JPH04500957A - ナトリウム排泄増加ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ナトリウム排泄増加ホルモン 発明の分野 本発明はヒト又は他の動物においてナトリウム排泄を増加させるために用いうる ナトリウム排泄効果を有した化合物に関する。

発明の背景 ヒト及び他の陸生哺乳動物におけるナトリウム排泄コントロール系の特質は長年 にわたり研究されてきた。

１９６０年代初期まで、哺乳動物におけるナトリウム排泄は２つの因子：即ち１ ）糸球体濾過速度（“ＧＦＲ”）及び２）鉱質コルチコイドホルモン活性のうち １つの変化によってコントロールされると考えられていた。しかしながら、１９ ６１年にＤｅＷｇｒｄｅｎｅｒ　ｅｊ　ｍｌ、、Ｃｌ１ｎｉｃｘｌＳｃｉｅｎｃ ｅ、　２１：２４９−２５８　（１９６１）　により、他の因子がナトリウム排 泄を調節することが明らかにされた。ナトリウム排泄の増加（以下、“ナトリウ ム排泄増加”と称される）は一定のＧＦＲ及び鉱質コルチコイドホルモン活性に もかかわらずイヌにおいて細胞外液容量増加に応じて起きることが観察された。

ＤｅＷａｒｄｅｎｅｒらの観察のおかげで、著しい努力が、ナトリウム排泄の調 節に関与する他の因子を単離かっ同定するために、当分野の研究者らにより行わ れた。ナトリウム排泄の主調節因子が存在するという考えのちとに、いく人かの 研究者らは“ナトリウム排泄増加ホルモン”と呼ばれる物質を追跡した。例えば 、 Ｂ＋１ｃｋｅｒ、Ｎ、Ｓ、、　’Ｔｈｅ　ＣｏｎＨｏ１　ｏｌ　Ｓｏｄｉｕｍ　 Ｅｔｃ＋ｅｔｉｏｎＷｉｔｈ　Ｎｏｒｍｓｌ　畠ｎｄ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｎｅｐ ｈ＋ｏｎ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｅ−Ｅｍｉｎｅｎｃｅ　ｏｆＴｈｉｒ ｄ　Ｆａｃｔｏｒ’　（正常及び低ネフロン群におけるナトリウム排泄のコント ロール：第三因子の出現）、八ｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　、　４３：３１３　（１ ９６７）参照；更にＨａｂｅｒ及びＨＩｕｐｅｒｔ、　Ｈ７ｐｅｕｅｎｓｉｏｎ 、　４：３１５　（１９８７）参照。

本発明以前に、Ｎａ／に−ＡＴＰアーゼポンプに関して作用するナトリウム排泄 増加因子は純粋形で単離されず、化学的に規定されず又は研究所で合成されなか った。

事実、２以上の生化学化合物が観察された効果に関与しているかもしれない証拠 がある。はとんどの研究者により研究された能動ナトリウム輸送阻害分画の阻害 剤は、分子量５００ドルトン以下（限外濾過で示される）の小さな分子である。

一部のグループはその化合物がペプチドであろうと報告したが、最近の研究では その因子のペプチド性を否定した。

ここ数十年にわたる多くの研究は、心臓疾患、肝不全及び月経前症候群を含めた いくつかの疾患に関する高ナトリウム食の逆効果（例えば、高血圧）及びナトリ ウムの腎臓貯留に向けられていた。利尿剤はこれらの病状を防止又は転換させる 努力に関して今日広く用いられている。しかしながら、最も強い汎用利尿剤はナ トリウム排泄を増加させるばかりでなく、望ましくないカリウム喪失をも招く。

残念ながら、代替品として処方されるカリウム補助剤は通常口にあわず、高価で 、しかも継続ベースで耐えることが患者にとり困難である。

このため、特異的にナトリウム排泄を増加させるがカリウム喪失を起こさない強 力なナトリウム排泄増加化合物に関する必要性が存在している。本発明はこの要 求を満たすと同時に、関連した利点も提供する。

発明の要旨 本発明は“ナトリウム排泄増加ホルモン”と命名される実質上精製されたナトリ ウム排泄増加化合物を提供するが、これはカリウム排泄に悪影響を与えることな くナトリウム排泄を増加させる。このナトリウム排泄増加ホルモンはステロイド 核、分子量３６０．４及び分子式０式％ 本発明の一面において、該ナトリウム排泄増加ホルモンは、尿毒症患者の尿を凍 結乾燥し少量の脱イオン水で再調製して濃縮サンプルを得、濃縮物質をゲル濾過 により分離し、酢酸ピリジニウム／メタノール緩衝液を用いて逆相高圧液体クロ マトグラフィーに後項ピークを付すことで得られる。生物活性物質の活性は約４ ５％メタノールで溶出される。次いでＨＰＬＣの精製産物はトリメチルシリル化 され、高温でガスクロマトグラフィーに付される。次いでこのクロマトグラフィ ーの単一産物は、蒸発後にナトリウム排泄増加ホルモンを得るため酸溶液中で加 水分解される。

本発明のもう一面において、該ナトリウム排泄増加ホルモンは哺乳動物において ナトリウム排泄を増加させるために用いられる。

図面の簡単な説明 図１は例１で記載される精製された活性サンプルの紫外線吸収スペクトルについ て示している。

発明の詳細な説明 本発明に至る研究過程で、ナトリウム排泄増加作用を有する化合物が実質上純粋 な形で単離された。本化合物はナトリウム排泄増加ホルモンと命名され葛。この ナトリウム排泄増加ホルモンは、哺乳動物、好ましくはヒ１又はイヌの血液及び 尿並びに視床下部のような選択組織のホモゲネートを含めた様々な起源から得る ことができる。本化合物は正常ヒト尿中に存在するが、２４時間の尿採取で回収 される量は尿毒症個人の尿の場合に著しく高い。

ナトリウム排泄増加ホルモンは分子量３６０．４、分子式Ｃ２１Ｈ２８０５及び ステロイド核を有する。ナトリウム排泄増加ホルモンの物理的性質に関する他の 情報も入手しうる。それは白色粉末として単離され、約２２０ｎｍで主紫外線吸 収ピーク及び約２９０ｎｍで広い二次ピークを示す。ナトリウム排泄増加ホルモ ンは極温に高耐性であることがわかり、−８０℃又は激しい沸騰で１年間にわた る接触後でも下記のように生物活性を維持している。

それは水溶性であって、高比誘電率のある有機溶媒に可溶であることもわかり、 その極性性質を示した。それはｐＨ６，８の酢酸アンモニウム（・ＮＨ４０ＡＣ ）緩衝液を用いてセファデックスＧ−２５カラムから溶出され、塩ピーク後に現 れる。

ナトリウム排泄増加ホルモンの生物活性は５ＮＨＣＩとの接触で著しく低下する 。生じる反応は、適切な環境下で脱離（例えば、脱水）、転位（例えば、逆アル ドール）及び／又は加水分解（例えば、ラクトン開裂）反応をうけることが知ら れるステロイド核上のヒドロキシル、カルボニル又はカルボキシル基と酸との相 互作用に基づくらしい。

加えて、ナトリウム排泄増加ホルモンは０．２Ｍ酢酸ピリジニウム緩衝液（ｐＨ ５，５）／メタノール勾配を用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ ）カラム（Ｃ−１８樹脂カラムを用いた逆相ＨＰＬＣ）Ｌかる後メタノール濃度 約４０〜５０％、好ましくは４５％で同カラムから反復均等溶出によって更に精 製することができる。

ここで用いられる“ナトリウム排泄増加ホルモン”という用語は、少なくとも１ 種の哺乳動物において投与時にネフロンでＮａ−に−ＡＴＰアーゼ活性を阻害す ることによりナトリウム排泄速度を増加させる化合物をいう。

この天然ヒトナトリウム排泄増加ホルモンは分子量３６０．４、分子式Ｃ２１Ｈ ２８０５及びステロイド核を有する。

ナトリウム排泄増加ホルモンという用語は、ナトリウム排泄増加活性を留めてイ ンビトロ又はインビボ修正をうけた双方の天然ホルモンにも関する。限定的修正 、即ち官能基の置換又は除去は生物活性を破壊しないのであれば行ってもよいこ とが理解される。更に、所定化合物に生物学的及び化学的に相当するか又はそれ よりも更に活性である多数の誘導体が製造されうろことが、ステロイド化学及び 医薬製造業界の当業者によって認識されるであろう。相当化合物の例としては、 酸官能基のエステル、ヒドロキシル官能基のエステル又はカルボニル官能基の一 般的カルボニル誘導体がある。

ナトリウム排泄増加ホルモンの状態を記載するために用いられる場合の“実質上 純粋”とは、自然環境下でナトリウム排泄増加ホルモンと通常関連し又はそれと 共に生じるタンパク質、ステロイド類及び他の物質を実質上台まないホルモンを 表す。

ここで用いられる“後項ピーク”という用語は、ナトリウム、カリウム、尿素及 びクレアチニン含有分画の直後に出現して基準伝導率及び２８０ｎｍでＵＶ吸収 を有するＧ−２５セフアデツクスカラムがら溶出される物質をいう。

ナトリウム排泄増加ホルモンの生物活性は、様々な細胞タイプ及びいくつかの動 物種においてナトリウム輸送に関与するいくつかのアッセイ技術で調べることが できる。例えば、経上皮ナトリウム輸送はヒキガエルの摘出膀胱、カエルの摘出 皮膚及びウサギネフロンの摘出潅流皮質集合管において阻害される。３種すべて の構造体において、ナトリウム排泄増加ホルモンが構造体の血液側に加えられた 場合にのみナトリウム輸送の阻害が生じる。

摘出された細管において、表面への添加はナトリウム流出（管腔から浴に）を減 少させるが、それが管腔表面に加えられた場合には効果がない。経上皮電位差（ Ｐ、　Ｄ、　）の同時低下が起き、管腔は低い正電位となる。用量応答研究にお いて、ナトリウム流出及びＰ、　Ｄ。

の双方はゼロに近づく。ここで用いられる“生物活性”という用語は、例２の方 法で測定されるように、８６Ｒｂ取込みを２０％以上阻害する物質に関する。

加えて、ナトリウム排泄増加ホルモンは、正常スプラグ−ドーリ−（Ｓｐ＋ｘｇ ｕｅ−Ｄａｖｌｅｙ）ラットにおいて絶食されるが但し水に自由に近づける場合 にナトリウム排泄の増加を起こす。それは非麻酔尿毒症ラットにおいてナトリウ ム排泄増加も生じさせる。ホルモンが正常ラット腎臓の腎動脈内に直接注入され た場合には、ナトリウム排泄増加は中度である。相当用量が尿毒症動物の腎臓の 腎動脈内に注入された場合には、ナトリウム排泄増加応答は著しく増加する。

ナトリウム排泄増加ホルモンは、ウシ腎細管から本来得られかつ細胞培養技術を 用いて維持される細胞系のＭＤＢＫ細胞によるナトリウム輸送を阻害する。この ような細胞系は１２３０１パーク・ローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８ ６２．ＵＳＡ （１２３０１Ｐｓｒｋ　Ｌｇｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、ＭＤ　２ ０８５２．ＵＳＡ）のアメリカンφタイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅ ｒｉｃｘｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ［１ｏｎｌから入手可能 であり、そこでは参照符号ＡＴＣＣＣＲＬ６０７１　（認証細胞系）として確認 される。一方、イヌ腎細管から得られるＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）の ような他の細胞系もアッセイで用いてよい。例２で後記された本発明により生物 活性を調べる好ましい方法では、培養増殖されたＭＫＢＫ細胞による８６Ｒｂ流 人を阻害しうる本発明のナトリウム排泄増加化合物の能力に基づくマイクロアッ セイを用いる。ウワバイン（１０’Ｍ）が参照阻害剤として用いられる。ナトリ ウム排泄増加ホルモンは、培養中のＭＤＢＫ細胞系による８６Ｒｂばかりでなく 、（短時間の測定で）ナトリウム流出及び流入も阻害する。

本発明のナトリウム排泄増加ホルモンはいくつかの臨床及び診断関係で用いるこ とができる。臨床適応症としては、うっ血性心不全、浮腫又は腹水を伴う肝硬変 、ネフローゼ症候群及び高血圧症状のような浮腫症状がある。

本発明の化合物は酸性又はアルカリ性条件下で不活性化に耐性であるため、経口 摂取が可能でありかつ好ましい。

しかしながら、静脈内、筋肉内、経皮等のような他の経路による投与も有効であ る。

一回で投与される量は、有益な臨床結果を得る上で十分なほどナトリウム排泄を 増加させる。その後の用量は初回用量の臨床効果に応じて調整することができる 。典型的な初回用量は、平均ヒトの場合で約１〜１０００ｍｇ。

好ましくは１０〜２５０ｍｇ、更に好ましくは２５〜１００ｍｇである。全一日 用量は１回分の個別的用量又は間隔をあけた複数回分の用量からなる。

医薬製剤は、活性化合物に加えて、不活性キャリア及び／又は保湿剤、香味剤、 結合剤及び増量剤のような他の不活性成分並びにナトリウムの遠位デリバリ−を 増加させる他の利尿剤（即ち、アセタゾラミド）のような薬理活性を有した他の 化合物も含有することができる。

医薬組成物は錠剤、カプセル、注射溶液及び懸濁液、経口溶液並びに医薬用に考 えられる他の処方剤の形をとることができる。例えば、錠剤用に考えられる組成 物は、活性物質２５ｍｇ５ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セ ルロース、ペパーミント油、ボリソルベ−ト８０、ポビドン及び前ゼラチン化デ ンプンを含有している。

ヒトでの使用に加えて、本発明のナトリウム排泄増加化合物は家畜動物、特にナ トリウム貯留疾患及び高血圧を有するベットにおいて同様の獣医学目的で用いる ことができる。

下記例は説明のためであって、本発明を制限するためのものではない。それらは 用いられる場合の典型例であるが、当業者に公知の他の操作も代わりに用いてよ い。

例１ ナトリウム排泄増加ホルモンの単離 ２４時間尿サンプルを８ｍｇ／ｄ１以上の血清クレアチニン濃度及び／又は２０ 〜２５ｍ１／ｍｉｎ以下の血清クレアチニンクリアランスを有する非透析患者か ら１〜１０日間にわたり採取した。各日に採取された尿の容量及び患者に投与さ れた全薬物に関する表示を行った。各２４時間尿採取液を減圧及び低温下でスラ ッジに凍結乾燥し、脱イオン水１００ｍ１で再調製した。次いで調製液を３００ ０ｒｐｍ、４℃で遠心し、ひだ付濾紙（ワットマン＃１）で濾過した。

簡単にいえば、凍原の６時間サンプルに相当する濃縮尿サンプルの２５ｍ１アリ コートをセファデックスＧ−２５〔ファイングレード；ニューシャーシー州ビス カットアウェイのファルマシア・ファイン・ケミカルズ社（Ｐｂｌｒｍｓｃｉ＊ 　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃｘｌｓ、　Ｉｎｃ、）　］充填の各２．５×９５ｃｍ カラムに供した。溶出はｐＨ６，８の１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液で５５〜５ ５ｍ１／ｈの速度で重力により４℃で行った。溶出液は自動分画コレクター〔モ デル７０００ウルトロラツク（Ｕ目ｒｏ＋ｓｃ）、Ｌ　Ｋ　ＢプロデューサーＡ 　Ｂ　（ＬＫＢ　Ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ＡＢ）　、ストックホルム、スウェーデン 〕を用いて１８Ｘ１５０ｎ＋＋ガラス管（１２ｍｌ）内に一夜かけて集めた。２ ８０＋＋＋ｎにおける紫外線吸収（ＬＫＢウビコード（ＬＫＢ　Ｕｗｉｃｏｒｄ ）　）及び伝導率トレーシング（５３１２Ｂ伝導セル装備モデル５３００Ｂコン ダクトライザー（Ｃｏｎｄｕｃｊｏ１７ｚｅｒ）　、Ｌ　Ｋ　Ｂプロデューサー Ａ　Ｂ）に基づき、溶出液及び管内容物をいくつかの異なる分画にプールした。

高分子量化合物（例えば、タンパク質）、ナトリウム、カリウム、尿素及びクレ アチニンを含有した分画を捨てた。ナトリウム排泄増加活性は塩ピーク直後に現 れる分画にのみ存在した。次いで溶出液のこの部分のみは、溶出液の具体的伝導 度が基準値に戻った管から出発して連続１０の管の内容物（全量１２０ｍ１）を プールし、ガラス容器内で一夜その物質を凍結乾燥することによりルーチンに調 製した。

次いで乾燥された溶出物をスクリューキャップガラス又はポリエチレンバイアル 内の８０％０．２Ｍ酢酸ピリジニウム（ｐＨ５，５）／２０％メタノール２．　 ５ｍｌに溶解し、−８０℃で貯蔵した。この溶液１１は約２時間で排泄された凍 原の容量に相当した。数カ月以内にわたる濃縮尿サンプル又は最終分画の貯蔵で も、その物質のナトリウム排泄増加活性に影響を与えないことがわかった。

アッセイに付された標準分画は、尿毒症患者又は正常体のいずれから得られたも のであっても、典型的には１０＋＋＋ｅｑ／Ｌ以下のナトリウム及び１　ｍｅｑ ／Ｌ以下のカリウムを含有していた。差異はアンモニウム、尿素及びタンパク質 濃度に関して尿毒症患者及び正常体からの分画で観察されなかった。平均値は、 アンモニウム２４．４±３．　７ｍｅｑ／Ｌ　、尿素１５．８±２　、　６　＋ ｎｇ／１００ｍ１及びタンパク質２．０±０．６Ｂ／ｎｌであった。

Ｇ−２５溶出物からの後項ビークに関して例２の方法で調べられる生物活性分画 を逆相クロマトグラフィーカラムＲＰ−Ｃ−１８［ブラウンリー・ラプス（Ｂｒ ｏｗｎｌｅｅＬａｂｓ）　、リクロゾルブ（Ｌｉｃ＋ｏｓｏｒｂ）　ＲＰ　−１ ８，１０μ。

シリーズ８７７１）に付し、８０％０．２Ｍ酢酸ピリジニウム（ｐＨ５，５）／ ２０％メタノールで約１ｍｌ／ｍｉｎにて１０分間しかる後５０％０．２Ｍ酢酸 ピリジニウム（ｐＨ５，５）１５０％メタノールまでの勾配で６０分間にわたり 溶出させた。分画を１分間隔で集めた。一方、５μのベックマン・ウルトラスフ ェアＯＤＳ（Ｂｃｃｋｍｌｎ　Ｕｌｊｕｓｐｈｅｒｅ　０ＤＳ）　（Ｃ−１８） 　（ベックマンＯインストルメンツ（Ｂｅｃｋｍｇｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ） 　、プレア（Ｂ＋ｅｘ）、カルフォルニア州〕を用いてもよいが、但し所望化合 物が溶出される時間は様々であって、ここで記載されるインビボ及びインビトロ アッセイで確認されねばならない。約４５±５分間で溶出する所望化合物はガラ スフィルターを用いてケイ光透過〔アミンコ・フルオロ・モニター（＾ｍ１ｎｃ ｏ　Ｈｕｏｒｏ　Ｍｏｎ１ｔｏｒ）　、アメリカン・インストルメンツ（＾ｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ、）、シルバー・スプリング（Ｓｉ ｌｗｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ）　、　メリーランド州〕により検出された：励起３１ ０−４１０ｎｍ及び放射４７５−６５０　ｎｕ０個々の管を“スピード・バキュ ーム”（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃｕｕｍ）　（サバント・インストルメンツ（Ｓｘｙ ｕｊＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ファーミングデイ（ＦｕｍｉｎｇｄＢ）、　＝ ニーヨーク州〕を用いて蒸発乾固し、脱イオン水に再溶解し、しかる後側２の方 法で生物活性について試験した。生物活性分画を合わせ、５６％０．２Ｍ酢酸ピ リジニウム（ｐＨ５，５）／４４％メタノールを用いて均等溶出により同一カラ ムで再クロマトグラフィーに付した。この方法で、見掛上均一な固体物は例２の アッセイで記載されるように放射性同位元素ルビジウム輸送を阻害しうるそれら の能力に基づき選択される適切な分画の蒸発後に単離した。この物質及び精製前 ステップからの物質に関するインビボ活性は、参考のため本明細書に組み込まれ るＢｒ１ｃｋｅｒ　ｅｊ　ｔｌ、、　Ｉ、　Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｓｌ、　５３ ：ｌ５５９−１５６７（１９７４）で記載されるようにラットでナトリウム排泄 増加とじて確認された。

この物質の紫外線吸収スペクトルは約２２０ｎｍ及び２９０ｎｍで最大を示した 。その物質はカリフォルニア州ブレア、ベックマン・インストルメンツのベック マンフルオロメーターで固有ケイ光を示した。

次いで生物活性物質を大過剰の１：１ピリジン二ＢＳＴＦＡ　（ビストリメチル シリルトリフルオロアセトアミド）と５０℃で３０分間反応させた。次いで得ら れた混合物を、検出器として高分解能Ｅ−１質量スペクトロメーターを用い、１ ５ｍ溶融シリカキャピラリーカラムＣＪ＆Ｗサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ）　Ｄ　Ｂ　−５−３０Ｗ）を用いてガスクロマトグラフに供した。

単一生成物の保持時間は２００〜７００秒であった。他の生成物は検出されなか った。トリメチルシリル基を１時間のＩＮ塩酸処理で加水分解し、凍結乾燥後に 実質上純粋な白色固体物のナトリウム排泄増加ホルモンを得た。

例２ 生物活性に関するマイクロアッセイ ナトリウム排泄増加ホルモンのナトリウム排泄増加活性は、ＭＤＢＫ、［メイビ ン・ダービー（Ｍａｉｂｉｎ　Ｄａ＋ｂｙ）ウシ腎細胞〕培養物による８６Ｒｂ の取込みに関するその効果から確認することができる。簡単にいえば、８６Ｒｂ （生物学上カリウムとして挙動する）の細胞による取込みはＮａ−に−ＡＴＰア ーゼ酵素の活性を阻害する因子によって阻害される。ウアバインはこの酵素の公 知阻害剤であるが、８６Ｒｂを含有したＭＤＢＫ細胞調製物へのウアバイン添加 で細胞による８６Ｒｂ取込みを９０％も阻害することができる。

約２００，０００のＭＤＢＫ細胞を１２の２　ｍｍ２ウエル含有トレーにいれ、 ダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）＃４３０−２ １００）において３７℃で４日間増殖させ、それに（リットル当たり）炭酸水素 ナトリウム３．７ｇ、フェノールレッド５ｍｌ、１０％ウシ胎児血清１０６単位 硫酸ペニシリンＧ、０．１ｇ当量硫酸ストレプトマイシン、硫酸ポリミキシン８ ７．３４ｍｇ及びフンギシン３．４ｍｇを加え、５％Ｃ０２，９５％空気の雰囲 気下で維持した。細胞は集密化し、約１０６細胞／ウエルの濃度で存在する。ア ッセイを行うために、細胞を強化ＤＭＥＭ　（５００μＬ）内において少なくと も２〜５分間の凍原に相当する容量中で試験物質５０〜７５μＬと共に３７℃で ３０分間ブレインキュベートした。このブレインキュベート後、約５　Ｘ　１０ ５ｃｐｍ　８６Ｒｂ及び更に５０〜７５μＬの試験物質を各ウェルに加え、細胞 を３７℃で更に１５分間インキュベートした。反応を冷ＰＢ３１ｍｌで停止させ 、冷ＰＢ３０．５ｍｌで２回洗浄した。洗液を捨てた。５％ＴＣＡ０．５ｍｌを 各ウェルに加え、３７℃で１０分間インキュベートして、細胞内に放射能を放出 させた。次いで各ウェルの上澄を小遠心管（１ｍｌ）に移した。１００μＬアリ コート（２回）をシンチレーション液含有シンチレーションバイアル〔水性サン プル用のレディ・セーフ（Ｒｅｇｄ７５ｇ１ｅ）　；ベックマン・インストルメ ンツ、プレ乙カルフォルニア州〕に移した。８６Ｒｂ活性をシンチレーションカ ウンター（ベックマンＬＳ３−８０１）で計数した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄 し、Ｏ，ｌＮＮａ１Ｈ５００μＬ中３７℃で一夜消化させた。翌日、加水分解さ れた細胞を参考のため本明細書に組み込まれるマイクロクマシー（ｍｉｃｒｏ　 Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）法（Ｃｈｉａｐｅｌｌ夏。

Ｆ、！ｌ　ａｌ、、＾ｎａ１７１ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｂ、、　９４：Ｉ６０．１ ９７４）によりタンパク質に関して分析した。各組のアッセイにおいて、ＰＢＳ 及び１０’Ｍウアバインを各々陰性及び陽性コントロールとして用いた。データ はｃｐｍ／ｍｇ細胞タンパク質として記録した。８６Ｒｂ取込みを２０％以上阻 害する分画は活性と考えられた。最も活性なサンプルは８６Ｒｂ取込みを実質上 更に大きなパーセンテージで阻害した。典型的な結果は表１で示されている。

表１ （各サンプルは２回ランし、平均化した）コントロール十Ｐ　Ｂ　８　７９．６ ９２６９、０５８　０％ ウアバイン１０　１７，６４９ １５、６１１　７７、７％ Ｇ−２５“後項”ナトリウム排泄増加活性（１０μＬ）　４５，５９２ ４１、５９６　４１．４％ （５０μＬ）　３２，３３６ ２０、８０３　５８．０％ 本発明は現在の好ましい態様に関して記載されているが、様々な修正が本発明の 精神から逸脱しないかぎり行いうると理解されるべきである。したがって、本発 明は下記請求の範囲によってのみ制限される。

シ良表（ｎｍ） 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．分子量約３６０、分子式Ｃ２１Ｈ２８Ｏ５及びステロイド核を有し、カリウ ム濃度の対応低下なしに哺乳動物においてナトリウム排泄を増加させるその能力 によって特徴付けられる化合物である、実質上純粋なナトリウム排泄増加ホルモ ン。
2. ２．化合物がトリストリメチルシリル誘導体を形成しうることで更に特徴付けら れる、請求項１に記載の化合物。
3. ３．化合物が約２２０ｎｍで主紫外線吸収ピーク及び約２９０ｎｍで副紫外線吸 収ピークを有する、請求項１に記載の化合物。
4. ４．化合物がステロイド核を有する、請求項１に記載の化合物。
5. ５．化合物が経口投与された場合にナトリウム排泄を増加させる上で活性である 、請求項１に記載の化合物。
6. ６．実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物を得る方法であって、 ａ．上記化合物を含有した生物学的サンプルを濃縮し；ｂ．上記濃縮サンプルを ゲル濾過により分離し、後塩ピーク物質を保有し； ｃ．溶出液として希水性酢酸ピリジニウム／メタノール混合液を用い樹脂カラム 上で反復逆相高圧液体クロマトグラフィーにより保有物質から生物活性分画を単 離し；ｄ．抽出された生物活性分画をトリメチルシリル化剤と反応させ； ｅ．得られた組成物をガスクロマトグラフに通し；及び ｆ．ガスクロマトグラフィー産物を回収かつ加水分解し、それによって実質上純 粋なナトリウム排泄増加化合物が得られる； ステップからなることを特徴とする方法。
7. ７．下記プロセス： ａ．目的化合物を含有した生物学的サンプルを濃縮し；ｂ．上記濃縮サンプルを ゲル濾過により分離し、後塩ピーク物質を保有し； ｃ．溶出液として希水性酢酸ピリジニウム／メタノール混合液を用い樹脂カラム 上で反復逆相高圧液体クロマトグラフィーにより保有物質から生物活性分画を単 離し；ｄ．抽出された生物活性分画をトリメチルシリル化剤と反応させ； ｅ．得られた組成物をガスクロマトグラフに通し；及び ｆ．ガスクロマトグラフィー産物を回収かつ加水分解し、それによって実質上純 粋なナトリウム排泄増加化合物が得られる； で得られる実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物。
8. ８．下記ステップ： ａ．目的化合物を含有した生物学的サンプルを凍結乾燥により濃縮し； ｂ．上記凍結乾燥サンプルを少量の脱イオン水で再調製して濃縮サンプルを得； ｃ．上記濃縮サンプルをセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過により分離 し； ｄ．０．２Ｍ水性酢酸ピリジニウム／メタノール溶出液を用いてＣ−１８カラム 上で逆相高圧液体クロマトグラフィーにより濾過濃縮サンプルから生物活性分画 を単離し； ｅ．抽出された生物活性分画を１：１ピリジン：ＢＳＴＦＡと反応させ； ｆ．得られた組成物をガスクロマトグラフに通して回収し；及び ｇ．産物を加水分解し、それによって実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物が 得られる； で得られる実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物。
9. ９．経口投与された場合にナトリウム排泄を増加させる上で活性である、請求項 ８に記載のナトリウム排泄増加物質。
10. １０．請求項８に記載された方法で得られる化合物である化合物。
11. １１．哺乳動物においてナトリウム排泄を増加させる方法であって、 ナトリウム排泄増加の必要な上記哺乳動物にナトリウム排泄を増加させる上で十 分な量で請求項１に記載された化合物を投与することを特徴とする方法。
12. １２．投与が経口摂取による、請求項１１に記載の方法。
13. １３．哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の方法。
14. １４．必要性が高血圧の浮腫形成状態に起因する、請求項１３に記載の方法。
15. １５．下記ステップ： ａ．目的化合物を含有した生物学的サンプルを凍結乾燥により濃縮し； ｂ．上記凍結乾燥サンプルを少量脱イオン水で再調製して濃縮サンプルを得； ｃ．上記濃縮サンプルをｐＨ６．８の１０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いたセファ デックスＧ−２５カラムでのゲル濾過により分離し； ｄ．溶出液として５０〜８０％０．２Ｍ水性酢酸ピリジニウム（ｐＨ５．５）／ ２０〜５０％メタノール緩衝液の勾配を用いＣ−１８カラム上で逆相高圧液体ク ロマトグラフィーにより濾過濃縮サンプルから生物活性分画を単離し； ｅ．抽出された生物活性分画を１：１ピリジン：ＢＳＴＦＡと５０℃で３０分間 反応させ；ｆ．得られた組成物を１５ｍ溶融シリカキャピラリーカラムを用いガ スクロマトグラフに通して回収し；及びｇ．１Ｎ塩酸で１時間かけて産物を加水 分解し、それによって凍結乾燥後に実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物が得 られる； で得られる実質上純粋なナトリウム排泄増加化合物。