JPH04501605A - バイオセンサーシステムに使用する選択的生体分子相互作用の可能な検出表面 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオセンサーシステムに使用する選択的生体分子相互作用の可能な検出表面 本発明はバイオセンサーの分野に関し、より詳しくは選択的生体分子相互作用の 能力のある表層を持つ金属表面を作る方法に関する。本発明は又所望のリガンド を結合させる活性化された表面、結合したリガンドを含む表面、及びそのような 表面のバイオセンサーへの使用からなつている。

＾ｉｚａｗａ　（１９８３年）によれば、バイオセンサーは分子認識のためのり セプター、例えシ固定化抗体を持つ選択的な層及び加工性シグナルへ相互作用情 報を伝達するための変換器の特異な組合せであると定義される。そのようなバイ オセンサーの一群はりセプターと周囲媒質との相互作用により表層の光学的性質 に引き起こされる変化を検出するであろう。そのような方法の中で特に楕円偏光 法と表面プラスセン共鳴法を挙げることができる。この種類の方法が現実の実行 において十分に働くためにはいくつかの要求、すなわち使用する検出表面（又は 測定表面）か所望のりセプターを含み、更に如何なる非特異的結合すなわち意図 する以外の成分の結合も生じない（又は無視し得る程度にのみ生ずる）ように容 易に誘導体化されるという要求が満たされなければならない。やや簡略化した表 現を用いると表面プラスモン共鳴法（略語ＳＰＲ。

これは５ｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅの頭語から導かれ る）は金属薄膜に近接する層における屈折率の変化を反射光ビームの強度に結果 として起こる変化により検出する方法であるといえる（Ｒａｅｔｈｅｒ、　ＩＩ （１９７７年）が参照される）。

検出表面はりセプター又は「リガンド」　（以後それらをこのように呼称する） であり、これらは一般に１つ又はそれより多い生体分子と選択的に相互作用する 分子又は分子構造である。

金属膜は使用する測定法に適した種類の基体に適用する。ＳＰＨの場合、これは 誘電体物質例えばガラス板の形態のそれが光束を金属表面に指向させるために使 用することを意味する。

現在までに出版された大部分の刊行物によると、ＳＰＲ法は生体分子の検出に適 用する場合単純に問題の生体分子を直接金属表面に吸着させ、次いでその結果測 定シグナルに現れる影響を調べることにより実行された。次の段階で、この表面 は場合により最初に結合させた分子層に対して親和力を持つ分子（リガンド）の 新しい層を結合させるために使用することができた。か（して例えばＬｉｅｄｂ ｅｒｇ、　Ｂ等（１９８３年）は最初の研究において、最初にＩｇＧの単層を銀 表面に吸着させ次いで抗ＩｇＧ層を前記単層に吸着させ、次に共鳴角に結果とし て起こる変化について影響を調べることにより、生化学的分析のためのＳＰＲ法 の可能性を指摘している。

更にその他では、例えばＣｕ１ｌｅｎ　ＤＣ等（１９８７／８８）は金被覆回折 格子を持つＳＰＲ法を使用してＩｇＧ／抗ＩｇＧ系における免疫複合体形成を調 べる場合、金属表面への生体分子の直接吸着を利用した。

欧州特許第２５７９５５号は金属膜をシリカで被覆し、場合によりシラン化試薬 で処理する方法を記述しており、及び欧州特許第２０２０２１号では金属膜を有 機層例えば特異抗原に対する抗体を含むことがあるそれで被覆している。

抗体を共有結合させる可能性は実際に明細書に述べられているが、有機層の実際 の性質は全（開示又は示されておらず、又同しことが有機層を作る方法に当ては まる。

欧州特許第２５４５７５号により、例えばＳＰＲ適用に適するような種類の光学 的構造は金属膜を所ｓｒ溶媒流延法」により有機ポリマーの層で被覆して作るこ とができる。

好ましい態様においては硝酸セルロースが使用され、及び生特異的リガンドを層 に結合させるための種々の公知の方法が挙げられる。

この種の刊行物は方法の可能性について指摘する一方、提案された技術的解決法 に固有のい（っかの限界についても説明している。

例えば欧州特許第２５４５７５号で指摘されているように、問題の一つは生体分 子が金属及びある種の無機表面と直接接触することにより少なくとも部分的な不 活性化を受けやすいことからなる。他の厄介な問題はある種の特別な適用に望ま しいい（つかのリガンドは安定な様式で金属表面に吸着されることができず、従 って再現性ある結果を得ることが期待できない。更に別の問題は生化学的系に存 在する媒質の多くは金属表面に腐蝕作用を持つことである。

この種の問題の少な（とも一部分は欧州特許第２５４５７５号による方法により 解決されるが、この種類の構造はいくつかの明白な欠点を持っている。生体分子 は硝酸セルロース膜に不可逆的に吸着されるというよ（知られた事実から好まし い態様による硝酸セルロースの形態のポリマーコーティングはいくつかの可能な 応用に制限を加えるであろう。光学的表面検出法に基づくバイオセンサー系にお いては、そのような現象は検出表面と例えばヒト血清試料に存在する成分との間 の非特異的相互作用による不明瞭且つ再現性のないシグナルを生ずることがある 。

そのような副作用は欧州特許第２５４５７５号においては測定と対照表面の組合 せを使用することにより較正された。

この方法が働くための要件は非特異的寄与の大きさが両表面で等しいことである 。しかしながらこの条件は現実の実施において常に満たされるわけではない。

他の問題は欧州特許第２２６４７０号で指摘されているように上述のそれと同様 な構造物の製造に関連する（米国特許第４４１５６６６号も参照される）。明細 書よりポリマーコーティングの許容される安定性、均−性及び再現性を得ること が如何に困難であるかを理解することができ、及びその結果生ずるバイオセンサ ー系を使用する場合の負の影響は容易に認識されるであろう。

１５〜２０ｎｓの厚さの硝酸セルロース型のポリマーコーティングの多くの実際 使用の場合、腐蝕に対して実際に十分な保護を加えるが、それにも拘らず小分子 がそのような層を浸透し、金属表面に不可逆的変化を引き起こす恐れがある。下 に示すように現在の型の測定に関連しである状況で出会うような硫黄化合物、例 えば有機チオール化合物がタンパク質のジスルフィド結合の還元に使用される場 合貴金属に対して高い親和力を持ち、吸着された場合金属の光学的性質に対して 制御されない変化を生ずるであろう。又硝酸セルロース型のポリマーコーティン グは例えば２％ＳＯ５による界面活性剤処理により損傷を受けることが示された （欧州特許第２５４５７５号参照）。

バイオセンサーシステム特にＳＰＲ用の一般に有用な検出表面は次の要件を満た すべきである。

それは使用する媒質に対して化学的に抵抗性であるべきである。

それはタンパク質及び他の生体分子と適合し得るものであり、所望される以外の 如何なる分子とも相互作用すべきでない。

この方法の種々な分析的問題に対する一般的適用性に要求されるような多数のり ガントとの共有結合を形成する能力を持つべきである。

高度の感受性と力学を獲得するため、表面は標的分子をそこに結合させるため試 料溶液用三次元マトリックスを提供すべきである。この方法で二次元表面を使用 する場合と比較して液量のより大きな部分がその屈折率の形で共鳴効果に影響す ることに利用されるであろう。

我々は今回好ましい態様において、これらの要件をとりわけよく満足する表面を 作り出した。

この金属表面は自由電子金属例えば銅、銀、アルミニウム又は金の膜で構成され る。これらの金属は異なる共鳴効果を与え、又銀はこの観点から極めて良好であ るが、それにも拘らず腐食安定性を考慮して金が好ましい金属であると決定した 。所望の生特異的リガンドを結合させるため、我々は金属表面に有機分子Ｘ−Ｒ −Ｙの単層を適用した。この単層は密に表面に詰め込まれており、リガンドの結 合に使用される外、それは保存中極めて安定であり、及び金属表面を化学腐食か ら保護する有効なバリア一層を形成する。

一般にある種の硫黄化合物による全表面の変性は例えばＮｕｚｚｏ　ＲＧ等（１ ９８３年）　、Ｐｏｒｔｅｒ　ＩＤ等（１９８７年）、及ヒＴｒｏｕｇｈｔｏｎ 　ＥＢ等（１９８８年）により記述されている。

密に詰め込まれた（ｄｅｎｓｅｌｙ　ｐａｃｋｅｄ）単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ）の形態のＸ−Ｒ−Ｙは上述の刊行物に記述された原理により付着するようにな り、結合は性質が部分的に共有結合であり、Ｘは金属に結合し、Ｙは官能性リガ ンドと結合する働きをする。これはリガンドを場合によりＹの活性化後Ｙに直接 結合させるか、又は生適合性多孔質マトリックス例えばヒドロゲルを、その上で マトリックスをリガンドと結合させるのに利用されるＹを介してバリア一層に結 合させることにより実現される。

Ｘは次の群、すなわち 非対称又は対称スルフィド（−５ＳＲ’　Ｙ’、−５ＳＲＹ）　、スルフィド（ −８Ｒ’　Ｙ’、−８ＲＹ）　、ジセレニド（−８ｅＳｅＲ’　Ｙ。

−３ｅＳｅＲＹ）　、セレニド（ＳｅＲ’　Ｙ’、−８ｅＲＹ）、チオール（− ＳＯ）　、ニトリル（−ＣＮ）　、イソニトリル、ニトロ（ＮＯｔ）　、セレノ ール（−３ａｌｌ）　、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、 チオカルバメート、ホスフィン、 チオ酸またはジチオ酸（−ＣＯＳＨ，−ＣＳＳＩＩ）の１つに属する。

Ｒ（とＲ’）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に 密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／ 又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さはｌＯ原子を越えない。より短 い鎖の場合、安定性のより劣る層を生ずる。一般に１２〜３０原子の鎖長が好ま しい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。

ＹとＹ′は好ましくは同一であり、それらの標的物質に直接又は活性化後結合で きるような性質を持つ。Ｙ（及びＹ’）は従って液体クロマトグラフィー法で固 定化に使用される多（の基例えばヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデ ヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基のいずれかであること ができる。これら又は他の基による種々なリガンド例えば生体分子の結合に関す る多（の論文が文献中に見出され、従って利用可能な代替物質を選択することは 当業者にとってたやす（明らかなことである。

この思想の明らかな変形は種々な有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙの混合物の吸着を含む。こ れは更に誘導体化の増加した容量を獲得する目的、又は多官能性表面を得る目的 で行うことができる。更にバリア一層はＲｅｇｅｎ　ＳＬ等（１９８６年）によ り記述されているような方法で種々な種類のより複雑な分子例えば互いに連結し た２つ又はそれより多い炭素鎖を含む分子を用いて形成させることができる。

必要により、バリア一層中で分子を架橋させることにより安定性を更に増加させ ることができる。これはＲ又はＹ中の官能基例えばＲ中の二重結合又は三重結合 の光開始重合により達成することができ、例えばＲｉｎｇｓｄｏｒｆ■等（１９ ８８年）が参照される。

所望のリガンド又は生体分子がＹを介してバリア一層に直接結合している場合、 上述の要件のいくつかは満たされ、許容できる結果を少なくともいくつかの実際 的応用の場合に得ることができる。しかしながら好ましい具体化においては生適 合性多孔質マトリックス例えばヒドロゲルをバリア一層に結合させ、及びこのマ トリックスは数オングストローム−数千オングストロームの厚さを持ち、標的生 体分子に適したリガンドを固定化させるために使用される。実際の実施において マトリックス層の厚さは使用する測定システムの測定場所における測定シグナル の大きさに適合し、それにより測定条件の最適設定が得られるように選択される 。ＳＰＲ適用においてマトリックス層の厚さは好ましくは５〜ｉｏ、　ｏｏｏオ ングストローム特に５〜１．０００オングストロームである。従来技術と比較し て単位面積当り相当に高いりガント密度がここに記述したマトリックスで得られ 、この場合分子の結合は主として単層中で起こる。このようにして相当に増強さ れた測定シグナルが得られ、システムを大きな力学範囲で有用なものにする。

ここで考慮され、現在マトリックスの好ましい具体化であるヒドロゲルは璽ｅｒ ｒｉｌ１等（１９８６年）により定義される。ヒドロゲル結合はタンパク質適合 性と非特異的相互作用の最小化に関する前述の要件のすべてを満たす検出表面を 得るために必須である装置ｅｒｒｉｌ１等はヒドロゲル表面におけるそのような 性質を示す多数の例を記述している。考えられる実際の適用により、いくつかの 利用可能な選択肢から任意の特定のヒドロゲルを選ぶことができる。

ヒドロゲルは例えば多糖類例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アル ギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体例えばカルボキシメチル誘導体 、又は水膨潤性有機ポリマー例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポ リアクリルアミド、ポリエチレングリコールであることができる。

特にデキストラン型の多糖類は例えばセルロースとは対称的に性質が非結晶性で あり、このような関係においては極めて適当である。デキストランは生体分子を 結合するマトリックスとしてクロマトグラフィー操作で極めて広範囲に使用され てきた。この思想が本来持つ利点の一つは現実にこの全技術が現在バイオセンサ ー適用、すなわち適当なりガントが固定化されているバイオセンサー技術の最終 段階に利用可能なことである。ヒドロゲルはバリア一層「金属−Ｘ　−Ｒ−ＹＪ に結合させるか、又はモノマー物質の適当な溶液からそのままの状態で形成させ ることができる。更に別の処理段階例えばその後のヒドロゲルの架橋は当業者に とって当然にたやすく明らかであろう。

この種類の表面変性は特異的又は二者択一的に低い非特異的相互作用が一方の表 面と他方のタンパク質又は他の生体分子との間で要求される他の技術分野にも利 用することができる。挙げることが出来る例は生体分子分離のためのクロマトグ ラフィーシステムの一部分であり、ここでは例えば金属フィルターは上述の方法 で変性させた表面を持つことができる。これらの原理に従って毛細管型クロマト グラフィー用カラムを作ることも可能である。更に表面構造は「インビボ」型の 環境で使用するための生適合性を獲得するように変性させ得ることは明らかであ る。意図する特定の使用分野により、例えばヒドロゲルの実際の選択は望ましく ない相互作用を最小にするように行うことができる。当業者にとって上述の一連 の例から多くの別の使用分野はたやすく明らかであろう。

本発明を更に例証する具体例において、１６−メルカプトヘキサデカノールの層 が金膜に結合し、この金膜上でバリア一層のヒドロキシル基はエビクロロヒドリ ンで処理することによりエポキシ活性化される。次の段階でデキストランをエー テル結合を介してバリア一層に付着させる。次にデキストランマトリックスはリ ガンドを結合させるため公知技術例えば次の原理の一つにより活性化される。

一つの具体例においては、ヒドラジド機能がアルデヒド基を含む１ノガンド例え ばアルデヒド機能を含むように酸化された炭水化物鎖を含む抗体を結合させるた めデキストランマトリックス中に作られる。この場合デキストランマトリックス は最初にヒドラジド基を形成するように一部分反応を受けたカルボキシメチル基 により変性される。この活性化されたマトリックスにより少なくとも二つの重要 な利益が得られる。すなわち１）このマトリックスは未反応のカルボキシル基を 含み、これは低いイオン強度条件下でイオン交換剤として働き、又静電的相互作 用により固定化されるべきリガンドはデキストランマトリックスに濃縮される。

２）このマトリックスはリガンドのアルデヒド基とマトリックスのヒドラジド機 能とが縮合することにより極めて有効にリガンドを結合させ表面に濃縮する。

他の具体例においては、カルボキシメチル変性デキストランにおけるカルボキシ ル基の一部を反応性エステル機能を生ずるように例えばＮ−ヒドロキシスクシン イミド及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド 塩酸の水溶液で処理することにより変性される。上述の場合と同じ方法で残留電 荷すなわち未反応カルボキシル基はリガンドの表面への濃縮の遂行に寄与するで あろう。次いでアミノ基を含むリガンド例えばタンパク質とアミノ酸はデキスト ランマトリックスに共有結合により結合させることができる。

別な方法においては、前述の反応性エステルはジスルフィド含有化合物例えば２ −（２−ピリジニルジチオ）エタノールアミンとの反応に利用される。この方法 でジスルフィド基を含むマトリックスが得られ、及びこれらはチオール含有リガ ンド例えば免疫グロブリンの還元されたＦ（ａｂ）断片との結合に使用すること ができる（Ｂｒｏｃｋ−１ｅｈｕｒｓｔ　Ｋ等（１９７３年）参照）。ジスルフ ィド結合を例えば還元又はチオールジスルフィド交換により分裂させた後、形成 されるチオール変性表面はジスルフィド含有リガンド例えばＮ−スクシンイミジ ル−３−（２−ピリジニル）プロピオネート（５ＰＤＰ）変性タンパク質の結合 に使用することができる。

この方法の利点はりガントを例えば還元処理により分裂させて反応性チオールを 持つ検出表面が得られることである。このチオール変性表面は類似の方法でチオ ール又はジスルフィド含有リガンドの更新された共有結合に使用することができ る。このようにして検出表面の化学的再生の能力を得ることができ、これは同一 表面をいくつかの異なるリガンドの結合のための一般的用途に使用することがで きる。この方法は例えば生物学的相互作用を研究する場合にも使用することがで き、この相互作用は固定化されたリガンドに保持されている生物学的活性により 破壊されることはない。

本発明の一つの重要な態様は所定の分析で使用する検出表面を形成する一つ又は それより多い層はバイオセンサーシステムのフロースルーセルにおける表面に適 当な試薬を添加することによりその場所で合成及び／又は官能化されることであ る。

要約すると、それと共に相互作用することにより生体分子の検出に使用すること ができる多数のリガンドが存在する。イオン交換性基、金属キレート化基及び種 々な種類の生体分子用リセプター例えば慣用的な液体クロマトグラフ法で知られ ているようなそれが複雑な測定システムにおいてさえ選別目的に適当なシステム の構築に使用し得ることはたやすく明らかであろう。

この検出表面の新規な種類は多数の試料成分分析のため多重検出表面からなるシ ステムで測定を実行することを可能にする。このようなシステムにおいては、各 々の特定の検出表面はその場所で所望の特異性を獲得するように官能化されると 極めて高度な多能性が得られる。この場合そのような検出表面は最初に活性化さ れたデキストラン層を含み、官能化は検出表面の各々の対応する一つに適当なリ ガンド溶液を通過させることにより実行される。その後試料溶液を多重検出表面 を通過させ、結合させた成分が検出される。

少な（とも２つの検出表面を持つセンサーユニット並びにその官能化の方法は発 明の名称が［センサーユニットとそのバイオセンサーシステムにおける使用（Ｓ ｅｎｓｏｒｕｎｉｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ｓ ｙｓｔｅｍ）　Ｊと称する我々の係属中のＰＣＴ出願（スエーデン特許願第８８ ０４０７４−６号に基づ（）の目的であり、その開示は参考例としてここに組み 入れる。

一つの具体例においては、いわゆるキメラ分子（二官能性又は多官能性分子）が 検出表面を官能化させるため使用される。キメラ分子は基礎表面例えば前述のデ キストラン被覆検出表面に結合しようとする部分と検出される生体分子に親和力 を持つ他の部分とからなる。′デキストランの場合キメラ分子は生粋異的リガン ド例えば免疫グロブリンに共役結合するデキストランに対する抗体からなること ができる。このようにデキストラン抗体と種種な特異性の基とを含む一連のキメ ラ分子を用いて、−装置中に同じ種類のいくつかの検出表面を含むいわゆる測定 用カセットを多数の生体分子の併行検出のため簡単な方法で活性化させることが できる。他の方法においては、検出表面は表面にキメラ分子を結合させるため所 謂ハプテンで変性させる。例えば上述の反応性エステル表面をテオフィリンアナ ログで誘導体化し、次いでキメラ分子を結合させるために使用することができる 。この場合キメラ分子はテオフィリンを指向し、生粋異的リガンドと結合する抗 体からなる。これらの具体例から本発明の表面を使用する場合、使用者は同一の 基礎表面を簡単な方法でその所望のりガント（＝所望のりセプター）のいずれか をそこに付着させるために使用することができるから、高度の多能性に到達し得 ることは極めて明らかである。

（ｉ）バイオセンサーシステムに使用する選択的生体分子相互作用の可能な表面 積を持つ金属表面を作る前述の方法、（ｎ）上述の表面、及び（ｆｆｌ）それら のバイオセンサーへの使用に関する本発明は、下記の実施例により例証するがそ れのみに限定されるものではない。金属はもちろん各々の場合意図する特定の測 定法に適当な基体、例えばＳＰＲの場合はガラス板に適用される。基体の選択は 本発明の部分を形成しない事実を考慮し、本明細書と同様に下の実施例は全体と して検出表面、すなわちその上に付着した層を持つ遊離金属表面のみに関連する 。

本発明の検出表面は種々なバイオセンサーシステム及び特にＳＰＲ例えば「光学 的バイオセンサーシステム（Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｂｆｏｓｅｎｓｏｒ　Ｓｙｓｔｅ ｇｅ）　Ｊと称する我々の係属中のＰＣＴ出願（スエーデン特許願第８８０４０ ７５−３号に基づく）に記述されているそれに使用することができ、その開示は 参考例としてここに組み入れる。

１、検出表面製造の実施例 １．１１６−メルカプトヘキサデカノールの合成１６−メルカプトヘキサデカノ ールを次の反応略図により合成した。

１）　ＣＩｌ、ＣＯ３−／ＤＩＦ ＬｉＡｊｌｌ。

−〉ＩＩｓ（１ｍｓ）＋５ＯＨ （Ｖ） １６−メルカプトヘキサデカン酸メチルエステル（ＩＶ）は公知の方法により調 製した（Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ　Ｒ１：等（１９７０年）、Ｇｈｏｓｈ　ＳＳ等（ １９８７年）及びＶｏｌａｎｔｅ　ＲＰ　（１９８０年）、及びこれらの刊行物 に引用されている参考例）。

（■）の１６−メルカプトヘキサデカノールへの還元は次のように実行した。

７０ｍ／のトルエンに溶解した１６−メルカプトヘキサデカン酸メチルエステル １２．０ＩＦ（４１−１ｍｍｏｌ）をトルエン中リチウムアルミニウムヒドリド −ビス−テトラヒドロフラン（ＩＭ）の７０藺１　（７０＋＋ｍｃ）ｊ）に激し く撹拌しながら注意深く滴加した。この添加の量温度は２５℃より下に維持した 。

反応を室温で２０分間進行させた。過剰のヒドリドを酢酸エチル次いで１００ｍ ／の２Ｍ塩酸で分解した。層を分離した。水層を１０（１＋／のトルエンで抽出 した。合併した有機層を１００ｍ／の２Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マ グネシウムで乾燥し蒸発した。

収量１０．　ｈ　（８７，２％）、ＧＬＣによる純度９６％。

生成物をメタノールからの再結を繰り返して精製した。

〉９９％の純度は許容されると判断した。融点５５．０〜５６．０℃。

１．２　＾Ｕ被覆ガラス表面の基礎結合１．２，１　１６−メルカプトヘキサデ カノールの化学吸着５インチの金被頂ガラスウェハーを蓋を備えたベトリ皿（内 径１６ｃｍ）中に置いた。エタノール／水（８０／　２０）中１６−メルカブト ヘキサデカノールの５．θ■菖溶液の４０ｍ１を表面に注いだ。ベトリ皿を４０ ℃の振盪インキュベーターで２０分間インキュベートした。表面を５　Ｘ　５０ ｍ／の水、５０ｍ１のエタノール／水８０／２０、及び５Ｘ５Ｑ＋＋７の水で洗 浄した。表面のサイクリックボルタメトリー分析は膜が有効に金の酸化を防ぐこ とを示した。

１．２．２　エビクロロヒドリンによる処理１６−メルカプトヘキサデカノール で被覆した表面を２０寥ｌの０．４Ｍ水酸化ナトリウム及び２０ｍ１のジエチレ ングリコールジメチルエーテル中２．　Ｏｗｌのエビクロロヒドリンの溶液に接 触させた。２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面を ２×５０１１１のエタノール及び５　Ｘ　５Ｑｓ＋ｌの水で洗浄した。

１．２．３　デキストランによる処理 １３、５ｙのデキストラン（Ｔ　５００．　Ｐｈａｒｓａｃｉａ）を４０．５ｍ ｌの水に溶解した。４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、溶液をエビク ロロヒドリン処理表面上に注いだ。次に振盪インキュベーター中で２５℃で２０ 時間インキュベートした。表面を１５Ｘ　５０８１の５０℃の水で洗浄した。

１．３　基礎表面の誘導体化 １．３．１　ヒドラジド表面の合成 ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した。混合物を １．２．３によりデキストラン処理表面に注ぎ、２８℃の振盪インキュベーター で１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰 り返した。

洗浄した後、表面を２０ｍＪの水中０．８ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピ ル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）で５分間処理し、次いで２０ ｍ１の水中４．０直ｌのヒドラジンヒドロキシドを添加した。表面を２５℃の振 盪インキュベーターで１６時間インキュベートし、次いで水で洗浄した。

１．３．２　反応性エステル機能を持つ表面の合成３Ｑ、ｌの水に０．６９ｇの Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１、１５ｇのＥＤＣを溶解した。混合物を１． ３．１によるカルボキシメチル変性デキストラン表面に注ぎ、２５℃の振盪イン キュベーターで６０分間インキコベー・トシた。表面を水で洗浄した。

■３．３　テオフィリン表面の合成 ０、１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）中５儀璽の８−（３−アミノプロピル）− テオフィリン（Ｒ，Ｃ，Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、１９８０年）の溶液をＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステル活性化デキストラン表面（実施例１．３．２に よる）と共に２５℃で一晩インキユベートし、次いで表面を水で洗浄した。

■　リガンドの誘導体化した基礎表面への結合Ｉ［，１抗ＩｇＥ抗体 １０勤夏酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）中杭ＩｇＥ抗体（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ）を０’　５ｈａｎｎｅｓｓｙ　（１９８５年）により 記述された方法により１０ｍ１＋過沃素酸ナトリウムで水浴中で２０分間酸化し た。緩衝液を置換した後、抗体を１０ｍ１ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４゜０）中でヒド ラジド変性デキストラン表面に結合させた。結合しなかった抗体を０．１Ｍグリ シン（ｐＨ２，５）で溶離した。

■、２　抗ベーター２−ミクログロブリン抗体抗ベーター２−ミクログロブリン 抗体（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ）を実施例Ｉ［、］の ように酸化し、ヒドラジド変性デキストラン表面に結合させた。

■、３　ウサギ抗マウス軽鎖抗体（ＲＡＩＩＬＣ）３．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ５，５）中ＲＡＩＩＬＣ抗体をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体化 デキストラン表面に２０分間かけて結合させ（実施例１．３．２による）、次い で結合しない抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７，４）と０．１Ｍグリシン（ｐＨ２， ５）中で表面を洗浄することにより除去した。

ＩＩ　ＳＰＲ法を使用する生体分子試験検出表面をフローセルを持つＳＰＲ測定 装置に導入した。

光学装置を調整した後測定シグナルを一定流量条件下で時間の関数として調べた 。

■、１　モノクローナル抗体の濃度とサブクラス同一性の測定 モノクローナル抗体を含む培養培地を検出表面上にＲ＾肛Ｃ抗体の共有固定化し た後注入した（実施例■、３）。

第１図は（１）培養培地の注入、（２）モノクローナル抗体を含む培養培養の注 入、及び（３）０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）による再生について得られた応 答曲線を示す。

第２図は種々な濃度のモノクローナルＩｇＧ１抗体の標準曲線を示す。ｍｌ当り ５〜１００＊ｐ抗体の範囲で用量応答曲線の精度は±１０％より良好である。

第３図はサブクラス特異的試薬の注入と結合モノクローナルのＩｇＧ　ｌ抗体と しての同定を示し、図中（１）表面結合モノクローナル抗体であり、続いて（２ ）抗ＩｇＧ２ａ、　（３）抗ＩｇＧ３、（４）抗ＩｇＧ２ｂ、及び（５）抗Ｉｇ Ｇ　ｉの注入による結果を示す（これらは表面に結合する）。システムが可逆的 で反復可能なことを立証するため、抗体結合とサブクラス同定を同一表面上で１ ００回繰り返した。

■、２　抗テオフィリン複合体のセンサー分子の担体としての親和力研究と速度 論研究 タンパク質Ａとタンパク質Ｇを抗テオフィリン抗体との複合体（キメラ分子）の 形態でテオフィリン表面に導入した。この方法でタンパク質Ａ又はタンパク＠Ｇ と種々なサブクラスのモノクローナル抗体との間の相互作用を研究することがで きた。

複合体の調製 モノクローナル抗テオフィリン抗体Ｎｏ、　４５９、種々な異なるＩｇＧサブク ラスのモノクローナル抗体、ＩｇＧ１サブクラスＮｏ、　Ｅ　１６４．９５及び １２１のモノクローナル抗ＩｇＥ抗体及びＩｇＥをＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢから入手した。抗テオフィリン抗体をペプシンで分解し てＦ（ａｂ）’　−２断片を形成させるか、又は無傷の抗体として使用した。タ ンパク＠Ａ、タンパク質Ｇ及び５ＰＤＰはＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏ ｔｅ−ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢから入手した。

タンパク質Ａ−抗テオフィリン複合体はＣａｒｌｓｓｏｎ等（１９７８年）によ り記述された方法によりこれら分子の双方の５ＰＤＰ変性により調製した。変性 させたタンパク質Ａを１０ｍ１のＤＴＥ（１，４−ジチオエリスリトール）で還 元した後、１．８の変性度（分子当たりピリジルスルフィド基）を持つ抗テオフ ィリンの３．３ｍｇを１．３の変性度（チオール／分子）を持つ還元されたタン パク質Ａの１３．８８９と混合した。

接合を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中でｐＨ７，７で一 晩進行させた。タンパク質Ｇの抗テオフィリンのＦ（ａｂ）’　−２断片との複 合体を同様の方法で調製した。

分析 結合テオフィリンを持つ検出表面は上述の複合体により容易に官能化される。２ つの平行する検出表面、それらの１つはタンパク質Ａ複合体により他はタンパク 質Ｇ複合体により官能化されているそれらを用いて、一連の免疫グロブリンにつ きタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇとの親和力をそれぞれ極めて迅速に比較するこ とが可能であった。得られた結果は例えばＧｕｓｓ等（１９８６年）により報告 されているこれらの点に関する差異を確認している。

この実験は速度論と親和力の定性的測定を速やかに実行する可能性のみならず、 それぞれの場合における適当な試薬を用いてそのような検出表面は広範囲の種々 な検定に利用できることから本発明の検出表面を使用する方法の順応性をも例証 するものである。

１１［，３所謂サンドウィッチ法を使用するベーター２−ミクログロブリンの検 定 実施例■、２により調製した抗ベーター２−ミクログロブリン抗体を含む検出表 面を用いてベーター２−ミクログロブリン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ　ＡＨ）の測定を行った。検出表面に結合させたベーター２−ミクロ グロブリンの測定シグナルを溶液中のその濃度の関数として、直接（第一次応答 ）及び第二次免疫吸着剤−精製抗体によりシグナル増強させた後（第二次応答） の両方の場合につき記録した。ここで前記精製抗体は第一次結合させたベーター ２−ミクログロブリンを介して表面に結合して所謂サンドウィッチ構造を形成す る。この明白で実験的に簡単な方法は少な（とも１０倍低い検出水準を与える。

■　検出表面に吸着させたタンパク質量の測定１．３．１に記述されたカルボキ シメチル変性デキストラン表面に吸着させたタンパク質量の定量を放射能法を用 いて行った。１４（又は３ｓＳでラベルしたタンパク質（免疫グロブリンＧ１キ モトリプシノーゲンＡ及びトランスフェリン）をＳＰＲ測定装置の中に置いた表 面にイオン交換により濃縮した。表面が乾燥した後角度の変化を記録し、ＳＰＲ 測定装置から除いた。次いで表面上のＩ４Ｃラベルタンパク質の量を表面からの ベータ線放射を測定することにより装置中で定量した。放射能法の検量は吸着さ せたタンパク質の表面濃度の絶対値を与える。第４図はＳＰＲ測定装置からの応 答のベータ線測定から得られる表面濃度との関係を示しており、種々な実験条件 で７８の測定を行った。５０ｎｇ／ｍｍ−までのタンパク質濃度を持つ表面が得 られ、これはトランスフェリンの約１０倍密な単層に相当する。これは記述され たヒドロゲルの能力を示し、本発明の生適合性多孔質マトリックスの検出表面を 使用することにより達成される大きな測定シグナル増強効果を実証するものであ る。同様な表面濃度は反応性エステル機能を持つ表面にタンパク質を固定化させ ることにより達成され、このことは種々なＳＰＲ測定における増強された力学の ためタンパク質の「多層結合」を作る可能性を示すものである。

参考文献 Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ　ＲＣ等（１９８９年）、Ｉｓｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　： 　Ｃ１１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔ ｈｅ　１９８０ｓ、Ｎａｋａｗｕｒａ　Ｒ１゜Ｄｉｔｏ　ＷＲ及びＴｕｃｋｅｒ 　ＥＳ編集、■巻：＾ＲＬ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８０．４５〜６４ページ Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ　Ｋ等（１９７３年）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　１ ３３巻、５７３ページ Ｃａｒｌｓｏｎ　Ｊ等（１９７８年）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｓ　１７３巻、７ ２３ページ Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ　ＲＫ等（１９７０年）　、Ｊ　Ｏｒｇ　Ｃｈｅｗ、３５巻 、３１９５ページ Ｃｕ１ｌｅｎ　ＤＣ等（１９７ｇ／　８８年）　、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、　３ 巻、２１１〜２２５ページ Ｇｈｏｓｈ　ＳＳ等（１９８７年）、Ｊ　Ｏｒｇ　Ｃｈｅｗ、　５２巻、８６２ ページＧｕｓｓ　Ｂ等（１９８６年）　、　Ｔｈｅ　ＥＩＢＯＪｏｕｒｎａｌ、 ５巻（７号）、１５６７〜１５７５ページ Ｌｉｅｄｂｅｒｇ　Ｂ等（１９８３年）　、５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕ ａｔｏｒｓ、　４巻、２９９〜３０４ページ Ｉｅｒｒｉｌｌ等（１９８６年）　、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ　ａｎｄＰｈａｒｍａｃｙ、　ｍ巻、Ｐｅｐｐａｓ　ＮＡ編集、１章、ＣＲ ＣＰｒｅｓｓＮｕｚｚｏ　ＲＧ等（１９８３年）　、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏ ｃ、　１０５巻、４４８１〜４４８３ページ ０’５ｈａｎｎｅｓｓｙ　ＤＪ　（１９８５年）　、Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、７巻、３４７ページ Ｐｏｒｔｅｒ　ＩＤ等（１９８７年）　、　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　５ｏｃＳ　１ ０９巻、　３５５９〜３５６８ページ Ｒａｅｔｈｅｒ　Ｈ（１９７７年）　、　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｆ ｉｌｍｓ、Ｂａ５ｓＧ％Ｆｒａｎｃｏｍｂｅ　Ｉ及び■ｏｆｆｍａｎ　Ｒ編集、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１４５〜２６１ペ一ジＲｅｇｅｎ　ＳＬ等（１９８６年） 　、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓａｃ、　１０８巻、６０９４〜６０９５ページ Ｒｉｎｇｄｏｒｆ　Ｈ等（１９８８年）、＾ｎｇｅｗ　Ｃｈｅｗ　Ｉｎｔ　Ｅｄ 　Ｅｎｇｌ。

２７巻、１１３〜１５８ページ Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ　ＥＢ等（１９８８年）　、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、　４巻、３ ６５〜３８５ページ Ｖｏｌａｎｔｅ　ＲＰ　（１９８１年）　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔ、　２２巻、３１１９ページ ＦＩＣ，１ ＦＩ（，２ 相対的応答 μｇ／ｍＱ ＦＩ（，３ 応答 ＦＩＣ，４ タンパク質表面濃度（ｎｇ／ｍｍり 国際調査報告 圓−ｖ−ｍ　４＠＄ａ１ｍ　ｋ　ＰＣＴ／ＳＥ　８９１００６４２国際調査報告 に丁／ＳＥ８９１００６４２

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．銅、銀、アルミニウム及び金からなる群より選ばれる自由電子金属の膜から なり、前記膜の面の１つは有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ（式中、Ｘは 非対称又は対称ジスルフィド（−ＳＳＲ′Ｙ′、−ＳＳＲＹ）、スルフィド（− ＳＲ′Ｙ′、−ＳＲＹ）、ジセレニド（−ＳｅＳｅＲ′Ｙ、−ＳｅＳｅＲＹ）、 セレニド（ＳｅＲ′Ｙ′、−ＳｅＲＹ）、チオール（−ＳＨ）、イソニトリル、 ニトロ（−ＮＯ２）、セレノール（−ＳｅＨ）、３価リン化合物、イソチオシア ネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、 チオ酸又はジチオ酸（シＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）の群の１つに属し、ここでＲと Ｒ′は炭化水素鎖であって好ましくは枝分かれしておらず、場合によりヘテロ原 子により中断されており、及び１０原子を越え、好ましくは１２〜３０原子の長 さであり（非対称分子の場合Ｒ′又はＲはＨであることができる）、及びＹとＹ ′は好ましくは同一であり、既知の本来リガンド又は生適合性多孔質マトリック スを共有結合させるための活性基、例えばヒドロキシル、カルボキシル、アミノ 、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ又はビニル基である）の密に 詰め込まれた単属で被覆されていることを特徴とするバイオセンサーに使用する 検出表面。
2. ２．単層Ｘ−Ｒ−Ｙに結合し、及びそれを介して所望のリガンドを結合させるこ とができる生適合性多孔質マトリックスを含むことを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の検出表面。
3. ３．生適合性多孔質マトリックスはヒドロゲルであることを特徴とする請求の範 囲第２項記載の検出表面。
4. ４．ヒドロゲルは多糖類例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギ ン酸、澱粉及びセルロース、又はこれらのいずれかの誘導体、又は膨潤性有機ポ リマー例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール 又はポリアクリルアミドであることを特徴とする請求の範囲第３項記載の検出表 面。
5. ５．ヒドロゲルはデキストランからなることを特徴とする請求の範囲第４項記載 の検出表面。
6. ６．ヒドロゲルは所望のリガンドを固定化させるためヒドロキシル、カルボキシ ル、アミノ、アルデヒド、カルボニル、エポキシ又はビニル基を含むように誘導 体化され、及び場合により生特異的リガンドを前記基を介して結合させることを 特徴とする請求の範囲第３項又は第４項のいずれか一項記載の検出表面。
7. ７．デキストランは所望のリガンドを固定化させるためカルボキシル、アミノ、 アルデヒド、カルボニル、エポキシ又はビニル基を含むように誘導体化され、及 び場合により生特異的リガンドは前記基又はデキストランのヒドロキシル基を介 して結合させたことを特徴とする請求の範囲第５項記載の検出表面。
8. ８．ヒドロゲルは（ｉ）反対電荷を持つ生体分子の濃縮を実現するための電荷し た基、及び（ｉｉ）検出表面に濃縮した生体分子を共有結合させるための反応性 基を含むように活性化されたことを特徴とする請求の範囲第４項記載の検出表面 。
9. ９．荷電した基はカルボキシル基であり、及び結合基は反応性エステル、ヒドラ ジド又は反応性ジスルフィド含有誘導体であることを特徴とする請求の範囲第８ 項記載の検出表面。
10. １０．デキストランは（ｉ）反対電荷を持つ生体分子の濃縮を実現するための荷 電した基、及び（ｉｉ）検出表面に濃縮した生体分子を共有結合させるための反 応性基を含むように活性化されたことを特徴とする請求の範囲第５項記載の検出 表面。
11. １１．デキストランはカルボキシル基で活性化され、前記カルボキシル基の一部 分は反応性エステル、ヒドラジド、チオール又は反応性ジスルフィド含有誘導体 の形態に活性化されたことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の検出表面。
12. １２．反応性ジスルフィド含有誘導体は反応性エステルと２−（２−ピリジニル ジチオ）エタナミンとの間の反応により形成されることを特徴とする請求の範囲 第９項又は第１１項のいずれか一項記載の検出表面。
13. １３．２−アミノエタンチオール誘導体を含むことを特徴とする請求の範囲第９ 項又は第１１項のいずれか一項記載の検出表面。
14. １４．単層Ｘ−Ｒ−Ｙに結合するリガンドを含むことを特徴とする請求の範囲第 １項記載の検出表面。