contain other ingredients effective in fibrinolytic therapy. These include, but are not limited to, tissue plasminogen Achnabeta, urokinase, and leptokinabi are included6.: These other compounds may be used in combination with another ingredient in the composition containing the hirudivepti of the invention of item 2.i. It can exist. Others 2. - Noshiludin peptide is a compound of this kind. It can be mixed with a fibrin-dissolving agent. Conjugation can be carried out by any method known in the art, such as siluzine peptide and quipurin 144J (I, as a single molecule, using Zunawaji recombinant DNA technology or in vitro conjugation). The present invention also relates to compositions containing the siludin peptides of this invention, and methods of using such compositions in the treatment of tumor metastases. The effectiveness of the hirudin peptides of the present invention for the treatment of tumor metastases through inhibition of sexual growth is based on the presence of precoagulant enzymes present in certain cancer cells [Ni Falanga and Nishji – Gorton, “Isolation and Characterization of Cancer Precoagulants: Dystine Derived from Malignant Tissues” "Glothiase", Biochemistry, 24. pp, 5558-67 (1985); Niss G. Gorton et al. Cysteine Proteinase Precoagulant J, Blooct, 66, pp. 1261-65 (1985); A new precoagulant in Chemia J, Blood, 7L pp, 870-75 (1988)], this enzyme activates the conversion of factor X to factor X a in the coagulation cascade, resulting in fibrin precipitation and then as a substrate for tumor growth (acting as a factor) (a) through inhibition of thrombin or both By inhibiting the precipitation of brine. The luginbebutide of the present invention acts as an effective anti-metastatic tumor agent. Pep of this invention Examples of metastatic tumors that can be treated with Tide include, but are not limited to, brain carcinoma, liver carcinoma, lung carcinoma, bone carcinoma, as well as Includes neoplastic blastoma cell carcinoma. The invention also provides a method for treating thrombocytopenia using low doses of the peptides and analogs of the invention. The present invention relates to methods and compositions for inhibiting thrombin-induced platelet activation and thrombin-induced endothelial cell activation. Inhibition of endothelial cell activation performed by the methods and compositions of this invention includes This includes inhibition of platelet activating factor (PAF) synthesis by these cells. This mechanism of inhibition has important implications in the treatment of diseases characterized by thrombin-induced inflammation, which is thought to be mediated by PAF. The invention also provides compositions comprising low doses of the peptides and analogs of the invention, and their use in the treatment of patients with diseases characterized by thrombin-induced inflammation. Regarding how to Diseases of this type include, but are not limited to, adult respiratory distress, septicemia, sepsis, and local reperfusion injury. By using low doses of hirudin peptides, it was surprisingly and unexpectedly possible to achieve the aforementioned inhibitory activity in treated patients with minimal anticoagulant activity. can be done. However, the use of low doses of hirudin peptides suggests that the treatment of diseases characterized by inhibition of platelet and endothelial cell activation or thrombin-induced inflammation may be accompanied by anticoagulant effects. Advantageous in situations where it is desirable without consequences. Preferred compositions for inhibiting platelet and endothelial cell activation according to this invention are about 0. 0001 mg/kg body weight to about 0.099 mg/kg body weight. More preferably, these compositions contain from about 0.001 mg/kg body weight to about 0.05 mg/kg body weight. Consists of weight. The invention also relates to the use of hirudin peptides or compositions containing them as anticoagulants for extracorporeal blood. As used in this application, the term "extracorporeal blood" includes 2. removed from the patient via a conduit, subjected to extracorporeal treatment, and then dialysis This includes blood that is returned to the patient in a procedure such as blood flow or hemofiltration or blood bypass during surgery. The term also includes blood products that are stored outside the body for ultimate administration to the patient. Products of this type include whole blood, plasma or any blood fraction in which clotting is desired. Compositions of this type are similar to the injectable preparations described above. The amount or concentration of these types of active peptides is based on the volume of blood being treated, or more preferably its thrombin content. It is possible. Manako's invention relates to the bioanalytical use of hirudin peptides or to blood samples. The present invention relates to a composition containing these for measuring factor IXa, factor Xa, thrombin, or a mixture thereof. These peptides and compositions can be used in a manner similar to reagents used in conventional assays. Additionally, the peptides of this invention can be utilized in currently available methods and kits designed to detect Factor IXa, Factor Xa, thrombin, or mixtures thereof. Furthermore, the peptides of the invention can be used for in vitro thrombosis imaging in humans and other animals. It can be used for In one aspect of this invention, the lugin pegtide is Radioactively label with geoisotope. Selection of radioisotopes is based on a number of well-known factors, including, but not limited to, toxicity, biological half-life, and detectability; suitable radioisotopes include, but are not limited to, I2%l, I''I, and Techniques for labeling peptides are well known in the art.The most preferred Preferably, the radioisotope is 1231 and the labeled peptide is labeled using the 1211-Polton-Hunter reagent, preferably by intravenous route, and the labeled peptide is administered to the patient to induce binding to thrombin contained in fibrin cloves. line This clock 1~ is then detected by well-known detection means, such as a computer image. observation by using a camera capable of detecting radioactivity connected to a radioactivity monitoring system. Sympathize. In addition, this technology is capable of inhibiting platelet binding), thrombin, and meizothrombin. give a message. This invention also provides a peptidomimetic analyte of the siludin peptide described herein. Regarding logs. Peptidomimetic analogs mimic the three-dimensional structure of the active site contained in the parent peptide. These analogs are According to Mr. W of the present invention, siluzinpep Tide analogs can be semi-peptidic or non-peptidic in nature. These peptidomimetic analogs advantageously exhibit increased shelf life and biological stability when compared to the parent compound, and furthermore, the peptidomimetic analogs of the present invention The bioavailability of dometic analogs is determined when administered by oral or topical routes. may be larger than the corresponding peptide. Furthermore, these analogs exhibit increased anticoagulant activity. The present invention also provides a siluzin peptide of the present invention that can form a covalent bond with thrombin. Concerning the analog of According to one embodiment, these analogs are characterized by the presence of a dinitrofluorobenzyl group attached to the amino terminus of the peptide. Other W! According to Mr. A, these analogs include tyrosine or derivatized tyrosine substitutions, Both analogue types, which are characterized by troanisole at the carboxy-terminal residue and any other (by troanisole), have the ability to form a covalent bond with thrombin and therefore have greater affinity for that molecule. As a result of this greater affinity, these hirudin peptide analogs have substantially greater potency than other hirudin peptides of this invention that bind thrombin via ionic interactions. have power. The peptidomimetics and covalent analogs of this invention are It should be understood that the peptides are characterized by biological activities similar to those of the peptides. Ru. Thus, in the same manner as the peptides of this invention, these analogs can be used in compositions, combinations and methods of diagnosis, treatment and prophylaxis. Mana this invention specifies the substitution of 5pqs or Asn5i for the arginine residue. The present invention relates to a hirudin peptide identical to the peptide described above except for the characteristics. These peptides contain the AI-g s3-G 1 ys di-ASpss sequence that binds to and inhibits platelet surface glycoprotein IIb/IIIa. These peptides are Most unexpectedly, all agonist-induced platelet activation Furthermore, the presence of the Arg-Gly-A sp sequence makes it possible to target these peptides to sites in platelet-rich lots. Once the peptides reach this target, they inhibit both additional platelet aggregation and fibrin production. This action avoids blood clot interception, thereby effectively imparting increased clot lysis. These novel peptides can be used in compositions and methods that achieve the dual effects of increasing clotting time and inhibiting platelet activation. According to another aspect of the invention, one or more of the hirudin peptides or analogs Any combination of these may be used in compositions and methods for coating invasive devices that are inserted into a patient. can be done. These compositions and methods result in a reduced risk of thrombotic complications in patients receiving devices of this type. Surfaces that can be coated by the methods and compositions of this invention Examples include prostheses, artificial valves, vascular grafts, stents, and catheters. Techniques for coating these surfaces are known in the art. These include chemical cross-linking or physical adsorption of ludinebebutide or analog-containing compositions to the device surface. In order that this invention may be more fully understood, the following examples are included. It is to be understood that these examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the invention in any manner. In all examples of peptide synthesis described below, amino acid analysis of the synthetic peptides was performed. Amino acid hydrolysates were prepared by treatment in 6N hydrochloric acid under vacuum at 110° C. for 24 hours, followed by ion exchange chromamography using a Beckman System 6300 analyzer. Synthetic peptides were typically analyzed for purity by reverse phase HPLC. Unless otherwise indicated, each Beckman liquid chromatography system or Using a Ride Biosystems 150A chromatography system, The peptide sample (20.~100 μg) was applied to a Vydac C4 column (0.46X25crn)* or an Aquabore RP-300C@ column (0.46X3.Ocm). Equilibrated in water containing fluoroacetic acid (TFA) and developed using a gradient of increasing acetonitrile concentrations from 0 to 80% in the same TFA-containing solvent. The gradient was run at 1.0 ml/min. The elution stream was monitored for absorbance at 215 nm, m for 30 minutes at a flow rate of 17. The AquaBore C8 column was equilibrated in water containing 0.1% TFA and O. Developed using an increasing gradient of ~70% acetonitrile. The sample I- was developed for 45 minutes at a flow rate of 0.5 mJ-/min, after which the elution stream was monitored for absorbance at 214 nm rrt. Ta. Inu Plate-1 Wataru, Lujin 5! -64 and Hiruto 41-44 (Kobetsu or Hirujin S! 1-44 has the amino acid formula: H2N-Asn-G1y-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Giu-'ryr-Leu-COOH. Hiruzinct, , is the amino acid formula; -GXu-Glu-Tyr-L eu -C,00H. Dirt 1. , a single synthetic moiety), 7, and a Pride Biosystems 430A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems) by solid-phase peptide synthesis using It was prepared using In particular, 0.259 meq of Boa-Leu-0-resin (1% divinylbenzene resin) (DVB)) was sequentially reacted with 2 mmol of protected amino acids. ii, ? After synthesis of the polymer, 0.42 g of wet resin was removed from the reaction vessel. The remaining 0.43 g of wet resin was reacted twice with 2 mmol of protected amino acid following one cycle. In this way, hirudin was synthesized using [2]. 14 and I nyldine 411-64 were fully deprotected and freed from the resin by treatment with anhydrous HF:P-cresol:ethylmethyl sulfuric acid (10:1:i, v/v, 'v). Open Torn. The yield of peptide is; fil-resin4? -44 and Pilge N5t. 4 and 56% and 53%, respectively. Separate HPLC analysis of the peptides ensures a high degree of purity and For hirudin 41-64 and hirudin'J)-1!4, 214 nm K1 and Yu eluting at 16.3 minutes and 16.3 minutes. - Tr=Leu Hirudin 5 Toro 2 no 4 Des (Tyr-Leu) Hirudin 9 M-62 has the amino acid formula 2H2N-A, 5n-Gly-Asp Phe-Glu- Glu-X Ie-Pro-Glu-Glu- It has COOH. Tyr-Leu hirudin 11-62 was prepared as follows: First, carboxypeptidase A was prepared. Mainly R.B.Amb. [Enzymatic Hydrolysis by Carboxypeptidase J, Hetho, ds EnzyIlol, 25. According to Part B, pp. 143-54. fermentation 1. Onng at 4°C. The suspension was suspended in Qml of deionized water and centrifuged in a microcentrifuge. The supernatant was drained and 100 μm of 1% sodium bicarbonate was added to the pellet. Then, 0.0% until the precipitate is dissolved. 1N NaOH was added dropwise. Then 0.1. The pH was adjusted to 8.0 by dropwise addition of NHCl. 0.1MN-ethyl The enzyme concentration was adjusted to 1 mg/ml by adding lumorpholine acetic acid, pH 8,25. 1.3 mg of hirudin 53-64 prepared in Example 1 was dissolved in 250 μl of N-ethyl morpholine acetic acid, pH 8.25 (containing 1.0 M NaCl). Thereafter, 30 μm (30 μg) of carboxypeptidase A prepared above was added, and the reaction system was incubated at 37° C. for 2 hours. Aquabore RP 300C* column (0,46x3.Oc m ) and Apra Peptide fragments were purified by reverse phase HPLC using an ID Biosystems 150A liquid chromatography system. Equilibrate the column in water containing 0.1% TFA and run a gradient of increasing acetonitrile concentration from 0 to 35% over 45 minutes at a flow rate of 0.5 ml/min in a solvent containing 0.085% TFA. It was developed using The elution stream was monitored for absorbance at 214 nm. Both fractions were collected manually. The amino acid composition and effect on the clotting time of human plasma were determined. and analyzed it. Tyr-Leu hirudin% 5-62 is It was observed that it elutes earlier than both Luzinrad and Shizuku. Yinfeng Yu Hirujin, 744 mu Hirudin 57-44 has the amino acid formula: H2N-Glu-Glu-Ile-Phe-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH. Hirujin S? To synthesize -64, the procedure outlined in Example 1 was followed. However, 0.55 mmol of Boc-Leu 0CH2P AN resin (1% DVB) (Applied Biosystems) was used instead of Boc-Leu-0 -resin (1% DVB). Thereafter, 2 mmol of protected amino acids were added in each cycle of conjugation. crude bae The yield of putide was 17.9%. Gradient odor was determined by HPLC analysis. A single major peak was revealed, eluting at 14.2 minutes. X Yutaka [4 Hirudin 45-44 2 scans Hirudin 4%-64 has the amino acid formula: Ht N-Thr-Pro-Asn-Pro -Glu-3er-Hl 5-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu -Glu-11e -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH. The procedure outlined in Example 2 was followed in which hirudin A%-44 was synthesized using 0.259 meq of Boc-Leu-0-resin (1% DVB). However, for the first 13 cycles of synthesis, 2 mmol of protective atom was used in each conjugation step. I used amino acids. For the remaining 6 cycles of synthesis, 2 mmol of the protected amino acid was used twice. The peptide was fully deprotected and unconjugated from the DVB resin by treatment with anhydrous HF:p-cresol:ethyl methyl sulfate (10:1:1, v/v/v). Approximately 100 mg of peptide was recovered by extracting the resin with 30% acetic acid. The yield of hirudin 4%-164 was 17%. HPLC analysis showed a high degree of purity (>90%) and acetonitrate in the product. A single major peak of the 214 nm absorbing substance at 214/14.4 in the Lil' gradient was revealed. shaku152 Hirujin%%-64mu Hirudin s%-64 has the amino acid formula: Hz N-AsP-Phe-Glu-Glu-I 1e-Pro-Glu-Glu-Tyr-L e II-COOH. do. Hirudin 5S-64 was prepared by the procedure outlined in Example 1. 0.0 259 meq of Boc-Leu-0-resin (1% DVB) was used. Then, 2 mmol of protected amino acids were added to the growing peptide in each conjugation cycle. Deprotection and cleavage from the resin was performed as in the previous example. The recovery rate of this peptide was 30%. HPLC analysis revealed a high degree of purity (>95%) and acetonyl A single major peak at 16.1 minutes in the Toryl gradient was revealed. Hirudin 64-4% 4 Hirudin 64-45 has the amino acid formula: Ht N-Leu-Tyr-Glu-Glu -Pro-I 1e-Glu-Glu-Phe-Asp-Gly-Asn-As n- Has His-3er-Glu-Pro-Asn-Pro-Thr-COOH do. Hirudin 64-48 was synthesized by the procedure outlined in Example 1. However, 0.259 meq of Boc-0-benzyl-Thr-0-resin (1% DVB) was used instead of Boc-Leu-0-resin (1% DVB). first 6 sa For each conjugation step, 2 mmol of protected amino For the remaining cycles of acid-based 0 synthesis, 2 mmol of protected amino acid was used twice. The peptide was fully deprotected and unconjugated from the DV B resin by treatment with anhydrous HF. After extraction with 30% acetic acid, 120 mg of peptide was recovered and the yield of hirudin 64-41 was 19.9%. HPLC analysis of the peptides revealed a high degree of purity (>90%) and a A single major peak eluting at 13.7 minutes on the settonitrile gradient is evident. It became clear. Hirudin 44-4% was used as a control to measure the anticoagulant activity of various peptides of this invention. X1 L Hirujin $4-44 Mu Hirudin 54-64 has the amino acid formula: H2N-G1y-Asp-Phe-Glu-Glu-I1e-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH. Hirudin 54-64 was synthesized by a procedure similar to that outlined in Example 1. The protected amino acid of 2rnmol I was synthesized in each of the conjugation cycles of the 6 syntheses. After synthesis using acid, the peptide was fully deprotected and unconjugated from the DVB resin as in the previous example. HPLC analysis revealed a high degree of purity (>60%) in the product and a single major peak of 214 nm absorbing material. On Tuesday, I tested the above-prepared hirudin peptide by HPLC for the purpose of activity analysis. lugin 4%-64, hirudin 49-64 and hirudin 15-64 in water. The crude peptides (25 mg each of hirudin 4%-64, hirudin 49-64 and and 30 mg of hirudin 5M44) were dissolved in 2.0 ml of 0.1% TFA in water. I understand. An additional 1.0 ml of the 6M salt, guanidium chloride, was added to the crude samples of Hirudin 11-44 and Hirudin 53-44 to increase solubility. Samples were separately injected onto a Vydac C1 column (22 mm x 25 cm) previously equilibrated in 0.1% TFA in water. Increasing acetonitrile concentrations from 0 to 80% over 45 minutes in the same TFA-containing solvent at a flow rate of 4.0 mL/min. The column was developed using a solvent. The elution flow was monitored at 229 nrn and fractions were collected manually. Other hirudin peptides according to this invention can be similarly prepared and purified. Shakuse 1J. N-acetylation of ludinbegtide of this invention is performed directly during peptide synthesis. 9%-164 was synthesized by the basic procedure used to synthesize hirudin $1-44 as described in Example 1. However, in order to perform N-acetylation, we modified the procedure and added 2 mm, ol of asparagus in the final cycle of peptide synthesis. Other peptides of the invention that underwent 2 mmol of N-acetylasparagine conversion were similarly converted to non-acetylated form in the final cycle of peptide synthesis. This can be done by substituting the N-acetyl form of the amino terminal amino acid. X 凰正" 1 見肚小ヱ△11-Nita 1JJuti L Hirudin $3-114 is 〇-sulfated with a tyrosine residue to produce sulfo-Tyr,, hirudin. Gin $3-44 was prepared. Tanari et al., “Tyrosylation from non-sulfated peptide precursors” Preparation of sulfated cholecystokinin octapeptide J, Anai, Biochei. 154, pI), 194-99 (1986). 1.5 mg of hirudin 5j-44 prepared in Example 9 was added to 50 μl of dimethyl vol. 2. Dissolve the solution in Muamide and dry the solution under N2. The peptide was then transferred to 40 μl of dimethyl vol. 50 μg of N in 40 μIDMF (7,0×IO−’ mol) was dissolved in S-Mamide (DMF). Adding a solution of IQ)i, l containing A-zylcarbodiimide to N-dicyclo added. After allowing the reaction to run for approximately 5-10 minutes at 25°C, 750 μm of deionized water was added. Prior to further purification, the entire amount was removed by centrifugation using a microcentrifuge. The insoluble reaction products were removed and the 7sulfoTyr,zhirudin 11-44 was purified from other peptides and reaction components. Ba, Idak C1, column (4,6X25cm) and Applied Bi By HPLC using an Osystems liquid chromatography system. Equilibrate the column with 0.1% TFA-water solvent. 12. Using a solvent containing 0.085% TFA, 0.8 m! Acetonitrile Li-Li increasing from 0 to 35% over 90 minutes at a flow rate of /min. Nine cars developed using a glue gradient were collected, dried in a Speed Vac device, and resuspended in deionized water. As shown in Figure 1, 214nrn absorption Multiple beaks of collected material were analyzed. By assaying the peaks for anticoagulant activity, two effective sulfo-Tyr ss hirudin, - - containing fractions, Beaks A and B, No. 10) were identified. Ultraviolet spectrum analysis of Beak A at neutral pH revealed an absorption maximum between 258 and 264 nm, indicating the presence of modified tyrosine residues. Amino acid analysis of the Beak A peptide revealed that Hirujin! Addendum 1B-14 was confirmed. The data shows that beak A is sulfo-Tyr, hirudin, 4. It was shown to contain 17. Surbo Tyr &! The peptide of Beak A, in which the presence of Hirudin '3$-64 was confirmed, was treated with 30% TFA at 60'C for 1 hour to remove the sulfate group. The resulting peptides were dried, resuspended in water, and subjected to reverse-phase HPLC. Ta. Using Aquabore RP-300C, column (0-4-6X 3-Ocm) and Applied Biosystems 150A HPLC instrument. Ta. Equilibrate the column in water containing 0.1% TFA and Increasing acetate from 0 to 70% over 45 minutes at a flow rate of 0.5 ml/min in solvent It was developed using a gradient of nitrile concentration. This peptide is a non-sulfated leech It exhibited HPLC chromatographic behavior identical to that of Jin 1B-44. Furthermore, treatment The peak absorption of the treated peptide returns to 275-280 nm, which is similar to that of the unmodified tyrosine. This was typical for peptides containing a single residue. The sulfation procedure described above was then applied to the corresponding large amount of N-acetylated peptides. Ta. As shown in the HPLC chromatogram of FIG. 2a, treatment of 25 mg of N-acetyl-hirudinrad 44 (prepared in Example 9) by the Nakahara method yielded 80. The desired Tyr-KH reaction product was produced in 1% yield. However, the reaction was proportionally spread to 50 mg of N-acetyl-hirudinrad 64. This experiment resulted in a yield of 48.5%, which markedly improved the chemistry of the Nakahara process. We achieved high yields of Tyr-IFEnated derivatives in large-scale sulfation reactions. More specifically, 40 ml of dimethylformamide in the presence of 5.0 ml of N,N-dicyclohexylcarbodiimide (0.2 g 10.16 ml of dimethylformamide) 1 g of N-acetyl-hirudin 53-44 was dissolved in the amide. The mixture was stirred at O'C and 0.5 ml of concentrated sulfuric acid was added dropwise to the reaction mixture until a precipitate formed. After 5 minutes, the reaction was stopped by adding 40 ml of water. Reverse phase HPLC separation of the compound (Figure 2c) revealed a yield of 81.7% of the sulfated peptide. and sulfo-Tyro-N-acetyl-hirudin 9s-64. ! Large-scale purification of the purified ludin peptide was then performed using a one-step anion-exchange chromatography process. It was done by matography. Specifically, crude sulfo-Tyrij-N-acetyl-hirudin 1j-44 was purified on DEAE Sephas (250 ml wet resin 15 g crude peptide). Pre-equilibrate the column with 20mM sodium acetate. Samples were loaded in 100 ml, pH 5.0. The column was developed with a linear NaCl gradient (0-0.4M). Sulfo-T7rasN-acetyl-hil Jin 9B-64 eluted at approximately 0.2-0.3 M NaCl, after the unsulfated peptide but before the sulfated byproduct sulfo-Tires-N-acetyl-hirudin 5s-64. Other lugin peptides of this invention can be sulfated, purified, and analyzed by the same procedures described above. N-acetyl-hirudin 5N-64 was modified to form its Tyr-sulfonated derivative, sulfonyl- TyrssN-acetyl-hirudin 5 4 4 sulfonyl-ryr, N-acetyl-hirudin! +1-44 is a side reaction product obtained during the large scale sulfation reaction described in that example. Thus, sulfonyl-T'5'r*sN-acetyl-hirudin 1,44 was obtained in a yield of 30-40%, and sulfo-T'5'r*sN-acetyl-hirudin 1,44 was obtained in reverse phase HPLC fraction M (see Figure 3). It is observed that it elutes before $3-6ff. Dog Part 1 Assay This example demonstrates the inhibitory activity of the hirudin peptide of this invention against thrombin. shall be measured by inhibition of activated partial thrombin time (APTT). Ru. Anticoagulant activity was determined using a Coagul A-Meta 2001 instrument (General Diagnostics, Morris Brains, New Chassis) and pooled normal human plasma (George King Biochemical, Overland Pars). It was determined by assaying the APTT of the blood cells (4:1, v/v, plasma:water diluted). For details, diluted plasma was added to the stock solution of hirudin peptide. mixed with liquid. The concentration is 750 JJ, g/ml in water (non-sulfated hirudin peptide). (for oxidized hirudin peptide) to 35 μs/ml (for oxidized hirudin peptide) in water. Plasma and hirudin peptide were mixed in a final volume of 125 μl before each APTT measurement. For each APTT measurement, the Core A-Meta-Dish (General Diagnostic Add 92 txl of crude thromboplastin solution (General Diagnostics) and 100 μl of 0.3M calcium chloride to each well of the The APTT assay was started by adding the sample reagent. Calcium chloride was prepared fresh before each assay. Upon activation The time was kept constant at 180 seconds. The results of such an assay comparing the APTT of hirudin 53-64 and sulfo-Tyr is-hirudin@M-44 are shown in FIG. non-sulfated pepti STEP 1, which has been shown to advantageously exhibit a higher level of activity in increased coagulation than The sulfonated peptide, sulfonyl-'ryr, hirudin 1B-44, Ho-Tyr, showed a similar APTT as observed for Hirujin 5 and Toro 4. did. FIG. 5 shows the M CT s of various hirudin peptides of this invention. (nmo 1 of peptide per 125 μl diluted plasma required to increase clotting time to 50% of the maximum net increase observed in the APTT assay). This pep showing M CT s o The sulfated counterpart of tide, sulfo-73'rohirudin 51-64, is a MCT s. Advantageously, an approximately 10-fold increase in . An unsulfated peptide lacking an asparagine residue (ASnss), hirudin 5γ-64, had no effect on increased clotting time when compared to the negative control peptide hirudin 64-45. same Similarly, a peptide that does not contain tyrosine residues, Tyr Leugin-62, did not show a comparable increase in clotting time. The presence of an asparagine residue (corresponding to Asil ss of the published HV-2 sequence) and a thousand rosin residue (corresponding to Tyr6s of the hirudin sequence) contributes to this development. It is thought to be important for the anticoagulant activity of the peptides. All of the ludin peptides that produce a decrease in M CT so behave similarly in a biphasic dose-dependent manner, where firstly a narrow range of peptide concentrations leads to a 20 s increase in APT T . A second wider range of peptide concentrations resulted in an additional 10-15 seconds increase in clotting time. In order to analyze the specificity of the inventive thrombin peptide for thrombin, We investigated its effect on increasing thrombin time (TT) and time was measured using the tilt tube method. For details, see 0゜i 5M NaC at a concentration of 2.5U/ml! Human α-nitrombin (Diage, 7 Nonutica staga, Asniere, France) was dissolved in 0,0 1M Tris-HCl, pH'7°4, containing 10 mM CaCl2 and 10 mM CaCl2. Premixed with 10 μg/m h of sulfo-Tires hirudin 5N-4 (0.8 U/ml final concentration of rhombin) and l': = 200 μl of normal human plasma (distillate). The thrombin time of 7 normal plasma mixed with 100 μl of Thrombin solution (Josiah King Biomedical, KA) was typically 15 seconds. Figure 6 shows a comparison of the increase in thrombin time by hirudin (Sigma, Sen. Lewis, MO) and sulfo-Tyr4s hirudin. Concentrations of 3.3xto-"M sulfo-T'yr*s hirudin 51-6. increased T T by 1S to 55 seconds. Comparison to sulfo-T'yr*s hirudin 51-64 showed an approximately 50-fold greater molar-specific inhibitory activity against thrombin, which is the same relative inhibitory activity observed in APTT Azusei. The ability was demonstrated by hirudin 54-44. A 2-fold decrease in the inhibitory activity of ik resulted upon removal of the asparagine residue corresponding to ASn s3.C from hirudin lff-44. - Removal of the terminal 1”yr and Leu residues results in an invalid A peptide with no proper inhibitory activity, hirudin 5-toro 2, was given. Jin 9N-64 < Sulfo-Tyres hirudin 5m-64) has its non-sulfated counterpart. 3 Based on these observations, the C-terminal amino acid residue of the 9-element siludine peptide showed a 10-fold increase in clotting time when compared to It is believed that at least some of the anti-thrombin activity of the bifluorescent protein acts. Additionally, a fragment contained within the C-terminal residues of the original hirudin (hirudin In the opposite direction to the peptide chain, i.e., C001-f to N1 (2nd end), a ``distinction'' was found homologous to a fragment contained within the proposed thrombin-binding domain of human thrombomotinillin. - Wen et al., [Cyto's) cZ DNA sequence, 2: 2 cDNA sequences and distant genetic chromosomes, Binch effis↑ry. 2G, DI], 4305-57 (1987)]. Thrombomotilin is an endothelial cell glycemic protein that forms a stoichiometric complex with the endothelial cell. Go J, 5science, 235. pp. 1348-52 (1987) Identification of homology between the C-terminal @ fragment in hirudin and residues 150 to 155 of the thrombocadeulin precursor suggests that this fragment in thrombocalmodelulin contributes to complex formation with thrombin. 10-16 (1987), 10-16 (1987); Both the formation of the urin-1 and thrombin complexes are It was previously shown that the intermediate site confers proteinase. These observations also indicate that the structural components of fibrinopeptide (in the production mode) and both 1-lobomodeco6rin and hirudin (in the inhibition mode) interact with the substrate recognition site in thrombin, thereby inhibiting the release of fibrinogen. Indicates that the bond is compatible. It is thought that the binding of the thrombin peptide to thrombin causes the activation of protein C2, which further promotes the protein C-mediated in vivo anticoagulant properties of factor Va and a. Hirujin is Toro It is unlikely that this shares this property since it reduces the catalytic activity of thrombin.Thus, the anticoagulant activity of the siluzinbegutide of this invention could be derived from the binding of the peptide to the non-catalytic site of thrombin and It is believed that -J gives an increased value for thrombin-catalyzed hydrolysis of fibrinogen. "Yu" The specificity of the glutin peptide for human 1 and α-tronabine was demonstrated in the TT assay.・α-Tron It was determined by comparing its relative inhibitory activity against both thrombin and bovine α-thrombin. Figure 7 shows sulfo-T yr &! B-N-Acetyl-Hilji N S! 1-44 is an inhibitor of human α-thrombin from bovine α-thrombin. Then 4~. - is 5 times more active. Human α-thrombin and bovine α-thrombin are extremely similar in structure. The presence of a unique resin residue at position 1.49 of the β-chain of the human molecule is distinct. This residue does not specify the site of 7.-autocatalytic degradation. Lys·-149 of human α-thrumbin is considered to be an important structural determinant for the binding of the thrombin peptide of the present invention to thrombin. Himi, 14 The interaction between hirudin and thrombin has been shown to be reversed by heparin/antithrombin III [Niss R.S. and J. Hofsterdzi, 1. Effect of heparin on the interaction between J and E'1. ．． i, B10ChelI1. , 169. D! ], 3 73-3-/6. (’t987)] 1. This result suggests that hirudin and heparin This is due to the fact that both antithrombin and antithrombin form a complex with epsilon thrombin without blocking the catalytic site of the enzyme. The hirudin peptide of this invention It was observed that the fibrinogen solubility of M. nigra was inhibited, but the amidolytic activity was inhibited. Therefore, hirudin peptide is effective against anticoagulated human plasma. Assays were performed to determine whether heparin acts additively or synergistically with heparin. In the APTT assay using pooled normal human plasma, A synergistic effect between Tide and heparin was observed. Figure 8 shows the dose-dependent effects of the hirudin peptide sulfoTyr ashirudin $3-44 alone, heparin alone, or the combination of this peptide and heparin. The APTT assay was performed as in Example 12. So I went. Both heparin (Sigma, St. Louis, MO) and sulfo-Tyras hirudin 15-64 (prepared as in Example 10) were added at a concentration of 10 μg/ml. Used at degrees. The results show that the combination of sulfo-Tyr, hirudin 11-14, and heparin has the expected combination of anticoagulant activity of either molecule alone or in combination. This indicates that the net increase in clotting time was greater than the metering effect. Since heparin use is associated with bleeding complications, this type of combination is advantageous in using low doses of heparin to achieve an anticoagulant effect. For the inhibition of thrombin-catalyzed hydrolysis of the tripeptidyl p-nitroanilide substrate Tosyl-C,IJ-Pro-Arg p-nitroanilide (Chromosim TH, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) The pildin peptide of this invention was analyzed spectrophotometrically at 420 nm using a Carry 219 double beam spectrophotometer. Analyzed scientifically. 10 μl of thrombin solution (bovine plasma thrombin, Calbioge Vasing Diagnostics, La Jolla, CA; Mix with pH 1, 4, 0, 15M NaC11 buffer solution. The reaction product was prepared by: Thereafter, 25 μM substrate solution (4 mg/ml tosyl-Gly-Pro-Arg-P-nitroanisole in the above buffer) and varying amounts of hirudin 4164 from the 1.0 mg/ml stock solution (same as in Example 4) were added. (prepared similarly) was added to give a final fixation volume of 1.035 ml and a final concentration of thrombin and substrate of 2.8X10-'M and 1.4X10-'M, respectively. -'M concentration, hirudin 41-44 showed no measurable inhibitory effect on thrombin-catalyzed hydrolysis of the synthetic substrate. In contrast, original hirudin at concentrations of 1.2 and 2.4 and gave an inhibitory effect of 73%. Based on these observations, it is believed that peptides corresponding to the C-terminal 21 amino acids of hirudin, and similar derivatives thereof, do not inhibit thrombin cleavage of small synthetic substrates. This indicates that the peptide of the present invention is This is completely consistent with our idea that it does not bind to the catalytic site of the bottle. It is therefore believed that the inhibitory effect on clotting time exhibited by the peptides of this invention is due to their affinity for sites on thrombin other than the catalytic site. K belly and 1 reciprocal, then sulfo-Tyr, B a I b / c mouse of j bilge 29M-64. (Charles River Laboratory, Boston, Mass.) by intravenous injection. In addition, the administration-dependent increase in clotting time of luginbebutide of this invention in vivo was measured. 10.100 and 250 μg of Sulfo Tyras Hirudin! Containing 3-44 The animals were injected with the same dose. After 5 minutes, the animals were bled. Blood was collected in citrated containers and plasma was isolated by centrifugation. The method described in Example 12 Mouse plasma was assayed for activated partial thrombin time (APTT). FIG. 9 shows that sulfo-T'yrsshirudin 5M-64 produces a dose-dependent increase in mouse plasma AP TT in vivo. K1 Bean Works Sulfo T r6. Polyester glycol of hirudin 5j-64: 1 sentence - α plate The hirudin peptide of the present invention and a pharmaceutically acceptable polymer are conjugated to form a peptide. We attempted to increase the half-life of Chido. For more details, please refer to polyethylene glycol, polyester A derivative of thiol/glycol N-succinimide succinate (SS-PEG, average MW = 5.000) was prepared. Conventional method [Abuchowski et al., Cancer Biochei, Biophys, 7. Op., 175-86 (1984)], then 100 μg of sulfo-Tyrohirudin 5B-64 prepared in Example 10 was dissolved in 200 μl of 20 mM sodium borate, pH 9.0, and this was dissolved at a 50-fold molar concentration. The 0 reaction system reacted with excess S S-PEG was left overnight at room temperature and then loaded onto reverse phase HPLC for purification and characterization. Reversed phase HPLC was performed using an Applied Biosystems 150A chromatography system. The analysis was carried out using an Aquabore RP-300Ca column (0.46×3.Ocm) using a stem. Equilibrate the column in water containing 0.1% TFA and use an increasing gradient of acetonitrile from 0 to 50% in 0.085% TFA solvent over 45 minutes at a flow rate of 0.5 ml/min. Expanded. The elution flow was monitored for absorbance at 214 nm. The 5S-PEG derivative of sulfo-TVr*ssildin5tro4 elutes before the underivatized form and is contained in a broad peak. It was recognized that Induction and non-induction of sulfo-Tyris hirudin 83-64 Comparison of the anticoagulant activity of both derivative forms revealed the same dose dependence in the increase in APTT. Thus, 83-PEG-Sulfo-Tyr*shirudin 44 is an active derivative of the peptide of the invention which advantageously exhibits the expected increase in circulating half-life when compared to its underivatized counterpart. Factor rXa catalyzes the activation of factor Don't interfere The inhibition of factor I A Factor IXa/Factor in the presence of sulfo-T', rrss hirudin 93-64 (0-66-7 μs/m, 1). The mixture of i was activated by adding 25+nM CaC12 and an aliquot of normal 1' plasma as recommended by the manufacturer. After incubating the samples for 10 minutes at 37°C, S 2222f4'4 (Cavitorum, Helena Laborato) with 100 μm in sample Riis, Beaumont, 'X) added 1-2, after 5 minutes by making acidic. Stops reacting to hair 1. Ta. The extent of S-2222 cleavage was followed spectrophotometrically at 405 rtm. Figure 10 shows that sulfo-'1'yr63 hirsin, j-□, did not show inhibition of dose-dependent S-2222 cleavage in this a. Since peptide does not inhibit the FXa cleavage of 3-2222, this result is It is shown that increasing concentration of putido causes decreasing production of factor Xa. Therefore Therefore, SurboTyr*shirudin 5m-44 should inhibit factor X activation of factor IXa. Inhibition of factor IXa was complete at a 6 x 10''6 concentration of peptide. Inhibition of factor Xa activation of lactobacillus was assayed. As in the previous assay, factor Xa was generated from factor IX a/X in the presence of calcium phospholipids and diluted plasma. Ta. The thus synthesized factor .05M+-Lis-HCl, pi (7, 5,0, 1M NaCl, RN Thompson), Cl1n, 1 nvest, 59. By the method of Do, 900-i) 5 (i977), purified blood was extracted from three plasma samples. ! After incubation at 37°C for 60 minutes, 30 μl of both were taken and mixed with 4XX SDS nanoparticle solution. 7, S1') The enzyme/glue was analyzed by 5-PAGE on a 10% acrylamide gel. After the electrolyte, this gel was stained with Comassie brilliant blue. 1, G1 Col-rx Numbin's factor) (a activation @night, gel soil, anti-V) Destroy the product. : , and visually evaluated) -4 no ζ. Figure 11 shows pitcher-dependent inhibition of the conversion of 7-on bino\'s I-den''2'pi〉 by increasing f4 degrees of Surbo T, 3'r 6!11; Luzin, 5M-14. show. Alternatively, a by-product as described above and a sample were incubated with the substrate at 1 °C using Chromosim® J4 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, XN). The resulting trompin activity was analyzed. Both 5)t 1 portions of each →j nonle were added to Kikobe Soto containing 1.0 ml Tris-MCI, PH 7,5,0,15 M NaCl and 4 μg/rn K chromocim TH. Thrombin activity was monitored continuously at 420 rim. Like this Analysis of thrombin activity by the formula shows that at a concentration of 1'0 Jg/m x surboT3rr4mhirudin, -6, 4 times the esterolytic activity generated through factor Xa activation of proto-17 thrombin. showed a decrease. In addition, the data of t'L et al. showed that sulfo-T 5'r 6s1: and lugin 5m-64 inhibited factor X activation of factor IX t4 and prothrombin factor Xa activation. However, the level of inhibition of factors a and Xa is about 10 times less than that of thrombin. These results suggest that the structure of leugin that interacts with factors IXa and Xa is localized to the C-terminal fragment, ie, inhibition occurs after interaction with a non-catalytic site. They also contain various forms lacking the sulfated Tyrgs residue, and Tyrgs are natural and non-antithrombin anticoagulants of the Tyrgs protein. This means that it cannot exhibit solid properties. Hirudin peptide, good it, < is Surbo'! '3' r as Hilji/Rie The anti-metastatic activity of Sarcoma 'i'', r4', i-cell [L. N. Liotta et al., Nature, 284. pp, 67-68 (1980)] and synergistic C57B I, 776 mice (Jaxosi Laboratories. Mice were injected intravenously or subcutaneously, followed by intravenous injection of 104-10'T241 tumor cells. After 15 days, the animals were sacrificed and the lung tumors were weighed at 1.7 mm. Madness and activation are bra #Measured as % reduction in cancer colonies compared to Sebo treatment versus time. Dai J1 Example 20 Fall and Danshi, N21-1JRS, 2K9, F; Using sulfo-Tyrss hirudin, 1. and semi-vepti1ζ or non-peptidomimetic agents. Synthetic molecules can be produced that exhibit analogue, antithrombin and anticoagulant activity. The peptidomimetic analog of this groove is the hirudin peptide of this invention. The inhibitory activity of fibrinotan against thrombin hydrolysis, the activation of factor IXa by factor X, and the activation of Xa by b'o)-thrombin. The peptidomimetics Flog of this invention, marked as "Hill Log", is represented by the following chemical formula: h"-1 Goonis 1 U" Shiotnu CooF! Co0FE The semi-peptidic peptidomimetic analogs of the siludine peptides of this invention can be prepared to stabilize the loop, turn, or helical structure of the parent peptide. For example, the loop m structure is the N- and by adding cysteinyl or lysyl residues at both the C- and C-terminal ends. The terminal cysteinyl residues are cross-linked, but oxidation produces hirulog-1 (Figure 12a), oxidation with aliphatic dithiols produces hirulog-2 (Figure 12b), or aliphatic dihaloacetates or propionates. Hirulog-3 is prepared by alkylation (Figure 12c) by cross-linking the terminal lysyl residues, but using any of a number of imidate schemes with different spacer lengths, or by using dihydroxysuccinimidyl fat. Using family reagents, this result and Hirulog-4 is produced in this manner (FIG. 13). The structure around Pro-3 of sulfo-TVr4s hirudin, t, was replaced with l1e-7 using chloroalanine, and (L) or (D)-7 phosphorus was used. clones with or without concomitant substitution of Glu-9 or Glu-10. Peptidomimetic analogs containing loalanine alone generate crosslinks of Glu-9 or Glu-10 to Ata-7 through geton binding, and Derivatives with serine at position 9 or 10 can provide cross-linking via an ether linkage, producing hirulog-6 (Fig. 14b), which can produce group-5 (Fig. 14a). The helical structure of the peptidomimetic analogue of this invention Substitution of cysteinyl residues at positions (n) and (n+3), direct oxidation, aliphatic dithiamine For example, sulfo-Tyr6s hirudine using cysteinyl! ! Substitution of As n, -1 and Phe-4 of -44 and oxidation via ethanedithiol (Fig. 15) results in an increase in the N H2-terminal side of the derivative. This contributes to a stable helical structure in the peptide derivative. give This is exemplified by Hilllog-7. It is also possible to produce completely non-peptidic peptidomimetic analogues belonging to this invention. and considering the strategy described above for a given peptidic compound. Hirudin peptides used in blood clot imaging include hirudin peptides such as sulfo-Tyras hirudin S%-64. For example, the α-ammonium group of sulfo-Tyr6s hirudinrad 44 (prepared in Example 10) can be modified by covalent attachment of chemical groups to O, 125-125 in IM sodium borate, pH 9,0. It can be reacted with Polton-Hunter reagent (Nihon England Nuclear, Boston, Mass.). The 125-labeled peptide (with a specific activity of >5 μC1/μg) is then desalted by a column of Biogel P2 equilibrated with phosphate-buffered saline. The mo can be tested with a monitoring thrombin time and APTT assay. Ex-vivo imaging of experimental thrombus is mainly carried out by T.M. Parabri et al. Gu J, Proc, Natl. Acad, Sci, USA, 86. 0.1036-40 (1989); in particular, the imaging was carried out as described in the manuscript submitted to 0.1036-40 (1989). Experimental clots are generated by displacement of Dacron graft fragments in precoagulated shunts. to form I2'A I-labeled sulfo-'r3'r, 3 hirudin5. − Inject 〇 into the venous part of the Ticoflex branch. Then a series of forward images are taken. Obtain about 5 to 1 hour. An Ohio Nuclear Series 100 gamma camera with a PDP-11/34 computer is used. Graft and blood pool The kinetics of uptake of the 1.28-ludin peptide by the method can be derived from the radionuclide images thus obtained. Using the same technique,7 ex vivo images of deep venous thrombus obtained by vasostasis of the femoral vein of a baboon can be obtained. Because sulfo-Tyrbs hirudin 5j-64 binds to thrombin with high specificity, radiolabeled hirudin peptide The use of Tide allows accurate in vitro imaging of experimental thrombi. Ma In addition, the size of the antibody is smaller than that of the original antibody against thrombin or thrombin. Inbebutide is a radioactively labeled peptide that provides images of platelet-bound thrombin and meizothrombin as well as thrombin contained in buiplin clots. offer the possibility of Shaku Dodan 22, 5,000 ■'Yu III Beans, 2 Dans, 1 ball, 1 weight, 2 - Hebyou upper - (F) - + Nil Ao Platelet-rich and platelet-deficient blood Prepare the plasma. J.A. Jakubowski and N.G.A.-D. Modification of human platelet action by dietary enrichment in saturated or polyunsaturated fats, AtherosclerOsis, 31. l111.335-44 (197B) Blood from healthy human volunteers was then diluted with 1/10 of 3.8% tristrimonium citrate. Collected to final volume. All donors must be free of all species for at least <12 weeks prior to blood collection. No similar treatment was used. Platelet-rich plasma was prepared by room temperature centrifugation of citrated whole blood for 15 minutes at 1100X in a Truvall rotor. For platelet-poor blood, use citrated whole blood in 12. Centrifuge for 15 minutes in OOOXg By separating it, you can make one [,ta]. Surpo Tyras N-acetic acid was administered over a concentration range of 0 to 0.55 μg/mi. Chill Shirujin @9. Both the anticoagulant and antiplatelet activities of -64 were analyzed. Anticoagulant activity was determined by measuring APTT as described in Example 12. Platelet aggregation was performed by adding sulfo-Tyr,j N-acetyl-hirudin 5,14 containing 0.05 ml of water to 0.4 ml of blood prewarmed to 37°C. Measured by addition to platelet-rich plasma. The mixture was stirred for 1 minute at 37°C, after which thrombin was added (final concentration 0.41 J/ml). by Odata PAP4 4-channel platelet analyzer (Ba・f Odata, Hatsutobo The turbidity was monitored over a period of 4 minutes using a turbidity filter (B, PA). The anticoagulant activity of the highest concentration of sulfo-Tyr6s N-acetyl-thirudine 51-64 used in this assay was 125% less than that of normal serum. I had a low A P rT value. In contrast, sulfo-Tyrss-'P''l-acetyl-hirudin 5m-44 inhibited platelet aggregation by 50% at concentrations of 0.15-0625 μg/nail (FIG. 16). .:i shows that low doses of the triglyceride peptides of this invention are effective in blocking platelet activation under therapeutically non-coagulant conditions (i.e., 1, 7"). 150-200% of 4) ＼ A P T T increase). x1 example -2,, -3, d- to n-ti-':-i;-mini-two, z=,,;4 le t-772n,, 65-seeing-en-otsu 13-64 ``I: , 'tF Riichi ±, Oi, s41 Yuzuki-1 Left Force 1. Culture the standing histoma h Ii!! leech inhibiting thrombin-induced synthesis of factor (PAF) Assay the ability of sulfo-tyres hirudin $3-64 or sulfo-tyres hirudin $3-44 to Ta. HUVECs were extracted from human sea bream cords by collagenase digestion according to established procedures [M.N. Gimbro, Jr. [Vascular Endothelial Cell Culture*1]. Prog. He1ost, Thrcib, 3. pp. 1-28 (1976)]. Ht, J VEC were grown in swarms in 96-well microtiter plates in the presence of [ ]'H]-ace7-1. Cells cultured in this manner were Cetyl-PAF is produced by extraction of HUVECJll phospholipids. It can be quantified by Hirudin (0~IJJg/rr+, 1), hirudin 5s-a4 (0''200 μg/ml) or sulfo-Tyrai hirudin $3-44 (0~·8 μg/ml) was mixed with the addition of thrombin (final concentration was IU/ml) was added to ['H]-acetate-loaded HUVEC. Cells were incubated for 5 min. The supernatant was then removed and 0.1% gelatin was added to the HUVEC. A medium containing 50 mM acetic acid in methanol (2:l v/v) was added. PAF was drawn and quantified using standard techniques [T.M. Chi 1/et al., “Cultured endothelial cells synthesize both platelet activating factor and prostacyclin in response to histamine, bradykinin, and adenosine triphosphate. -80 (1985)], the IC5o values for the three inhibitors are given as follows: We investigated the effect of sulfo-N-acetyl-hirudin93-th4 on thrombin-induced polymorphonuclear leukocyte (PMN) adhesion to HlJVEC. . 126 offspring 24 cultured Gray carcasses were incubated with HUVEC in MEM containing serum (group 3. Remove the culture medium, wash the cells twice with fresh serum-free medium, and incubate in the same medium at 37°C for 10-30 minutes to increase serum growth. components were removed. To each well was added 1 rnl of PMN (2,5XiO',/rnl), previously equilibrated at 37°C. PMN was precipitated for 2 min in UV EC mode. Then, each hole was injected with sulfo-T3'ra3N-acetyl-"hirudin ss-*4 < 5 JA g/m, 1) Alternatively, 1 liter of salt was added, followed immediately by 1 liter of heronbin (0, 1 or 1° O U/rnl). The attached PMNs were directly counted.The results showed that the PMNs attached were 20% of the total amount of PMNs attached to the 2-Ty Y6s N-Ace Bluehirudin'111-414 and 0, IU/rnl) rhombin. Show that it was completely removed in the Nambra containing M, and 75% inhibited in the Nambra containing i, Ot, J/m t. 〔j''mzt-ku11man Yuj N-ace Ru Ar5s-shirujinrat64's N-acetyl-Argsshirji % m-64 was prepared by phase peptide synthesis and synthesized by the procedure described in Example 1. It was isolated to >95% purity. This peptide has a predominant Arg-Gly-Asp structure in many adhesive proteins that interact with platelet glycoprotein IIb/IIIa. Containing columns [M. D. Pierschachel and I. Luoslach, “Fib ronectin's cell adhesion activity is doubled by a small synthetic fragment of the molecule.''Mature, 309. EI El, 30-33 (1984)]. The anticoagulant activity of N-acetyl-Arg@m hirudin m5-m5 was evaluated using the APTT assay described in Example 12. N-Acetyl-Argss Hill Zin$t 44 showed 78.9% of the anticoagulant activity of N-acetyl-hirudinrad 64. Inhibition of platelet activation by N-acetyl-Ar gss hirudin 5M-64 was also measured using the same assay described in Example 22. However, small blood Plate aggregation was induced by the addition of collagen (40 μg/ml) or ADP (10 μl). It inspired me. FIG. 17 shows that N-acetyl-Argsshirudin 5tro4 inhibits platelet aggregation in a dose-dependent manner, with approximately 190 μg/ml Ice for collagen-induced aggregation. and 490 μg/ml for ADP-induced aggregation. These results demonstrate that N-acetyl-ArgSS and Luzinlat 44 can block thrombin-mediated thrombosis, either through fibrinogen cleavage or platelet activation, and that N-acetyl-ArgSS 44 can block thrombin-mediated thrombosis, either through fibrinogen cleavage or platelet activation, and also through collagen, ADP, epinephrine, thromboxane A2 or thromboxane A2. indicates that the same is true for any other compound that activates platelets. Furthermore, the Arg Gly-Asp sequence makes it possible for this peptide to target blood clots. can be used to increase the local concentration of thrombin inhibitor at the site. K1 and 11 Stoichiometric amount of sulfo-Tires hirudin! 4-14 and dinitrodifluoroben By reacting Zane (DNDFB) in dimethylformamide, The zine analog dinitrofluorobenzyl-sulfo-Tyr, hirudin 14-64 (DNFB-sulfoTyr, hirudin 54-64) was synthesized. The reaction mixture was incubated for 24 hours at 22°C, after which it was dried under vacuum and redissolved in 0.1% TFA in water. The resulting products were separated by HPLC chromatography using an Aquabore RP 300 C# octasilyl column (0,46×3.Ocm). first The ram was equilibrated with 0.1% TFA in water (solution 1XA). After loading the sample, incubate from 0 to 50% solvent B (0,085% TFA/70% acetonitrile) for 45 minutes. The column was developed using a glue gradient. The effluent flow has an absorption of 214 nm. The revenue was monitored. DNFB-Sulfo-Tyr6s Hirudin5. -〇 was eluted with 48% solvent B. Synthesize the hirudin analog nitroanisole 4s hirudin 55-m5 in a two-step method. accomplished. First, as described in Example 1, Boc-0-Leu resin was replaced with Boc-0-methoxytyrosine resin in the synthesis of methoxytyrosyl, siluzine 41 using solid-phase synthesis technology. . The peptide was removed from WM fat and purified by HP[,C] using a Vydac 04 column as shown in Figure 1.Then, it was purified with excess tetranitromethane in 20mM Tris-HCl, pH 8.0. The 0 reaction, in which purified methoxytyrosyl, S Hirschiff 8%-45, was nitrated by addition of chloride was incubated at 27°C for 4 hours. The resulting product was lyophilized, redissolved in 20 mM ammonium bicarbonate, desalted using a pre-equilibrated Vydac 04 column (IX 30 cm), and purified with 20 mM ammonium bicarbonate. Elution was performed with ammonium acid. Nitroanisole 4s Hirujin 5t 4s Minutes Separation was performed by HPLC using an Aquabore RP-300C8 octasilyl column (0.46 x 3.0cm) as described above. Following the procedure described in Example 25, DNFB-['sS]-SulfoTyr ,, Shirujinro-64 was prepared. As a starting material, sulfo-Tyr,shirudin was sulfated using Ht["S]04 during the sulfation procedure (see Example 1o). Rad-44 was used. A 10-fold molar excess of DNFB-["S]-SulfoTyr, Hirudin!4-44 was added to a solution containing 0.35 nmol human thrombin in phosphate buffered saline. This mixture was incubated for 3 hours. After that, 5DS-polya was added on the sample. Acrylamide gel electrophoresis (12.5% acrylamide) was performed. autoradio After autography, a band corresponding to the size of thrombin was visualized. 50 tons A 500-fold excess of unlabeled N-acetyl-sulfo-Tyrbs hirudin! Performing the binding step in the presence of 4-44 blocked the formation of the covalent complex. While a number of embodiments of this invention have been described above, it will be apparent that the basic structure may be modified to provide other embodiments utilizing the methods and products of this invention. However, It will be understood, therefore, that the scope of the invention is defined by the claims appended hereto, and not by the specific embodiments set forth above by way of example. 2za Art: t=nlty F7θ 2doσノ F/θ 2 and bノ FIG, 2 and Cノ FIo, 3 A, c>rr(s'. ``jkaurine FI6.9 10 100 750200250 XX)nu+bd-go/63 Hirunon s :t-b4 (Metsu9) lz(1>t ・14 (%) I:l(':12 Lys-ksn41y-ksp -the-Glu- にLu-!1m-Pro-( :1u-Giss-Dingyr(503)-L*u-Lys^5n-Gly-^5p -yh*-01u-Glu-人1al(:1 )-Pro-Glu-Glu-TyrlsO3)-L*u enter an-Gly-Ph*-Glu-GLu-Tyr1 a(CL)-Pro-Glu-5ar-Tyr(5 mouths, )-LeuCys-Gly-Asp-Cys-GLu-GLu4Le-Pro-C1u-(Lu-Dingyr (So,)-LeuFIG /6 〃-Bonshichi-SuJ,-7)'/"63 E: +k)'＞53-54 (B1 7g＜9'4''753 hi1shiji°'53-64 (pM) International Search Report

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、（ａ）実質的に次 の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＸはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｌｎよりなる群 から選択される） よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 ２．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、（ａ）実費的に次 の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＹはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列Ｖａ１【配列 があります】 の少なくともＣ末端部分、並びに アミノ酸配列【配列があります】 の少なくともＣ 末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ、並びにＬｅｕ−ＧＩ ｎよりなる群から選択され、かつチロシン残基は負に荷電した側鎖基を合有する ）よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 ３．負に荷電した側鎖基が、スルフェート、ホスフェート、カルボキシレート、 スルホネート、ホスホネート、カーボネート、メチルスルホネート並びにメチル ホスホネートよりなる群から選択される請求項２記載のペプチド、４．負に荷電 した側鎖基が、スルフェートおよびスルホネートよりなる群から選択される請求 項２記載のペプチド。 ５．ＹがＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、ＺがＬｅｕであり、前記負に荷電した 側鎖基がスルフェートであり、前記ペプチドがスルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３ −６４である請求項４記載のペプチド。 ６．ＹがＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、ＺがＬｅｕであり、前記負に荷電した 側鎖基がスルホネートであり、前記ペプチドがスルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン ５３−６４である請求項４記載のペプチド。 ７．アミノ末端アミノ酸がＮ−アセチル化された請求項１または２記載のペプチ ド。 ８．前記ペプチドが、スルホ−Ｔｙｒ６３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−６４ およびＮ−アセチル−スルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４よりなる群か ら選択される請求項７記載めペプチド。 ９．アミノ末端アミノ酸がジニトロフルオロベンジル化された請求項１または２ 記載のペプチド。 １０．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドはトロンビンと共有 結合を形成することができ、前記ペプチドが、 （ａ）主として次の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＹはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列【配列があり ます】少なくともＣ末端部分、並びに アミノ酸配列【配列があります】 の少なくともＣ 末端部分よりなる群から選択され、Ｗはニトロアニソールである） よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 １１．抗凝固剤および抗血小板活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、 （ａ）主として次の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＶはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列【配列があり ます】の少なくともＣ末端部分、並びにアミノ酸配列【配列があります】の少な くともＣ末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ並びにＬｅｕ −Ｇｌｎよりなる群から選択され、チロシン残基は負に荷電した側鎖基を合有す る）よりなる群から選択される抗凝固剤および抗血小板活性を示すペプチド。 １２．前記ペプチドが薬学的に許容し得る重合体と共役する請求項１、２、１０ または１１のいずれかに記載のペプチド。 １３．前記重合体が、ポリエチレングリコールＮ−スクシニミジルスクシネート である請求項１２記載のペプチド。 １４．前記ペプチドがフィブリン溶解剤と共役する請求項１、２、１０または１ １のいずれかに記載のペプチド。 １５．請求項１または２記載のペプチドのペプチドミメティックアナログであっ て、前記アナログがフィブリノーゲンのトロンビン加水分解を阻害し、かっ抗凝 固剤活性を示すペプチドミメティックアナログ。 １６．前記アナログが、ヒルログ−１、ヒルログ−２、ヒルログ−３、ヒルログ −４、ヒルログ−５、ヒルログ−６並びにヒルログ−７よりなる群から選択され る請求項１５記載のペプチドミメティックアナログ。 １７．前記ペプチドきメテイックアナログがフィブリン溶解剤と共役した請求項 １５または１６記載のペプチドミメティックアナログ。 １８．愚者または体外血液における血液凝固時間を増加させる薬学的に許容し得 る組成物であって、請求項１乃至１４いずれかに記載のペプチドおよび請求項１ ５乃至１７いずれかに記載のペプチドミメティックアナログよりなる群から選択 される薬学的に有効量の少なくとも１つの成分からなる薬学的に許容し得る組成 物。 １９．ヘパリンおよび低分子量ヘパリンよりなる群から選択される化合物を更に 含み、前記ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの薬量が、前記ヘパリンまたは低分 子量ヘパリンを単独治療で投薬する場合に所望の結果を達成するのに要求される ものより少ない請求項１８記載の組成物。 ２０．前記ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの薬量が約２，５００〜５，０００ 単位未満である請求項１９記載の組成物。 ２１．前記組成物が、薬学的に有効な量のフィブリン溶解剤を更に含む請求項１ ８乃至２０いずれかに記載の組成物。 ２２．患者または体外血液における血液凝固時間を増加させる方法であって、請 求項１８乃至２１いずれかに記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前 記患者または前記体外血液を処置する工程からなる方法。 ２３．愚著の血管疾患を予防または処置する方法であって、請求項１８〜２１い ずれかに記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前記愚者を処置する工 程からなる方法。 ２４．血管疾患の予防または処置のための、請求項１８乃至２１いずれかに記載 の組成物の使用。 ２５．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を決定する組成物であって、前記組成物が、請求項１乃至６いずれ かに記載の少なくとも１つのべプチドからなる組成物。 ２６．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を決定する方法であって、前記方法が、前記サンプルと請求項２５ 記載の組成物とを接触させる工程からなる方法。 ２７．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を検走する診断キッ下であって、前記キットが、請求項１乃至６い ずれかに記載の少なくとも１つのペプチドからなる診断キツド。 ２８．転移性腫瘍の生育を阻害する薬学的に許容し得る組成物であって、前記組 成物が、請求項１乃至１４記載のペプチドおよび請求項１５乃至１７記載のペプ チドミメティックアナログよりなる群から選択される薬学的に有効量の少なくと も１つの成分からなる組成物。 ２９．患者の転移性腫瘍の生育を阻害する方法であって、前記許方法が、請求項 ２８記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前記患者を処置する工程か らなる方法。 ３０．前記転移性腫瘍が、臓のカルシノーマ、肺のカルシノーマ、肝臓のカルシ ノーマ、骨カルシノーマ並びに新生組織細胞カルシノーマよりなる群から選択さ れ石請求項２９記載の方法。 ３１．前記ペプチドが、１２３Ｉ、１２５Ｉ並びに１１１Ｉｎよりなる群から選 択されるラジオアイソトープによりラベルされた請求項１、２、７、９、１０ま たは１１いずれかに記載のペプチド。 ３２．請求項３１記載のペプチドからなる患者のフィブリンまたは血小板血栓の 生体外イメージング用組成物。 ３３．患者のフィブリンまたは血小板血栓の生体外イメージング方法であって、 （ａ）前記患者に請求項３２記載の組成物を投薬し、（ｂ）前記組成物を監視す る検出手段を使用する工程からなる方法。 ３４．患者に挿入される侵入器具の表面を被覆する組成物であって、前記組成物 が、請求項１乃至１４いずれかに記載のペプチドおよび請求項１５乃至１７いず れかに記載のペプチドミメティックアナログよりなる群から選択される少なくと も１つの成分からなる組成物。 ３５．患者に挿入される侵入器具の表面を被覆する方法であって、前記方法が、 前記表面と請求項３４記載の組成物とを接触させる工程からなる方法。 ３６．血液凝固時間を増加させ患者の血小板活性化を阻害する薬学的組成物であ って、前記組成物が、薬学的に有効量の請求項１１記載のペプチドからなる薬学 的組成物。 ３７．血液凝固時間を増加させ患者の血小板活性化を阻害する方法であって、前 記血小板活性化が全ゆるアゴニストによって誘導され、前記方法が、請求項３６ 記載の組成物を用いて前記患者を処置する工程からなる方法。 ３８．患者のトロンビンにより誘導された血小板活性化およびトロンビンにより 誘導された内皮細胞活性化を阻害する薬学的組成物であって、前記組成物が請求 項１乃至８いずれかに記載の薬学的に有効な低薬量のペプチドからなり、前記低 薬量が約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体着〜約０．０９９ｍｇ／ｋｇ体重である薬学 的組成物。 ３９．患者のトロンビンにより誘導された血小板活性化およびトロンビンにより 誘導された内皮細胞活性化を阻害する方法であって、前記方法が、請求項３８記 載の組成物を用いて前記患者を処置する工程からなる方法。 ４０．患者のトロンビンにより誘導された炎症を処置する薬学的に許容し得る組 成物であって、前記組成物が請求項１乃至８いずれかに記載の薬学的に有効な低 薬量のペプチドからなり、前記低薬量が０．０００１ｍｇ／ｋｇ体着〜約０．０ ９９ｍｇ／ｋｇ体着である組成物。 ４１．患者のトロンビンにより誘導された炎症を処置する方法であって、前記方 法が、請求項４０記載の組成物を患者に投薬する工程からなる方法。 ４２．前記トロンビンにより誘導された炎症が、成人呼吸困難症、敗血性ショッ ク、敗血症並びに局所再灌流傷害よりなる群から選択される疾患によって生起さ れる請求項４１記載の方法。 ４３．ペプチドまたはポリペプチドのチロシン残基を硫酸化する方法であって、 前記方法が、 （ａ）前記ペプチドまたはポリペプチドを有機溶媒に溶解し、 （ｂ）前記溶解したペプチドまたはポリペプチドと脱水剤とを反応させて前記ペ プチドまたはポリペプチドのチロシン残基を脱水し、 （ｃ）沈澱形態に至るまで前記溶解したペプチドまたはポリペプチドに硫酸を滴 下して添加することにより前記脱水したチロシン残基を硫酸化する 工程からなる方法。 ４４．前記ペプチドをＮ−アセチル−ヒルジン５３−６４およびヒルジン５３− ６４よりなる群から選択する請求項４３記載の方法。 ４５．前記有機溶剤をジメチルホルムアミドとし、前記脱水剤をジシクロヘキシ ルカロジイミドとする請求項４３記載の方法。[Claims] 1. A peptide exhibiting anticoagulant activity, the peptide comprising: (a) substantially the following: The formula: [There is an array] and (b) the peptide of (a). D-retro form of (wherein X is the group consisting of COOH, Leu and Leu-Gln) (selected from) A peptide exhibiting anticoagulant activity selected from the group consisting of: 2. A peptide exhibiting anticoagulant activity, wherein the peptide (a) has the following practical cost: The formula: [There is an array] and (b) the peptide of (a). D-retro form of (where Y is NH2, amino protecting group, amino acid sequence Va1 [sequence there is】 at least the C-terminal portion of Amino acid sequence [Sequence available] at least C selected from the group consisting of terminal moieties, Z is COOH, Leu, and Leu-GI selected from the group consisting of n, and the tyrosine residue incorporates a negatively charged side group ) A peptide exhibiting anticoagulant activity selected from the group consisting of: 3. The negatively charged side chain groups are sulfates, phosphates, carboxylates, Sulfonates, phosphonates, carbonates, methyl sulfonates and methyl 3. The peptide of claim 2 selected from the group consisting of phosphonates; 4. negatively charged Claim in which the side chain group is selected from the group consisting of sulfate and sulfonate. Item 2. Peptide according to item 2. 5. Y is Asn-Gly-Asp, Z is Leu, and the negatively charged The side chain group is sulfate, and the peptide is sulfo-Tyr63hirudin53. -64. The peptide according to claim 4. 6. Y is Asn-Gly-Asp, Z is Leu, and the negatively charged the side chain group is sulfonate, and the peptide is sulfonyl-Tyr63hirudin. 5. The peptide according to claim 4, which is 53-64. 7. The peptide according to claim 1 or 2, wherein the amino terminal amino acid is N-acetylated. Do. 8. The peptide is sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53-64 and N-acetyl-sulfonyl-Tyr63hirudin53-64 The peptide according to claim 7, which is selected from the following. 9. Claim 1 or 2, wherein the amino terminal amino acid is dinitrofluorobenzylated. Peptides described. 10. A peptide exhibiting anticoagulant activity, the peptide being shared with thrombin. a bond can be formed, and the peptide is (a) Mainly the following formula: [There is an array] and (b) the peptide of (a). D-retro form of (where Y is NH2, amino protecting group, amino acid sequence ] at least the C-terminal part, and Amino acid sequence [Sequence available] at least C terminal portion, W is nitroanisole) A peptide exhibiting anticoagulant activity selected from the group consisting of: 11. A peptide exhibiting anticoagulant and antiplatelet activity, the peptide comprising: (a) Mainly the following formula: [There is an array] and (b) the peptide of (a). D-retro form of (where V is NH2, amino protecting group, amino acid sequence At least the C-terminal part of the amino acid sequence [there is a sequence] selected from the group consisting of at least the C-terminal portion, Z is COOH, Leu and Leu -Gln, the tyrosine residue incorporates a negatively charged side group A peptide exhibiting anticoagulant and antiplatelet activity selected from the group consisting of 12. Claims 1, 2, 10, wherein said peptide is conjugated with a pharmaceutically acceptable polymer. or the peptide according to any one of 11. 13. The polymer is polyethylene glycol N-succinimidyl succinate. The peptide according to claim 12. 14. Claim 1, 2, 10 or 1, wherein the peptide is conjugated with a fibrinolytic agent. 1. The peptide according to any one of 1. 15. A peptidomimetic analog of the peptide according to claim 1 or 2. Therefore, the analogue inhibits thrombin hydrolysis of fibrinogen and acts as an anticoagulant. Peptidomimetic analogs exhibiting solid-state activity. 16. The analogue is Hirulog-1, Hirulog-2, Hirulog-3, Hirulog -4, Hilllog-5, Hilllog-6 and Hilllog-7. 16. The peptidomimetic analog according to claim 15. 17. A claim in which the peptidic methane is conjugated with a fibrinolytic agent. 16. The peptidomimetic analog according to 15 or 16. 18. A pharmaceutically acceptable drug that increases blood clotting time in in vitro or extracorporeal blood. A composition comprising the peptide according to any one of claims 1 to 14 and claim 1. Selected from the group consisting of peptidomimetic analogs according to any one of 5 to 17. a pharmaceutically acceptable composition comprising a pharmaceutically effective amount of at least one ingredient; thing. 19. further comprising a compound selected from the group consisting of heparin and low molecular weight heparin. and the dosage of said heparin or low molecular weight heparin is required to achieve desired results when dosing molecular weight heparin as monotherapy. 19. The composition of claim 18. 20. The dosage of the heparin or low molecular weight heparin is about 2,500 to 5,000 20. The composition of claim 19, wherein the composition is less than one unit. 21. 2. The composition further comprises a pharmaceutically effective amount of a fibrinolytic agent. 21. The composition according to any one of 8 to 20. 22. A method of increasing blood clotting time in patient or extracorporeal blood, the method comprising: Preparation in a pharmaceutically acceptable manner using the composition according to any one of claims 18 to 21. A method comprising the steps of treating said patient or said extracorporeal blood. 23. A method for preventing or treating a serious vascular disease, comprising: A method of treating the above-mentioned patient in a pharmaceutically acceptable manner using the composition described in any of the above. A method consisting of steps. 24. According to any one of claims 18 to 21, for the prevention or treatment of vascular diseases. Use of the composition. 25. factor IXa, factor Xa, thrombin or these A composition for determining the concentration of a mixture, said composition comprising: A composition comprising at least one peptide according to claim 1. 26. factor IXa, factor Xa, thrombin or these 26. A method for determining the concentration of a mixture, said method comprising: said sample and said sample. A method comprising the step of contacting a composition as described. 27. factor IXa, factor Xa, thrombin or these A diagnostic kit for testing the concentration of a mixture, the kit comprising: A diagnostic kit comprising at least one peptide according to any of the above. 28. A pharmaceutically acceptable composition for inhibiting the growth of metastatic tumors, the composition comprising: The composition comprises the peptides according to claims 1 to 14 and the peptides according to claims 15 to 17. a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of tidomimetic analogues; A composition consisting of one ingredient. 29. A method of inhibiting the growth of a metastatic tumor in a patient, the method as claimed in claim 1. treating said patient in a pharmaceutically acceptable manner using the composition of claim 28; How to be different. 30. The metastatic tumor may be visceral carcinoma, lung carcinoma, or liver carcinoma. selected from the group consisting of cancer, bone carcinoma, and neoplastic carcinoma. 30. The method according to claim 29. 31. The peptide is selected from the group consisting of 123I, 125I and 111In. Claims 1, 2, 7, 9, 10 or 10 labeled with selected radioisotopes. or 11. 32. fibrin or platelet thrombus of a patient comprising the peptide according to claim 31. Composition for in vitro imaging. 33. A method for ex vivo imaging of fibrin or platelet thrombi in a patient, the method comprising: (a) administering the composition of claim 32 to said patient; and (b) monitoring said composition. A method consisting of the step of using a detection means. 34. A composition for coating a surface of an invasive device inserted into a patient, the composition comprising: is the peptide according to any one of claims 1 to 14 and any one of claims 15 to 17. at least one selected from the group consisting of peptidomimetic analogs according to any one of A composition consisting of one ingredient. 35. A method of coating a surface of an invasive device inserted into a patient, the method comprising: 35. A method comprising the step of contacting the surface with the composition of claim 34. 36. A pharmaceutical composition that increases blood clotting time and inhibits platelet activation in patients. Therefore, the composition comprises a pharmaceutically effective amount of the peptide according to claim 11. composition. 37. A method of increasing blood clotting time and inhibiting platelet activation in a patient, 36. The platelet activation is induced by any agonist, and the method comprises: A method comprising treating said patient with a composition as described. 38. Thrombin-induced platelet activation in patients and thrombin-induced A pharmaceutical composition for inhibiting induced endothelial cell activation, the composition comprising: It consists of the pharmaceutically effective low dose peptide according to any one of Items 1 to 8, Pharmacy where the drug dose is about 0.0001mg/kg body weight to about 0.099mg/kg body weight composition. 39. Thrombin-induced platelet activation in patients and thrombin-induced 39. A method of inhibiting induced endothelial cell activation, the method comprising: a method comprising the step of treating said patient using the composition described above. 40. A pharmaceutically acceptable composition for treating thrombin-induced inflammation in a patient. 9. A composition comprising a pharmaceutically effective compound according to any one of claims 1 to 8. The low dose is 0.0001 mg/kg to about 0.0 mg/kg. A composition having a body weight of 99 mg/kg. 41. A method of treating thrombin-induced inflammation in a patient, the method comprising: 41. A method comprising administering to a patient a composition according to claim 40. 42. Inflammation induced by thrombin causes respiratory distress in adults and septic shock. caused by a disease selected from the group consisting of sepsis, sepsis, and local reperfusion injury. 42. The method of claim 41. 43. A method for sulfating tyrosine residues of a peptide or polypeptide, the method comprising: The method includes: (a) dissolving the peptide or polypeptide in an organic solvent; (b) Reacting the dissolved peptide or polypeptide with a dehydrating agent to dehydrating the tyrosine residues of the peptide or polypeptide; (c) dropping sulfuric acid onto the dissolved peptide or polypeptide until it reaches a precipitated form; The dehydrated tyrosine residues are sulfated by adding A method consisting of steps. 44. The peptides were combined with N-acetyl-hirudin 53-64 and hirudin 53-64. 44. The method of claim 43, wherein the method is selected from the group consisting of: 64. 45. The organic solvent is dimethylformamide, and the dehydrating agent is dicyclohexyl. 44. The method according to claim 43, wherein the method is lucalodiimide.
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