JPH0611702B2 - 治療上活性な蛋白質組成物の熱処理方法 - Google Patents

治療上活性な蛋白質組成物の熱処理方法

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JPH0611702B2
JPH0611702B2 JP56030005A JP3000581A JPH0611702B2 JP H0611702 B2 JPH0611702 B2 JP H0611702B2 JP 56030005 A JP56030005 A JP 56030005A JP 3000581 A JP3000581 A JP 3000581A JP H0611702 B2 JPH0611702 B2 JP H0611702B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療上活性な蛋白質組成物を、殺菌（pasteu
rization）のために熱処理する方法に関するものであ
る。すなわち本発明に従えば治療上活性な、熱処理され
た蛋白質組成物が得られる。本明細書中の部および％
は、特に断わらない限り重量部および重量％をそれぞれ
意味する。
多くの有用な血液分屑（blood fractions）および血液
蛋白質は、次に示すような公知の方法に従う分別により
人間の血漿から得られる：たとえば米国特許第２３９０
０７４（1945年）号およびJournal of the American Ch
emical Society、第６８巻、第４５９頁（1946年）に記
載のCohnのアルコール分別法およびRivanol 硫酸アン
モニウム法。前記の方法および他の変形方法は、“The
Plasma Proteins”、第２版、第III巻、第５４８〜５５
０頁（Academic Press,New York,New York）（1977年）
に要約されている。これらの血液分屑は、ある種の治療
特質を有する生物学的に活性な蛋白質を含んでいる。例
えば、第VIII因子すなわち抗血友病性因子は、血友病に
対し有効である；プラズミノジエンは、急性血栓塞栓障
害の治療用プラズミンの先駆物質である；免疫性血清グ
ロブリン（IgG）は、先天性ガンマグロブリンの欠乏、
麻疹、灰白髄炎および肝炎Ａ並びにＢの治療に用いられ
る；フィブロネクチン（fibronectin）は、火傷、ショ
ック、癌などの治療に活性であると確認されている；ア
ンチトロンビンIIIは、凝固抑制剤であり、寒冷沈澱物
（cryoprecipitate）自体が典型的血友病に直接用いら
れ得る；血漿蛋白分屑（人間）およびアルブミンは、火
傷によるショック、打撲傷、腹部の突発事故およびレッ
ドセル（red cell）でなく血漿流体の支配的不足を起こ
す他の原因の治療で有用である；免疫性グロブリン、イ
ントラビナス（intravenous）（改質免疫血清グロブリ
ン）は、多量に投与できる免疫血清グロブリンの代替物
である；米国特許第４１６００２５号に記載されている
第VIII因子抑制剤バイパス活性物質は、第VIII抑制剤患
者のための血液凝固促進配合物である；α−１−抗トリ
プシンは気腫の治療に用いることができる；血漿生長ホ
ルモンは下垂体生長不足を矯正し、ソマトメジン（soma
tomedin）は生長不足の矯正に有効であり、他の免疫血
漿グロブリン（たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび
ＩｇＭ）は、各種の免疫性蛋白質不足の治療に用いるこ
とができる；プレアルブミン（米国特許第４０４６８７
７号）は、免疫学的能力を高めるのに用いられる；プラ
ズミノジエン−ストレプトキナーゼ錯体（米国特許第４
１７８３６８号）は血栓塞栓症の治療のために患者に投
与できる；セルロプラズミン、トランスフェリン、ハプ
トグロビンおよびプレカリクレイン（prekallikrein）
は、薬剤その他の用途を有している。
血漿、血漿分屑並びに個々の血液蛋白を含む組成物の使
用者が直面する１つの問題は、治療上活性な含有蛋白質
の熱不安定性である。多くの場合、生理学的温度以上す
なわち約４０〜４５℃より高くこれらの蛋白質が熱せら
れたとき、活性の実質的な消失、時には活性の完全な消
失がみられる。従ってこれらは、このような不活性化を
最小限度とするように製造中および貯蔵中に特別の注意
を必要とする。
前記の蛋白質の熱不安定性は、蛋白質を殺菌不能とす
る。血漿から分離させた治療上活性な蛋白質は、蛋白質
分屑の原材料に、すなわち供与者の血液に存在するビー
ルスたとえば肝炎ビールスを含んでいるかもしれない。
ビールスの存在は公知の方法で確実には検知できないの
で、血漿分屑法での未殺菌分屑を受ける者には肝炎にか
かる危険が存在することになる。多くの場合、この危険
よりは、医者により定められたごとき治療用血漿分屑を
受けないことによる患者の損失のが大きい。
血漿から誘導されるいくつかの治療上活性な蛋白質は、
好首尾をもって殺菌されている。たとえば、アルブミン
は、ある種の安定剤たとえばアセチル−トリプトファン
およびカプリル酸ナトリウムの存在下で、６０℃または
６４℃で１０時間熱することにより｛Gellis他、J.Cli
n.Invest.,第２７巻、第２３９〜２４４頁（1948年）｝
殺菌され得ることが公知である。この殺菌された物質を
受ける個々の人は、肝炎にかからなかったので、このこ
とは、前記の加熱条件下でアルブミンの活性を保ったま
ま肝炎ビールスを不活性化させたことを示している。血
漿蛋白質分屑（人間）は、また、前記の方法により殺菌
中に安定化される。
プラズミノジエンを殺菌する方法は、Baumgartenらの米
国特許第３２２７６２６号に記載されている。１ｍ当
りプラズミノジエン0.25〜２０mg（mg／ｍ）含有しリ
シン0.1〜0.5モル濃度を含むpH5.3〜7.5の配合水溶液を
６０℃で１０時間加熱している。特許所有権者が述べて
いるように、肝炎ビールスは、潰滅され、肝炎を移す危
険は排除されるがプラズミノジエンの活性は保たれてい
る。リシン不在下での前記の条件下でプラズミノジエン
を殺菌しようとする試みは、プラズミノジエンの活性の
完全な破壊をもたらしている。プラズミノジエンが殺菌
の間にＮ−アセチル−トリプトファンおよびカプリル酸
ナトリウムにより安定化され得ず、また、アルブミンお
よび血漿蛋白質分屑（人間）がリシンの存在下で殺菌さ
れ得ないことに注目することは興味あることである。
Singherは、肝炎ビールスにより汚染されていない物質
を得るプラズミノジエンの処理法を示している（米国特
許第２８９７１２３号）。この特許の殺菌法では、プラ
ズミノジエンの水溶液が、約１０時間約６０℃に加熱さ
れる。プラズミノジエンの活性が保たれるのは、溶液の
pHが、３より大きく6.5より大きくなく、イオン強度
が、0.3より大きくないときである。
生物学的物質から肝炎ビールスを除去するもう１つの方
法が、米国特許第４１６８３００号に記載されている。
処理されるべき物質は、配合物と接触され、この配合物
が、各種の疎水性リガンドと結合したビーズ化ポリアク
リルアミドプラスチックまたはアガロースゲルであって
もよいようになっている。血漿とアルブミンは、前記の
精製によって肝炎ビールスを除去されている。
酵素トロンビンの水溶液は、ある種グリコシドの飽和量
の存在下で５０℃に加熱して安定化される（Seegers,Ar
ch.Biochem.,1944年、第３巻、第３６３〜３６７頁）。
安定化された溶液は、前記の温度で４８時間以上加熱さ
れても活性の消失は最少限度である。一方、Seegers
は、また、グリコシドおよびポリオールは、酵素プロト
ロンビンの安定化で最少限の有効性を有するだけである
ことを示している。リゾチームおよびリボ核酸酵素の可
逆性変性が、Gerlsmaら｛Int.J.Peptide Protein Res.,
第４巻、第377〜383頁（1972年）｝により検討された。
ある種多価アルコールは、これらの酵素が変性される温
度をいくらか上げることが確認されている。また、Simp
sonら｛J.Am.Chem.Soc.,第７５巻、第２１版、第5139〜
5152頁（1953年）｝およびDonovan｛J.Sci.Fd.Agric.,
第２８巻、第５７１〜５７８頁（1977年）｝は、オバル
ミン（卵白蛋白質）の変性温度が、蛋白質水溶液中の蔗
糖の存在下で僅かに上げられることに注目している。し
かしながら、Donovanは、オバルミンおよびＳ−オバル
ミンの変性温度がそれぞれ84.5℃および92.5℃であるこ
とを指摘している。さらに、オバルミン、Ｓ−オバルミ
ンおよび前記の酵素は、人間の疾病の治療に治療活性を
有さないが、血漿蛋白質は、治療活性を有している。事
実、下記に述べるように、蛋白分解酵素は、血漿蛋白質
を不活性化させる。
前記の米国特許の中で、Singherは、肝炎ビールスを潰
滅させるいくつかの方法を挙げている。これらの方法
は、効果が最低であり、ナイトロジエンマスタードまた
はβ−プロピオラクトンを使用する。適当な投与量での
高エネルギー照射は、有効であるが、人間の血漿産出物
に適用すると生物学的活性を破壊する。熱も肝炎ビール
スに対し有効であることが認められていて、好ましい処
理は、物質を６０℃で１０時間加熱する。短期での７０
℃より高い温度または長期でのより低い温度も好首尾を
もって試みられている。しかしながら、高温は、蛋白質
の変性の可能性から望ましくないことに気付くことが重
要である。さらに、短期での低温は避けるべきであり、
その理由は、各種の蛋白分解酵素が、これらの条件下で
活性化され、これら活性化酵素が、蛋白質の分解をもた
らすからである。また、殺菌に対し６０℃より低い温度
を用いることは、伝染性ビールスを含まない物質を一貫
して得られることを示していない。
前記したように、１０時間、６０℃および６４℃の加熱
が、アルブミン中の肝炎ビールスを好結果をもって潰滅
するという認識は、前記のGellisらによってなされた。
Gellisらは、前記の条件下で加熱されたアルブミンは、
肝炎ビールスが殺菌前に存在していても肝炎を移さない
ことを実験的に証明した。しかしながら、肝炎ビールス
は、１時間、５６℃の加熱、すなわちビールスの不活性
化に通常用いられる温度の加熱、で生き残ることに気付
いている。このように、１時間、約５６℃の温度での加
熱は、ほとんどのビールスを不活性化させ得るが、肝炎
のビールスは不活性化されず、１時間、５６℃で加熱さ
れた肝炎ビールスを含む物質は、この物質を受ける個人
個人に肝炎の感染をもたらす。
本発明は、前記に概説した問題を排除する手段を提供す
る。本発明の方法では、感温性で、治療上活性な蛋白質
を含むある種組成物が、約６０〜７５℃の温度での加熱
すなわち殺菌に際し、加熱安定化量すなわち殺菌安定化
量のスクロースとの混合により熱安定化される。これま
でに得ることのできなかった治療上活性な蛋白質を含む
殺菌された組成物は、本発明の方法の結果次のようにし
て得られる：通常は水性媒体に可溶化させるかまたは懸
濁させたスクロースおよび未殺菌蛋白質組成物からなる
混合物を、蛋白質組成物を殺菌するのに十分な時間と温
度とで加熱する。有意義なことに、感温蛋白質組成物
は、唯一な熱安定化剤としてスクロースを用いて殺菌さ
れ得る。殺菌すなわち熱処理に引き続き、スクロース
は、慣用の用法で蛋白質組成物から所望に応じて全部ま
たは一部、除去され、殺菌された蛋白質組成物は、慣用
の方法に従い処理されてその最終的治療の用途に供され
る。
本発明の主たる利点は、熱安定性で、殺菌されていて、
治療上活性な蛋白質組成物を得ることができることであ
り、このことはこれまで未知であり、達成できていな
い。本発明の治療上活性な蛋白質組成物は、肝炎ビール
スを不活性化させるのに公知の条件下で、活性の消失を
最低として加熱され得るので、これらの価値ある物質が
患者に投与され得、患者は、肝炎ビールスによる感染の
危険を実質的に減じて治療上活性な蛋白質組成物の十分
な治療上の恩恵を得ることができるようになる。
本発明のもう１つの利点は、治療上活性な蛋白質組成物
が、分屑に先立って血漿へ、さらには、部分的に分屑さ
れた血漿へ、また、個々の血漿分屑へ、さらには個々の
血漿蛋白質自体へ適用できることである。このように、
本発明の方法の多用性が理解できよう。分屑に先立つ血
漿の殺菌は、全血漿に適用されるCohn法以外の分屑法を
可能とする。このようにしてアルブミンの収率は、約２
０％またはそれ以上、上げることができる。今日まで、
Cohn法は、殺菌を行わないでは非肝炎感染性である歴史
を有する免疫性血清グロブリンのごときある種治療用分
屑を確保することに依存してきた。本発明以前には、免
疫性血清グロブリンは殺菌されていなかったことを思い
起こすべきである。
添付図面の第１図は、蔗糖濃度と、変性免疫性血清グロ
ブリンと、蔗糖存在下での殺菌後の蛋白光の百分率変化
との間の関係を示す３次元図である。
前記したように、温度約６０〜７５℃、好ましくは約６
０〜７０℃での加熱すなわち殺菌に際し、熱安定化量す
なわち殺菌安定化量のスクロースと混合することによ
り、安定化され得る、感温性で、治療上活性な蛋白質を
含んでなる殺菌済（すなわち加熱処理済）組成物でスク
ロースを任意には含んでいてもよい組成物を、本発明は
含む。
本発明の方法では、殺菌されるべき蛋白質組成物は、後
続する殺菌の間、蛋白質組成物を安定化させるのに十分
な量のスクロースと共に水性媒体中に、懸濁または溶解
させる。本発明に従う蛋白質組成物を安定化させるのに
必要なスクロースの濃度は、蛋白質組成物中の治療上活
性な蛋白質の種類と濃度およびスクロース自体の種類に
依存する。通常、熱安定化量すなわち殺菌安定化量は、
スクロース約１〜1000部、好ましくは５〜１００部を、
蛋白質組成物中の全蛋白質１部当りに含むべきである。
通常、重量−容量で、約１部の蛋白質組成物を、スクロ
ース少なくとも１０％、好ましくは少なくとも約３０
％、ないし好ましくは殺菌温度で飽和量を含む水性媒体
約１〜５００部、好ましくは４〜２００部と混合する。
治療上活性な蛋白質は、殺菌中に治療活性の実質的な部
分すなわち少なくとも４０％を保持するなら安定化され
るとみなされる。蛋白質組成物の治療活性の７０％また
はそれ以上が、殺菌中に保持されることが好ましい。し
たがって、加えられるべきスクロースの量は、治療活性
の前記の量を保持するような量とすべきである。
蛋白質組成物をスクロースと混合した後、混合物を、殺
菌に十分な時間と温度とで加熱するようにする。このよ
うに、この混合物は、肝炎ビールスを不活性化させる公
知の条件下で加熱されて殺菌される。肝炎ビールスを不
活性化させ、肝炎の感染の危険を実質的に減じさせる有
効な殺菌は、未殺菌蛋白質組成物を温度約６０〜７５
℃、好ましくは約６０〜７０℃で、約１０時間、通常は
約６２〜６５℃で約１０時間加熱することによってなさ
れる。
殺菌は、生理学的条件に近いpH条件下で行われる。した
がって、混合物のpHは、通常、約5.5〜8.0、好ましくは
約6.0〜7.5の範囲内にあるべきである。通常、殺菌中、
可能なら生理学的条件が望ましく、治療上活性な蛋白質
組成物への最少限の好害を確保する。
殺菌中の特別な蛋白質組成物を安定化させるのに必要な
特定のスクロースの量および組成物を殺菌するのに必要
な条件は、本明細書の教示に従いパイロット試行を用い
本分野に精通した者により容易に決定され得る。
殺菌に引き続き、スクロースと蛋白質組成物との混合物
は、スクロースの全部または一部を除くように処理され
る。この目的の達成のため慣用の方法が用いられ得る。
たとえばこの混合物は、適当な半透膜を用いて透析でき
る。スクロースを除去する他の手段も、本分野に精通し
た者に提案されよう。
殺菌された混合物は、本分野で公知の方法により水を除
去するように処理されてもよい。たとえば、混合物を凍
結乾燥させてもよく、または限外濾過してから凍結乾燥
させてもよい。さらには、混合物を、水除去に先立って
慣用の方法により無菌濾過してもよい。
本発明の殺菌された蛋白質組成物は、治療に用いる製薬
配合物にすることができる。この組成物を静脈内配剤用
にするには、通常、生理学的物質たとえば塩化ナトリウ
ム、グリシンなどを含有し、生理学的状態に匹敵する緩
衝させたpHを有する水に蛋白質組成物を溶解させる。通
常、静脈内用に配剤された蛋白質組成物用の指針は、政
府の規則により確立されている。
本発明の範囲に入る、感温性で、治療上活性な蛋白質
は、予防および／または治療を目的として患者に通常は
投与される蛋白質で、約４０〜４５℃以上に熱せられた
ときいくらかの治療上の活性を失い、スクロースの存在
下で温度約６０〜７５℃で熱せられている間すなわち殺
菌されている間に安定化され得る蛋白質である。本発明
に従って殺菌され得る治療上活性な蛋白質を限定すると
いうことでなく説明上例示すると次のものである：静脈
血漿または胎盤血漿（placental plasma）から誘導され
る蛋白質、個々の血漿分屑および個々の血漿蛋白質を含
む。たとえば本発明の方法により殺菌され得る蛋白質組
成物は、次のものがある：治療上活性な蛋白質プラズミ
ノジエンとして、アルブミン、抗血友病性因子（第VIII
因子）、フィブロネクチン（冷不溶性グロブリン）、免
疫性グロブリン、生長活性を有する、血漿蛋白質（分子
量1000〜30,000）、たとえばプレカリクレインなどおよ
びこれらの混合物。さらに、“脱脂肪した（defatte
d）”アルブミンを含む殺菌された組成物は、本発明に
より得られる。用語“脱脂肪した”とは、アルブミンお
よびＰＰＦ（人間）が殺菌前に初めの状態で存在と同じ
だけの脂肪酸物質を含むこと意味する。殺菌され脱脂肪
された組成物は、標準の殺菌安定化剤たとえばカプリル
酸ナトリウムおよびナトリウムアセチル−トリプトファ
ネートを用いて得られるような高い脂肪酸物質の注入に
耐えない患者に投与可能である。
抗血友病性因子Ｂ（第IX因子）およびプレカリクレイン
促進剤が、前記の方法に従いスクロースの存在下で殺菌
され得ないことは注目に値する。もちろん、これらの蛋
白質のその治療活性の実質的全ては、前記の蛋白質組成
物がその活性の実質的な部分を保持する条件下で失われ
る。
既述のごとく本発明方法では、ポリオールの一種である
スクロースが使用される。スクロースは、水混和性であ
り、蛋白質と生理学的に適合性であり、そしてその分子
量は低く３４２である。高分子量ポリオール、たとえば
多糖類（たとえばデキストリン、澱粉、グリコーゲン、
セルロース、ペントサン、ペクチン、ヘミセルロースな
ど）は、本発明の方法に用いるのには好ましくはなく、
その理由は、通常これらは水不混和性であり、殺菌完了
後に蛋白質組成物から分離するのが困難であるからであ
る。
殺菌されるべき蛋白質組成物のフィブリノゲン（第Ｉ因
子）含量が、重要であることが確認され、フィブリノゲ
ン含量が高いほど、必要炭水化物の量は大きくなる。蛋
白質組成物のフィブリノゲン含量は、全蛋白質の重量に
基づき約６０％より大きくなく、あるいは、たとえば５
４％スクロースの溶液（重量−容量）の重量に基づいて
0.6％より大きくないようにすべきである。好ましい例
では、蛋白質組成物は、溶液の重量に基づいて４０％よ
り大きくないフィブリノゲンを含むべきである。殺菌さ
れるべき組成物中のフィブリノゲンの量が、前記の限度
を越え、炭水化物の量が増加されないと、スクロースに
より治療上活性な蛋白質に与えられた熱安定性は、実質
的に下がるか、または完全に消失する。
６０％より大きいフィブリノゲン含量を有する蛋白質組
成物は、本発明の方法に従って、次の場合に殺菌され得
る：(1)溶液中のフィブリノゲン濃度が、0.6％未満、好
ましくは0.4％未満のとき、(2)アルブミンなどのよう
に、殺菌中に安定化され得る蛋白質が、まず、蛋白質組
成物に加えられてそのフィブリノゲン含量を６０％より
小さく下げられる場合（加えられた蛋白質は、必要に応
じて初めの蛋白質組成物から容易に分けられる性質を有
すべきである；また、加えられた蛋白質が初めの蛋白質
組成物の意図する治療用途に合い、除去される必要がな
くてもよい）、または(3)少なくとも約５部の炭化水素
がフィブリノゲン１部当りに用いられる場合。
本発明の方法は、肝炎ビールスを不活性化させる他の方
法と組合せて、たとえばアミノ酸のごとき他の安定剤の
存在下で蛋白質組成物を殺菌するか、または肝炎ビール
スを殺す公知の物質の存在下で蛋白質組成物を加熱する
他の方法と組合せて用いてもよい。
アミノ酸として、リシン、アルギニン、ロイシン、イソ
ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニ
ン、トリプトファン、バニリン、アラニン、アスパラギ
ン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジ
ン、プロリン、セリン、チロシンなどが用いられてよ
い。アミノ酸などのような前記のアミノ酸を生ずる物質
も用いられ得る。スクロース存在下のアミノ酸は、本発
明以前に殺菌不能であった蛋白質組成物に対し有効でな
い殺菌安定化剤であることを理解すべきである。
本発明の重用な生成物は、スクロースと、治療上活性な
蛋白質組成物との殺菌された水性混合物を含む。スクロ
ースを含まないが治療上活性な蛋白質を含む殺菌された
組成物およびスクロースと水とを含まない殺菌された蛋
白質組成物も、本発明の範囲に入る。本発明に従って殺
菌された蛋白質組成物を治療有効量含む製薬配合物も意
図される。本発明の特別な生成物は、本発明以前に殺菌
されなかった治療上活性な蛋白質を含む殺菌された組成
物である。たとえば、本発明の生成物には、次のものを
含む殺菌された組成物がある：抗血友病性因子（第VIII
因子）、フィブロネクチン、免疫性グロブリン、プレカ
リクレイン。
前記したように、本発明の殺菌された生成物は、製薬配
合物に組入れられて、治療の目的に用いられる。しかし
ながら、用語“製薬配合物”とは、本明細書で広い意味
において、治療目的ばかりでなく本分野で公知の薬剤の
目的に用いられる本発明に従って殺菌された蛋白質組成
物を含む配合物を包含することを意図する；ワクチン、
インターフェロンなどの製造用ビールスのごとき有機体
が、血漿または血漿分屑たとえばCohn Effluent II＋II
I、Cohn Fraction IV、Cohn Fraction Vなどで生長させ
られる組織培養などに対する。
上記の用途のいずれに対しても、蛋白質組成物は本発明
で提供されるように伝染性肝炎から解放されていること
が都合よい。治療用に使うことを意図した製薬配合物
は、治療有効量の殺菌された蛋白質組成物、すなわち、
予防的または治癒的な保健処置に必要な量を含むべきで
ある。製薬配合物が薬剤として使用されるなら、殺菌さ
れた蛋白質組成物の薬剤量を含むべきである。同様にし
て、組織培養または培養媒体に使用する場合、殺菌され
た蛋白質組成物は、所望の生長を得るため十分な蛋白質
組成物の量を含むべきである。本発明に従って殺菌され
た蛋白質組成物が、殺菌条件下で不活性化されるビール
スおよびその他の有機体の伝染量を含み得ないことは明
白であるべきである。
前記した本発明を、以下の例でさらに説明する。
例１ 抗血友病性因子の殺菌 Ａ．KOATE 抗血友病性因子｛Cutter Laboratories,In
c.（Berkeley,Californis）製の第VIII因子｝の瓶４本
を、それぞれ１０ｍの注射用蒸留水（WFＩ）に再構成
した（蛋白質1.9mg／ｍ）。瓶をプールしてスクロー
ス（0.8ｇ／ｍ）で処理した。この混合物を６０℃で
１０時間加熱して殺菌した後、一夜かけ、最終的な容器
ＡＨＦ（抗血友病性因子）、緩衝剤（0.3Ｍグリシン、
0.15Ｍ塩化ナトリウム、0.01Ｍくえん酸ナトリウム、お
よび１％ブドウ糖）に対し透析した。
対照標準としてKOATE 抗血友病性因子のもう１つの瓶
を１０ｍのWFＩで再構成してからスクロースで飽和さ
せた。このサンプルは５℃に保存し、６０℃１０時間の
加熱は行わなかった。この保存サンプルを、前記の場合
同様に透析した。
殺菌されたサンプルおよび前記の対照標準を次のように
分析評価した： 全蛋白質は、２８０ナノメータで吸光測定法により測定
した。
凝血促進剤活性（VIII：Ｃ）は、Langdellらの方法｛J.
Lab.Clin.Med.,第４１巻、第６３７〜６４７頁（1953
年）｝およびProctorらの方法｛Am.J.Clin.Path.,第３
６巻、第２１２頁（1961年）｝を変形した１段階活性化
部分トロンボプラスチン時間（APTT）テストにより分析
評価した。
リストセチン−ビレブランド因子活性（VIIIＲ：ＷＦ）
は、Olsonらの方法｛Am.J.Clin.Path.,第６３巻、第２
１０〜２１８頁（1975年）｝に従うゲル濾過された小板
を用いて分析評価した。
定量因子VIII抗原（antigen）（VIIIＲ：Ａｇ）測定
は、Laurell｛Anal.Biochem.,第１５巻、第４５〜５２
頁（1966年）｝の手順に従い行なった。
第VIII因子関係蛋白質に対する抗血清は、ベーリング診
断法（Behring Diagnostics）（Sommerville,New Jerse
y）から得た。
蛋白質種の分布は、酢酸セルロース電気泳動により分析
評価した。
結果を以下の表にまとめる。
Ｂ．ＡＨＦ濃厚物を、新鮮な凍結した人間の血漿からHe
rshgoldら｛J.Lab.and Clin.Med.,第６７巻、第２３〜
３２頁（1966年）｝の変形方法によりつくった。
ＡＨＦ濃厚物の水溶液は、十分なくえん酸ナトリウムお
よび塩化ナトリウムに加えて0.01Ｍと0.15Ｍの濃厚物を
それぞれ得、1.6Ｍの濃厚物へグリシンを加えた。この
混合物を５℃に１時間保った。生ずる沈澱を、遠心法に
より集めて除去した。この溶液を0.1Ｍグリシン、0.01
Ｍくえん酸塩および0.15Ｍ塩化ナトリウムに対し、Amic
on 中空繊維システム（Amicon Corp.,Bedford,Massach
usetts）を用いて透析して前記の物質の最終容器レベル
に到達させた。
ＡＨＦ溶液を、Amicon PM 10半透膜を用い限外濾過によ
り２０のＡ280まで濃縮した。この段階に引き続き、Ａ
ＨＦ溶液を十分なスクロースと混合して（0.8ｇ／ｍ
）含有スクロース溶液を得た。この混合物を６０℃で
１０時間加熱して殺菌してから最終的な容器ＡＨＦ緩衝
剤に対し透析した。
殺菌されたＡＨＦ濃厚物を、この例の前記Ａに挙げた手
順に従って分析した。結果を表２に示す。
例２ 変性免役性血清グロブリンの殺菌 変性免疫性血清グロブリン（MISG）を、米国特許第3,90
3,262号（参考例として挙げた）に記載された方法に従
って得た。このようにして得たMISGをダイアフィルトレ
ーション（diafiltration）の後、スクロース0.8ｇ／MI
SG溶液１ｍ（５４％）の添加によるスクロースで処理
した。この混合物を６０℃で１０時間加熱した。この殺
菌した物質を、等容量のWFＩで希釈した後、室温で生理
学的pH約6.8±４で７容積交換のためRomicon ＧＭ８０
ダイアフィルター（diafilter）（Romicon Corporatio
n,Woburn,Massachusetts）を用いてWFＩに対してダイア
フィルター（diafilter）した。
ダイアフィルトレーション後、MISG溶液は、0.1Ｍグリ
シンと１０％マルトースを含んだ５％MISG水溶液を得る
ように配合してから殺菌濾過を行なった。
対照標準として、0.1Ｍグリシンと１０％マルトースを
含んだ未殺菌の５％MISG水溶液を、米国特許第3,903,26
2号の方法によりつくったMISGから得た。
殺菌されたMISG溶液と対照標準を、抗補体（AC）活性、
麻疹、ポリオおよびジフテリアの効力に対し分析評価し
た。
また、SDS-PAGEパターンを、殺菌されたMISG溶液と対照
標準とに対し比較した。
抗補体活性：抗補体活性は、標準希釈評価により測定し
た。典型的には、テスト物質の２倍連続希釈度の0.2ｍ
を、サリン0.4ｍにてんじくねずみ補体の４“フ
ル”ユニットで３７℃で２時間培養した。｛補体の１フ
ルユニットは、感作化（sensitized）羊赤血球の１％懸
濁液0.4ｍの完全な溶血現象を起こす量である｝。残
留補体を、次に、感作化羊赤血球の１％懸濁液0.4ｍ
の添加と、３７℃でさらに３０分間の培養とにより測定
した。溶血現象の程度は、視覚的に評価し、抗補体力価
（anticomplement titer）は、少なくとも５０％の溶血
現象を与えるテスト物質の最大希釈度とした。
抗体力価：麻疹、ポリオタイプIIおよびおたふくかぜの
抗体は、組織培養中和分析評価により測定した。
水痘帯状疱疹抗体は、補体結合により評価した。
破傷風およびジフテリアの抗体はてんじくねずみの毒素
の中和により評価した。
抗連鎖球菌Ｏは、羊の赤血球の溶血現象により測定し
た。
狂犬病抗体は、迅速螢光焦点抑制テスト（RFFIT）を用
て評価した。
グループＢ連鎖球菌性活性は、てんじくねずみペリトニ
ール（peritoneal）食細胞分析評価を用いて行なった。
アンチ（Anti）Ａ、アンチＢは、標準化されたクームス
テストを用いて評価した。
プレカリクレイン活性剤（PKA）および活性化可能な
Ｆ．ＸIIは、２段階Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニ
ンエチルエステル塩酸塩（BAEE）分析評価法により測定
した。
物理的テスト：ゲル透過クロマトグラフィーを、Bio Ge
l Ａ−1.5ｍ（BioRad Laboratories,Richmond,Califor
nia）を含む直列にした２つの2.6×９０cmコラムを用い
室温で行なった。
SDS-PAGE（ドデシルスルホン酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）を、５％ゲルを用いて行なっ
た。ＳＤＳを蛋白質溶液に加えると、蛋白質に結合して
非常に大きな陰電荷を錯体に与える。このプロセスで、
全ての非共有相互作用は、妨げられる。すると、個々の
組の分離は、ポリアクリルアミドゲルの分子篩特性を利
用して可能となる。
超遠心機（ＵＣ）分析：沈降速度法を用いてＵＣ分析を
行う。表３に示した沈降係数Ｓは、水中２０℃での沈降
速度の測定（Ｓ20W）であり、粒子の形状と重量には無
関係である。
χ＝回転中心からの距離 ω＝角速度（ラジアン／秒） κ＝時間（秒） 殺菌されたMISGは、the Burean of Biologics of the F
ood and Drug Administrationの全ての提案必要条件に
合う。
未殺菌出発MISGの５％溶液を、スクロースの不在下で６
０℃で加熱した。MISGは、７５分でゲル化した。
結果は表３および第１図にまとめてある。
第１図は、スクロースの存在下でのMISGの殺菌処理の実
験結果を示す三次元図であって、横軸（Ｘ軸）はMISGの
濃度（％）を表し、縦軸（Ｙ軸）はスクロースの添加量
（ｇ／ｍ）を表し、垂直軸（Ｚ軸）は蛋白光（ＯＰ）
の程度（％）を表す。第１図に示されているように、た
とえばMISGの５％溶液の確実な殺菌のためのスクロース
の添加量の下限は約0.5ｇ／ｍである（第１図中の点
Ａ）。スクロースの添加量0.5ｇ／ｍは、スクロース
濃度３７％W/V（すなわち３３％W/W）に相当する。スク
ロースの添加量が0.2ｇ／ｍより少ないときにはゲル
化が常に起り、MISGが不活性化される。蛋白光はMISGの
不活性化の程度を示す尺度であって、その詳細な説明は
米国特許第4186192号明細書に記載されている。
例３ プラズミノジエンの殺菌 プラズミノジエンは次のようにして得た：人間の血漿か
ら誘導したCohn第III因子（“The Proteins”第II巻、1
954年版、第６６３〜７５４頁、Academic Press,New Yo
rk,N.Y.）を、pH7.5で0.1Ｍ燐酸ナトリウム、0.15Ｍ塩
化ナトリウムに懸濁させた。リシン−セファロース親和
力媒体（Iysine-Sepharose affinity medium）の代りに
無水マレイン酸テトラエチレングリコールジメタクリレ
ートコポリマーに共有カップルさせたリシンを用いDeut
schら（Science、1970年版、第１７０巻、第1095〜1096
頁）により示された方法と同様な方法によりプラズミノ
ジエンを分離させた。このように得たプラズミノジエン
（0.7mg）を、ガラス瓶に入れ注射用水１ｍで再構成
した。プラズミノジエン溶液をスクロース（0.8ｇ／ｍ
）で処理し、１０時間６０℃で加熱して殺菌した。プ
ラズミノジエンの収率は、まずこれをストレプトキナー
ゼを使って血漿に活性化することにより測定した。得ら
れる血漿を用いて標準化された量のBAEEを裂開（cleav
e）し、裂開（cleavage）の程度を２５５ナノメータ（n
m）で分光光度法により測定した。活性プラズミノジエ
ンの回収は、次のように処理した対照標準のサンプルに
対し４倍の大きさだった：このようにして得たプラズミ
ノジエン0.7mgを注射用の水１ｍの添加でガラス瓶に
再構成した。プラズミノジエン溶液をスクロースの不在
下で１０時間６０℃に加熱した。生成物の分析は、前記
の方法によった。
例４ 血漿の殺菌 標準製造方法に従う供給者血漿から得た人間の血漿（３
００ｍ）をスクロース（0.8ｇ／ｍ）で処理した。
血漿−スクロース溶液を６０℃で１０時間熱して殺菌し
た。ゲル化は観察されなかった。殺菌されたこの血漿
を、0.45％塩水を用いて容積で２倍に希釈し、Amicon P
M １０フィルターを用いてノーマルサリン（normal sa
line）に対しダイアフィルターして添加スクロースを除
去した後、前記のフィルターを用いてその初めの体積ま
で限外濾過により濃縮した。
前記と同じ給源からの人間の血漿１０ｍを対照標準と
してスクロースの不在下で６０℃に加熱した。
本発明の殺菌された血漿および未殺菌出発血漿を酢酸セ
ルロース電気泳動（ＣＡＥ）により分析した。結果を、
次表にまとめる。
殺菌された血漿サンプルのＣＡＥ分析では新たなピーク
がみられなかっとことは注目に値する。
例５ アルブミンの殺菌 乾燥Cohn分屑Ｖ（９６％アルブミンより大）粉末（62.5
ｇ）を、0.15Ｍサリン1.2に懸濁させた。この懸濁液
に、洗浄した活性炭31.75ｇを加えた。懸濁液のpHを、
６Ｎ塩酸の添加により3.0に調整した後、１時間攪拌し
た。遠心濾過の後、懸濁液をWhatman No.５４フィルタ
ーにより濾過した。濾液のpHを６Ｎの水酸化ナトリウム
の添加により7.04まで調整し、溶液１０ｍを0.2ミク
ロンのフィルターを用いて殺菌濾過した。
殺菌濾過した溶液を、スクロース（0.8ｇ／ｍ）で処
理してから１０時間６０℃に加熱して殺菌した。殺菌中
ゲル化は生じなかった。スクロースは、殺菌後、0.9％
サリンに対し透析により除去した。
殺菌されたアルブミンのSDS-PAGE分析は、未殺菌出発ア
ルブミンに対し得られたものと実質的に同じものであっ
た。
アルブミンの５％溶液を対照標準として、この例のはじ
めに記載したようにしてつくり、６０℃で加熱した：こ
の溶液は、加熱に先立ってスクロースにより処理しなか
った。アルブミンは、殺菌期間内にゲル化した。
例６ フィブリノゲンの殺菌 Cutter Laboratories,Inc.製のParenogen の１瓶を水
１００ｍで再構成した。再構成した瓶のフィブリノゲ
ン濃度は、Ｍ−Partigen フィブリノゲンプレート（Be
hring Diagnostics,American Hoechst Corp.,Somervill
e,New Jersey）を用いてラジアル免疫拡散（Radial imm
unodiffusion：ＲＩＤ）により測定され、1000mg／１０
０ｍであった。フィブリノゲン溶液のアリコットを、
0.07Ｍくえん酸ナトリウム中に希釈して、５４％スクロ
ース中で６０℃で殺菌した。結果を表５にまとめる。
これらのデータは、フィブリノゲンが、４００〜６００
ｍ（0.4〜0.6％）より小さな濃度で存在すると１０時
間６０℃で熱的に安定であることを示している。４００
〜６００mg／１００ｍの範囲では、溶液は、僅かに乳
白色となり、変性の開始を示す。ゲル化は、蛋白質変性
から直接生じた（これは、活性の実質的消失を伴う）。
例７ ＡＨＦの殺菌へのフィブリノゲン濃度の影響 KOATE AHFの４つの最終的な容器ロット（Ａ〜Ｄ）およ
び１個の工程中のロット（Ｅ）へ、（ここに「工程中ロ
ット（Ｅ）」は上記最終的な４個の容器ロット（Ａ〜
Ｄ）に続いてスクロースを加えた第５番目のサンプルで
あり、前記４個のロットと異り未だKOAE商標下に市販さ
れていないロットである）十分なスクロースを加えて約
５４〜５６％の濃度となるようにした。各ロットのフィ
ブリノゲン含量は、ＲＩＤおよび酢酸セルロース電気泳
動（ＣＡＥ）により測定した：ＲＩＤ法は、溶液中のフ
ィブリノゲンの量を与え、ＣＡＥ法は、蛋白質組成物中
のフィブリノゲンの量を与える。各ロットは、６０℃で
１０時間加熱した：結果を表６に示す。
例８ 肝炎減少手段としてのDNAポリメラーゼ不活性化 概説：肝炎Ｂビールス（ＨＢＶ）（血清肝炎の原因とな
る）は、直径４２ナノメータ（nm）を有し、外表面被覆
と２７mmの内部芯とからなる。独自なＤＮＡ−デイペン
デントＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ−dependent ＤＮ
Ａ polymerase）が、ビールスの芯と関係する。この酵
素は、固有の（endogenous）ＤＮＡ合成活性に関与する
と考えられる。Kaplanら｛J.Virology第１２巻第995〜1
005頁（1973年）｝は、ダン（Dane）粒子に富んだ配合
物中でこの酵素の存在を確認できた。さらに、ピークの
酵素活性は、HBsAgのペレットが、スクロース密度勾配
超遠心分離（sucrose density gradient ultracentrifu
gation）により分屑されたとき、ダン粒子または芯の存
在と関連すると思われることが示された。これらのダン
粒子は、肝炎Ｂビールスでの急性伝染に際し非常に高濃
度で通常見いだされる。Bradleyら｛Nature第251巻、第
３５６〜３５７頁（1974年）｝は、ＨＢＶでの接種後
で、HBsAgまたは臨床上の病気の出現前に、４匹中４匹
のチンパンジーの血清中にDNAポリメラーゼが現われる
のを見いだしている。
精製ダン粒子の伝染性は、徹底的にテストされてない
が、Robinsonら｛New England J.Med.第２９５巻第1232
〜1236頁（1976年）｝により、もしダン粒子が、ＨＢＶ
の伝染型であるとすると、血漿伝染性はHBsAg値よりＤ
ＮＡポリメラーゼ（DNAP）活性とよく関連すると予想さ
れると、提案されている。しかしながら、ダン粒子の伝
染性が、はっきりと証明されるまで、DNAP活性が別の無
生育性のビールスで証明され得ることが認められねばな
らない。
この例８で用いられる分析評価は、Robinsonらにより開
発された方法に手を加えたものである。４つのヌクレオ
チド、アデニントリオースフェート（ATP）、シトシン
トリホスフェート（CTP）、グアノシントリホスフェー
ト（GTP）およびチミジントリホスフェート（TTP）を、
ＤＮＡ合成手順において用いた。ヌクレオチドのうちの
２つ、dCTPおよびcGTPをトリチウムで放射性標識付をし
た（radiolabelled）。ＤＮＡ合成作用は、３７℃で３
時間行うようにした。酵素の活性に依存して、可変量の
放射性標識をＤＮＡに組込んだ。トリクロロ酢酸の沈澱
を適当に洗浄した後、サンプルをシンチレーション計数
計で計数した。
肝炎Ｂビールスの給源：ビールスは、次の手順によりHB
sAg陽性血漿（positive plasma）から精製した。前記の
血漿を溶解させ、６０分、４０℃6000rpmで遠心分離に
より澄ませた。次に、上澄み液を１６時間、４℃、5000
0×ｇで遠心分離してビールスを濃縮した。得られるペ
レットを、0.01Ｍトリス塩酸（Tris HCl）、0.001Ｍナ
トリウムエチレンジアミン四酢酸（Na2EDTA）、0.1Ｍ塩
化ナトリウム（NaCl）、0.1％（容量−容量）メルカプ
トエタノール、および0.1mg／ｍの牛血清アルブミン
（bovine serum albumin）（ＢＳＡ）を用いて初めの血
漿容積の２０％に懸濁させ、次に３０分、４℃、5000rp
mで澄ませて不溶性物質を除去した。
実験：前記のビールス配合物の約0.1ｍを、約５４％
のスクロース（添加スクロース0.8ｇ／ｍ）を含む５
％アルブミン0.9ｍへ加えた。混合物を６０℃で１０
時間加熱した。前記のようにして得たもう１つのサンプ
ルを、６４℃で１０時間加熱した。
前記のビールス配合物約0.1ｍを約５４％のスクロー
スを含有する５％イントラベナスＩＳＧ0.9ｍと混合
し、この混合物を６０℃で１０時間加熱した。これにつ
いて、同様にして得たイントラベナスＩＳＧサンプルを
用いて６４℃で１０時間、くり返した。
対照標準として、0.004Ｍカプリル酸ナトリウム（Ｓ
Ｃ）および0.004Ｍアセチル−Ｌ−トリプトファン（Ａ
Ｔ）に含むようにした５％アルブミン0.9ｍを、前記
で得たビールス0.1ｍと混合し、この混合物を６０℃
で１０時間加熱した。安定剤を含んだ前記の５％アルブ
ミンのもう１つの0.9ｍのサンプルを、ビールス配合
物0.1ｍと混合後、６４℃で１０時間加熱した。
前記の対照標準を６０℃および６４℃で１０時間熱する
と、志願人の接種で得られた結果で示されるように肝炎
ビールスを非伝染レベルまで不活性化させることが、前
記のGellisらにより示された。
用語“伝染性肝炎を実質的に含まない”とは、活性な肝
炎ビールスを非伝染レベルまでしか含んでいないことを
意味する。結果を表７にまとめる。
データは、６４℃で１０時間の加熱が、全てのサンプル
についてDNAPの不活性化のほぼ同じレベルを生じ、６０
℃で１０時間の加熱が、対照標準およびイントラベナス
ＩＳＧサンプルでDNAP不活性化の同じレベルを生ずるこ
とを示している。結果として、本発明の方法に従って６
４℃で１０時間殺菌したサンプルのDNAP不活性化が、前
記のように殺菌されたとき非肝炎伝染性であるとして公
知の対照標準サンプルとほぼ同じなので、本発明のサン
プルも、非肝炎伝染性であると考えられよう。
例９ プレカリクレインの殺菌 プレカリクレインを次のようにして準備した：人間の血
漿を、pH8.0で0.05Ｍトリス0.2％Polybrene 溶液に対
しより低いイオン強度まで透析した。透析した血漿を、
次に、DEAE Sephadex Ａ５０コラムにかけ、分屑し
た。活性プレカリクレインピークをプールして、Concan
avalin A-Sepharose と接触させた。Concanvalin A-Se
pharoseを洗い、プレカクレインを、0.5Ｍのα−メチル
−マントサイドで溶離させた。プレカリクレインに富ん
だ溶液（0.5mg蛋白質／ｍ）を透析してから、殺菌濾
過した。５ｍのプレカリクレインをスクロース（0.8
ｇ／ｍ）と混合してから６０℃で１０時間熱した。プ
レカリクレインの回復は、これを過剰のプレカリクレイ
ン活性剤（ＰＫＡまたは第XIIの因子）の使用でカリク
レインまでまず活性化させることにより測定した。得ら
れるカリクレインが、ベンゾイルアルギニンエチルエス
テル（BAEE）の標準量を分解させるために使われた。分
解の程度は、分光光度法により２５３ナノメーター（n
m）で測定した。プレカリクレイン活性の回復は、８５
％であった。
標準対照として、スクロースなしのプレカリクレイン溶
液１ｍを６０℃に熱した。全活性が、３時間内に消失
した：沈澱は視覚的にとらえられなかった。
例１０ フィブロネクチンの殺菌 フィブロネクチンを、ゼラチン−Sepharose 親和性媒
体法によるEngvallらに示された方法｛Int.J.Cancer第
２０巻、第２頁（1977年）｝によりつくった。フィブロ
ネクチンは、４Ｍ尿素で洗浄することにより親和性媒体
から溶離させた。
尿素を除くために、フイブロネクチン−尿素溶出液を、
呼称残率（nominal retation）10000分子量のAmicon
中空繊維半透膜カートリッジを用い１０％スクロース
（0.1ｇ／ｍ）の中のBufferＡに対しダイアフィルタ
ーした。
リテンテイト（retentate）を、未還元および還元ナト
リウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）ポリアクリルア
ミドゲルへのゲル電気泳動によりフイブロネクチン含量
について分析した。フイブロネクチンバンドはゲルにつ
いて見える、９０％より多い蛋白質に対するものであ
る。未還元SDSポリアクリルアミドゲルのフイブロネク
チンの分子量は、400000〜500000だった：報告された分
子量は、Yamadaらにより（Nature、1978年、第275巻、
第１７９頁）450000〜500000である。還元ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルのフイブロネクチンの分子量は、2500
00〜270000であった；報告された値は前記のYamadaらに
より210000〜250000である。
フイブロネクチンは、そのアミノ酸によりさらに確認さ
れ、これは、Yamadaらにより報告されたもの（Biochemi
stry 1977年、第5552頁）と一致した。
前記で得た精製フイブロネクチンに対する抗体をつく
り、これは、市場で入手できるフイブロネクチン（Coll
aboration Research,Inc.,Waltham Massachusetts）と
交叉反応した。免疫拡散（immunodiffusion）の検討で
は、前記で得たフイブロネクチンは、両サンプルが前記
の抗体に対し交叉反応させられるとき市販のフイブロネ
クチンと同一であることを示した。
前記で得たフイブロネクチンは、ステインドＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルにより測定されるように９５％より
も純粋であることが例証された。
実験Ａ．リテンテイト（3,6,1）を追加のスクロースと
混合してスクロースの最終濃度が５７％（0.81ｇ／ｍ
）となるようにした。この混合物を、６０℃で１０時
間加熱して殺菌し、次に冷却してから、Amicon カート
リッジを用い前記のようにBufferＡ（複数容積の交換）
に対しダイアフィルターしてスクロースを除去した。次
に、溶液を、BufferＡ（0.05Ｍ Na3PO4緩衝液（pH7.
6）および0.1Ｍ NaCl）へ殺菌濾過した。
殺菌されたフイブロネクチンの活性（実験Ａ）は、次の
分析評価により測定した。
Molnarらにより記載されたラット肝スライス分析評価
（Rat Liver-Slice Assay）｛Biochemistry第１８巻、
第3909頁（1979）｝。この分析評価を、添加フイブロネ
クチン１２〜１６μｇ、ヘパリン１０ユニット、１２５
Iで標識付けしたゼラチン被覆ラテックス粒子（各ガラ
ス瓶へ10000cpm添加）、最終容積1.2ｍまでのクレブ
ス−リンゲル緩衝液、新鮮なラット肝のスライス100〜1
50mgを用いてシンチレーション瓶を用いて行なった。こ
の混合物を、振盪させながら３０〜３７℃で３０分間培
養した。標識付けしたゼラチンラテックスの摂取量は、
天然のフイブロネクチンおよびスクロース殺菌フイブロ
ネクチンにより１０倍まで増加されたが、スクロースの
不在下で３０分以上、６０℃で加熱されたフイブロネク
チンでは増加されなかった。
Checkらにより記載された凝集反応分析評価（Agglutina
tion Assay）｛J.Reticnloendothelial Soc.第２５巻、
第３５１〜３６２頁（1979年）｝。この分析評価は、肝
スライス分析評価と同様にして行なった。フイブロネク
チン（２〜３１μｇ、場合により６００μｇ）を、ヘパ
リン１０ユニット、標識付けしてないゼラチン被覆ラテ
ックス0.6％溶液３００μおよび最終容積1.2ｍまで
のクレブス−リンゲル緩衝液を含むガラス瓶へ加えた。
ガラス瓶は、３０〜３７℃で３０分間振盪させた。凝集
反応は、ミルク様溶液から、凝集粒子を伴う透明な溶液
への移行をみることにより視覚的に記録した。活性は、
凝集が起こり、スクロース殺菌フイブロネクチンが添加
フイブロネクチン８〜２３μｇ／ガラス瓶でのゼラチン
−ラテックス粒子の可視凝集を起こすフイブロネクチン
の最低限添加量として表わす。スクロースの不在下で６
０℃で３０分以上加熱されたフイブロネクチンを、５７
０μｇより多い量でガラス瓶１本当りに加えたら活性の
大きな消失を示す凝集がみられた。
実験Ｂ．以下の追加分を加えて実験Ａと同様とした：ス
クロースとの混合後のリテンテイトをアルギニンと一緒
にしてアルギニンの最終濃度0.5モル濃度とするように
した。
実験Ｃ．スクロースをリテンテイトに加えずに実験Ｂと
同様とした。（本発明には従わない）。
実験Ｄ．アルギニンの代りに0.5モル濃度のリシンを用
い実験Ｃと同様とした（本発明に従わない）。
実験Ｅ．対照標準として、リテンテイト（3.61.）を、
６０℃で１０時間加熱し、次に冷却後ダイアフィルター
し、次に実験Ａに示したように殺菌濾過した。
実験Ｆ．対照標準として、リテンテイト（3.61.）を、
実験Ａのように５７％の濃度までスクロースを用いてつ
くり、５℃で１０時間保持した。このサンプルは、加熱
しなかった。
実験Ｂ〜Ｅのサンプルを、前記の分析評価により分析し
た。実験Ａ〜Ｅの結果を次表にまとめた。
殺菌されたフイブロネクチンの状態は、２つの追加の分
析評価により評価した。
ポリアクリルアミドゲルへの非変性緩衝剤の電気泳動
｛Peacock、A.C.らSience１４７、1451（1965年）｝フイ
ブロネクチンのサンプルを、緩衝剤Ａ中で６０℃に加熱
し、前記の手順で調べた。６０℃で、１２分後、汚染ゲ
ルにパターンのはっきりした変化が明確となり、凝集と
蛋白質のアンフォールディング（unfolding）を示し
た。対照的に、５７％スクロースで１０時間前記のよう
に殺菌されたフイブロネクチンは、未加熱のフイブロネ
クチンの場合のように単一バンドだけを示した。両サン
プルの相対的移動度は同じであった。これらの結果は、
フイブロネクチンが、スクロース中での殺菌中、凝集を
起こさず他の構造変化を示すことを如実に語っている。
定量的マイクロ補体結合の方法による免疫学的テスト
（Arnheimら、１９６７J.Biol.Chem.第242巻第3951
頁）。フイブロネクチンの各サンプルに対し、特定の抗
血清による反応曲線を測定した。反応試験管は、希釈し
た抗血清0.5ｍ、アンチゲン（antigen）0.5ｍ（フ
イブロネクチン３〜1000ng）、およびてんじくねずみの
補体0.5ｍを含むようにした。フイブロネクチンに対
する抗血清を１：6000に希釈した。マイクロ補体結合テ
ストの結果は、未加熱の精製フイブロネクチンの反応性
の百分率として表わした。
５４％スクロース中で１０時間６０℃で殺菌したフイブ
ロネクチンは、未加熱のフイブロネクチンよりも７〜１
２％弱い抗血清との反応を示した。この感度テストに対
し交叉反応性の変化は、ほとんどまたは全く示唆的でな
い。たとえば、未加熱フイブロネクチンを、人間の血清
（自然のフイブロネクチンを含んでいる）と比較する
と、１７〜３０％の変化がみられる。他の蛋白質系で
は、この大きさの変化は、単一のアミノ酸置換により異
なる対をなす蛋白質間にみられる（Reichlin,J.Mol.Bio
l.第６４巻、第４８５頁、1972年）か、または立体配座
でほんの僅か異なる対をなす蛋白質間にみられる（Prag
erら、Immunochemistry第３巻、第８３１頁、1974
年）。これらの結果は、フイブロネクチンの構造が、ス
クロース殺菌により実質的に変化させられなかったこと
を例示する。
例１１ 溶出液II＋IIIの殺菌 溶出液II＋IIIは、Cohnのアルコール分屑法により得た
（前記のJournal of the American Chemical Societyお
よび米国特許第2,390,074号）。溶出液は、使用するま
で−８０℃に保存した。
溶出液II＋IIIのサンプル（９３０ｇ）を、5.0kgのWFＩ
に対しダイアフィルターし、リテンテイトが４２０ｇに
なるまで限外濾過を行い、リテンテイトのpH（6.39）
を、４Ｎの水酸化ナトリウムの添加により6.87とした。
塩化ナトリウム3.4ｇをダイヤフィルター済サンプル４
００ｍへ加え、これを殺菌濾過した。
このようにして得た溶出液II＋III１００ｍをスクロ
ース８０ｇに加えた。この混合物を６０℃で１６時間加
熱して殺菌した。殺菌したサンプルをＣＡＥにより分析
したところ、４つのピーク、アルブミン純度79.6％を示
した。対照標準として、加熱してない溶出液II＋IIIへ
ＣＡＥを適用した：分析結果は、４つのピーク、アルブ
ミン純度83.9％を示した。結果は、溶出液II＋IIIの活
性の実質的部分が殺菌過程中に保持されたことを示して
いる。
殺菌したサンプルを、0.85％塩化ナトリウム（１：４０
０v/v）に対し透析し33.0のＡ280（初期Ａ280）まで濃
縮した。このサンプルを殺菌濾過してから−４０℃で凍
結させた。
例１２ 抗血友病因子の殺菌 KOATE 抗血友病因子の３つのロット（ロットＡ，Ｂ，
Ｃ）からそれぞれ２本のガラス瓶が、各注射用蒸留水
（WFＩ）１０ｍとして再構成された（約２０mgの蛋白
質／ｍ）。このガラス瓶をプールして、スクロース0.
8ｇ／ｍ（５４％）または1.2ｇ／ｍ（７０％）で処
理した。不溶性物質は遠心濾過により除去した。次にこ
の混合物を、10時間６０℃に熱して殺菌した。
対照標準として、再構成した抗血友病因子を、0.8ｇ／
ｍまたは1.2ｇ／ｍでスクロースにより処理した。
対照標準および前記の殺菌されたサンプルを、例１の方
法に従って分析評価した。結果を、表９に示す。
例１３ 抗血友病因子の安定性への炭水化物濃度の影響 ＡＨＦ溶液は、Mozenの変形方法（Rev.Hematol.第１
巻、第１３５〜１６０頁、1980年）によりつくった。
前記のＡＨＦ溶液を、注射用蒸留水で10.0のＡ280まで
希釈し、各アリコットに分けた。このアリコットへ、出
発溶液１ｍ当り、スクロース1.2ｇと1.5ｇとをそれぞ
れ加えた。これらのアリコットを、１０時間、６０℃に
加熱した。対照標準のアリコットをこの間５℃に保持し
た。対照標準および殺菌したサンプルを、例１に記載の
手順に従いスクロースの存在下で分析した。結果を表１
０にまとめる。
前記のようにして得たもう１つのＡＨＦ溶液を、注射用
蒸留水で希釈し25.0のＡ280とし、次にアリコットに分
けた。いくつかのアリコットのpHを水酸化ナトリウムま
たは塩酸により調整して表１０Ａに示す値とした。他の
アリコットをリシン中に0.32Ｍ含むようにした。リシン
の添加後、pHを表の値に再調整し、出発溶液１ｍ当り
スクロース1.2ｇをそれぞれへ加えた。全てのアリコッ
トを前記のように加熱し、例１に示す手順によりそれぞ
れの対照標準と比較した。
これらのデータは、リシン有りまたはリシンなしのこの
殺菌での最適pHが、約6.5〜7.0、好ましくは約6.55の範
囲にあることを示している。
例１４ フイブリノゲンの殺菌 Darenogen フイブリノゲンの１瓶を、水で再構成し
て、それぞれ8.7％および1.0％の蛋白質濃度（フイブリ
ノゲン含有量９０％以上）を有する２つのロット（Ｈお
よびＪ）をつくった。各ロットを、0.8ｇ／ｍ（５４
％）および1.6ｇ／ｍ（８０％）でスクロースと混合
してから１０時間６０℃で加熱して殺菌した。
これらのデータは、フイブリノゲンが、スクロース1.6
ｇ／ｍにより処理されたとき、６０℃で１０時間、熱
的に安定であることを示している。したがって、前記の
例６に示された教示またはこの例に示された教示に従い
フイブリノゲンを殺菌するのに選択可能である：すなわ
ち、１００ｍ当り４００〜６００mgより多いフイブリ
ノゲンを含有するフイブリノゲン溶液が、殺菌すべきサ
ンプル中のスクロースの濃度を好ましくは1.6ｇ／ｍ
またはそれ以上のレベルに増加させることにより、活性
の実質的な消失を伴わずに好首尾をもって殺菌され得
る。室温（２０℃）で、飽和スクロースの溶液は、重量
−容積で2.1ｇ／ｍ（９２％）を含む。
【図面の簡単な説明】
第１図は、スクロースの存在下での殺菌後の蛋白光の百
分率変化、変性免疫性血清グロブリンの濃度およびスク
ロース濃度の間の関係を示す三次元図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・エル・ランドブラツド アメリカ合衆国カリフオルニア州エル・セ リト・クラブ・ヴユ−・コ−ト1390 (56)参考文献 特開 昭53−59018（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−25020（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−95715（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−145615（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−77527（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−118819（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−118820（ＪＰ，Ａ)

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】抗血友病性因子（第VIII因子）、フィブロ
    ネクチン、プラズミノジエン、アルブミン、変性免疫性
    血清グロブリン、フィブリノゲン、およびプレカリクレ
    インからなる群から選択された感温性でありかつ治療上
    活性な蛋白質を含有する組成物の熱処理方法において、 (a)前記蛋白質組成物にスクロースを水性媒質中で混合
    し、この混合物中の前記スクロースの存在量は約３０％
    W/Vないし飽和量であり、 (b)この混合物をpH約５．５〜８．０において約６０〜
    ７５℃の温度に加熱し、しかしてこの加熱は、この蛋白
    質組成物が殺菌され、かつ、この蛋白質組成物が伝染性
    肝炎源を実質的に含まなくなるまでの充分な時間にわた
    って行うことを特徴とする蛋白質組成物の熱処理方法。
  2. 【請求項２】混合物が、段階(b)で温度約６２〜６５℃
    に加熱される特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】混合物が約１０時間加熱される特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】段階(b)の混合物からスクロースを除去す
    る段階をさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】段階(b)の混合物にダイアフィルトレーシ
    ョンまたは透析を行って、段階(b)の混合物からスクロ
    ースを除去する特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】段階(b)の混合物から水を除去する段階を
    さらに含む特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】段階(b)の混合物に限外濾過または凍結乾
    燥操作を行うことによって該混合物から水を除去する特
    許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】約１〜１０００部のスクロースを１部の全
    蛋白質と混合する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  9. 【請求項９】蛋白質組成物が抗血友病性因子の濃厚物で
    ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】約１〜１０００部のスクロースを１部の
    全蛋白質と混合する特許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】スクロースの水性媒質中溶液約１〜５０
    ０部を濃厚物１部と混合する特許請求の範囲第９項記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】段階(b)の混合物を約６２〜６５℃の温
    度に加熱する特許請求の範囲第９項記載の方法。
  13. 【請求項１３】混合物を約１０時間加熱する特許請求の
    範囲第９項記載の方法。
  14. 【請求項１４】段階(b)の混合物からスクロースを除去
    する段階をさらに含む特許請求の範囲第９項記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】段階(b)の混合物にダイアフイルトレー
    ションまたは透析を行って、段階(b)の混合物からスク
    ロースを除去する特許請求の範囲第１４項記載の方法。
  16. 【請求項１６】段階(b)の混合物から水を除去する段階
    をさらに含む特許請求の範囲第１４項記載の方法。
  17. 【請求項１７】段階(b)の混合物に限外濾過または凍結
    乾燥操作を行って該混合物から水を除去する特許請求の
    範囲第１６項記載の方法。
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