JPH04501266A - ヨード―１２５で標識された放射線療法用接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、腫瘍特異的モノクローナル抗体の治療的応用の分野に関し、さらに詳 しくは、癌治療に存用な放射線療法免疫接合体に関する。

発明の背景 放射性同位元素を癌細胞の近位に局在させることを意図する免疫療法は、様々の 放射性核種について広く試験されている。理論的には、このような放射性核種は 、−次崩壊現象から離れた腫瘍を、いくつもの細胞層を通して破壊するのに十分 な放射線を運ぶことができる筈である。しかしながら、臨床試験では、放射線標 識モノクローナル抗体は、注射した放射能用量の約０．００４％未満をヒト腫瘍 に局在させることしかできないことを示している。したがって、モノクローナル 抗体が、生体の他の部分に有意な放射線毒性を起こすことなく、腫瘍容量に治療 上十分な放射線を送達できるかどうかは不確定である。

放射性ヨウ素接合体の患者への治療的適用はヨウ素−１３１（”’ｌ）の使用に 限られてきた。最近、放射性ヨＶｉｔｒｏ細胞毒性に関する研究が学術文献に報 告されている。Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４５　：　５０８０　（１９ ８５）には、Ｍｒ２５０，０００メラノーマ関連抗原に対する１１１標識ネズミ モノクローナル抗体によるヒトメラノーマ細胞の特異的殺滅が開示されている。

Ｂｌｏｏｄ　６７　：　４２９（１９８６）ニハ、Ｔ６５抗原に特異的す＋　２ １１−標識ネズミモノクローナル抗体の、ヒト悪性Ｔ細胞系に対する選択的細胞 毒性が開示されている。この文献は、長い曝露時間が凍結条件で達成できたこと 、そしてインターナリゼーシ町ンはわずかじか起こらないことを示している。

＋２５［−標識モノクローナル抗体の臨床的に有用な応用は、生物医学の分野で はきわめて興味がある。

発明の要約 本−発明は、腫瘍特異的モノクローナル抗体またはそのフラグメントとオージェ 電子放出放射性核種からなる放射線療法用免疫接合体を提供するものであり、こ の場合、腫瘍特異的モノクローナル抗体またはフラグメントは放射性核種の腫瘍 細胞核局在を可能にする。放射線療法用免疫接合体はその治療有効量を、その抗 体またはフラグメントと反応する悪性腫瘍を有するまたは有することが疑われる 患者に投与される。

その一実施態様においては、本発明は、１７Ａ抗原に対して特異的なモノクロー ナル抗体またはそのフラグメントおよび１１６Ｉからなる放射線療法用免疫接合 体を提供する。本発明はさらに、上記放射線療法用免疫接合体の治療有効量を投 与することからなる１７−ＩＡ陽性悪性腫瘍の処置方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１８は、０℃でインキュベートした後の、１２５ＩＭＡｂ１７−ＩＡの１７− ＩＡ−陽性腫瘍細胞へのインターナリゼーションを示す。図１ｂは、３７℃でイ ンキュベートした後のインターナリゼーションを示す。

図２は、３７℃でインキュベートした後の、１２ｓ（ＭＡｂ１７−ＩＡのＳＷＩ 　１１６細胞へのインターナリゼーションを示す。

図３は、１２ｓＩ　ＭＡｂ　１１１６−Ｎ５−１９−９（７）１’ンターナリゼ ーシヨンを０゛Ｃおよび３７℃でインキユベートシた後ＳＷＩ　１１６細胞中で 測定した対照実験の結果を示す。

図４ａ、４ｂ、４ｃおよび４ｄは、特異的１２６１標識モノクローナル抗体およ び対照薬剤による５Ｗ１１１６細胞中で評価した染色体異常を示す。

図５は、様々な濃度の１１１８１放射標識および非標識ＭＡｂ１’　７−　Ｉ　 Ａに曝露した後の、１００中期あたりの染色体切断（ＣＢ）をもつ細胞の数を示 している。

図６は、１２Ｂ［放射標識ＭＡｂ１７−ＩＡとインキユベートシた後のＳＷＩ　 １１６および］、　７−　Ｉ　Ａ−陰性腫瘍細胞（ＷＩＳＨ）の細胞生存曲線を 示す。

発明の詳細な説明 本発明は、腫瘍特異的モノクローナル抗体またはそのフラグメントとオージェ電 子放出放射性核種からなり、この腫瘍特異的モノクローナル抗体またはフラグメ ントは腫瘍細胞核局在を可能にする免疫接合体を使用することを特徴とする癌治 療法に関する。本明細書において用いられる「腫瘍細胞核局在」の表現は、抗体 またはフラグメントが、哺乳動物細胞の核およびその関連成分（核膜、核質、染 色質、染色体、核小体、ヌクレオソーム、ＤＮＡおよびＲＮＡ）への特異的取り 込みを示すことを意味する。本発明の免疫接合体は、正常組織に傷害を与えるこ となく腫瘍に対して選択的細胞毒性を発揮できる。

本発明に用いられる腫瘍特異的モノクローナル抗体は、動物を腫瘍関連抗原含有 生物学的サンプルで免疫処置し、動物からの抗体産生細胞とミエローマ細胞の間 に融合細胞ハイブリッドを形成させ、得られたハイブリッドをクローニングし、 ついで腫瘍関連抗原に結合する抗体を産生ずるクローンを選択することによって 得ることができる。動物の免疫処置、融合細胞ハイブリッドの形成、および所望 の結合特異性をもつクローンの選択は、本技術分野においてよく知られている。

完全な抗体から抗体フラグメントの製造も、免疫学の分野の熟練者にはよく知ら れている。本発明においては、１７−ＩＡ抗原を含有する生物学的サンプルを動 物の免疫処置に使用し、１７−ＩＡ抗原に対して特異性を存するモノクローナル 抗体またはそのフラグメントを用いるのが好ましい。

モノクローナル抗体１７−ＩＡ（以下ＭＡｂ１７−ＩＡ）は、胃腸腺癌に関連す る腫瘍特異的抗原（以下ｒ１７−ＩＡ抗原」）に結合することが報告されている （Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、　Ｈ，、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ、　Ｚ、、　Ｍｉｔｅｈ ｅｌｌ、　Ｋ、。

Ｆ、、　Ｈｅｒｌｙｎ、　Ｄ、、　Ｈｅｒｌｙｎ、　Ｍ、、　Ｇｒｏｔｚｉｎｇ ｅｒ、　Ｐ、Ｊ、。

抗原は特性が明らかにされ（Ｒｏｓｓ、　Ａ、　Ｈ，、Ｈｅｒｌｙｎ、　Ｄ、。

［１ｉｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｄ、　＆　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、　Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１３５　：２９７〜３０３．　１９８６）、３０．０００ 〜４０，０００ダルトンの２個のサブユニットをもつ細胞表面蛋白質として記述 されている。

オージェ電子放出放射性核種は本技術分野でよく知られている。たとえば、放射 性ヨウ素−１２５は、電子捕獲によって崩壊しくＴ　Ｉ／２　＝　６０．５日） テルリウム−１２５ｍの準安定状態になり、これが内部転換（９３％）およびγ −線放射（７％）による即時崩壊を受けてテルリウム−１２ｓ娘元素に変換する 。生成した内殻空孔により、複雑な一連の電子殻再整理が起こって、低エネルギ ーＸ線（２７〜３５　ｋｅＶ　）および低エネルギー電子のカスケードを生じる 。

腫瘍特異的モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、多くの既知の標識方 法の任意の方法によって、オージェ電子放出放射線核種で標識できる。１！Ｓ１ 標識のための好ましい技術はＭａｒｋｗｅｌｌ　、Ｍ、　Ａ、　Ｋ、　＆Ｆａｘ 。

Ｃ，Ｆの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ　７　：　４　Ｂ　０７〜４８１７ ゜１９７８）である。この教示を参考として本明細書に導入する。抗体はまた、 様々な他のよく知られた操作（たとえば、クロラミンＴ、　Ｂｏｌｔｏｎ　−Ｈ ｕｎｔｅｒ　、ラクトペルオキシダーゼ等）によって、放射性ヨウ素で標識する ことができる。

本発明の方法においては、放射線療法用免疫接合体の治療有効量を、その免疫接 合体の抗体またはフラグメント成分と反応性の悪性腫瘍を有するまたは有する疑 いのある患者に投与する。患者への放射線療法用免疫接合体の投与方法は本技術 分野においては既知である。好ましくは、本発明の免疫接合体は、約２０〜２０ ０ミリキユーリーの放射能を示す、重量として約２〜２０ｍｇの抗体量として投 与される。

理論に拘束されるものではないが、本発明の１！６Ｉ標識モノクローナル抗体が 有効であるためには、モノクローナル抗体がその特異的膜抗原に結合する結果と して、まず細胞内への有意なインターナリゼーションが起こる必要があるものと 考えられる。さらに、ｌ　７−ＩＡ陽性悪性腫瘍の細胞の殺滅を最大にするため には、！−１２５放射標識モノクローナル抗体またはその放射性分解生成物が核 に直接結合しなければならないと考えられる。

本発明をさらに以下の実施例によって説明する。実施例中、部はすべて重量パー セントであり、温度は摂氏である。

Ｗｌ　１１６細胞を、２０％ウシ胎仔血清２０％を補充したＲＰＭＩＩ　６４０ 培地中で培養した。Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ　）から入手した、ＷＩＳＨと命名され た他の細胞集団、ヒト羊水細胞を、ウシ胎仔血清ｌＯ％を含有する同じ培地中で 培養した。この細胞系は、ＭＡｂ１７−ＩＡに結合する腫瘍特異的抗原を含有し なかった。細胞系は５％ＣＯｚ含有空気下の適湿インキュベーター中、３７℃で 維持した。以下の実施例および対照実験では、細胞はすべて対数期に培地を除去 して収穫し、０．０２％ＥＤＴＡおよび５μｇ／ｍ１ＤＮＡアーゼ含有０．０５ ％トリプシンで洗浄し、ついで実験に応じて様々な細胞濃度で新鮮な培地に再懸 濁した。検定には、モノクローナル抗体１７−ＩＡ、　ＩｇＧ　（２ａ）イソタ イプ；　１１１６−ＮＳ−１９−９，ＩｇＧ　（２ａ）イソタイプ：およびＲＩ 　ＩＤｌ０．ＩｇＧ　（２ａ）イソタイプが使用された。１１１６−ＮＳ−１９ −９モノクローナル抗体は５Ｗ１１１６細胞系から発散される結腸癌抗原に結合 する。ＲＩＩＤＩＯモノクローナル抗体は心臓ミオシンと反応性を示し、非免疫 反応性対照抗体として使用さＩｏｄｏｇｅｎ　”　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、　）法（Ｍａｒｋｗｅｌｌ　。

Ｎ、Ａ、Ｋ、＆Ｆｏｘ、Ｃ，Ｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１　７　：４８０ ７〜４８１７．　１９７８）を用いて１１ｓ　■で標識した。Ｉｏｄｏｇｅｎ被 覆チューブに抗体（１０ｍｇ／ｍｌ、アルブミンを含まない）２００μｇ、つい でＰＢＳ　（食塩溶液中０．１Ｍリン酸塩緩衝液、　ｐＨ７，０）　８０μｍを 加えた。

約２．５ミリキユーリーのＮａ”！　（担体なし、　Ｄｕｐｏｎｔ　ＮＥＮ）を 直ちに加え、生じた反応を１０分間続けた。アスコルビン酸溶液（０，５ｍ１． 　１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて反応を停止させ、結合１！５Ｉを、予め２％ヒト血 清アルブミン食塩溶液で洗浄した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５Ｍカラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）上でヨウ素イオンから分 離した。放射標識抗体は空隙容量中に溶出し、ヨウ化ナトリウムγ−シンチレー ションカウンター中で検定した。

免疫反応性およびインターナリゼーション、　１ｍｓ［標識ＭＡｂ１７−ＩＡの 免疫反応性は、様々な濃度の放射性抗体との直接細胞結合によって評価した。５ Ｗ１１１６細胞（５Ｘ１０’）を様々な濃度の標識抗体（０，０３９〜２０１ｔ 　Ｃｉ／　ｍｌ）と、マイクロフユージ（Ｂｅｃｋｍａｎ　）内でＲＰＭＩＩ　 ６４０培地（２０％ウシ胎仔血清）１００μｍ中、３７°Ｃにおいて４時間イン キュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、１０％ウマ血清（ Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｖａ　）および０．０２％ＮａＮ　ｌ 含有ＰＢ　Ｓ　（ｐＨ７，４）で２回洗浄した。最終的な細胞ペレットについて 、ｌ［ｌの３５ｋｅＶ　Ｘ−線を検出するようにセツトしたヨウ素ナトリウムγ −シンチレーションカウンターでカウントした。

Ｉｔｆｉ［標識ＭＡｂ１７−ＩＡののインターナリゼーションは、２Ｘ１０＠細 胞を、一定濃度の抗体（０，５μＣｉ／ｍ１．０．７２μｇ、１０μｍ）を含む ＲＰＭＩＩ　６４０培地（２０％ウシ胎仔血清）中で、様々な期間（０〜４８時 間）インキュベートして測定した。時々振盪しながら３７℃でインキュベートし た後、混合物を遠心分離し、１０％ウマ血清および０．０２％ＮａＮｉ含有ＰＢ Ｓ１ｍｌで４回洗浄した。最終の遠心分離後、上澄液を捨て、細胞ペレットにつ いて放射能を検定した。総細胞結合（細胞関連）放射能を測定した。次に、細胞 ペレットを０．２１０１のグリシン−ＭＣＩ緩衝液、ｐＨ２，８に再懸濁し、０ ℃で２０分間インキュベートした。総細胞関連放射能を遠心分離によって、酸で 除去されない部分を含む細胞ペレットと、放射能の酸で除去される部分を含む上 澄液とに分離した。

上澄液と細胞ペレットについてそれらの放射能含量を別個に検定した。この操作 をついでインキュベーションを０℃で行い反復した。

染色体傷害の検定：対数期の細胞約１０’個を、５ｍｌの生育培地を含むフラス コ（２５ｃｍ”）に接種した。

３７℃で２４時間インキュベートした後、培養液に様々な濃度の１１１標識モノ クローナル抗体または対照薬剤を加え、得られた混合物をさらに４８時間インキ ュベートした。インキュベーションの終結５時間前に、デメコルシン（０，０６ ℃ｇ／ｍｌ）で細胞を中期に静止させた。単層を０．０５％トリプシンと１０分 間インキュベートして分散させ、細胞を低張性溶液としての０．０７５Ｍ　ＫＣ Ｉにより３７°Ｃで４０分間処理した。得られた細胞懸濁液を１５ｍ１の遠心分 離チューブに移し、新たに調製したＣａｒｎｏｙ溶液（酢酸：メタノール、１： ３）５ｍｌと静かに混合し、室温で１０分間インキュベートした。１．００Ｏｒ ｐｍで１０分間インキュベートして細胞を収穫し、上澄液を除去し、新鮮なＣａ ｒｎｏｙ溶液１０ｍ１中に静かに再懸濁した。室温でのインキュベーション、遠 心分離および再懸濁を３回反復した。最後に、細胞懸濁液３〜４滴を、清浄な冷 却、湿潤スライド上に滴加し、風乾させた。ついで、スライドをギームザで染色 した。２回の実験からの計１００個の細胞（各実験から５０細胞）について、・ 　油浸下に各用量レベルで分析した。細胞を、染色分体切断、無動原体断片、多 動原体染色体、環状染色体、および染色分体交換について評価した。

定量的分析には、各種の染色体異常を染色体切断（ＣＢ）として表した。断片お よび染色分体切断は１個の切断とし、二動原体および環状像は２個の切断と評価 した。

染色分体交換の場合には、切断の数は、コンフィギユレーションと交換像に関連 した染色体の数によって決定した。

微小核（ＭＮ）の定量に際しての細胞培養とｌｔｓ［抗体処理の操作は、染色体 検定の場合と同一とした。トリプシン処理および低張性ＫＣＩ中３７℃で１０分 間の膨潤後、単細胞懸濁液を氷冷Ｃａｒｎｏｙ固定液中で固定し、清浄なガラス スライド上に滴下した。細胞質構造が核と同じギームザ染色反応を示し、核から 明瞭に分割され（核水庖と識別するため）、径が核の１／６〜１／３である場合 、ＭＮとして記録した。２回の実験から計２０００個の細胞（各回ｔｏｏｏ個） について計数し、各得点を平均した。

細胞生存数二指数増殖期の細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁液の希釈系列を調 製した。期待される平板効率および生存フラクションに応じて、適当数の生存単 細胞（ＩＸＩ　Ｏ’　〜４Ｘ１０”）を増殖培地４ｍｌを含む６０ｍｍペトリ皿 ３〜５個に接種した。同時に、様々な濃度の１！Ｓ［標識ＭＡｂ　１７−　ＩＡ 　（０〜４０　ｔｔＣｉ／ｍｌ）および対照薬剤を添加した。細胞を３７℃で４ ８時間インキュベートした。ＳＷＩ　１１６細胞の倍加時間は約４８時間と測定 された（様々な時間間隔で既知細胞数のトリパンブルー排除による直接細胞計数 ）。４８時間試験薬剤に曝露した後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し た。新しい増殖培地を加え、細胞を適湿５％　００２大気下、３７°Ｃでさらに １９日間インキュベートして、コロニーを形成させた。ついでプレートをＣｒｙ ｓｔａｌ　Ｖｉｏｌｅｔ（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　）で 染色し、５０個を超える細胞を含む各コロニーを計数した。細胞生存値は以下の 式を用いて決定した。

平均生存率の測定には２回の独立した実験を行った。

放射標識ＭＡｂ１７−ＩＡによる細胞生存率の測定には１７−ＩＡ陰性腫瘍細胞 系（ＷＩＳＨ）も使用した。

結果 ＭＡｂ１７−ＬＡのＩ！Ｓ（による放射標識では比活性１０〜１２ｍＣ１／ｍｇ が得られた。平均放射性ヨウ素化収率は９０〜９５％の効率を示した。この操作 は、はるかに大量の放射標識１−１２５．２５ミリキユ一リー以上までスケール アップできる。最終標識生成物の免疫反応性は、単純細胞結合検定で評価された （図１）。これは様々な濃度のＩ！５！標識抗体に曝露された腫瘍細胞への結合 放射能の、無視できる程度の結合しか示さない非免疫反応性ｌ１ｌｓ■抗体（Ｒ ＩＩＤＩＯ）の場合（目盛が合わないのでグラフには示していない）に対する相 対量を示している。ＭＡｂ１７−ＩＡに曝露された細胞によって結合される放射 能の量は、放射能濃度がｌＯμＣｉ／ｍ１以上になると一定の分画になる。この 検定で用いた細胞数（２Ｘ１０’）では、細胞あたり０．６７　ｐＣｉまたは１ ．５ｄｐｍ　／細胞が最大、結合するようである。この量は、細胞あたり約１． ９Ｘ１０’放射性ヨウ素原子または抗体０．０４７ｐｇ（抗体１分子あたりヨウ 素原子１個として）に相当する。放射標識非免疫反応性ＭＡｂ　ＲＩＩＤＩＯは 、ＳＷＩ　１１６細胞に対してわずかな総細胞結合しか示さなかった（約２．５ 　Ｘ　１０−’ｄｐｍ　／細胞）。

ＳＷＩ　１１６細胞によるｌ！ｌ［標識ＭＡｂｌ？−ＩＡのインターナリゼーシ ョンは、０または３７°Ｃでの細胞結合を測定し、穏和な酸洗浄を用いて膜結合 抗原から遊離抗体を溶液中に再放出させる抗原−抗体複合体の解離により決定し た。これらの例および実験では、以下の式を使用した。

インターナリゼーション（％） ＝細胞ペレット中放射能カウント（酸除去不能）×１００％／総細胞結合カウン ト 細胞を１２５１標識ＭＡｂ１７−ＩＡに曝した後にインターナライズした！−１ ２５放射能の量を測定し、結果を図１ａおよびｌｂに示す。図１ａから明らかな ように、総細胞結合曲線（細胞会合放射能）と上澄液曲線（酸除去可能放射能） は０°ではほぼ等しく、抗体の９０％以上が膜結合抗原から解離し、各時間とも 、上澄液中に回収された。５Ｗ１１１６細胞を放射性ＭＡｂ１７−ＩＡと３７° Ｃでインキュベートすると（図１ｂ）、放射能の有意な部分が細胞ペレットに残 り（酸除去不能）、インキュベーション時間とともにこれは増加し、上澄液中の 放射能（酸除去不能）は少ない。

５Ｗ１１１６細胞中にインターナライズされる相対百分率は、図２に示すように 、インキュベーション４時間（２９％）から４８時間（４９％）まで有意に増加 する。

すなわち、これらの結果は、放射性ヨウ素化ＭＡｂ１７−ＩＡのインターナリゼ ーションはその細胞特異的抗原への結合後に起こり、インターナライズされる量 は時間とともに増加することを示唆している。放射標識（１！Ｓｔ）非免疫反応 性ＲＩＩＤＩＯ抗体による研究（４５８〜６９５ｃｐｍ　、０〜４時間、３７° Ｃ）および”ｓｒａｍ　１１１６−ＮＳ　−１９−９抗体１ｍヨル研究カラ得ら れた結果は、図３に示すように３７°Ｃではほとんどまたは全くインターナリゼ ーションが起こらなかったことを示唆している。

放射標識＋！Ｊモノクローナル抗体および対照薬剤の濃度を増大させていって、 それに曝露した細胞の有糸分裂像での染色体異常を評価し、結果を図４ａ、４ｂ 、４ｃおよび４ｄに示す。これらの実験では、中期の１００個の細胞あたりの染 色体切断（ＣＢ）をもつ細胞の数を、±１０％変動する二重サンプルから計数し 、結果を図４ａに示す（０μＣｉ／ｍｌ濃度は、各試験薬剤の実験時にめたバッ クグランド染色体異常を示す）。各サンプル毎に５０個の中期細胞を分析した。

１００個の中期細胞におけるＣＢの総数を図４ｂに示す。結果は、放射能濃度が 高（なると多重切断が起こることを示している。１０００個の細胞あたりの微小 核が形成された細胞の数も計数し、結果（変動±１０％の二重サンプルの平均） は図４０に示す。二重サンプル（変動±ｌθ％）からの細胞１０００個あたりの 平均縁ＭＮ数は図４ｄに示す。

図４ａ−ｄは１１６１崩壊現象による特異的な核の傷害を示している。”’！− Ｒ１１Ｄ　１０およびＮａ”’Ｉｔ；！放射能濃度を上昇させても、変異の頻度 および変異の総数の増大は全く認められなかった。５Ｗ１１１６細胞上に表出さ れる抗原に結合するが、インターナライズされない＋２５Ｉ標識１１６−ＮＳ− １９−９では、正常対照値に比べてわずかに染色体異常の頻度が増大したのみで あった。

＋１［標識ＭＡｂ１７−ＩＡによって生じるオージェ電子傷害は、計数された傷 害の頻度および総数の増加（図４ａおよび４ｂ）から明らかなように、染色体異 常の増大に相関して、用量依存性の反応であることを示している。

細胞傷害が１２６１のみによるものかどうかを明らかにするため、一定比活性の 等重量の放射性および非放射性ＭＡｂ１７−ＩＡを用いた染色体試験を実施した 。この実験では、点数値は変動±１０％の二重サンプル（５０個の中期細胞）に ついて計数した。図５ａは、１２５７標識ＭＡｂ１７−ＩＡに曝露された５Ｗ１ １１６および　ＷＩＳＨ細胞系における染色体切断を示している。図５ｂは、５ Ｗ１１１６細胞において、放射標識ＭＡｂ１７−ＩＡを等モル濃度の非標識ＭＡ ｂ１７−ＩＡと比較した場合の結果であり、非標識抗体では、正常バックグラン ド以上への染色体傷害の増加は起こらないことを示している。

図５ａに示すように、１２６Ｉ標識ＭＡｂ１７−ＩＡに曝露されたＷ［ＳＨ細胞 系には、有意な程度の染色体傷害は全く認められなかった。照射効果による特異 常な核傷害の他の表示は、細胞内での微小核の形成である。１０００個の細胞あ たりの、微小核の平均頻度および平均総数（２回の別個の実験の平均値）は図４ ０および４ｄに示すように、有意増大した。これらの結果は、′！ｓＩ標識ＭＡ ｂ１７−ＩＡが、放射能濃度の上昇に比例して増加する。多分、オージェ電子に よると思われる特異的な染色体傷害を誘発できることを示唆している。高い放射 能濃度（１０μＣｉ／ｍ１以上）では、細胞あたりの多重切断の増大ならびに微 小核（ＭＮ）数の増加による総染色体切数（ＣＢ）数の増加がみられる。さらに 、高放射能濃度において特徴的な照射誘発の染色体粉砕を示す細胞が約１０倍に 増加した。これらの結果は、特異的な染色体傷害が、インターナライズしてＤＮ Ａに直接作用するモノクローナル抗体に付着したオージェ電子放出体によって起 こることを示唆している。

細胞生存数に対する１１６１標識ＭＡｂ１７−ＩＡの作用は５Ｗ１１１６および ＷＩＳＨ細胞系を用いて測定した。結果は図６に示す。これらの実験では、ｌｏ ｇ　（％生存分画）を放射能濃度に対して測定した。数値の結果は２回の実験に 基づくものである。非免疫反応性抗体としての１！６［標識ＲＩＩＤＩＯをＳＷ Ｉ　１１６細胞において、ｌ！６１標識ＭＡｂ１７−ＩＡと比較した。さらに、 ＷＩＳＨ細胞において＋１ｓＩ標識ＭＡｂ１７−ＩＡ細胞生存率を等モル濃度（ １，４〜５．６Ｘ１０−”Ｍ）での非標識ＭＡｂ　１７−ＩＡの場合と比較した 。

＋１″ｌ標識ＭＡｂ１７−ＩＡについての細胞生存曲線は、放射能濃度の上昇（ ２，５〜４０μＣｉ／ｍｌ）の関数としてコロニー数に３　ｌｏｇの低下を示し ている（図７）。＋２６１標識ＭＡｂ１７−ＩＡはＷＩＳＨ細胞系に対して細胞 毒性を示さず、また非放射性ＭＡｂ１７−ＩＡ濃度を上昇させて（１，４・〜５ ．６Ｘ１０”Ｍ）これに５Ｗ１１１６を曝露させてもコロニー生存率には影響を 与えなかった。また、放射標識１２’［−ＲＩ　ＩＤＩ　Ｏ（非免疫反応性抗体 ）についても、細胞生存率への影響はなかった。これらの結果は、抗原を含まな い細胞が１！Ｊによって影響されないことから、１２５Ｉは、放射性ＭＡｂ１７ −ＩＡに特異的な抗原を含む細胞の生存率の低下の原因になることを示唆し１７ −ＬＡ抗原に特異的なモノクローナル抗体と１２５１からなる免疫接合体に１７ −ＩＡ陽性腫瘍細胞を曝露すると、致死効果を生じることが明らかにされた。こ の致死効果を生じるための第一の要件は、抗原−抗体複合体か細胞内へのインタ ーナリゼーションを受けることと考えられる。第二の要件は、細胞下領域へのオ ージェ電子による最大の効果が達成される腫瘍細胞核への１２Ｊの結合と考えら れる。細胞に対する照射傷害は最終的には染色体傷害によるものである。得られ た多くのデータは１２ＪがＤＮＡに取り込まれた場合、非回復性の傷害ど効率的 な細胞殺作用を生じることを強く示している。

上述の研究から、放射標識ＭＡｂ１７−ＩＡは、特異的な細胞膜関連抗原に結合 後、有意にインターナライズされることにより、第一の要件に合致していること がわかる。″′ｌ標識ＭＡｂ１７−ＩＡのインターナリゼーションは、４時間後 には総細胞関連放射能の２９６７％を細胞内に取り込ませ、これは４８時間後に は４９％に上昇する。これらの時期には、インキュベーション時の細胞外液およ び上澄液（遠心分離および洗浄後）中の遊離ヨウ素イオンを標準的クロマトグラ フィー法を用いて検出することにより、脱ハロゲン化やヨウ素の細胞外培地への 再放出は認められないことを確認した。

ＳＷＩ　１１６細胞ヘノ１２ｓｒ標識ＭＡｂ１７−ＩＡ（７）最大結合はｌＯμ Ｃｉ／ｍｌ濃度付近で平坦になるようである。

放射能の計算量では約０．６７ｐＣｉ／細胞で一定になる。

細胞に結合した総放射能の２９〜４９％がインターナライズすると仮定して、０ ．１９〜０．３３　ｐｃｉが細胞の細胞内容量に会合していることになる。この 値は、Ｖ７９チャイニーズハムスター細胞において３７％生存を達成するのに必 要な＋２１１１ヨードデオキシウリジンの細胞あたりの取り込み（０，０３５ｐ Ｃｉ　／細胞）より約５〜ｌｏ倍高い。しかしながら、本発明者らの実験では、 インターナライズして核に会合した放射能分画は測定されなかったし、それより は有意に低かったとしても、なお、直接、核およびＤＮＡに会合すれば関連細胞 に致死的結果を招くのに適当な量以上であろうと思われる。

核に取り込まれた＋ｔｓＩに伴う核傷害は、染色体に特徴的な照射傷害である。

この傷害はそれ自体、染色体切断（ＣＢ）ならびに微小核（ＭＮ）の数として表 れ、これは核における放射能濃度に比例する。上述の試験では、必須の抗原を含 む腫瘍細胞のみに特異的な放射標識ＭＡｂ１７−ＩＡの取り込みによる染色体傷 害の増大に関連する類似の用量依存性が認められている。対照薬剤、たとえばＮ ａ”’Ｉ　、　＋１６Ｉ標識ＲＩＩＤＩＯ抗体、および＋１１標識１１６−ＮＳ −１９−９抗体は、ＳＷＩ　１１６細胞系におけるのと類似の放射能濃度でも、 染色体傷害の見るべき増加を生じなかった。しかしながら、放射性１１６−ＮＳ −１９−９は、用量依存性のない、わずかな染色体異常の増加を示した。１１６ −ＮＳ−１９−９モノクローナル抗体は、細胞外培地中に放出される５Ｗ１１１ ６細胞上の他の腫瘍関連抗原に結合するので、直接的なインターナリゼーション よりもむしろ、貧食活性によって、インキュベーション時に、抗原−抗体複合体 がこれらの細胞に取り込まれる可能性はある。本発明者らの研究はまた、放射性 １１６−ＮＳ−１９−９が図３に示すように、インターナライズされないらしい ことを示している。またさらに、腫瘍細胞上に特異的な抗原が存在しなければ、 抗原を含まない細胞（ＷＩＳＨ細胞系）は放射性標識腫瘍特異的抗体によって影 響されず、また上述の正常バックグランドレベル以上への染色体異常の増加も生 じないものと思われる。

使用した細胞系とは無関係に、照射によって誘発される染色体異常は、細胞生存 率の低下を生じる致死率の増加と高い相関を示す。１２５Ｉ標識ＭＡｂ１７−Ｉ Ａの細胞毒性は、細胞生存データを用いて測定した。非免疫反応性放射標識抗体 および抗原を含まない細胞は、放射性ヨウ素化ＭＡｂ１７−ＩＡによって影響さ れない。これらの研究に用いられた非抗原性ＷＩＳＨ細胞系は、光子照射を用い る細胞生存試験により、ＳＷＩ　１１６細胞系の場合と類似の照射感受性を有す る。しかしながら、１２５１オ一ジエ電子致死作用は、高いＬ　Ｅ　Ｔ照射によ る場合と同じく直接作用によるものであるから、Ｘ線光子による照射感受性の変 動の程度は多分、ＤＮＡにおけるオージェ電子の直接作用にはほとんどまたは全 く影響しないと考えられる。細胞の放射性試験薬剤とのインキュベーション時間 は４８時間とした。インキュベーションを４時間しか行わなかった時にはＳＷＩ 　１１６細胞系とｌ！Ｍｌ標識ＭＡｂ１７−ＩＡとの細胞生存率に対する影響は みられなかった。この因子は、時間とともに増大する放射性抗体のインターナリ ゼーションの量によるものであろう。インターナライズされたＩＩＳ［標識腫瘍 特異的モノクローナル抗体の細胞生存率に対する影響は、細胞内に保持される］ ２６１の量に用量依存性を示すようにみえる。

Ｖ７９細胞への”Ｊ　ＵｄＲのインターナリゼーションと比較すると、核への取 り込みはもっばら存糸分裂活性に依存し、一方、放射標識モノクローナル抗体で は、インターナリゼーションと核への結合に重要な他の因子が関連し、必ずしも 細胞分裂のみに関係するものではない。

１２Ｓｉ標識ＭＡｂ１７−ＩＡｉ：よりＳＷＩ　１１６細胞ニツいて得られた生 存曲線はわずかな肩をもつように見える。

これは、ＩｔｓＩノ致死作用は、′！１１［ＵｄＲがＤ　Ｎ　Ａ　ｉ：取り込ま れた場合について示唆されてきたような高ＬＥＴ照射と１，１．類似しないこと を示唆している。しかしながら、Ｉ２１ｉｌオージエ電子の照射誘発傷害か酸素 の存在下に修飾されることは、反応性の遊離ラジカルの発生という第二の作用機 構が細胞傷害の原因にもなることを示唆しいる。

さらに、ＤＮＡに対する１６■の高い致死的傷害は、生物学的反応性に富む分子 内で直接的な化学変化を生じる、大きな陽性荷電１２ｓＴｅ娘電子（＋８）によ る可能性もある。

これらの研究は、ある種のＩ！５１放射標識モノクローナル抗体たとえばＭＡｂ １７−ＩＡを用いて各腫瘍細胞への細胞毒性を増大させるためには、特異的な細 胞結合、インターナリゼーション、および核との相互作用が、決定的に重要であ ることを示している。細胞膜作用の一次的な機構は、一般的に、ＤＮＡ内へ高度 に局在されるエネルギー沈積として理解される。１！Ｂ１の見掛は上の高しＥＴ 毒性についての理論的および実験的考察は、ＤＮＡの崩壊部位の周囲ｌＯオング ストローム半径の球内におけるオージェ電子の電子エネルギー沈積（３１５ｅＶ ）の考え方を支持するものである。期待されるエネルギー密度は１崩壊あたり１ ．３　Ｘ　１０　”　ｒａｄに等しいと推測されてきた。したかって、崩壊現象 のいずれかの側に約３塩基対長に相当する短いＤＮＡセグメントが著しい影響を 受け、多重の鎖切断および塩基傷害を生じることが予測おいて特異的腫瘍細胞を 破壊できる能力は、放射免疫療法に明確な利点をもたらすものである。放射性ヨ ウ素化の操作および技術は、比較的簡単で、安全で（放射線への曝露は低い）、 経済的で比活性の高い生成物が得られる。放射性ヨウ素−１２５への非腫瘍細胞 の曝露は全く存置でないようであり、患者を大用量の放射性ヨウ素で処理する場 合の、弱いヨウ素Ｘ線への全身曝露も大きな問題はないことが確実である。他の 放射性核種たとえば＋１１ｉ、　＊ＯＹおよびα線放射体はさらに高い粒子照射 を生じ、腫瘍細胞以外も存意に破壊する能力を有し、高い放射毒性を起こす可能 性がある。循環１■Ｉ標識モノクローナル抗体の、非腫瘍細胞には害を与えずに 個々の腫瘍細胞を破壊する能力は、標準的な癌装置に対する補助療法剤として、 とくに再発や転移疾患の可能性がある場合、癌療法を理想的なものとする候補薬 剤であることを確信する。

晴　萌　ＦＩＧ、　ｌａ ０　２．５　５．０　７．５　１０．０ＦＩＧ、　４ｃ Ｐｃｉ／ｍ１ ＦＩＧ、　７ 補正書の翻訳文提出書　（特許法第１８４条の８）′　ｒ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍特異的モノクローナル抗体またはそのフラグメントとオージェ電子放出 放射性核種からなり、腫瘍特異的モノクローナル抗体またはフラグメントは放射 性核種の腫瘍細胞核局在を可能にする放射線療法用免疫接合体。
2. ２．１７−１Ａ抗原に特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントと１ ２５Ｉからなる放射線療法用免疫接合体。
3. ３．ＭＡｂ１７−１Ａと１２５Ｉからなる放射線療法用免疫接合体。
4. ４．悪性腫瘍を有する患者の処置方法において、抗体またはフラグメントがその 悪性腫瘍と反応性を有する「請求項１」記載の放射線療法用免疫接合体の治療有 効量を投与する方法。
5. ５．「請求項２」記載の放射線療法用免疫接合体の治療有効量を投与することか らなる１７−１Ａ陽性悪性腫瘍を有する患者の処置方法。
6. ６．放射線療法用免疫接合体は、放射能として約２０〜２００ミリキューリー、 抗体重量として約２〜２０ｍｇを投与する「請求項５」記載の方法。
7. ７．「請求項３」記載の放射線療法用免疫接合体の治療有効量を投与することか らなる１７−１Ａ陽性悪性腫瘍を有する患者の処置方法。
8. ８．放射線療法用免疫接合体は、放射能として約２０〜２００ミリキューリー、 抗体重量として約２〜２０ｍｇを投与する「請求項７」記載の方法。