JPH04501429A - ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルスで汚染された薬理組成物中の ウィルスの不活性化方法 見見立１１ １・見シは■ 本発明は、化学的不活性化および／または物理的方法を利用して、凝固因子など の、タンパク質成分を含存し、ウィルスで汚染された薬理組成物中のウィルスを 不活性化する方法に関する。特に、本発明はウィルス感染性のないものとされる 血漿または他の血漿タンパク−含有組成物に関し、このような血漿またはその画 分は有用な不安定タンパク（１ａｂＨｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　、例えばＸ因子な どを含んでいる０本発明の特定の方法はチオシアン酸ナトリウムおよび限外濾過 の利用を必要とする。

２、Ｍ迷肢歪夏脱尻 血液は固体（細胞、即ち赤血球、白血球および血小板）および液体（血漿）で構 成されている。これらの細胞はヘモグロビンなどの潜在的に価値ある物質を含み 、かつこれらは、例えばインクフェロン、成長因子および他の生物学的応答修飾 因子などの他の有用な物質を製造すべく誘発され得る。血漿は主として、水、塩 、脂質およびタンパクからなっている０個々のタンパク成分のより詳しい説明が なされる前に、このタンパクは、まず簡単に“アルブミン”と“グロブリン゛と に分類された。ヒト血漿中に見出された典型的な抗体く免疫血清グロブリン）は 感染性肝炎、インフルエンザＨなどに対する抗体を包含する。

全血は、輸血の際には投与前に、注意深（血液型を決定し、かつ交叉適合試験を 行わねばならない。しかし、血漿については一般に予備テストを必要としない、 いくつかの用途においては血漿の適当な両分のみ、例えば血友病またはフォノビ ルブランド病の治療に対する■因子錯体などが必要とされる。血液の特定の両分 の使用に関する論理的根拠は、多数の別々に形成された要素並びに血漿タンパク および多種の機能を有する成分を血液が含んでいることにある。かくして、全血 １単位の１人による献血から赤血球、血小板、血漿および低温沈殿された■因子 −フィブリノーゲン濃縮物を得ることができる。フェレシス　（ｐｈｅｒｅｓｉ ｓ）の手続きは一人の献血者から大量の顆粒球、血小板および血漿を得ることを 可能とする。血液成分使用の論理的根拠は、患者が一般に特定の成分のみの置換 を必要とするにすぎないことにある（グリーンウォルト（Ｇｒｅｅｎｗａｌｔ） 等の“輸血の一般的原理（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｒ１ｎｃｉ−ｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂ ｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｆｕｓｉｏｎ）　、１９７８年、Ａ、　Ｍ、　Ａ、エディト リアルポードを参照のこと）。従って、残りの成分は他の特定の成分を必要とし ている患者の治療に用いることができ、かくして献血された各血液単位からの恩 恵を数名の患者にわけ与えることが可能であり、その結果該血液単位からの恩恵 を最大限利用することができる。血液の、その成分への分割および該成分の後の 分画は該タンパクを濃縮することを可能とする。極めて重要なことは、該血漿画 分が全血よりも一層長期に亘る貯蔵が可能であり、かつ液状で、凍結または乾燥 状態で配布し得るという事実である。

最後に、全血として投与するには安全性に欠ける古い全血からの血漿タンパクを 、血液銀行から回収して利用することがいくらかの場合には可能である。

ヒト血漿中にみられるタンパクはプレアルブミン、レチノール−結合タンパク、 アルブミン、α−グロブリン、β−グロブリン、凝固タンパク（■、■、■、ｘ １■、■、ＸＬ　Ｘｌｌ、　Ｘｌ１１オヨびインヒビタ、例えばタンパクＣ１抗 トロンビン■など）、フィブロネクチン、免疫グロブリン（免疫グロブリンＧ、 　Ａ、　Ｍ、ＤおよびＥ）および補体成分を含む。既に記載されている血漿タン パクは一般に１００を越えている。包括的な例示は“ザプラズマプロテインズ（ Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）″、バットナム（Ｐｕｔｎａｍ）　 Ｆ。

Ｗ９編、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９７５）に見出すことができる 。

血液細胞画分中にみられるタンパクはヘモグロビン、フィブロネクチン、フィブ リノーゲン、炭水化物の酵素およびタンパク代謝産物などを含む。更に、他のタ ンパクの合成、例えばインクフェロンおよび成長因子などの合成も誘発し得る。

血漿を化学的に分画して、アルブミンまたは血漿タンパク画分、■因子濃縮物、 ■因子複合体および免疫血清グロブリンを得ることができる。

血漿分画には、一般に有機溶媒、例えばエタノール、エーテルおよびポリエチレ ングリコールなどを低温にて、かつ調節されたＰＨにて使用して、１またはそれ 以上の血漿タンパクを含む特定の両分を沈殿させる工程が含まれる。生成する上 澄自体を次に所定の分画の程度に達するまで沈殿等の操作にかけることができる 。

極く最近では、分別はクロマトグラフィー法によっている。血液分画の概説はカ ークオスマー（にｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ）のエンサイクロペディアオブケミカル テクノロジー（Ｂｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈ −ｎｏｌｏｇｙ）　、第３版、インターサイエンスバブリッシャ、第４巻、第２ ５〜６２頁にみられる。

血漿の低温エタノール画分の主成分は以下の通りである。

第１表 面分　タンパク ■　フィブリノーゲン、低温不溶性グロブリン、■因子、プロベルジン ■およびｍ　ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、フィブリノーゲン、β−リポタンパク、 プロトロンビン、プラスミノーゲン、プラスミンインヒビタ、■因子、■因子、 ■因子、Ｘ因子、トロンビン、抗トロンビン、同種凝集素、セルロブラスミン、 補体Ｃ’　１．　Ｃ’　３ＩＶ−１α−１−リポタンパク、セルロブラスミン、 プラスミン−インヒビタ、■因子、ペプチダーゼ、α−およびβ−グロブリン ■−４トランスフェリン、チロキシン結合グロブリン、血清エステラーゼ、α− １−リポタンパク、アルブミン、アルカリホスファターゼ ■　アルブミン、α−グロブリン ■　α−１−酸糖タンパク、アルブミン上述の分画表は更に分画する際の基本と なり得る。例えば、画分■および■は、根本的にＩｇＧ抗体の混合物である免疫 血清グロブリン（ＩＳＯ）を得るべく更に分画できる。

別の分画計画は凍結血漿の使用を含み、該凍結血漿は解凍するとＡＨＦ　（抗血 友病因子）を含む低温沈殿物と、フィブロネクチンと、低温上澄とを与える。こ の低温沈殿物を次に分画してフィブロネクチンとＡＨＦとを得る。

ポリエチレングリコールは高純度ＡＨＦおよび非凝集性ＩＳＯを得るのに使用さ れてきた試薬の一つである。

ヒト血漿から新しい生成物を開発する際には、常に少なくとも３つの主な問題に 遭遇する。これらは発熱物質（内毒素）による汚染、ウィルス性肝炎の伝染また は他のウィルス性疾病の伝染および凝固酵素の活性化などである。

ヒト（または獣医用途）に腸管外投与される薬理組成物の溶液は細菌および真菌 などの感染性微生物を滅菌する必要がある。その一般的方法は該組成物を、１０ ０℃を越える温度にて、大気圧を越える高圧下にて所定の効果を挙げるに十分な 時間蒸気殺菌（オートクレーブ処理）することである。この処理でウィルスを殺 すことができるが、血清凝固■、■、■、■、Ｘ因子などのタンパク成分を含む ものなどの熱に敏感ないくつかの組成物にとってこの処理は有害もしくは破壊的 である。

発熱物質はグラム−陰性細菌の外部細胞壁由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）である。

これらは有毒物であり、インタクト　（ｉｎｔａｃｔ）細菌により合成かつ分泌 される毒物と区別するために内毒素としても知られている。発熱物質は多くの生 物学的活性を有し、これらは発熱、凝固メカニズムの活発化およびショックの誘 発を含む。

結局、感染性物質に関る殺菌の必要性に加えて、発熱性物質を除去すること、お よび最終的な血漿生成物を殺菌または他の同様な処理により、病気の原因となる 細菌を無毒化することが基本である。

血液凝固因子は正常な凝固メカニズムにおいて極めて重要な投書を演じている。

例えば、■因子欠乏症にかかった患者はひどい出血（血友病Ｂ）を示す。治療の 目的で投与し並びに科学的研究のために、大量の■因子および他のビタミンに一 依存タンｉ＜りを単離し得ることが望ましい。

■因子複合体は、■、■、■およびＸ因子に富む凍結乾燥されプールされた血漿 誘導体の一つである。これは血漿療法にとって替り得るものである。これは血漿 よりも一層少量でビタミンに一依存凝固因子をもたらすが、かなり高い肝炎発症 の危険性をもつ。

濃縮物を含む■因子は独特の高い有用性をもつ血液製品であつて、■因子欠乏症 （血友病Ｂ）をわずらう患者の出血を抑制するのに使った場合には救命に役立つ 。これらの製品は、またインヒビタを有する血友病Ａに悩む患者を治療するため にも使用されている。ただ、この利用の臨床的証明は現在行われている際中であ る。濃縮物を含む■因子は、また重度の出血を止めるために、あるいは先天性の 凝固因子欠乏症にかかっている患者における手術中のあるいは術後の出血を回避 するのに、更にワルファリン−型の薬剤、即ち経口抗凝固剤の投与過多により誘 発される多重因子欠乏症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｄｅｆｉｃｉｅｎ ｃｙ）の治療のためにも利用されている。

■因子の市販の濃縮物は、以前イオン交換樹脂を用いて、ビタミンに一依存凝固 因子を結合せしめ、これらタンパクを他の大部分の血漿タンパクから分離するこ とにより調製していた。次いで、これらの凝固因子濃縮物を該樹脂から溶出し、 さらに精製せずに治療で使用すべくバイアルビンに詰めていた。このような濃縮 物は凝塊形成能をもつ傾向にあり、これは恐らく該濃縮物が外来のビタミンに一 依存凝固因子および／または燐脂質を含むためであると考えられる。更に、この ような濃縮物は、肝炎および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むウィルス 性疾患の伝染における疑わしい媒介物でもあった。更に、■因子の粗濃縮物は溶 液中で長期に渡り安定に存在しないので、定期的な注入療法には使用できず、こ のことは該濃縮物の慢性交換療法における価値を制限している。

最近の組換えＤＮＡ法を用いた■因子製造に対する努力は、従来受入れられてい た技術による培養上澄からの■因子の分離の際に遭遇する困難のために失敗に帰 している（アンソン（Ａｎｓｏｎ）。

Ｄ、Ｓ、　、オーステン（Ａｕｓｔｅｎ＞、Ｄ、　Ｅ、　Ｇ、　、およびブラウ ンレｘ　（Ｂｒｏｗｎｌｅｓｓ）、　Ｇ、　Ｇ、にょる、“哺乳動物細胞中での 、組換えＤＮＡクローンの活性ヒト凝固■因子の表現（ｆ！ｘｐｒｅｓｓ　１ｏ ｎｏｆ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸ　 ｆｒｏｍ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＣ１ｏｎｅｓ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌ ｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ）’と題する論文（Ｎａｔｕｒｅ、　１９８５．１上５．ｐ ｐ、６８３−６８５）；ドゥラサル（ｄｅ　Ｉａ　５ａｌｌｅ）、Ｈ，。

アルテンバーガー（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ）　、Ｗ、、！ルヵイム（Ｅ１ｋａ ｉａ＋）。

Ｒ１，ドラ）　（Ｄｏｔｔ）、に、等の“組換えＤＮＡ技術を利用して表現させ た活性γ−カルボキシル化ヒ）ＩＸ因子（Ａｃｔ　ｉｖｅ　ｒ　−ｃａｒｂｏ− ｘｙｌａｔｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｕｓ ｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　”と題する 論文（Ｎａｔｕｒｅ、１９８５．　３工旦、　ｐｐ。

２６８−２７０；およびブスビ（Ｂｕｓｂｙ）、Ｓ、　、　クマ（Ｋｕｍａｒ） 。

Ａ、、ジョゼフ（Ｊｏｓｅｐｈ）、　Ｍ、、　ハーフパップ（Ｈａｌｆｐａｐ） 、　Ｌ、。

イ：／スＬ／イ（Ｉｎｓｌｅｙ）　、　Ｍ、　、等の“移入細胞内での活性ヒト ■因子の表現（ｌ！ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖｅ　）Ｉｕｍａｎ　 Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓ−ｆｅｃｔｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ）　’と題 する論文（Ｎａｔｕｒｅ、１９８５．　３１６．　ＰＰ。

２７１−２７３）参照）。かくして、ヒト血漿から得られた■因子の安全な処方 物に対する医学上の需要が依然として残されている。

哺乳動物、特にヒトの血漿中の、肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）およびヒト免疫不全 症ウィルス（ＨＩＶ）の脂質−含有ウィルスなどのウィルスを不活性化する多く の試みがなされてきた。いくつかの国では、血漿中の肝炎Ｂウィルスの不活性化 を、肝炎Ｂウィルスのタンパク様（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）タンパクを架 橋するか、あるいは該ウィルスの核酸と相互作用する型のウィルス不活化試薬と 該血漿とを接触させることにより実施している。例えば、肝炎Ｂウィルスとアル デヒド（ホルムアルデヒドなど）と接触させて、タンパクを架橋結合し、該肝炎 Ｂウィルスを不活性化する試みが知られている。また、該ウィルスをその核酸並 びにタンパク成分に作用する薬剤であるβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）と接触 させることにより、該ウィルスの不活性化を行うことも公知である。

更に、特にβ−プロピオラクトン処理後に紫外（ＵＶ）光を利用することも公知 である。これらの方法は、血漿中のウィルスの不活性化には不向きであると考え られている。というのは、これら不活性化剤（ホルムアルデヒド、β−プロピオ ラクトンおよび次亜塩素酸す）　ＩＪウム）の殆どが該血漿の有用なタンパク成 分、特に血漿のいわゆる“不安定”血液凝固因子を変質もしくは変性してしまう ということが観察されたからである。

このような熱に敏感なタンパク含有組成物からの細菌お゛よび真菌の除去は、一 般に細菌を保持し得るフィルタを使用して達成される。その典型例はボール社（ Ｐａｉｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびミリボア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｒ＋）により作られている多孔度０．１〜０．２μ（１０ ０〜２００　ｎｍ）のメンブランフィルタである。一般に、このような薬理組成 物中のタンパク成分は損傷を受けることはない。しかし、メンブランフィルタは 著しく感染性のかつ危険な微生物、例えばウィルス粒子を保持し得ないことが知 られ°Ｃいる。フィルタ装置は、有効なフィルタの多孔度を１分に小さな寸法に すれば、いくつかのウィルス粒子を保持できるように工夫できる。このような装 置は、例えばウィルス性ワクチンの製造におけるように、ウィルス粒子を回収す るためにしばしば利用されている。しかし、多くのウィルス粒子はメンブランフ ィルタの有効多孔度よりも小さな寸法をもち、これに保持されることはない。

例えば、ヒト血漿から作られた凝固因子溶液中に存在する可能性のある肝炎Ｂウ ィルスは径４２ｒｕｍを有し、従って１．’　００　ｎｍ　（０，１μ）のメン ブランフィルタを容易に通過するであろう。

血漿から作られた血漿製剤（ｂｌｏｏｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ）が肝炎を媒介するこ とは周知である。初めに、ウィルス伝染の興味は、まず有害な試薬（肝炎Ｂウィ ルス）の存在の指標となる肝炎Ｂ抗原（ＨＢｅＡｇ）に集中し、かつこの試薬除 去の試みは、工業的に可能かつ承認された実験室的手法による、輸血に用いられ たあらゆる血漿の広範なスクリーニングへと導かれた。このような実験室的スク リーニングは、全血の輸血を受けた患者における肝炎Ｂの発生率を見掛は上域じ るが、血漿製剤から伝染されたこの疾病の発生率における大きな改善はみられな かった。血液製剤の恒常的利用者はワクチンの接種によって免疫状態に維持され ていなければ、この疾病の危険性に露されていることになる。このワクチンの利 用は有効ではあるが、これに関連した他の臨床上の危険があるかも知れない。様 々な吸着法または沈殿法、例えばポリエチレングリコールの使用によるウィルス 除去の試みは感染性を十分に除き得たことが立証されていない。紫外光とβ−プ ロピオラクトンとの組合せがいくつかの血漿製剤中のウィルスの不活性化に役立 つ可能性があるとするいくらかの証拠がある。しかし、β−プロピオラクトンが 発癌特性をもつといういくらかの懸念がある。

熱に敏感なタンパク成分を含み、かつ危険なウィルス粒子を含む恐れのある薬理 組成物の安全性を増すためには、追加の処理が必要とされる。この処理は生物学 的能力を保護するための特定の安定剤と共に該タンパク成分の溶液を加熱する方 法、該タンパク成分の凍結乾燥品を加熱する方法および該タンパク成分の溶液を 有機溶媒または他の殺ウイルス剤で処理する方法を含む、これら方法の多くは、 厄介で、時間労費で、あるいは処理の厳しさの故にタンパクを分解する恐れがあ る。これら方法のいずれも血漿製剤に単独で適用した場合の有効性については依 然として疑問があ肝炎Ｂに対するスクリーニングテストの開発はこの病気の伝染 を減じる上では限られた価値しかもたないが、このウィルスの同定（並びに肝炎 Ａウィルスの同定）は、血漿誘導体により伝染された肝炎の大部分に対して見掛 は上原因となる第３のウィルスの認識をもたらした。このウィルスは“非−Ａ、 非−Ｂ肝炎”ウィルスじｎｏｎ−＾＋　ｎｏｎ−Ｂ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ″ｖｉ ｒｕｓ）と呼ばれている。

血漿中の肝炎Ｂウィルスの不活性化法は公知であるが、通常は実施できそうにな い、一つの方法は血漿に抗体を添加して、免疫複合体を形成することを包含する 。抗体形成およびその精製の費用が血漿生成のコストに大きく加算され、更にこ の方法は肝炎Ｂウィルスに特異的なものであるから、十分な量の非−Ａ、非−Ｂ 肝炎ウィルスが不活性化されるという何等の保証もない、一般的に承認された、 利用可能な非−Ａ、非−Ｂ抗体またはウィルスのためのテストはなく、単にこれ を達成する途上にあるという報告があるにすぎず、従って高力価で抗非−Ａ、非 −Ｂ抗体を含む血漿を選別することは依然として不可能であり、またこのような 解決法が実施可能であることを示すものも今のところない。

ヒト血漿由来の治療薬の開発が進展するにつれて、ウィルス殺菌の必要性が明ら かとなってきた。安定な血漿タンパク溶液は殺菌に耐え得るが、不安定な血液凝 固因子はこのような加熱中に殆どの場合不活性化されるか、あるいはその能力が 著しく減じられてしまう、このことは実際の用途を制限してしまう。結果として 、■因子、Ｔ−グロブリン、■因子、フィブリノーゲンなどのレシピエンドは、 投与された有用なタンパク成分が肝炎ウィルス並びに他の感染性ウィルスにより 汚染されているかも知れないという危険性をしばしば容認せざるを得ない。結局 、これらのレシピエンドはこれらのウィルスで感染され、かつこれらウィルスの 引き起こす器官系の損傷および結果としての死に至らしめる恐れのある無能力化 および疾病を容認せざるを得ないという危険性に直面することになる。従って、 より一層効果的かつ実施可能性のある核熱に対して敏感な血漿の精製法、特に熱 を利用することのない殺ウイルス法の開発が望まれている。

かくして、高度に精製された■因子の製造並びに単離手段、即ち方法の開発に対 する特別な要求があり、該■因子はその後効力のある、速効性の治療用血液製剤 に処方でき、該製品はインビトロで安定であり、しかも重大な出血にみまわれた 患者に効果的な安楽さを与える。

本発明は３つの目的、即ち（１）安全性、（２）ウィルスを不活性化したタンパ ク含有組成物、（３）著しいタンパクの変性を招くことがないという３つの目的 を達成することを意図する。これら３つの目的は必ずしも同時に成立するもので はない、というのは、例えば殺菌はウィルス感染性を不活化するが有用な血漿タ ンパクを実質的に変性し、β−プロピオラクトンはウィルス感染性を不活化する 一方で安全性に欠け、またホルムアルデヒドなどの物質はウィルスを不活性化す る一方で同様に有用な血漿タンパク、例えば■因子を著しく変性するからである 。

従って、タンパク含有組成物を得る方法であって、そこに含まれる有用なタンパ ク成分を実質上変性することがな（、しかも明らかな発癌性物質（例えばβ−プ ロピオラクトン）の使用を含まない上記の如き方法を提供することが望ましい、 より詳しくいえば、実質的にすべての肝炎ウィルスおよび他の存在するウィルス が不活性化された血液タンパク含有組成物を提供することが望ましい０本発明の 更なる目的は癌細胞、正常な細胞からのまたは所定の組換えＤＮＡを挿入した細 胞の発酵過程から得られる生成物であって、実質的にウィルスを含まず、かつ血 漿の公知の感染性試薬を含むカテゴリーの脂質−含有ウィルスを含まない該生成 物を提供することにある。

尤ヨ１Ｊと（二！ タンパク含を組成物、例えば全血、血液細胞タンパク、血漿、血漿分画沈殿物、 血漿分画上澄、低温沈殿物、低温上澄、あるいはこれらの一部もしくはその誘導 体あるいは血清〔正常なまたは癌細胞から得られた（例えば組換えＤＮＡ技術で 得た）非−血液製品〕を化学的消毒剤と、十分な時間接触させると、薬理組成物 中に存在するウィルス（例えば肝炎ウィルスまたはヒト免疫不全症ウィルス（Ｈ ＩＶ））が、該組成物中のタンパクを変性することなしに実際上完全に不活性化 されることが今や見出された。化学的および物理的手段の組合せを血液タンパク 混合物またはその濃縮物もしくはその両分に適用すると、該タンパクを変性する ことなしに完全かつウィルスを含まないタンパク含有組成物が得られる。

本発明は、不安定血液タンパクおよびウィルスを含有する血液製剤を、好ましく は該タンパクの変性を伴うことなしに、ウィルスを含まないものとする、著しく 効果的な化学的手段と物理的手段との組合せを提供する０本発明は、一般的にい えば血液成分療法に係り、より詳しくいえばプロトロンビン複合体濃縮物からま たは組換えＤＮＡ技術からの■因子を含む培養上澄を包含する■因子の他の起源 から■因子を精製する独特の手段および方法に関する。

本発明の方法は、 ！ａｌ　血液製剤と、有効量の化学的消毒剤、好ましくは該血液製剤中のタンパ クを変性しない選ばれた化学的消毒剤と、バフファーとを混合し、 （ｂ）　実質上すべてのウィルスを不活性化するのに十分な時間該混合物を静置 し、 ｔｅｌ　必要ならば、該化学的消毒剤を除去し、およびｆｄｌ　該血液製剤から 不活性化されたおよび活性なウィルスを物理的に除去する工程を含む。

好ましくは、該化学的処理工程は予め精製された血液製剤について実施する。例 えば、該精製および化学的処理は以下の工程を含むことができる。

ｆａ）　血液製剤を、モノクローナル抗体親和性のマトリックス上でクロマトグ ラフィー処理してこれを精製し、申）　該クロマト処理した血液製剤を該モノク ローナル抗体親和性マトリックスから選ばれた化学的消毒剤のバッファ溶液で溶 出しもしくは消毒剤を含まない別の溶離剤で溶出した後化学的消毒剤を添加し、 （Ｃ）　実質的にすべてのウィルスが不活性化されるに十分な時間該溶出混合物 を静置し、 （ｄｉ　必要ならば、透析により該化学的消毒剤を該活性血液製剤から分離し、 および （ｅ）　ｔｉ血液製剤から、該不活性化されたウィルスおよび活性なウィルスを 物理的に除去する。

このような手順によって、ウィルスを含まず、かつタンパク変性のない血液タン パク含有組成物が得られる。本明細書でいう血液タンパク含有組成物とは血液細 胞（例えば、ヘモグロビン、α−インクフェロン、Ｔ−細胞成長因子、血小板由 来の成長因子等）、プラスミノーゲン活性化因子、血漿、血漿画分、血漿沈殿物 （例えば、低温沈殿物、エタノール沈殿物、又はポリエチレングリコール沈殿物 ）、または上澄液（例えば低温上澄液、エタノール上澄液、またはポリエチレン グリコール上澄液）等を包含する。血液タンパク含有組成物は、■因子などの不 安定血液タンパクが一種以上存在することにより特徴付けられる。

上記方法は、■因子、■因子、■因子、Ｘ因子、プロトロンビン、タンパクＣ、 タンパクＳなどを包含するビタミンに一依存性タンパクを含む薬理組成物、特に 高い特異的活性を有する精製■因子溶液に対してとりわけ有用である。該不安定 血液タンパクは感染性肝炎に対する抗体またはヒト免疫不全症ウィルスに対する 抗体を含むことができる。

本発明の方法は、所定のタンパクの高い収率と高い純度および特に他の凝固因子 による比較的低い汚染率との組合せを与える点で従来の方法に勝るものである。

本発明は取扱いが容易でしかも経済的な化学的手段と物理的手段との組合せを提 供し、かくして容易に利用できる最終処方物を与える。本発明は、また不必要か つ高価な精製処理を利用せず、しかも実質的に危険性のない使用の容易な最終処 方物を与える。

発明の詳細な説明 本発明はウィルスで汚染されたタンパク質を含む組成物、特に、例えばプロトロ ンビン複合体（第■因子、第■因子、第Ｘ因子及び第Ｘ因子）及び寒冷沈降物（ 第１因子及び第■因子）の如き血液タンパク質を含むウィルスで汚染されたタン パク質を含む組成物中のウィルスの失活及び除去に関する。また、本発明は、一 種以上の血液タンパク質を含む血清；第■因子、第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子 、フィブリノーゲン及び免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、等）の如き 少なくとも一種の血液タンパク質を含む血液タンパク質含有部分；並びに細胞溶 解産物または血液細胞中に透導されたタンパク質に関する。更に特別には、本発 明は脂質を含むウィルスの失活及び除去、優先的にはＢ型肝炎ウィルス並びに非 Ａ型ウィルス、非Ｂ型ウィルスの失活及び除去に関する。

末法により失活、除去されるその他のウィルスは、例えばサイトメガロウィルス 、エプスタイン−バーウィルス、乳酸脱水素酵素ウィルス、ヘルペス群ウィルス 、ラブドウィルス、ロイコウィルス、ミクソウィルス、アルファウィルス、アル ボウィルス（群Ｂ）、バラミクソウィルス、アレナウイルス、コロナリウイルス （ｃｏｒｏｎａｒ　ｉｖ　１ｒｕｓｅｓ）及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ） を含む。

好まｊ７い方法は、タンパク質変性を生じないで、不安定血液タンパク質及びウ ィルスを含む血液製剤のウィルスを失活し除去する。

それは、 （ａ）　血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティーマトリックスでクロマト グラフィーにかける工程； （ハ）　クロマトグラフィーにかけた血液製剤をモノクローナル抗体アフィニテ ィーマトリックスから有効量の選択された化学消毒剤で溶離する工程： （Ｃ）　実質的に全てのウィルスを失活するのに充分な期間にわたって特別な温 度で溶離混合物を放置する工程；（ｄ）　所望により、透析により活性血液製剤 から化学消毒剤を分離する工程；及び （ｅ）　失活したウィルス及び活性ウィルスを血液製剤から物理的に除去する工 程 を含む。

化学消毒剤は、有機溶剤／洗剤の組合せのような、脂質を含むウィルスを実質的 に失活することが知られている薬剤またはチオシアン酸ナトリウムのような、ウ ィルス型に対して殆ど特異性のない薬剤のリストから選ぶことができる。

チオシアン酸ナトリウムは本発明に使用するのに好ましい化学消毒剤であり、約 ０．５　Ｍ〜約６Ｍ、好ましくは約０．５Ｍ〜約２Ｍ。

更に好ましくは約１．５Ｍ〜２Ｍの量で使用される。

血液製剤から失活ウィルス及び活性ウィルスを除去するための物理手段は、限外 濾過、超遠心分離機及び電気泳動からなる群から選ばれる。好ましい物理手段は 限外濾過である。

本発明の好ましい方法の他に、血液製剤をウィルスを含まないようにする別の方 法がある。第一の別法は、物理手段を使用しないで化学手段のみを使用する。こ のような方法は不純な血液製剤を化学消毒剤のみと接触させることを含む、第二 の別法はまず物理手段を使用し、続いて化学消毒剤で失活させ、ついで必要によ り失活ウィルス及び活性ウィルスの両方を除去するための物理手段を使用する。

第三の別法は、 ｔａ＋　血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティーマトリックスでクロマト グラフィーにかけてそれを精製する工程；（ｂ）　クロマトグラフィーにかけた 血清製剤を選択された化学消毒剤でモノクローナルアフィニティマトリックスか ら？容離する工程； （ｅ）　化学消毒剤との更なる接触を省（工程；及び＋ｄ）　精製された活性血 液製剤を回収するように失活ウィルス及び活性ウィルスを物理手段により分離す る工程を含む。

第四の別法は、 （ａ）　血液製剤をモノクローナル抗体アフィニティーマトリックスでクロマト グラフィーにかけてそれを精製する工程：偽）　非消毒荊溶離剤で溶離し、続い て化学消毒剤を添加する工程；（Ｃ１溶離した混合物を、実質的に全てのウィル スを失活させるのに充分な時間にわたって放置する工程；及び＋ｄｌ　必要によ り、血液製剤から失活ウィルス及び活性ウィルスを物理的に除去する工程 を含む。

化学消毒剤による血液タンパク質を含む組成物の処理は約４〜２５℃、好ましく は４℃の温度で行なわれる。血液タンパク質を含む組成物と化学消毒剤との接触 は約１〜２．５時間、好ましくは少なくとも約１時間である。

通常、化学処理後に、化学消毒剤は除去されるが、これはウィルス失活剤の性質 及び血漿タンパク質を含む組成物の意図される更なる処理に応じて必ずしも全て の場合に必要ではない。

本発明の最も好ましい実施態様に於いて、血液製剤はモノクローナル抗体アフィ ニティマトリックスによるクロマトグラフィー分離により精製され、ついでウィ ルスを死滅するのに充分な時間にわたってチオシアン酸ナトリウムで処理され、 ついでウィルスを保持するのに有効な細孔サイズ、例えば約ｉｏｏ、ｏｏｏダル トンの排除限界及び適切な流量を維持するのに充分な圧力、例えば約０．３５Ｋ ｇ／ｃｄ　（５ｐ、ｓ、ｉ、）を有する膜を用いて少なくとも１回限外濾過され る。

血液製剤（ここで使用される例は第Ｘ因子である）がモノクローナル抗体アフィ ニティーマトリックスによるクロマトグラフィーにより予備精製される場合、タ ンパク質ｌａｇ当り１９０単位程度に高い特異的活性を得ることができる。チオ シアン酸ナトリウム処理はチオシアン酸ナトリウム溶液を使用してマトリックス がら組成物を溶離し、ついでウィルスを死滅するのに充分な時間にわたって混合 物を放置することにより都合よく行なうことができる。

夫々のこれらの工程、即ち、予備精製、化学滅菌、及び保持濾過はウィルス感染 性を減少するのに非常に有効である。−緒に使用される場合、ウィルス安全限外 濾過物が得られるべきである。

実質的に不完全なウィルスまたはウィルス成分は、それらの分子量及び直径に応 じて有効に除去されてもよく、また除去されなくてもよい。しかしながら、この ような不完全粒子または欠損粒子は宿主中で感染性であるとは予想されない。第 Ｘ因子の更なる精製は、所望により、アミノ−へキシルセファロースによるクロ マトグラフィーにより行なわれてもよい。

血友病Ｂの治療に有効な薬理組成物である第■凝固因子は、じかに関心があるが 、排他的な関心があるものではない。１００Ｋダルトン未満の分子量を有する第 Ｘ因子は、分子の大きさが６０に〜７０にダルトンの範囲内にある第■因子、第 ■因子、第Ｘ因子、プロティンＣ、プロティンＳ等を含むビタミンに依存性凝固 因子の系統群の一員である。第Ｘ因子の如き凝固因子はヒト血漿から調製され、 幾つかの潜在的に感染性のウィルス及び有害ウィルスにより汚染されることがあ る。主に関係するウィルス粒子はＢ型肝炎ウィルス及びＨＩＶであり、これらは 夫々４２ｎｍ及び１１００ｎの直径を有する。示されるように、これらのウィル ス粒子の直径は、ＸＭ３００膜またはＸＭ１００膜のいずれかによる限外濾過が 、第■凝固因子またはその他の薬理製品からそれらを有効に除去するような直径 である。現在の知識によれば、それはまた非Ａ型肝炎ウィルス及び非Ｂ型肝炎ウ ィルスの予想される特性である。

末法は第■因子、Ｔ−グロブリン、第Ｘ因子またはプロトロンビン複合体（第■ 因子、第■因子、第Ｘ因子及び第Ｘ因子）、フィブリノーゲンの如き血液製剤誘 導体並びにこのような規格に通した特性を有するあらゆるその他の血液誘導体の 調製を可能にし、これらの全ての誘導体は残留の感染性肝炎ウィルスまたはその 他のウィルスを殆ど含まないか、または全く含まない。

上記の同じ操作工程により、正常細胞または癌細胞の製剤中に存在するウィルス はとのような製剤に於いて不安定タンパク質活性を保持しながら失活させること ができる。例えば、同じ化学失活処理により、正常細胞または癌細胞を使用して 生成された製剤、正常細胞または癌細胞からの滲出物、ハイブリドーマ及び遺伝 子スプライシングにより生成された製剤を失活させることができる。

このような処理は所望のタンパク質に実質的に悪影響を及ぼさない。所望のタン パク質の生成に使用される細胞は、勿論、哺乳類細胞並びに非哺乳類細胞であり 得る。

本発明は、本発明の精神または必須の特性から逸脱しないで、その他の特別な形 態に於いて具体化し得る。

Ｈの六　を−　る　法 タンパク質を含む巨大分子の大きさは、質量単位に於ける分子量によりしばしば 特定され、その分子量により表わされる。また、１０００ダルトン（ＩＫダルト ン）の分子量を有する分子は、１モルの純粋分子が１０００ｇの重量であるとい う記述により説明し得る。（本件出願に関して、タンパク質分子の分子量よりも むしろそれらの物理寸法を参照することが更に一層便利である。）タンパク質分 子は共有結合アミノ酸の線状の鎖である。溶液中で、これらの鎖は特別な方法で コイル状になり、再度折りたたまれ、そして適当な技術により視覚化される場合 、圧密の球体、楕円、棒状体または繊維であると見られる。個々の分子種の形状 を予測する科学は造形的であるが、形状は既知の物理的方法により測定し得る０ 強い偏りが正確な測定により決定され、これの影響が説明されるまで、専門家は 分子の形状が球体であると推定する。

ダルトンで表わされる重量による分子の大きさが既知の技術により測定され、且 つタンパク質折り重ね（ｆｏｌｄｔｎｇ　）の密集度（ｃｏｍｐａｃｔｎｅｓｓ 　）　（密度）が得られる場合には、球形粒子の分子寸法の計算が簡単な幾何学 により決定し得る。累積測定に基いて、タンパク質分子の粒子密度が変化し夫々 のタンパク質に関して特有であり得ることがわかる。しかしながら、その変化は 一般には大きくなく、平均値または典型的な値が大きな誤差なしに使用し得る。

これは密度の逆数である部分比容積（Ｖ）として通常表わされる。タンパク質の 典型的な比容積は０．７５　ｃｃ：／ｇｍである。こうして、以下の実施例に関 して、ダルトンの単位の定義を用いて、分子量１００．０００ダルトンのタンパ ク質分子は、タンパク質の６．０２３Ｘ１０”個の分子当り１５５ｇの重量であ る。公称の部分比容積０．７５ｃｃ／ｇを用いて、このタンパク質の単一分子に より占められる容積は０．１２４５Ｘ１０−”ｃｉである。球体の容積に関する 式から、タンパク質の直径６．２ｎｍが計算される。

ｉｏｏ、ｏｏｏダルトンの排除限界を有する限外濾過膜は、理論上、１００．０ ００ダルトン未満の分子量の成分の薬理組成物から６，２ｎｍを越える直径を有 するウィルス粒子を除去すべきである。

ＨＩＶウィルス減少方法を解明するために行なわれる多（の実験はウィルスに感 染されると知られている培養細胞からの上澄組織培地を（ウィルス接種源）とし てしばしば使用していた。これらの培地はウィルス減少を試験するために処理さ れている培地と同じ化学組成をもたない。殆どの培地は、実際には、栄養増殖補 足物として１０％程度の多量のウシ胎児血清を含む、精製／処理系を接種するの に直接使用される場合、研究者は（Ｊｌｌ添加された組織培養成分のあらゆる効 果が接種源対処理系の小さい比、例えば１：１０の使用により最小にされること 、または山）添加成分の効果が、あらゆる状況で、無視し得ることを結言するよ うに強要される。この方法が適当に避は得る場合には、これらの結論のいずれも が容認されない。

感染性ＨＩＶの直接源としての細胞培地の使用に関して、更に技術上（及び実験 設計上）の難点がある。感染組織培養細胞は感染性ウィルス（上澄増殖培地中） の力価１０’〜１０”ＴＣＩ　Ｄ、。

（組織培養アッセイに於ける５０％の感染供与量）を生じることが一般に知られ ている。殆どの論文は、この範囲の下限が上限よりも通常であることを示す、感 染力価を検出し測定するのに使用される全てのアッセイ系は検出感度の下限を有 する。プラーク形成性ではないウィルスに関して普通使用されるＴＣＩＤｓ。ア ッセイの定義により、最低の陽性アッセイはアッセイ試料の容積当りｌＴｃＩＤ ５゜である。使用される適用に於いて、測定される試験物質の容積に応じて、あ らゆる研究者のアッセイの感度は試験試料１ｍｊ当り１０”未満から１０”ＩＤ ５ｏまで変化し得る。（その他の型のアッセイ系がＨＩＶに関して記載された。

多くの発表論文は、一層低い感度を示す。上記と比較して、アッセイ試料１ｍｌ ！当１．０”ＩＤＳ。に相当する感度限界は別のアッセイ法に関して異常ではな い）。

次に、ウィルス減少機構の有効性に関する実証の有効限界について考慮する。接 種源が１０Ｓ〜１０８以下の力価であり、接種源容積が試験処理組成物の１＝１ ０であったならば、減少実験の初期ウィルス力価は１０４〜１０７より高くない であろう、アッセイ系の選択に用いられる注意に応じて、“検出不能”として見 られる最終ウィルス力価は１０”個程度に多量の感染性ウィルスを含み得る。適 切に表わして（検出不能値が潜在的に０であったことを不当に強調しないで）、 実証し得る減少は１０２〜１０’ＩＤＳ。以下である。

ここで、設計及び行動の異なる過程は、このウィルス減少が他者により実証され たものよりはるかに有効であることを実証するように選ばれた。血液製剤の調製 の安全限界が“最悪の場合″のシナリオの概念に対して測定し得ることが最初に 推測されたくベトリチア＝　（Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ　）　、Ｊ、　Ｃ，ら著 、”Ｃａ５ｅ　ｆｏｒＣｏｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｔｈａｔ　Ｈｅａｔ　Ｔｒｅａｔ ｅｄ、、　Ｌｉｃｅｎｓｅｄ、　ＡｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃＦａｃｔｏｒ　 ｉｓ　Ｆｒｅｅ　ｆｒｏ＋＊　ＨＴＬＶ−ｍ　”、、　ＬａｎｃｅｔＩＩ　：　 ８９０〜８９１頁、１９８５年を参照のこと）、（註：　ＨＴＬＶ−ＩＴ［−Ｈ Ｉ　Ｖ−１）、最悪の場合には、ウィルス減少処理が使用されなかったならば、 凝固因子濃度は２Ｘ１０’　（約５．５１ｏｇ１゜）の力価をもつことができた 。この概算の統計上の処理は、患者が寿命中に２×１０５の投与量またはそれに 近い投与量を受ける場合には、更に高い安全限界が必要とされることを示唆する 。何となれば、凝固因子は慢性使用薬であるからである。こうして、一群の例と して、ニューラス（Ｎｅｕｒａｔｈ　）らの米国特許第４，７６４，３６９号、 ニューラスらの米国特許第４，５４０，５７３号、及びニューラスらの米国特許 第４．８２０，８０５号（これらの特許の開示が参考として含まれる）（これら は全て、ベトリチアニらにより記載された安全限界をかろうじて示す）に記載さ れたモデルウィルス研究に関して記載される減少は、慢性使用により必要とされ る一層高い安全限界を示すのに不充分である。本願の場合には、ＨＩＶウィルス は超遠心分離により部分精製され濃縮されて組織培地成分を実質的に含まない。

ウィルスは研究下にある処理液体と適合性であるように選ばれた謹衝荊組成物中 に懸濁される０本実験をその方法の専門技術との比較に関して疑わしくする化学 的な不安原因（ウィルス以外）はない、１ｍ７当り１０１０〜Ｎｏ”ＩＤＳ。の 濃縮力価が得られる。

この技術はニューラスらの米国特許第４．７６４．３６９号、ニューラスらの米 国特許第４．５４０．５７３号、及びニューラスらの米国特許第４．８２０．８ ０５号に記載されたウィルスの如きその他のウィルスに容易に通用される。

実験設計のこの注意深い先行事情は、依然として実験限界を表わす。多工程ウィ ルス減少法のいずれかの工程がウィルス力価をこの一層高い限界に減少するよう に著しく有効である場合（１０’未満の感度であるアッセイ系でもって）、多工 程系の全有効性は単一の実験で研究し得ない、最善の科学設計に関して、理想的 には、単一の処理工程を行なう前に測定される初期力価は、残留ウィルスが処理 工程後に存在するように充分高いものであるべきである。こうして、減少の良く 特定されたインクレメントが規定し得る。残留力価がその後の工程に挑戦するの に不充分であり、その工程の終了時に残留ウィルスを再度確保する場合、第二工 程の特定される限界は規定し得ない。この組合せ法に於いて、二つの処理工程の 夫々は、格別濃縮されたウィルス濃厚物を使用という注意を更に払って、適当に 得ることができる最大値に実質的に相当する力価の減少を与える。本発明者らの 実験に於いて、ウィルス減少潜在能力の本発明者らの研究室内の実証に使用した 初期力価は治療製剤を調製する実際の実施中にタンパク質組成物の偶発の汚染に より予想し得たものを越える多くのｌｏｇｌ。である（Ｃ，Ｆ。

ペトリチアニ、らの文献を参照のこと）、これは本発明の実施に於いて安全の広 い限界を示し、慢性薬使用の統計上の分析により必要とされる安全の特別な限界 を可能にする。

こうして、二つの連続減少工程の合計の減少数値は、夫々が独立に有効性を測定 する本発明者らの能力の限界にある場合には、規定し得ないが、高い効能のウィ ルス減少機構の適用される貫刺性が予測し得る。エレクトロニクスの如き、その 他の技術に於いて、貫刺性の概念が使用中のフェイルセイフ操作の確保の水準を 増大するのに使用される。この概念は血漿タンパク質治療に於けるウィルス伝染 からの安全の確保に関して従来ｖ！、！されていなかった。

大夾伝上 ＭｉＪＵＬ過−にＪり影タニ（火ヌ！ｌ鉛友第■因子に対して特異的なモノクロ ーナル抗体アフィニティーマトリックスによるクロマトグラフィーにより、精製 第■因子をブロサー（ＰＲＯＴＨＡＲ、商標）から得た。それは溶液１　ｍ　！ ！当り約０．０６５ｍｇのタンパク質及び８単位の第■因子活性を含んでいた。

アミコンＸＭ３００膜及び０．３５Ｋｇ／ｃｄ　（５ｐ、ｓ、ｉ　）の圧力を用 いて、精製製剤を限外濾過した。限外濾過は非常に迅速に進行した（約２．５　 ｍ　ｌ　／分）、その後、濾液をアミコンＸＭ１００膜で再度濾過した。最終限 外濾液中の第■因子の活性は６７％であった。特定の活性が変化されなかったの で、損失は第■因子の失活の結果ではなかった。

災り匠ｌ パートＡ−ウィルス　′のｆＩ ＯＥＭ細胞を約１の感染多重度で感染することによりウィルス原液濃厚物を調製 した。１０％のウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び０．００ ２ｍｇ／ｒｎｊ！のポリブレンで補足されるような充分のＲＰＭ１１６４０培地 約４５０ｍ培地約４５遁感染４日後に培養液中に得られた最高細胞密度はｌＸｌ ０’個の細胞／ｍｌであり、この時点で培養液を新しい培地で半分に希釈した。

培養液の全容量は１８０ｍｊ７であった。保温培養を更に３日間続け、その時広 範な細胞病理を観察した。培養液を１．２μＭの酢酸セルロースフィルターで濾 過した。ウィルスを、４℃で４時間にわたって６１．ＯＯＯＸｇで遠心分離によ り濾液からペレット化した。ベレット化ウィルスをＰＢＳ　（食塩加リン酸緩衝 液）で再懸濁した。原液は１　ｍ　４２当り１　０　１０ｇ１ｏより大きいＩＤ Ｓ．を含んでいた。

バートＢ−ＮａＳＣＮ処理によるウィルスの失活ｉＩＸ因子を３ＭのＮａ５ＣＮ でモノクローナル抗体アフィニティーマトリックスから溶離し、その後セファデ ックスＧＩＯで脱塩した。上記のＨＩＶ原液原液１奢ｌ■溶液２０ｍｌ１と混合 し、得られた混合物２　ｍ　１２を、表Ｈに示される種々の量の６Ｍのチオシア ン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ　）及び緩衝剤（０．ＯＩＭのトリス−ＨＣｌ及び ０．０２ＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に添加して適当なＮａ５ＣＮ濃度Ａ　１． 　００ｍＡ　１．　００ｍ１１．　５Ｂ　１，３５ｎ１．　０，６５ｍｊ！　２ ．０Ｃ　２．　００ｍ　ｌ　０．　ＯＯｍ　ｌ　３．　０Ｄ　１．３５ｍ１２０ ．６５ｍ１２．０試料Ａ，Ｂ及びＣを４℃で１時間放置し、試料りを２５℃で１ 時間放置した。その後、各試料を１０５．０００Ｘｇで９０分間遠心分離した。

ベレットをＰＢＳ１ｍｆ中で再懸濁し、ＣＥＭ細胞に対するウィルスの細胞変性 効果の直接観察によりＨＩＶに関して分析した。この実施例に使用したアッセイ 方法は力価をほぼ０、５　ｌｏｇインクレメントまで概数で表わす。結果を表■ に示す。

（処理前の各試料の初期ウィルス力価は９　ｌｏｇ、。であった。）結果は、チ オシアン酸ナトリウム処理がＨＩＶの８　ｌｏｇを失活したことを示す。更に、 結果は、約１．５より高い濃度がそれ程有効ではなかったこと、緩衝剤の使用が 必要とされなかったこと（試料Ｃを参照のこと）及び４℃、２５℃の両方に於け る処理が有効であったことを示す。

ＣＥＭ細胞を約１の感染多重度で感染することによりウィルス原液濃厚物を調製 した。１０％のウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び０．００ ２ｍｇ／ｒｒｌのポリブレンで補足されるような充分のＲＰＭ１１６４０培地約 ４５０ｍ培地約４５０ｍ層のコーニングローラーびん中で培養を確立した。感染 ４日後に培養液中に得られた最高細胞密度はｌＸ１０６個の細胞／ｍｌであり、 この時点で培養液を新しい培地で半分に希釈した。培養液の全容量は１８００ｍ ＃であった。保温培地を更に３日間続け、その時広範な細胞病理を観察した。培 養液を１．２μＭの酢酸セルロースフィルターで濾過した。ウィルスを、４℃で ４時間にわたって６１．０００Ｘｇで遠心分離により濾液がらペレット化した・ ベレット化ウィルスをＰＢＳ　（食塩加リン酸緩衝液）で再懸濁した。原液は１ ｍｌ当り１１　１０ｇ＋ｏより大きいＩＤ、。を含んでいた。

パートＢ−゛によるウィルスの、 ＨＩＶ原液（ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウィルス、ＬＡＶ−１株）５ｍｆｆｉを、ア フィニティー精製されセファデックスＧＩＯで脱塩された第Ｘ因子溶液４５ｍ１ に添加した。その混合物を、ＸＭ１００膜（６，２ｎｍの細孔直径）が外側に取 りつけられたアミコン攪拌セル（１８０ｍｊ＋の容量）に注ぎ、はぼ乾燥するま で限外濾過した。その後、そのユニフトを０．０５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣ ｉり　、０．００５Ｍのヒスチジン、ｐＨ７，０で３回洗浄して合計１２ｍｌの 洗浄液を生じた。出発物質、第Ｘ因子を含む限外濾液及び残留洗浄液をＨＩＶに 関して分析した。

表■中の結果は、１１．７１ｏｇのＨＩＶウィルスを含む混合物の限外濾過が第 Ｘ因子を含む限外濾液を生成し、ここでＨＩＶ感染性は０．５１ｏｇＪ少され１ １．２１ｏｇの減少であったことを示す。

残留洗浄液　１０．１　１．６ 限外濾液　０．５　１１．２ 実施斑↓ ＋ｌの　■　か”の　′によるライ」堡及勘天この実施例は、再構成ブロサー（ 商標）の加圧限外濾過が低活性の限外濾液を生成したことを示す。アーマ−・フ ァーマシューテイカル（Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　）のこ の登録商標により保護される製品は、ヒト第■因子、第■因子、第Ｘ因子及び第 Ｘ因子の安定な凍結乾燥濃厚物である。それは、溜めたヒト血漿から調製される 。再構成後に、それは１　ｍ　１当り約１８ｍｇの全タンパク質及び３３単位の 第Ｘ因子活性を含む濃厚なタンパク質溶液である。製剤中の第Ｘ因子の比活性は 全タンパク質１ｍｇ当り０．８〜２．０単位の範囲である。

パートＡ−１００にダルトンのカット−オフ（Ｃｕｔ−ｏｆｆ　）を有ｍ−−− −□−−−−−−− 最初の実験に於いて、ブロサー（商標）を０．０５Ｍのトリス−ＨＣ１ｐＨ８， ０で１：１に希釈した。得られた溶液を、１．０５Ｋｇ／ｃｉ　（１５ｐ、ｓ、 ｉ、）の圧力を用いてアミコンＸＭ１．００膜ｃｉｏ。

Ｋダルトンの分子量カット−オフ）で限外濾過した。限外濾過は非常に遅く進行 しく約０．２５　ｍ　！！　７分）、攪拌セル内のタンパク質が一層濃厚になる につれて流速は遅くなった。出発物質中に見られるわずかに約１％の第Ｘ因子の 活性が限外濾液中に現われた。

再構成ブロサー（商標）のに６の初期希釈及び０．３５Ｋｇ／ｄ（５ｐ、ｓ、ｉ 、）の圧力を用いるこの実験の反覆は、同様の低い第Ｘ因子活性を有する限外濾 液を与えた。この場合及びその他の全ての場合の第Ｘ因子活性ば、第Ｘ因子欠損 血漿のＡＰＴＴの修正度を測定することにより分析する。Ｊ、　Ｈ，レナハン（ Ｌｅｎａｈａｎ　）、フィリップス・アンド・フィリップス（Ｐｈｉｌｌｆｐｓ 　ａｎｄ　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ）、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　、、　１２巻、２６ ９頁（１９６６年）を参照のこと。

結果は、第Ｘ因子がわずかに６０−７０にダルトンの分子量を有するが、それは 多孔度が限外濾液中へのそれの通過を可能にしたはずの膜によりかなりの程度で 限外濾過しなかったことを示す。

妥当な説明は膜種性化として知られる現象に基く、膜により排除（保持）された タンパク質は、濾過されている溶液の本体に直ちに戻して混合されない場合には 、膜表面で薄い溶液層中に濃縮される。その層は、それが“ゼラチン状”になり 使用中の膜を覆う新しい形態の膜を構成する程濃厚になることがある。一般に、 このタンパク質膜の性質は非常に低い多孔度を有する機械膜の性質と極めて区別 される。

が−トＢ−３００にダルトンのカフヒオフを１ｔｌ狭アミコンＸＭ３００膜（３ ００にダルトンの分子量カット−オフ）　、０．３５　Ｋｇ／　ｃｄ　（５ｐ、 ｓ、　ｔ、）の圧力、並びに１：６及ｊ：１０の再構成ブロサー（商標）希釈を 用いて、実験を続けて行なった。わずかに約１７〜１９％の第Ｘ因子活性が限外 濾液中に見られた。限外濾過される溶液への０．１％のトウィーン８０（表面活 性剤）の添加は結果を改良しなかった。全ての場合、限外濾過した第Ｘ因子は出 発物質に対してわずかに６〜８倍の精製を示した。

結果は、その分離が一層多孔性の膜によりほんの適度に成功したことを示す。

結果は、限外濾過がアフィニティー精製第Ｘ因子溶液を更に処理するのに・うま く使用し得るが、それが一層純粋でない出発物質から高収量の第Ｘ因子を得るの には−・様に実用的ではないことを示す。

裏立旦ｌ 訓ｐ部ｍ侃は注しムＬジニ±北坑尊舅ｌタンパク質ｌａｇ当り約１〜３単位の第 Ｘ因子を含む第■因子濃厚液ヲ、最初にシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　）　’） イルスと８〜９　ｌｏｇ、。

ＴＣＩＤｓｅの最終力価まで接触し、その後、ニューラスらの米国特許第４，７ ６４．３６９号に記載されるように、０．１％のトリ　（ｎ−ブチル）ホスフェ ート及び１％のトウィーン８０　（洗剤）と接触させる。この特許の開示が参考 として含まれる。シンドビスウィルス感染性が４　ｌｏｇ、、より多いウィルス により減少されること・及び活性な第■因子含量が初期値の８０％を越えること が予想される。

この溶剤／洗剤で処理された第■因子溶液を、スミスの米国特許第４．７８６， ７２６号（その開示が参考として本明細書に含まれる）に記載されるようなモノ クローナル抗体と接触させる。第■因子の精製溶液が得られることが予想される 。この溶液は、得られる精製の理由により感染性シンドビスウィルスが更に減少 されること、及びウィルスの力価が検出し得ないことが更に予想される。

得られた第■因子溶液を、更にＨＩＶウィルスと接触させて８〜９１０ｇＩｏの ウィルスの最終力価を得る。タンパク質含量を、１ｍ１当り約０．０２５〜０． ０６５ｍｇのタンパク質に調節する。得られた溶液を、１００ＫＤ分子量カット −オフに相当する有効多孔度を有する膜で濾過する。第■因子の８０〜１ｏｏ％ が回収されること、及びＨＩＶウィルス力価が検出し得ない量まで減少されるこ とが予想される。

第■因子溶液を、１　ｍ　１当り約１００の国際単位の潜在能まで濃縮し、０． ０６６Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｆ　）　、０．０１　Ｍノヒスチジン、３％ のマンニトール、ｐ）１７．０　：！：　０．２からなる緩衝液に対して透析す る。外因性試験ウィルスを添加しないで行なう場合、この物質を無菌濾過しく０ ．１ミクロンのフィルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤を得る。

叉旌透エ ン　を゛　する１ タンパク質ｌａｇ当り約１〜３単位の第■因子を含む濃厚溶液を・スミスの米国 特許第４　、７８６　、７２６号に記載されたモノクローナル抗体と接触させる 。精製第■因子をＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）の如きカオトロピ ックな薬剤でモノクローナル抗体から溶離する。得られた第■因子溶液が高い比 活性の精製第■因子を含むこと、及び収率が８０〜１００％であることが予想さ れる。

得られた第■因子溶液を、更にＨＩＶウィルスと接触させてウィルスの最終力価 ８〜９１ｏｇ＋。を得る。　Ｎａ５ＣＮの最終濃度が約１゜５Ｍであるように、 チオシアン酸ナトリウムを第■因子−ＨＩＶ混合物に添加し、第■因子−ＨＩＶ 混合物を４℃〜２５℃の温度で１〜２．５時間の期間にわたって放置する。第■ 因子の潜在能が消毒剤処理により影響されないこと、及びＨＩＶ感染性の力価が 検出し得ない水準に減少されることが予想される。

その後、溶液を透析して化学消毒剤を除去し、ついで１００ＫＤ分子量カット− オフに相当する有効多孔度を有する膜で濾過する。

第■因子活性の８０〜１００％が回収されること、及びＨＩＶ力価が更に減少さ れることが予想される。また、不完全なウィルス粒子または変性されたウィルス 粒子が濾過により第■因子溶液から除去されることが予想される。

第■因子溶液を、１ｍｌ当り約１００の国際単位の潜在能まで濃縮し、０．０６ ６Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣＪ）　、０．０１Ｍのヒスチジン、３％のマンニ トール、ｐＨ７，０±０．２からなる緩衝液に対して透析する。外因性試験ウィ ルスを添加しないで行なう場合、この溶液を無菌濾過しく０．１ミクロンのフィ ルター）、凍結乾燥して製薬用に適した製剤を得る。

本発明の特別な実施Ｌｉ様が示され説明されたが、本発明の精神及び範囲から逸 脱しないで多くの変更がそれらになし得ることが明らかである。それ故、本発明 は、以上の記載により限定されない。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．不安定な血液タンパクおよびウイルスを含む血液製剤を、タンパクの変性を 起こさない有効量の化学的消毒剤と、該ウイルスの実質的すべてを不活性化する のに十分な時間および温度にて接触させることを含む該血液製剤中のウイルスの 不活性化法。
2. ２．不安定な血液タンパクとウイルスとを含有する血液製剤を、不活化されたウ イルスおよび活性なウイルスを含まないものとする方法であって、以下の工程： （ａ）該血液製剤と、タンパクを変性しない有効量の化学的消毒剤とを、該ウイ ルスの実質的すべてを不活性化するのに十分な時間、かつ十分な温度にて接触さ せ、（ｂ）物理的手段により、該不活性化されたウイルスおよび活性なウイルス を該血液製剤から分離する を含むことを特徴とする上記方法。
3. ３．更に、上記工程（ａ）を経た該血液製剤を透析して、該不活性化ウイルスお よび活性なウイルスを分離する前に、該化学的消毒剤を除去する工程を含む請求 の範囲第２項記載の方法。
4. ４．不安定な血液タンパクおよびウイルスを含有する血液製剤を、不活性化ウイ ルスおよび活性なウイルスを含まない製剤とする方法であって、以下の工程、 （ａ）該血液製剤をモノクローナル抗体親和性マトリックス上でクロマトグラフ ィー処理し、 （ｂ）該モノクローナル抗体親和性マトリックスから該クロマト処理した血液製 剤を、有効量の、タンパクを変性しない化学的消毒剤で溶出し、および （ｃ）該溶出混合物を、該ウイルスの実質的にすべてが不活性化されるのに十分 な時間および温度にて静置するを含むことを特徴とする上記方法。
5. ５．更に、以下の工程 （ｄ）該血液製剤から物理的手段によって該不活性化されたウイルスおよび活性 なウイルスを分離する をも含む請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．更に、上記工程（ｃ）を経た該血液製剤を透析して、該不活性化ウイルスお よび活性なウイルスを分離する前に、該化学的消毒剤を除去する工程をも含む請 求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．不安定な血液タンパクとウイルスとを含有する血液製剤を、不活性化ウイル スおよび活性なウイルスを含まない製剤とする方法であって、 （ａ）該血液製剤を、モノクローナル抗体親和性マトリックス上でクロマトグラ フィー処理し、 （ｂ）該モノクローナル抗体親和性マトリックスから、該クロマト処理した血液 製剤を、消毒剤を含まない溶離剤で溶出し、（ｃ）タンパクを変性しない、有効 量の化学的消毒剤を添加し、および （ｄ）該溶出混合物を、該ウイルスの実質的にすべてを不活性化するのに十分な 時間、かつ十分な温度にて、静置する各工程を含むことを特徴とする上記方法。
8. ８．更に、以下の工程 （ｅ）物理的手段によって該血液製剤から該不活性化されたウイルスおよび活性 なウイルスを分離する、をも含む請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．不安定な血液タンパクとウイルスとを含有する血液製剤を実質的にウイルス を含まない製剤とする方法であって、物理的手段によって、該血液製剤から実質 的にすべてのウイルスを除去する工程を含む上記方法。
10. １０．更に、該血液製剤を、該ウイルスの実質的にすべてを不活性化するのに十 分な時間、かつ十分な温度にて、タンパクの変性を生じない有効量の化学的消毒 剤と接触させる工程をも含む請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．更に、物理的手段によって、該血液製剤から、該不活性化ウイルスおよび 活性なウイルスを分離する工程をも含む請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．更に、アミノ−ヘキシルセファロース上でクロマト処理することにより、 該血液製剤から該不活性化ウイルスおよび活性なウイルスを除去する工程をも含 む請求の範囲第６項または第８項記載の方法。
13. １３．該血液製剤が血漿、血漿濃縮物、該血漿の任意の分画により得られる沈殿 物、該血漿の任意の分画により得られる上澄、血清、低温沈殿物、細胞溶解物お よび血液細胞中で誘発されたタンパクからなる群から選ばれ、かつ該不安定な血 液タンパクがフィブリノーゲン、低温不溶性グロブリン、プロベルジン、ＩｇＧ 、ＩｇＭ、ＩｇＡ、β−リボタンパク、プラスミンインヒビター、Ｖ因子、トロ ンビン、抗トロンビン、同種凝集素、セルロプラスミン、プロトロンビン、α− １−リボタンパク、ペプチダーゼ、トランスフェリン、チロキシン、結合グロブ リン、血清エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、α−１−酸糖タンパク、Ｉ Ｉ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＸＩＩＩ因子、免疫グ ロブリン、プレアルブミン、レチノールー結合タンパク、アルブミン、α−グロ ブリン、タンパクＣ、タンパクＳ、β−グロブリン、ｒ−グロブリン、ＩＩＩ因 子、補体成分、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘモグロビン、インタ ーフェロン、Ｔ−細胞成長因子、プラスミノーゲン活性化因子、感染性肝炎に対 する抗体、およびヒト免疫不全症ウイルスに対する抗体からなる群かむ選ばれる 請求の範囲第１項、第２項、第４項、第７項または第９項に記載の方法。
14. １４．該ウイルスが肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）およびヒト免疫不全症ウイルス（ ＨＩＶ）からなる群から選ばれる脂質−含有ウイルスである請求の範囲第１項、 第２項、第４項、第７項または第９項記載の方法。
15. １５．該化学的消毒剤が該ウイルスを実質的に不活性化することが知られている 試薬であり、かつ有機溶媒／洗浄剤の組合せまたはチオシアン酸ナトリウムであ る請求の範囲第１項、第２項、第４項または第７項記載の方法。
16. １６．該化学的消毒剤がチオシアン酸ナトリウムである請求の範囲第１５項記載 の方法。
17. １７．該化学的消毒剤が該ウイルスを実質的に不活性化するものとして知られる 試薬であって、有機溶媒／洗浄剤の組合せまたはチオシアン酸ナトリウムである 請求の範囲第１０項記載の方法。
18. １８．該化学的消毒剤がチオシアン酸ナトリウムである請求の範囲第１７項記載 の方法。
19. １９．該物理的手段が限外濾過、超遠心分離および電気泳動からなる群から選ば れる請求の範囲第２項または第９項記載の方法。
20. ２０．該物理的手段が限外濾過である請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．該物理的手段が限外濾過、超遠心分離および電気泳動からなる群から選ば れる請求の範囲第５項、第８項または第１１項記載の方法。
22. ２２．該物理的手段が限外濾過である請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．該不安定血液タンパクがＩＸ因子、Ｘ因子、ＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、プ ロトロンビン、タンパクＣおよびタンパクＳからなるビタミンＫ−依存タンパク 群から選ばれる請求の範囲第１３項記載の方法。
24. ２４．該不安定血液タンパクが感染性肝炎に対する抗体またはヒト免疫不全症ウ イルスに対する抗体を含む請求の範囲第１３項記載の方法。
25. ２５．不活性化ウイルスおよび活性なウイルスを含まず、かつ請求の範囲第３項 、第６項、第８項または第１１項記載の方法で調製された、１ｍｌ当たり約５０ 〜１５０単位のＩＸ因子活性をもつ精製された血液製剤。