JPH04501503A - 血小板特異的キメラ免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板特異的キメラ免疫グロブリン 発明の背景 血小板凝集は血液凝塊の形成に必須の事象である。普通の情況下では、血液凝塊 は、血管系から血液細胞が逃げるのを防止する作用をする。しかしながら、成る 種の疾患状態（例えば心筋硬塞）の間、凝塊は血流を制限するか又は全く閉塞し て、細胞の壊死をもたらす。

心臓発作の患者は、典型的には、凝塊のフィブリン成分を溶解する組織プラスミ ノーゲン活性化因子又はストレプトキナーゼのような血栓溶解剤で処理される。

フィブリン溶解と関連した主要な合併症は、血小板凝集に基づく再閉塞であり、 これは更に心臓の損傷をもたらす。糖タンパク質（ｇｐ）　ｎ　ｂ、、’　ｍ　 ａ受容体は、血小板凝集の原因であることが知られているので、これらの受容体 をブロックする試薬は血栓溶解に続（再硬塞を減少させるか又は防止しそして血 栓溶解の速度を促進すると予想される。

血小板凝集を阻止するための１つの方法は、ｇｐＩｌｂ／ｎＩａ受容体に対して 特異的なモノクローナル抗体が関与する。血小板凝集を抑制しそしてヒト血栓症 の処置に有用であると思われる７Ｅ３と名付けられたネズミモノクローナル抗体 は、公開されたヨーロッパ特許出願第２０５．２７０号及び第２０６，５３２号 に記載されている。ネズミ抗体は、ヒトの治療に使用する際には厳しい制限があ ることは当業界では知られている。

外来タンパク質として、ネズミ抗体は、その治療効果を減少又は破壊する及び／ 又は患者にアレルギー反応又は過敏症反応を誘発する免疫反応を引き起こすこと がある。血栓塞栓症におけるこのような治療モダリティの再投与の必要は、これ らのタイプの免疫反応の可能性を増加させる。

ヒト不変領域に結合した非ヒト結合領域から成るキメラ抗体は、ネズミ抗体の免 疫反応の問題を阻止する手段として示唆された。ＰＮＡＳ。

８１：６８５１（１９８４）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ８５００３９２参照。

不変領域は抗体分子の免疫反応性を大きく担っているので、ヒト起源の不変領域 を有するキメラ抗体は、ヒトにおいて抗ネズミ応答を誘発する可能性がより少な いであろう。しかしながら、所望の特異性のネズミ結合領域へのヒト不変領域の 連結が免疫反応性を減少させ及び／又は得られるキメラ抗体の結合能力を変える かどうかは予想できない。

本発明の要約 本発明は、特異的な非ヒト起源の可変領域又は抗原結合領域及びヒト起源の不変 領域を含む血小板特異的キメラ免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリン は、ｇｐＩＩｂ／Ｈａ受容体又は他の血小板成分に対して特異的であることがで きる。これらの抗体は、血小板に結合しそして血小板凝集を阻止することができ 、か（して抗血栓症剤として有用でありそして血栓溶解に続く再閉塞を防止又は 減少させるのに有用である。

第１図は、プローブとしてクローン化された可変領域を使用する７Ｅ３モノクロ ーナル抗体のためのＨ鎖及びＬＭｍＲＮＡ’　ｓのノザーン分析を示す。

第２図は、それぞれ、キメラ７Ｅ３免疫グロブリンのＬ鎖及びＨ鎖のキメラ遺伝 子構築物を有するプラスミドｐ７Ｅ３Ｖ＋ｈｃ、及びｐ７Ｅ３ＶＨｈＣ６４の略 図である。

第３図は、血小板に対するキメラ７Ｅ３免疫グロブリンの結合を示す。

第４図は、キメラ７Ｅ３免疫グロブリンによる血小板凝集の抑制を示す。

本発明の詳細な説明 本発明のキメラ免疫グロブリンは、個々のキメラＨ免疫グロブリン鎖及びＬ免疫 グロブリン鎖を含んで成る。キメラＨ鎮は、ヒトＨ鎖不変領域に連結されたｇｐ ＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ受容体に対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の抗原結合領域 を含んで成る。キメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖不変領域に連結された非ヒト抗体のＬ鎖 由来の抗原結合領域を含んで成る。

本発明の免疫グロブリンは、−価、二価又は多価であることができる。

−価免疫グロブリンは、ジスルフィド橋を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ 鎖から形成された二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブリンは、少なくとも１ つのジスルフィド橋を介して結合した２つの二量体から形成された四量体（Ｈ２ Ｌ２）である。多価免疫グロブリンは、例えば、凝集するＨ鎖不変領域（例えば ＩｇＭＨ鎖）を使用することにより製造することもできる。Ｆａｂ、　Ｆａｂ’ 又はＦ（ａｂ’　）２のようなキメラ免疫グロブリン断片も製造することができ る。

キメラ免疫グロブリンの非ヒト抗原結合領域は、血小板に対して特異的な免疫グ ロブリン由来のものである。好ましい免疫グロブリンは、血小板ｇｐＩＩｂ／Ｉ Ｉ［ａ受容体に対して特異的でありそして糖タンパク質ｇｐＩｒｂ／ｍａ受容体 複合体に結合するリガンドをブロックする。適当な抗体の例には７Ｅ３及び１０ Ｅ５が含まれる。ヨーロッパ特許出願第２０５゜２７０号及び第２０６，５３２ 号参照。これらの教示は本明細書に加入する。７Ｅ３抗体（又はそれと反応性の 抗体又は機能的に均等なエピトープ）は、ｇｐＩｌｂ／ｎＩａ受容体の複合化形 態に対して特異的であるので、特に好ましい。ｎｂ又はｍａ酸成分いずれかに対 して特異的な他の抗体も使用することができる。他の血小板抗原に対して特異的 な抗体を使用することができる。例えば、血小板と反応性の抗体である、Ｓｉ２ 抗体〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅ＠）、旦旦旦：９７９９−９８０４（１９８４）］のような顆粒膜タンパク質 ＧＭＰ−１４０を使用することができる。

好ましくは、抗原結合領域はネズミ起源である。その理由は、血小板に対する、 特にｇｐＩＩｂ／ＩＩ［ａ受容体に対するネズミ抗体は入手可能であるか又はネ ズミ系で生産することができるからである。他の動物又は翳歯種は抗原結合領域 の別のソースを提供する。

キメラ抗体の不変領域は、ヒト免疫グロブリン由来のものである。Ｈ鎖不変領域 は、５つのアイソタイプα、δ、ε、γ又はｍｕのいずれかから選ぶことができ る。更に、種々のサブクラスのＨ鎖（Ｈ鎖のＩｇＧサブクラスの如き）は異なる エフェクター機能を受け持ち、かくして所望のＨ鎖不変領域を選ぶことにより、 所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体を生産することができる。好ましい 不変領域は、γ１（ＩｇＧ１）、γ３（ＩｇＧ３）及びγ４（１ｇＧ４）である 。Ｌ鎖不変領域はに又はλタイプであることができる。

一般に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリンのＬ鎮及びＨ鎖成分の各々のため に、ヒト不変領域の少なくとも一部をコード化している第２ＤＮＡセグメントに 連結された非ヒト起源の血小板特異的可変領域の少なくとも機能的部分（例えば 、連結セグメントを伴う機能的に再配列された可変領域）をコード化している第 １ＤＮＡセグメントを含んで成る融合遺伝子を製造することにより生産される。

各融合した遺伝子は、発現ベクター中に組み込まれるか又は挿入される。受容細 胞は、遺伝子生産物を発現することができる受容細胞を、次いで上記遺伝子でト ランスフェクションする。トランスフェクションされた受容細胞を導入された遺 伝子の発現を可能とする条件下に培養し、そして発現された免疫グロブリンまた は免疫グロブリン鎖を回収する。

ＩｇＬ鎮及びＨ鎖の可変領域をコード化している遺伝子は、血小板特異的抗体を 生産するリンパ球から得ることができる。例えば、ｇｐＩＩｂ／ｍａ受容体に対 する抗体を生産するハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ抗体の免疫グロブ リン可変領域のソースを提供する。他の薩歯動物細胞系が入手可能である。細胞 系は、醤歯動物をヒト血小板又はｇｐｎｂ／Ｉｎａ受容体含有成分又は血小板の 画分てチャレンジし、抗体生産細胞とミエローマ細胞系との融合したハイブリッ ド細胞を形成し、このハイブリッドをクローニングしそして、血小板又は糖タン パク質ｇｐＩＩｂ／Ｈａ受容体に対する抗体を生産するクローンを選択すること により製造することができる。

不変領域は、標準クローン技術によりヒト抗体生産細胞から得ることができる。

別法として、２つのクラスのＬ鎖及び５つのクラスのＨ鎖を表現する遺伝子がク ローニングされているので、ヒト起源の不変領域はこれらのクローンから容易に 入手可能である。Ｆ（ａｂ’　）ｚ及びＦａｂ断片のようなキメラ抗体結合断片 は、截頭形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）にキメラＨ鎖遺伝子をデザイン することにより製造することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’　）２Ｈ鎖部分をコ ード化しているキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ，ドメイン及びヒンジ領域をコード 化しているＤＮＡ配列を含むであろう。

好ましくは、Ｌ及びＨキメラ鎖（又はその一部）をコード化している融合した遺 伝子は、受容細胞をコトランスフエクションするのに使用することができる２つ の異なる発現ベクター中に組み込まれる。各ベクターは２つの選択可能な遺伝子 、−一１つはバクテリア系における選択のため、１つは真核細胞系における選択 のため、−一を含み、各ベクターは異なる遺伝子の対を有している。これらのベ クターはバクテリア系における融合遺伝子の生産及び増幅、及び真核細胞のその 後のコトランスフエクション及びコトランスフエクションされた細胞の選択を可 能とする。

バクテリア系のための選択可能な遺伝子の例は、アンピシリン耐性を付与する遺 伝子及びクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子である。

真核細胞トランスフェクシントの選択のための２つの選択可能な遺伝子、（ｉ） キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇの、プリン ヌクレオチド合成のための基質としてキサンチンを使用する能力に基づいており 、類似の内在酵素は選択できない。イノシンモノホスフェートのキサンチンモノ ホスフェートへの転換を阻止する、キサンそのクラスの他の抗生物質により引き 起こされる真核細胞知勇でのタンパク質合成の抑制を阻止する。２つの選択方法 を同時に又は順次に使用して、真核細胞中に２つの異なるＤＮＡベクター上に導 入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現について選択することができる。

好ましい受容細胞系はミエローマ細胞である。ミエローマ細胞は、トランスフエ クションされた１ｇ遺伝子によりコード化された免疫グロブリンを、合成し、組 立てそして分泌することができる。更に、それらは免疫グロブリンのグリコジル 化の機構を有する。特に好ましい受容細胞はＩｇ非生産性ミエローマ細胞５ｐ２ １０である。この細胞は、トランスフェクションされた免疫グロブリン遺伝子に よりコード化された免疫グロブリンのみを生産する。ミエローマ細胞は培養物中 で又はマウスの腹膜内で増殖することができ、そこで分泌された免疫グロブリン を腹水から得ることができる。８９２６球又はハイブリドーマ細胞の如き池のリ ンパ球は、適当な受容細胞として働くことができる。

免疫グロブリンコード化遺伝子を含むベクターでリンパ球をトランスフェクショ ンするいくつかの方法がある。リンパ球にＤＮＡを導入する好ましい方法は、エ レクトロポレーションによる。この方法では、受容細胞は、導入されるべきＤＮ Ａの存在下に電気パルスにさらされる。例えば、ボッター等、ＰＮＡＳ　８１ニ ア１６１（１９８４）参照。ＤＮＡを導入する他の方法は原形質体（ｐｒｏｔｏ ｐｌａｓｔ）融合による。この方法では、リゾチームを使用して、キメ５１ｇ遺 伝子を含む組換えプラスミドを収容するバクテリアから細胞壁をはがす。得られ る原形質体をポリエチレングリコールによりミエローマ細胞と融合させる。原形 質体融合の後、トランスフェクシントを選びそして単離する。多くのタイプの細 胞にＤＮＡを導入するのに使用することができる他の方法はリン酸カルシウム沈 てんである。

キメラ免疫グロブリン遺伝子は、バクテリア又は酵母のような非リンパ球で発現 させることができる。バクテリアで発現される場合には、免疫グロブリンＨ鎖及 びＬ鎖は封入体の一部となる。かくして、鎖は、単離され、精製され、次いで機 能化免疫グロブリン分子に組み立てられなければならない。

本発明のキメラ血小板特異的抗体は、抗血栓症治療剤として有用である。キメラ 抗体（又はその断片）を使用して、血小板凝集及び血栓形成を抑制することがで きる。この抗体は、血栓形成又は再形成を防止すべきいかなる情況においても使 用することができる。例えば、この抗体は、血管形成後の処理、肺塞栓症、深静 脈血栓症及び冠状バイパス手術における凝塊を防止するするのに単独で使用する ことができる。この抗体は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又 はストレプトキナーゼのような血栓溶解剤と共に投与して、血栓溶解後に起こり うる再閉塞を防止又は減少させモして凝塊溶解を促進させることができる。抗体 又は断片は、再閉塞を生じつる血小板凝集を防止するのに十分な量で、血栓溶解 剤の投与の前、投与と共に又は投与の後に投与することができる。

抗体は、無菌食塩水の如き製薬学的に許容しうるビヒクル中で、非経口的に、好 ましくは静脈内に与えられる。抗体は、多数回投与するか又は制御された放出機 構（例えばポリマー又はパッチ投与系により）により与えることができる。

抗血小板抗体による繰り返し治療中に、薬剤誘発の血小板血症が起こることがあ り、これは、身体が、抗体被覆血小板を、それらに対して抗体を生じる外来タン パク質として認識し、次いでそれらを普通よりは迅速に除去する結果であるかも 知れない。キメラ抗血小板（例えばｇｐ　ＩＩ　ｂ／ｍａ）抗体の使用は、この 問題を回避することができる。キメラ抗体のネズミ成分の大部分は血小板（例え ばｇｐｎｂ／■ａ受容体）に結合され、か（して、キメラ抗体を、同じエピトー プ指向性ヒト抗体から機能的に識別可能とする免疫系に受け入れられず、故に非 免疫原性であると予想される。

本発明の血小板特異的キメラ免疫原性グロブリンは、血栓像形成にも有用である 。この目的で、抗体断片が一般に好ましい。上記のように、キメラＨ鎖遺伝子は 、トランケーテッド形態でデザインされて、免疫原性シンチグラフィーの像形成 のためのキメラ免疫原性グロブリン断片（例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’又はＦ（ａ ｂ’　）ｚ）を生成することができる。これらの分子は、直接又はＤＴＰＡの如 きカップリングしたキレート化剤を介して、宜３１ヨウ素、！２ｓヨウ素、９９ １″テクネチウム又はＩＩ＋インジウムのような放射性同位元素により標識して 、放射免疫原性シンチグラフィー剤を生成することができる。別法として、放射 金属結合（キレート化）ドメインを、キレート化抗体部位中に工学的につくって 標識部位を得ることができる。

かくして、キレート化免疫原性グロブリンは、非ヒト血小板特異的可変領域、ヒ ト不変領域（好ましくはトランケージコンされた）及びメタロチオニンの如き金 属結合タンパク質由来の金属結合ドメインを有するタンパク質としてデザインす ることができる。

血小板特異的キレート化免疫原性グロブリンは、血栓を有する疑いのある患者に 投与される。標識された免疫原性グロブリンを血栓部位に局在させるのに十分な 時間の後、標識のにより発生した信号をγカメラの如きフォトスキャン装置によ り検出される。検出された信号は、次いで血栓の像に転換される。この像は、生 体内で血栓を突き止めそして適当な治療方法を案出することととを可能とする。

本発明を、更に下記の実施例により説明する。特記しない限り、すべての部及び 百分率は重量によるものであり、度は摂氏である。

説明 実施例１　キメラ血小板特異的１ｇＧ４の生産Ａ・一般的方法 ７Ｅ３ハイブリドーマからのＨ鎖及びＬ鎖遺伝子のための可変領域をクローニン グする方法は、機能的に配列された（そして発現された）１ｇ遺伝子のための可 変領域と対応するＪ（連結）領域とのゲノムにおける連結に基づいた。Ｊ領域Ｄ ＮＡプローブを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングして、Ｊ領域に連 結されたＤＮＡを単離することができる。生殖系列配置（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｃ ｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎＸ再配列されていない）中のＤＮＡも又Ｊプローブに ハイブリダイゼーションするが、可変領域配列には連結されず、そして単離され たクローンの制限酵素分析により同定することができる。

故に、このクローニング方法は、ＪＨ及びＪＫプローブを使用して再配列された Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子から可変領域を単離することであった。これらのクローンを 、それらの配列が７Ｅ３ハイブリドーマ中で発現されたかどうかを決定するため にノザーン分析により試験した。発現された配列を含んだこれらのクローンは、 ヒト不変領域を含む発現ベクターに入れそしてマウスミエローマ細胞にトランス フェクションして、抗体が生産されたかどうかを決定した。次いで生産性細胞か らの抗体を７Ｅ３ネズミ抗体と比較して、結合特異性及び機能性について試験し た。

７Ｅ３ハイブリドーマからＨ鎖可変領域遺伝子を単離するために、ファージスベ クターｇｔｌＯを使用してサイズ選択ゲノムライブラリーを構築した。ＪＨプロ ーブを使用するＥｃｏＲＩ消化７Ｅ３ＤＮＡのサザーン分析は、再配列されたＨ 鎖位置に相当する単一３．　５ｋｂバンドを示した。

この断片は、７　Ｅ　３　Ｈ鎖可変領域遺伝子を含んでいるようであった。高分 子量ＤＮＡを７Ｅ３ハイブリドーマ細胞から単離し、そして制限エンドヌクレア ーゼＥｃｏＲＩで完全に消化した。次いでＤＮＡを０．７％アガロースゲルで分 別し、３−４ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡをゲルから直接単離した。フェノール／ クロロホルム抽出及びセファデックスＧ−５０ゲル濾過の後、３−４ｋｂ断片を λＧＴＩＯアーム（プロメガ・バイオチック・インコーホレーテッド）と連結し そしてプロメガ・バイオチックからのパッケージェネを使用して生体外でファー ジ粒子中にパッケージした。このライブラリーを、３Ｚｐ標識Ｊ　１１プローブ を使用して約３０，０００プラ一ク／１５０ｍｍペトリ皿の密度で直接スクリー ニングした。プラークハイブリダイゼーションは、５ｘＳＳＣ，５０％ホルムア ミド、２×デンハートの試薬、２００１ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃ で１８−２０時間行った。最終洗浄は、０．５ＸＳＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳ中で６ ５℃で行った。正のクローンをオートラジオグラフィーの後同定した。

Ｌ鎖ゲノムライブラリー構築 ７Ｅ３Ｌ鎖の可変領域遺伝子を単離するために、ゲノムライブラリーをλベクタ ーＥＭＢＬ−３中に構築した。高分子量ＤＮ、Ａを制限エンドヌクレアーゼ３ａ ｕ３Ａで部分的に消化しモして１０−４０％スクロース密度勾配でサイズ分別し た。１８−２３ｋｂのＤＮＡ断片をＥＭＢＬ−３アームと連結しそしてパッケー ジエネを使用して生体外でファージ粒子中にパッケージした。このライブラリー を、Ｊ、プローブを使用して３ｏ、ｏｏｏプラーク／１５０＋ａｍプレートの密 度でスクリーニングした。

ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＨ鎖うイブラリーで使用したのと同じで あった。

ＤＮＡプローブ マウスＨ鎖Ｊ、プローブは、Ｊ３及びＪ４セグメントの両方を含む２ｋｂのＢａ １ＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片である。マウスＬ鎖Ｊ１プローブは、すべての５つ のＪ、セグメントを含む２．　７ｋｂのＨｉｎｄｍ断片である。！！ｐ標識プロ ーブは、アマージャム社から得られるキットを使用してニックトランスレーショ ンにより製造した。遊離ヌクレオチドはセファデックスＧ−５０カラムを通して 遠心分離により除去された。プローブの特異的活性は約１０’ｃｐｍ／１ｇであ った。

ノザーン分析 １５１ｇの全細胞ＤＮＡを、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル（マニアチ ス等、モレキュラー・クローニング）での電気泳動に付しそしてニトロセルロー スに移した。プロットを、５０％ホルムアミド、２×デンハートの試薬、５ＸＳ ＳＣ及び２００１ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でニックトランスレーションさ れたＤＮＡプローブと、４２℃で１０時間ハイブリダイゼーションした。最終洗 浄条件は、６５℃で０．　５ＸＳＳＣ０，１％ＳＤＳであった。

エレクトロポレーションを使用するＤＮＡトランスフェクショントランスフェク ションされるべきプラスミドＤＮＡを、エチジウムプロミド／塩化セシウム勾配 中で平衡まで２回遠心分離することにより精製した。１０−５０１ｇのプラスミ ドＤＮＡを氷上のＰＢＳ中の８×１０’５Ｐ２１０細胞に加え、そして混合物を バイオラドのエレクトロポレーション装置に入れた。エレクトロポレーションは 、２００ボルトでありそして細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートに付 着させた（ｐｌａｔｅ　ｏｕｔ）。適当な薬剤選択を４８時間後に適用しそして 薬剤耐性コロニーを１−２週間後に同定した。

抗体生産の定量 精製したＩｇＧで得られた標準曲線を使用して、粒子濃度蛍光イムノアッセイ（ ジョリー・エム・イー等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、６７ ：２１）により、組織培養上澄液のＩｇＧタンパク質含有率を分析した。ヒト不 変領域を有するキメラ７Ｅ３抗体の濃度を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体被覆ポリ スチレンビーズ及びフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体を使用して決 定した。このアッセイは、自動化装置（バンデックス・ラボラトリーズ社）で行 った。

血小板特異的キメラＩｇＧ４抗体の精製ダイアフロＹＭ１００限外濾過膜（アミ コン）により組織培養上澄液を濃縮し、そしてタンパク質Ａ−セラアロースカラ ムに加えた。ｐＨ６゜５からｐＨ３，５までのクエン酸ナトリウムｐＨ勾配によ りキメラ抗体をタンパク質Ａカラムから溶離した。精製した抗体をグイアフロＹ Ｍ１００限外濾過膜を使用して濃縮した。抗体濃度は２８００■での吸光度を決 定することにより測定した。

結合抑制アッセイ 精製した抗体（ネズＥ７Ｅ３又はキメラ７Ｅ３）を使用して、ヒト血小板に対す る結合について放射ヨウ素化７Ｅ３抗体と競合させた。血小板に富んだ血漿（Ｐ 　ＲＰ）を、１８７５ｒｐｍで３．５分クエン酸塩処理全ヒト血液を遠心分離す ることにより製造した。１！５Ｉ標識７Ｅ３抗体（１５０、０００ｃｐｍ）を精 製した試験抗体の適当な希釈物に加えそして反応を１５０　１１ＰＲＰの添加に より開始した。室温でインキュベーションを１−２時間行いそして結合した抗体 を有する血小板を、遊離抗体から、０．４ｍｌマイクロヒュージ管中で１２．０ ００ｇで４分間３０％スクロースを通して遠心分離することにより分離した。血 小板／抗体ペレットを含む管先端を切り取り、そしてγ計数管で計数した。ヨウ 素化７Ｅ３とキメラ７Ｅ３の血小板に対する結合の競争を、ヨウ素化７Ｅ３と非 標識７Ｅ３１ｇＧの競争に対して比較した。

血小板凝集の抑制 精製した７Ｅ３又はキメラ７Ｅ３抗体をクエン酸塩処理全ヒト血液に加え、そし て３７℃で１０分間インキュベーションした。血小板凝集の速度を、全血液凝集 検出計（クロノログ社）を使用してコラーゲン又はＡＤＰによる活性化の後測定 した。

それぞれ、Ｊ□及びＪ、プローブを使用して約１００万のプラークをスクリーニ ングした後Ｈ鎖及びＬ鎖うイブラリーからいくつかの正のクローンを単離した。

少なくとも３ラウンドのプラーク精製の後、与圧のクローンについてバクテリオ ファージＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ（Ｈ鎖りローン）又はＨｉｎｄｌ［ｒ（Ｌ 鎖りローン）で消化しそして１％アガロースゲルで分別した。ＤＮＡをニトロセ ルロースに移しそしてプロットをＪ　、（Ｈ鎖）又はＪ　、３２ｐ標識ＤＮＡプ ローブとハイブリダイゼーションさせた。

Ｊ１１プローブにハイブリダイゼーションした３、５ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ断片 を含んでいる２つのクローンが得られた。３．０及び６．　Ｏｋｂの２つのサイ ズクラスのＨｉｎｄｍ断片カリ、プローブにより同定された。

７Ｅ３ハイブリドーマからの真性のＨ及びＬ鎖可変領域に対応するクローニング されたＤＮＡは、ハイブリドーマから単離した■ＲＮＡにハイブリダイゼーショ ンするはずである。Ｈ又はＬ鎖位置における非機能的ＤＮＡ再配列は発現されな いはずである。第１図は、３．　５ｋｂＥｃｏＲＩ推定Ｈ鎖断片及び６．０ｋｂ Ｈｉｎｄｍ推定り鎖断片は各々７Ｅ３ハイブリドーマからの適当なサイズの１Ｒ ＮＡにハイブリダイゼーションすることを示すノザーン分析を示す。サブクロー ニングされた断片をニックトランスレーションにより３２ｐで標識し、そして５ Ｐ２１０（７Ｅ３ハイブリドーマの融合相手）又は７Ｅ３由来の全ＲＮＡを含む ノザーンプロットにハイブリダイゼーションさせた。３．　５ｋｂＥｃｏＲＩ　 Ｈ鎖断片は７　Ｅ　３　ＲＮＡの２ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする が、５Ｐ２１０ＲＮＡにおいてはしない。同様に、６．　０ｋｂＬｌｆｌＨｆｎ ｄｍ断片は、７ＥａＲＮＡ中の１２５０ｂｐｍＲＮＡとハイブリダイゼーション するが、５Ｐ２１０ＲＮＡにおいてはしない。これらは、それぞれＨ鎖及びＬ鎖 ｍＲＮＡの正確なサイズである。クローニングされたＤＮＡ断片は７Ｅ３ハイブ リドーマにおいて発現された配列を含んでいるので、これらのデータは、これら が７Ｅ３ハイブリドーマからの正確な可変領域配列であることを示唆する。しか しながら、最終機能試験は、これらの配列は、適当な不変領域配列と組み合わせ られるとき、ネズミ７Ｅ３抗体の特異性及びアフィニテイと同様な特異性及びア フィニテイを有する抗体の合成を指向することができるという証明である。

ベクター及び発現系 ７Ｅ３ハイブリドーマからクローニングされた推定り及びＨ鎖■遺伝子を、前記 した（サン・エル等、ＰＮＡＳ　８４．２１４−２１８頁（１９８７））発現ベ クターにおいてヒトＪ及びＧ４不変領域遺伝子に連結させた。ｐｓＶ１８４ＤＨ ｎｅｏ１７−ＩＡＶ＋ｈＣ＋の１７−ＩＡＶ、Ｈｉｎｄｍ断片を、７Ｅ３からの 推定し鎖可変領域遺伝子に相当する５、ＱｋｂＨｉｎｄｌ［Ｉ断片で置き換えた 。同様に、ｐｓＶ２ＤＨｇｐｔ１７−ＩＡＶＨ−ｈｃａ４の１７　１ＡＶＨＥＣ ＯＲＩ断片を、７Ｅ３からの推定Ｈ鎖■領域遺伝子に相当する３、５ｋｂＥｃｏ ＲＩ断片で置き換えた。ｐ７　Ｅ　３　Ｖ　、ｈＣＨ＋及びｐ７　Ｅ　３　Ｖ　 ＩＩｈｃ　６４と名付けられた得られるプラスミドの構造を第２図に示す。

キメラＨ及びＬ鎖遺伝子を発現させるために、２つのプラスミドを、非生産性マ ウスミエローマ細胞系５Ｐ２１０にコトランスフエクションした。Ｌ鎖プラスミ ドは、Ｇ４１８に対する耐性を与えモしてＨ鎖プラスミドはマイコフェノール酸 に対する耐性を与え、かくして、各プラスミドからの遺伝子を有しそして発現す るクローンを得るのに２重選択を使用することを可能とする。Ｇ４１８及びマイ コフェノール酸にたいし。

て耐性のコロニーを安定な細胞系に拡大し、側薬剤の存在下に保持した。

これらの細胞系からの組織培養上澄液を、ヤギ抗ヒトｉｇＧＦｃ抗体及びフルオ レセインで標識された同じ抗体で被覆されたポリスチレンビーズによる粒子濃度 蛍光イムノアッセイを使用して抗体について試験した。

チェックした最初の１０系統から、約２１ｇ／ｍｌを生産した１つ（Ｃ−７Ｅ３ Ｆ６と名付ける）を更なる検討のために選んだ。

血小板結合活性アッセイ タンパク質Ａ−セファロースカラムを使用してｃ　−７Ｅ　３　Ｆ　６抗体の精 製の後、抗体を濃縮し、そして血小板結合活性アッセイにおいてネズミ７Ｅ３１ ｇＧと比較した。第３図は、ネズミ７Ｅ３及びｃ−７Ｅ３Ｆ６（推定キメラ抗体 ）が血小板結合について同じ程度に放射標識７Ｅ３と競争することを示す。結合 曲線は重なることができ、これはネズミ及びキメラ７Ｅ３の結合特性が同じであ ることを示している。

ｃ　−７Ｅ　３　Ｆ　６による血小板凝集の抑制精製したｃ−７Ｅ３Ｆ６を、試 験抗体のヒト血小板の凝集を抑制する能力を測定する機能アッセイにおいてネズ ミ７Ｅ３と比較した。第４図に示された結果は、両波体は同じ抗体濃度で同じ程 度にコラーゲン誘発血小板凝集を抑制することを示す。ｃ　−７Ｅ　３　Ｆ　６ は、同様な程度にＡＤＰ誘発血小板凝集も抑制する。

血小板結合アッセイ及び血小板凝集の抑制アッセイの結果は、１．）正確な可変 領域遺伝子が実際に７Ｅ３ハイブリドーマからクローニングされること、２）マ ウス不変領域をヒト不変領域で替えることは、これらのアッセイにより測定して ７Ｅ３可変領域の結合又は機能的特性に対して影響しないことを示す。

フィブロサン被覆ビーズアッセイ キメラｃ　−７Ｅ　３　Ｆ　６抗体は、抗体の血小板及びフィブリノーゲン被覆 ビーズ間の凝集を抑制する能力を測定する定性的、機能アッセイにおいて正であ ることが見出だされた。カラー・ビー等、（１９８３）ジャーナル・オブ・クリ ニカル・インベスティゲーション（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ）、７３： ３２５−３３８゜ 実施例２・キメラＩｇＧ１及び１ｇＧ３の製造ネズミ７Ｅ３抗体からのＨ鎖の可 変領域をコード化しているＤＮＡセグメントを、１７−ＩＡ可変領域断片を７Ｅ ３可変領域断片で置き換えることにより、発現ベクターｐｓＶ２ＤＨｇｐｔ１７ 　１ＡＶｏ　ｈｃｃ＋及びｐｓＶ２ＤＨｇｐｔ１７−ＩＡＶＨ−ｈＣ，（サン等 、ＰＮＡＳ　８４．２１４−２１８頁、１９８７）上に存在するヒト１及び３不 変領域に連結した。得られるキメラＨ鎖遺伝子を、キメラＬ鎖遺伝子と共に５Ｐ ２１０細胞中にコトランスフェクションして、Ｃ１、Ｋ１及びＣ３、Ｋ抗体を分 泌する安定な細胞系を発生させた。

均等物 当業者は、本明細書に記載の本発明の態様に対する均等物を、ルーチンな実験を するだけで認識し又は確認するであろう。このような均等物は下記の請求の範囲 に包含されることを意図する。

ＦＩＧ、　２Ａ　ｐ７Ｅ３ＶＫｈＣＫ ＦＩＧ、　２８　ｐ７Ｅ３Ｖ）ＩｈＣア。

十−−７Ｅ３ＶＨ−＋４ヒト　７４　◆−−ｐＢＲ３２２ｐｉ ６在冶ＣＰＭ 及■のＦｔｌｔや 国際調査報告 纂−一！−−門一一一＋ｗ＊ａ＋Ａ＊−＋ｔ−・９１−−・ＰＣＴ／に！５８９ １０２１Ｃ６国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非ヒト起源の抗原結合領域とヒト起源の不変領域を含んで成る血小板特異的 キメラ免疫グロブリン。 ２．抗原結合領域がネズミ抗血小板免疫グロブリン由来のものである、請求の範 囲第１項記載のキメラ免疫グロブリン。 ３．糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に対して特異的でありそし てそれに対するリガンドの結合を阻止する、請求の範囲第１項記載のキメラ免疫 グロブリン。 ４．抗原結合領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲第 ３項記載のキメラ免疫グロブリン。 ５．請求の範囲第１項記載のキメラ免疫グロブリンの抗原結合断片。 ６．請求の範囲第５項記載の放射標識抗原結合断片。 ７．ａ．ヒトＨ鎖不変領域の少なくとも一部に連結された糖タンパク質ｇｐＩＩ ｂ／ＩＩＩａ受容体に対して特異的な非ヒト免疫グロブリンのＨ鎖由来の抗原結 合領域を含んで成る少なくとも１つのキメラＨ鎖を含み、該Ｈ鎖は、 ｂ．ヒトＬ鎖不変領域の少なくとも一部に連結された非ヒト免疫グロブリンのＬ 鎖由来の抗原結合領域を含んで成る少なくとも１つのキメラＬ鎖と連結している 、 キメラ免疫グロブリン。 ８．抗原結合領域がネズミ抗体由来のものである、請求の範囲第７項記載のキメ ラ免疫グロブリン。 ９．抗原結合領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲第 ８項記載のキメラ免疫グロブリン。 １０．糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に対して特異的なネズミ 可変領域とヒト不変領域を含んで成る、キメラ免疫グロブリン断片Ｆａｂ、Ｆａ ｂ′又はＦ（ａｂ′）２。 １１．可変領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲第１ ０項記載のキメラ免疫グロブリン断片。 １２．放射標識されている、請求の範囲第１０項記載のキメラ免疫グロブリン断 片。 １３．放射標識が９９ｍＴｃ又は１１１Ｉｎである、請求の範囲第１２項記載の キメラ免疫グロブリン断片。 １４．ｂ．ヒト起源の免疫グロブリンの不変領域をコード化している第２ＤＮＡ 配列に連結された、 ａ．非ヒト起源の血小板特異的抗体の免疫グロブリン可変領域をコード化してい る第１ＤＮＡ配列、 を含んで成るキメラＬ又はＨ鎖免疫グロブリンをコード化している融合遺伝子。 １５．免疫グロブリン鎖の可変領域がネズミ起源のものである、請求の範囲第１ ４項記載の融合遺伝子。 １６．可変領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲第１ ５項記載の融合遺伝子。 １７．発現可能な形態にある請求の範囲第１４項記載の融合遺伝子を含む発現ベ クター。 １８．血小板に対して特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒト不変領域を含ん で成るキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の抗血栓症量を、血栓を有 する患者又は血栓形成の危険がある患者に投与することを特徴とする、抗血栓治 療の方法。 １９．非ヒト起源の抗原結合領域が糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対して 特異的である、請求の範囲第８項記載の方法。 ２０．血栓溶解剤、及び血小板に対して特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒ ト不変領域を含んで成るキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の抗血栓 症量を、血栓を有する患者又は血栓形成の危険がある患者に投与することを特徴 とする、抗血栓治療の方法。 ２３．キメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片を、血栓溶解剤の投与と共 に又は投与の後に投与する、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ又 はウロキナーゼである、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５．非ヒト起源の抗原結合領域が糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対して 特異的である、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２６．抗原結合領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲 第２５項記載の方法。 ２７．免疫グロブリン断片がＦａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）２断片である、 請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８．ａ．非ヒト起源の抗原結合領域とヒト起源の不変領域を含んで成る、放射 標識されたキメラ血小板特異的免疫グロブリン又はその断片を、血栓を有してい る疑いのある個体に投与し、ｂ．前記抗体又は抗体断片を血栓部位に蓄積させ、 ｃ．放射標識により発生した信号をフォトスキャン装置により検出し、ｄ．検出 された信号を血栓の像に転換する、ことを特徴とする血栓の像形成の方法。 ２９．Ｆａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）２断片を投与する、第２８項記載の方 法。 ３０．放射標識が９９ｍＴｃ又は１１１Ｉｎである、請求の範囲第２８項記載の 方法。 ３１．血小板特異的免疫グロブリンが糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体 に対して特異的である、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３２．抗原結合領域がモノクローナル抗体７Ｅ３由来のものである、請求の範囲 第３１項記載の方法。