JPS5916669B2 - 抗原又は抗体の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 フ 本発明は、免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜を
形成させる方法、更に詳しく言えば、特異的な抗体蛋白
質を抗原蛋白質に結合させると同時に抗体蛋白質の活性
部位の一部を以後の免疫反応のため活性状態に維持させ
る方法に関する。

本発明ヌ はまた、免疫学的に活性な大粒径の蛋白質お
よびそれと特異的に反応する小粒径の蛋白質を検出する
方法、更に詳しく言えば、蛋白質の一分子層および二分
子層の間のコントラストを改善する方法にも関する。と
ころで、免疫反応は極めて特異的な生化学的反応である
。

それによれば、抗原と呼ばれる第１の蛋白質がそれに対
して特異的な抗体と呼ばれる第２の蛋白質と結合して免
疫学的に複合した蛋白質を生成する。動物や人間のごと
き生体系内において起る免疫反応は病気との闘争という
点で重要である。生体系内に異種蛋白質（すなわち抗原
）が侵入した場合、現在ではまだ十分に解明されていな
い過程により、抗原に対して特異的な抗体が産生される
。かかる抗体の分子は抗原の分子上の対応箇所に対して
相補的な化学結合部位を有している結果、抗原および抗
体は化学的に結合し、それにより免疫学的に複合した蛋
白質を生成する。生体系は異種蛋白質の侵入に応答して
抗体を産生するから、生体系内に存在する抗体を検出す
ることは、その生体系内が暴露された抗原を判定する点
で医学診断上の価値を有する。逆に、生体系内における
ある種の抗原の存在を検出することもまた医学診断上の
価値を有する。このような抗原の検出による診断の実例
としては、妊娠試験としての尿中におけるＨＣＧ蛋白質
分子の検出並びに予定供血者の血液中における肝炎関連
抗原分子の検出が挙げられる。かかる診断試験を実施す
るためには、免疫学的に反応する１対の蛋白質の少なく
とも一方が入手されなければならない。現在知られてい
る抗原の唯一の源泉は生体系である。

更に詳しく言えば、異種蛋白質の導入に対して免疫反応
を示すことが知られているのは背椎動物のみである。た
とえば、抗原に暴路されたことのある動物や人間の血清
中には多数の対応する抗体が見出される。他方、多くの
抗原は実験室的な培養物中において制御可能に産生させ
ることができる。しかしながら、ある種の抗原たとえば
肝炎関連抗原は抗体と同じく現在では高等動物の生体系
からしか入手することができない。大抵の抗原は蛋白質
であるかあるいは本質的な成分として蛋白質を含有する
一方、全ての抗体は蛋白質である。

蛋白質は高分子量の巨大分子である。換言すれば、蛋白
質は種々の数のアミノ酸の連鎖から成る重合体であるか
ら、抗原および抗体蛋白質はそれぞれ幾つかの結合部位
を有し得る。主要な５種の抗体蛋白質（免疫グロブリン
ＧＧｌｇＭ．ＩｇＡ．ｌｇＥおよびＩｇＤ）のそれぞれ
は、明らかに、少なくとも２本の重ペプチド鎖および少
なくとも２本の軽ペプチド鎖から成ることを特徴とする
。ペプチド結合として知られるのはアミノ酸単位の間の
結合であるが、これらの重ペプチド鎖および軽ペプチド
鎖は概してＹ字形に配列している。そして、ＧＧ抗体蛋
白質の場合、活性部位すなわち結合部位はＹ字形の２本
の腕部の末端に位置している。免疫反応は、金属被覆ガ
ラススライドまたは金属スライドのごとき適当な基体の
使用をはじめとする各種の技術によつて検出することが
できる。

かかる基体を抗原蛋白質の溶液に暴露した場合、抗原蛋
白質は緻密な一分子層を成して基体の表面上に物理的に
吸着する。次いで、その抗原蛋白質に対する抗体蛋白質
を含有する血清に上記の被覆基体を暴露すれば、免疫反
応が起る。すなわち、抗原蛋白質分子上の対応箇所と相
補的な抗体蛋白質分子土の結合部位を介して抗体蛋白質
が抗原蛋白質と選択的に結合する結果、基体表面上には
免疫学的に複合した蛋白質の少なくとも部分的な二分子
層が形成される。ところで、かかる抗原一抗体蛋白質複
合体を有する被覆基体が引続いて同じ抗原蛋白質を含有
する溶液または同じ抗原蛋白質を含有するかどうか疑わ
れる溶液に暴露される場合に問題が生じる。

すなわち、このような暴露を行なつても、もはや抗原蛋
白質は抗体蛋白質と結合しないのが普通である。なぜな
ら、最初の抗原蛋白質層においては抗原蛋白質分子同士
が密接しているため、抗体蛋白質のあらゆる活性部位は
既に抗原蛋白質分子と結合してしまつているからである
。このように、表面免疫学の場合には、抗体蛋白質が（
抗原蛋白質層の）表面に結合すれば抗体蛋白質の活性（
すなわち、更に抗原蛋白質、細胞またはウイルスと結合
する能力）が失なわれるという問題が存在している。ま
た、とりわけ吸着された抗原蛋白質層が相対的に厚い場
合には、基体上における蛋白質の一分子層と二分子層と
を識別することが不可能であるという問題も良く起る。

たとえば、肝炎関連抗原のように、抗原蛋白質分子がそ
れに対する抗体蛋白質分子より少なくとも１０倍ほど大
きい場合にそれが言える。さて本発明に従つて簡潔に原
えば、免疫学的に活性な抗原蛋白質を含有する溶液に免
疫学的に不活性な蛋白質が添加される。

次いで、かかる溶液中に基体を浸漬すれば、基体の表面
は吸着により抗原蛋白質分子および不活性蛋白質分子の
一分子層で被覆される。その場合の不活性蛋白質分子の
量は、吸着層中の抗原蛋白質分子同士が不活性蛋白質分
子により平均して数百オングストロームだけ隔離される
ように選ばれる。かかる抗原蛋白質と特異的に反応する
抗体蛋白質を含有する溶液中に上記の被覆基体を浸漬す
れば、抗体蛋白質分子は抗原蛋白質分子と化学的に結合
する一方、抗体蛋白質分子の活性部位の一部はなお活性
状態を維持する。その結果、抗原蛋白質を含有するかど
うか疑われる溶液中に上記の被覆基体を引続いて浸漬す
れば、第１の抗原蛋白質層と結合した抗体蛋白質分子の
活性部位に抗原蛋白質分子が更に付着することとなる。
このように、本発明は特定の抗原蛋白質の存在を検出す
ることを目的とする溶液の分析のために利用できる。更
にまた、同じ抗体蛋白質および抗原蛋白質を含有する溶
液中に上記の被覆基体を交互に浸漬すれば、基体の表面
から抗原一抗体蛋白質複合体の比較的長い連鎖を伸長さ
せることもできる。かかる方法は細胞やウイルスを免疫
学的に同定するために利用することが可能である。なぜ
なら、細胞やウイルスの表面が不規則であつたとしても
、抗原一抗体蛋白質複合体の連鎖末端の抗体蛋白質分子
の幾つかが特定の細胞やウイルス上の抗原部位を見出す
確率は比較的高いと言えるからである。本発明に従えば
また、免疫学的に活性な相対的に大粒径の抗原蛋白質を
含有する溶液に免疫学的に不活性な蛋白質が添加される
。

次いで、かかる溶液中に基体を浸漬すれば、基体の表面
は吸着により抗原蛋白質分子および不活性蛋白質分子の
一分子層で被覆される。その場合、抗原蛋白質分子の各
々は不活性蛋白質分子によつて全面的に包囲されている
。かかる抗原蛋白質と特異的に反応する相対的に小粒径
の抗体蛋白質を含有する第２の溶液中に上記の被覆基体
を浸漬すれば、抗体蛋白質分子は抗原蛋白質分子と化学
的に結合し、それにより基体上には蛋白質の少なくとも
部分的な二分子層が形成される。ところで第１の一分子
層中における不活性蛋白質分子の量は、抗原蛋白質分子
同士が密接していると仮定した場合よりも多数の抗体蛋
白質分子を抗原蛋白質分子と結合させるため、抗原蛋白
質分子同士が十分に隔離されるように選ばれる。その結
果、基体土に設置された蛋白質の一分子層および二分子
層の間のコントラストは著しく改善されることになる。
このように本発明は、大粒径の抗原蛋白質（たとえば肝
炎関連抗原）のみの一分子層と小粒径の抗体蛋白質（た
とえば肝炎抗体）の第２の層をも含んだ二分子層とを識
別するための簡単な方法を提供するものであり、従つて
抗体蛋白質の存在を判定することを目的とする溶液の分
析のために利用できる。本発明の構成および実施方法は
、添付の図面に関連してなされる以下の記載を読めば最
も良く理解されるはずである。先ず第１図を参照すれば
、適当な基体材料の薄板１０から成る診断装置の一部の
拡大立面図が示されている。

かかる基体材料は金属、ガラス、雲母、プラスチツク、
溶融シリカ、石英などであり得る。とは言え、蛋白質に
対する屈折率の差が最大である点から見れば金属が好適
であつて、とりわけ金属スライドまたは金属被覆ガラス
スライドとして使用することが好ましい。問題となる蛋
白質（生物学的に見れば抗原または抗体）を含有する塩
水から通例成る第１の溶液中に基体１０を浸漬すると、
その蛋白質の分子１１は一分子層を成して基体１０上に
吸着する。なお本発明の説明に際し、以後、基体１０の
表面上に吸着した蛋白質分子１１の一分子層は抗原蛋白
質層として記載される。任意の蛋白質がかかる一分子層
を成して吸着するが、それ以上の吸着は起らない。すな
わち、蛋白質は基体には付着するけれども、それ自体に
は付着しないのである。従つて、かかる抗原蛋白質層は
一分子層に過ぎないわけで、それ以上の厚さを有するこ
とはあり得ない。抗原蛋白質で基体を完全に被覆するの
に要する時間は、溶液中の抗原蛋白質の濃度、溶液の撹
拌の度合および溶液の温度に依存する。たとえば、１％
ウシ血清アルブミン溶液がスライドを抗原蛋白質の一分
子層で完全に被覆するには約３０分要する。実質的に基
体１０の表面全域にわたつて抗原蛋白質分子１１の一分
子層が形成された後、被覆基体は抗原蛋白質の溶液から
取出され、次いで抗原蛋白質と特異的に反応する抗体蛋
白質を含有する溶液または含有するかどうか疑われる溶
液中に浸漬される。

かかる第２の溶液は、検出の対象とすべき特異的に反応
する抗体蛋白質以外に多数の成分を含有していてもよい
。とは言え、特異的に反応する抗体蛋白質以外の蛋白質
が基体上の抗原蛋白質層に付着することはない。それ故
、特異的に反応する抗体蛋白質が第２の溶液中に存在す
る場合に限り、抗原蛋白質およびそれと特異的に反応す
る抗体蛋白質の間の免疫学的複合が起るから、一定時間
後に基体は蛋白質の二分子層を有することになる。被覆
基体上に第２の（抗体蛋白質分子１２の）一分子層が付
着するのに要する時間もまた、溶液中の抗体蛋白質の濃
度、溶液の攪拌の度合および溶液の温度に依存する。血
清中の抗体蛋白質の場合、その時間は１田こも上り得る
。かかる第２の一分子層は、上記の３つの要因に応じ、
部分的なものに過ぎないこともあれば実質的に完全なも
のであることもある。第１図に示されたごとく、抗原蛋
白質層が基体１０を実質的に完全に被覆している場合、
すなわち隣接する抗原蛋白質分子同士の間隔が最小であ
る場合、抗体蛋白質分子は実質的に全ての活性部位を使
つて抗原蛋白質分子と結合し、そしてその活性を失なう
。

換言すれば、抗体蛋白質分子１２上における実質的に全
ての活性部位が抗原蛋白質分子１１上における対応した
結合部位と結合してしまうのである。なお、このような
基体被覆方法は、１９７２年６月２６日に提出されかつ
本発明と同じ受託者に委託された「蛋白質や抗体の検出
および精製のための方法並びに装置］と題する米国特許
出願第２６６２７８号明細書中に記載されている。第１
図の場合、実質的に基体１０の表面全域にわたつて抗原
蛋白質分子１１の一分子層が吸着しているため、かかる
抗原蛋白質に対して特異的な抗体蛋白質分子１２の一分
子層がそれと結合して二分子層を形成すると、抗原蛋白
質であれ抗体蛋白質であれ、追加の蛋白質が結合するこ
とはもはや不可能となる。

なぜなら、第２の一分子層中の抗体蛋白質分子１２上に
はもはや活性部位が残つていないからである。ところで
本発明においては、第２の一分子層中の抗体蛋白質分子
１２の第１の一分子層中の抗原蛋白質分子１１と結合さ
せると同時に、以後の免疫反応に際して追加の抗原蛋白
質分子と更に結合し得るよう抗体蛋白質分子１２の活性
部位の一部を活性状態に維持させるための方法が発見さ
れた。本発明の基礎は、第２図に示されている通り、基
体１０の表面上に吸着した抗原蛋白質分子１１の一分子
層を形成させる工程に関係している。図解の便宜上、抗
体蛋白質はＩｇＧ種のものとして示されているが、前述
のごとき他の４種の抗体蛋白質が本発明において使用で
きないというわけではない。 ″免疫学的
に複合した蛋白質の多分子膜を形成させるための基体１
０を選択した後、第１図に関連して上記に記載された方
法の場合と同じく、抗原蛋白質を含有する塩水から通例
成る第１の溶液中にかかる基体が浸漬される。ただし上
記の方法とは異なり、本発明方法の場合には基体の浸漬
に先立つて免疫学的に不活性な蛋白質が第１の溶液に添
加される。その結果、第２図に示される通り、基体１０
の表面上に形成された吸着層は不活性蛋白質分子２０に
より互いに隔離され（かつ基体表面に沿つて包囲された
）抗原蛋白質分子１１から成ることになる。なお第１の
溶液に添加される不活性蛋白質の量は、基体１０に付着
した隣接する抗原蛋白質分子１１同士の平均間隔が一般
に数百オングストロームとなるように選ばれる。こうし
て（抗原蛋白質および不活性蛋白質の）一分子層で被覆
された基体１０が第１の溶液から取出され、次いで第１
の溶液中の抗原蛋白質に対して特異的な抗体蛋白質を含
有する第２の溶液中に浸漬される。

（ＩｇＧ種の）抗体蛋白質分子１２の活性部位同士の間
隔は２００オングストロームであるから、抗原蛋白質分
子１１と結合した第２の溶液中の抗体蛋白質分子１２の
大部分はなお活性部位を保有する（抗体蛋白質分子の種
類に応じて分子１個当り１つ以上の活性部位が残留し得
る）。このように抗体蛋白質分子１２が活性状態に維持
される結果、以後の免疫反応に際して追加の抗原蛋白質
分子と更に結合することが可能となる。勿論、１個の抗
体蛋白質分子が１個の抗原蛋白質分子上における１つ以
上の結合部位と結合できないことは言うまでもない。従
つて第２図に示される通り、隣接する抗原蛋白質分子１
１同士が不活性蛋白質分子２０によつて十分に隔離され
ている結果、抗体蛋白質分子１２は抗原蛋白質分子１１
と結合しながらも、一般に各抗体蛋白質分子１２の活性
部位１２ａは以後の免疫反応のため活性状態に維持され
ることになる。このようにして、抗体蛋白質分子を（抗
原蛋白質の一分子層の）表面に結合させると同時に抗体
蛋白質分子の活性部位の一部を以後の免疫反応のため活
性状態に維持させるという本発明の主たる目的の１つが
達成されたわけである。抗原蛋白質がヒト血清アルブミ
ンである場合、不活性蛋白質はたとえば卵白アルブミン
であり、また抗体蛋白質はウサギ血清から入手される。
なお１％ヒト血清アルブミン溶液の場合、不活性蛋白質
としての卵白アルブミン濃度は１〜１０％の範囲内にあ
る。次いで第３図を参照すれば、抗体蛋白質の溶液から
取出された後（すなわち第２図に示された工程を施され
た後）、二分子層で被覆された基体１０が第１の溶液の
場合と同じ抗原蛋白質を含有する溶液または含有するか
どうか疑われる溶液中に浸漬される。

その結果、再び免疫反応が起るため、抗原蛋白質分子３
０が抗体蛋白質分子１２の残留活性部位１２ｇと選択的
に結合する。このような方法は、特定の抗原の存在を容
易に検出することを目的とする溶液の分析のために利用
できる。それはまた、基体１０の表面を起点として抗原
抗体蛋白質複合体の多数の連鎖を伸長させ、それによつ
て免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜を形成させるた
めにも使用できる。かかる多分子膜は、楕円偏光計のご
とき光学機器を用いて被覆基体を観察することにより容
易に確認できる。あるいはまた、前述の米国特許出願第
２６６２７８号および１９７３年７月３０印こ提出され
た同第３８４１１３号明細書中に詳しく記載されている
ごとく、かかる多分子膜を電気的に検査することもでき
る。そのためには、金属基体または金属被覆基体と水銀
滴またはその他の適当な電極によつて形成された導電板
および蛋白質層によつて形成された誘電体から成る蓄電
器の電気容量を測定すればよい。更にまた、上記の特許
出願明細書中に記載のごとく、かかる多分子膜を肉眼観
察によつて光学的に検査することもできる。そのために
は、蛋白質層上に設置された水銀滴と基体上に被覆され
た金属薄膜との間で可視的なアマルガムが生成するまで
の時間を測定すればよい。最後に、最も重要なものであ
るが、かかる多分子膜を上記の特許出願明細書中に記載
のごとく反射光または透過光によつて光学的に検査する
こともできる。このような反射光または透過光による光
学的検査のうち、成功をもたらした第１の技術（透過光
による光学的検査）が以下に示される。先ず、光透過性
材料たとえばガラス、プラスチツク、溶融シリカ、雲母
、石英などから成る基体１０が用意される。なお、好適
な基体材料はガラスであつて、とりわけ顕微鏡用ガラス
スライドの使用が簡便である。かかる基体が、金属（た
とえばインジウム）の蒸着ににより、多数の金属球体で
被覆される。そのためには、たとえば、水銀柱約５×１
０−５ｍ１Ｌの常用真空中においてインジウムをタンタ
ール製ボートからガラス製基体上へゆつくりと蒸着させ
ればよい。インジウム原子は基体の表面上において大き
い移動性を示し、しかもガラス製基体をほとんど濡らさ
ないため、基体上に蒸着したインジウムは集合して小さ
な球体となる。同様な特性を有しており、従つて基体上
に蒸着させた場合に球体を形成するものであれば、任意
の金属が使用できる。実際、インジウム以外に金、銀、
スズおよび鉛を使用した場合にも成功が得られた。かか
る金属の蒸着は基体が淡褐色となるまで継続される。こ
の時点において、金属球体は１０００λ程度の直径を有
する。金属球体の正確な寸法は重要でないが、その直径
は可視スペクトルの大部分の波長に等しくなければなら
ない。次の工程は、免疫学的に活性な第１の蛋白質（た
とえば抗原蛋白質）および免疫学的に不活性な蛋白質を
含有する第１の溶液中に金属球体で被覆された基体１０
を浸漬することである。第１の蛋白質および不活性蛋白
質はやはり一分子層を成して基体および金属球体上に付
着する。一分子層が形成された後、被覆基体は第１の溶
液から取出され、次いで第１の蛋白質と特異的に反応す
る蛋白質を含有する第２の溶液中に浸漬される。その結
果、（金属球体のないことを別にすれば）第２図の場合
と同じく、基体および金属球体には蛋白質の二分子層が
付着することになる。かかる被覆基体が第２の溶液から
取出され、次いで第１の溶液中のものと同じ第１の蛋白
質を含有する第３の溶液または含有するかどうか疑われ
る第３の溶液中に浸漬される。もし第１の蛋白質が存在
すれば、基体上には第３の一分子層（または部分的な一
分子層）が形成される。こうして得られた被覆基体が透
過光によつて観察され、そして被覆基体の外観から蛋白
質層の膜厚従つて問題の蛋白質の有無に関する判定が下
される。その際、蛋白質層の膜厚は被覆基体において観
察される褐色の色調の変化に対応する。このような変化
は極めて顕著なものであり、従つて蛋白質層の検出は全
く簡単な作業である。基体上に単独で存在する金属球体
がある色調の褐色に見えるとすれば、蛋白質の一分子層
で被覆された金属球体は暗い色調の褐色を示し、蛋白質
の二分子層で被覆された金属球体は一層暗い色調の褐色
を示し、そして蛋白質の三分子層で被覆された金属球体
はなお一層暗い色調の褐色を示す。かかる検出方法は、
電磁放射線が入射エネルギーの大部分の波長に等しい直
径を持つた導電性球体によつて著しく散乱され、しかも
その場合における散乱の度合は球体は付着した薄い絶縁
性被膜によつて大きく左右されるという事実に基づいて
いる。次に、成功をもたらした第２技術（反射光による
光学的検査）が以下に示される。先ず、金製の基体が用
意される。とは言え、経済的な理由から、他種金属上に
薄い金属をめつきしたものを使用する方が好ましい。か
かる基体を上記のごとき第１の溶液中に浸漬すれば、第
１の蛋白質１１および不活性蛋白質の一分子層が吸着す
る。ところで、金は可視スペクトルの内部に吸収帯を有
し、そのため特有の色を呈する。この事実がかかる光学
的検査技術の動作原理を与えるのである。なお、金属基
体としては先ず薄いインジウム層次に金属で被覆された
ガラススライドを使用するのが簡便であつて、その場合
のインジウム層はガラスと金との間の付着力およびスラ
イドの光学的特性を改善するのに役立つ。波長の関数と
しての金製基体の相対反射率は、蛋白質層が全く付着し
ていない場合、金特有の鮮やかな黄色を与える。しかる
に、基体上に蛋白質の一分子層が存在すると、試験用ス
ライド（すなわち基体）は鈍い黄色の外観を呈する。次
いで、第１の分分子層中に不活性蛋白質２０と共に存在
する蛋白質１１と特異的に反応する蛋白質１２の溶液に
暴露すれば、試験用スライド蛋白質の二分子層を有する
ことになり、そしてその反射特性のために緑色の外観を
呈する。更に第３の一分子層が存在すると、なお一層緑
色の外観が得られる。これまでに実施された試験のうち
では、金属球体を含む基体を用いた透過光による光学的
検査および金製基体を用いた反射光による光学的検査が
全般にわたつて最も有用であると思われた。更にまた、
これら２つの技術は問題となる蛋白質層の膜厚に応じて
相異なる感度を有することも確認された。更に詳しく言
えば、金属球体を含む基体を用いる技術の最大感度は約
２００λ以下の膜厚に関して達成されるのに対し、金製
基体を用いる技術の最大感度は３０λを越える膜厚に関
して達成される。従つて、使用する検出方法に応じ、各
々の分析において使用すべき基体１０の種類が決定され
る。すなわち、やはり前述の特許出願明細書中に記載の
ごとく、基体としての金属スライドまたは金属被覆ガラ
ススライドが平担な金属（たとえば金）被膜および金属
（たとえばインジウム）球体のいずれを有するべきかが
決定されることになる。なお簡略化のため、基体１０は
平担な表面を有するものとして図示されているが、第１
の一分子層が吸着する表面は上記の金属球体を含んでい
てもよいことが了解されるべきである。第３図に示され
るごとく、免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜（三層
膜）を形成させるための本発明方法は、ある種の蛋白質
に関して溶液を試験する際に特に重要である。

かかる蛋白質としては、それ自体およびそれに対する抗
血清が一般に入手し得ることから見れば、ホルモンが挙
げられる。実際、第３の一分子層が問題のホルモンであ
る場合、それは容易に検出することができる。最後に、
免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜を形成させるため
の本発明方法はまた、細胞やウィルスを免疫学的に同定
する際にも重要である。すなわち第４図に示されている
通り、基体１０の表面から抗原一抗体蛋白質複合体の多
数の連鎖を伸長させれば、連鎖末端の抗体蛋白質分子の
幾つかが細胞またはウイルス４０上の抗原部位を見出す
確率は比較的高くなる。その上、細胞またはウイルスの
表面が不規則であつたとしても、その確率はやはり高い
。公知の通り、各細胞を包囲している細胞膜からは、「
移植抗原」と呼ばれる分子が外方に伸びている。細胞４
０を免疫学的に同定するための二層系の場合、第１の一
分子層１１を形成するのはかかる移植抗原であつて、問
題の細胞が第３の蛋白質層を構成する。また、第４図に
示されたような四層系の場合には、第１および第３の一
分子層（それぞれ１１および３０）が移植抗原から成る
。同様に、ウイルスは蛋白質分子から成る外被を有して
いて、かかる蛋白質分子は切断分離し得ることも公知で
ある。ウイルス４０を免疫学的に同定するための二層系
における第１の分子層、そしてまた四層系における第１
および第３の一分子層を形成するのはかかる蛋白質分子
である。なお第２および第４の一分子層を成す抗体蛋白
質（それぞれ１２および４１）は、勿論、同定すべき特
定の細胞またはウイルスに対して特異的なものである。
以上の記載から明らかな通り、本発明に従えば、活性状
態を維持させながら抗体蛋白質を表面に結合させること
によつて基体土に免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜
を形成させるための新規な方法が提供される。

そのためには、免疫学的に活性な抗原蛋白質を含有する
第１の溶液に十分な量の免疫学的に不活性な蛋白質が添
加される。かかる第１の溶液中に適当な基体を浸漬すれ
ば、吸着により、抗原蛋白質分子および不活性蛋白質分
子の一分子層が基体の表面上に形成される。その場合、
抗原蛋白質分子同士は不活性蛋白質分子によつて隔離さ
れている。かかる一分子層の形成後、抗原蛋白質に対し
て特異的な抗体蛋白質を含有する第２の溶液中に上記の
被覆基体を浸漬すれば、抗体蛋白質分子は抗原蛋白質分
子と結合する一方、抗体蛋白質分子の活性部位の一部は
以後の免疫反応のために活性状態を維持する。従つて、
第１の溶液中のものと同じ抗原蛋白質を含有する溶液ま
たは含有するかどうか疑われる溶液中に上記の被覆基体
を引続いて浸漬することができる。このような操作を繰
返せば、抗原一抗体蛋白質複合体の多数の連鎖を伸長さ
せることも可能なわけである。次に第５図を参照すれば
、やはり適当な基体材料の薄板１０から成る診断装置の
一部の拡大立面図が示されている。

かかる基体材料は金属、ガラス、雲母、プラスチツク、
溶融シリカ、石英などであり得る。とは言え、蛋白質に
対する屈折率の差が最大である点から見れば金属が好適
であつて、とりわけ金属スライドまたは金属被覆ガラス
スライドとして使用することが好ましい。問題となる蛋
白質（生物学的に見れば抗原または抗体）を含有する塩
水から通例成る第１の溶液中に基体１０を浸漬すると、
その蛋白質の分子１１は一分子層を成して基体１０上に
吸着する。なお本発明の説明に際し、以後、基体１０の
表面上に吸着した蛋白質分子１１の一分子層は抗原蛋白
質層として記載される。任意の蛋白質がかかる一分子層
を成して吸着するが、それ以上の吸着は起らない。すな
わち、蛋白質は基体には付着するけれども、それ自体に
は付着しないのである。従つて、かかる抗原蛋白質層は
一分子層に過ぎないわけで、それ以上の厚さを有するこ
とはあり得ない。抗原蛋白質で基体を完全に被覆するの
に要する時間は、溶液中の抗原蛋白質の濃度、溶液の撹
拌の度合および溶液の温度に依存する。たとえば、１η
／ｍｌの濃度の肝炎関連抗原溶液がスライドを抗原蛋白
質の一分子層で完全に被覆するには約１０分を要する。
実質的に基体１０の表面全域にわたつて抗原蛋白質分子
１１の一分子層が形成された後、被覆基体は抗原蛋白質
の溶液から取出され、次いで抗原蛋白質と特異的に反応
する抗体蛋白質を含有する溶液または含有するかどうか
疑われる溶液中に浸漬される。

なお本発明の説明に当つては、基体１０の表面上に吸着
した抗原蛋白質分子１１と特異的に反応して第２の一分
子層を形成する抗体蛋白質分子に比べると、抗原蛋白質
分子１１は常に大きな粒径を有するものと仮定される。
上記の第２の溶液は、検出の対象とすべき特異的に反応
する小粒径の抗体蛋白質以外に多数の成分を含有してい
てもよい。とは言え、特異的に反応する抗体蛋白質以外
の蛋白質が基体上の抗原蛋白質層に付着することはない
。それ故、特異的に反応する抗体蛋白質が第２の溶液中
に存在する場合に限り、抗原蛋白質およびそれと特異的
に反応する抗体蛋白質の間の免疫学的複合が起るから、
一定時間後に基体は蛋白質の二分子層を有することにな
る。被覆基体土に第２の（抗原蛋白質分子１２の）一分
子層が付着するのに要する時間もまた、溶液中の抗体蛋
白質の濃度、溶液の撹拌の度合および溶液の温度に依存
する。血清中の抗体蛋白質の場合、その時間は１田こも
上り得る。かかる第２の一分子層は、上記の３つの要因
に応じ、部分的なものに過ぎないこともあれば、実質的
に完全なものであることもある。第５図に示されたごと
く、抗原蛋白質層が基体１０を実質的に完全に被覆して
いる場合、すなわち隣接する抗原蛋白質分子同士の間隔
が最小である場合、個々の抗原蛋白質分子と結合し得る
抗体蛋白質分子１２の数は限られて一しまう。

なぜなら、かかる免疫学的複合のために利用し得る抗原
蛋白質分子表面積が限られているからである。な こお
、このような基体被覆方法は前述の米国特許出願第２６
６２７８号明細書中に記載されている。第５図の場合、
実質的に基体１０の表面全域にわたつて抗原蛋白質分子
１１の一分子層が吸着しているため、かかる抗原蛋白質
に対して特異的な １小粒径の抗体蛋白質分子１２の一
分子層がそれと結合すれば二分子層が形成される。しか
るに、第２の一分子層中の抗体蛋白質分子１２は第１の
一分子層中の抗原蛋白質分子１１よりも粒径が小さく、
しかも第２の一分子層は第１の一分子層ほど ｌ緻密で
ないため、基体１０上における蛋白質の一分子層と二分
子層とを識別するのにかなりの困難が伴なうことは明ら
かである。このような事情を示す良い実例としては、第
１の一分子層中の抗原蛋白質分子１１が肝炎関連抗原で
あり、そして第 ２２の一分子層中の抗体蛋白質分子１
２が肝炎関連抗原に対して特異的な抗体である場合が挙
げられる。楕円偏光計のごとき光学機器を用いて被覆基
体を検査しても、基体上における（抗原蛋白質の）一分
子層と部分的な（抗原一抗体蛋白質複合体の）２二分子
層とを識別することは容易でない。従つて、第２の洛液
が肝炎関連抗原に対する抗体を本当に含有するかどうか
が簡単には決定できないわけであるから、かかる診断試
験はほとんど価値を有しない。ところで本発明において
は、第１の一分子 ５子層中の抗原蛋白質分子１１に一
層多数の抗体蛋白質分子１２を結合させ、それによつて
蛋白質の一分子層および二分子層の間のコントラストを
著しく改善するための方法が発見された。本発明の基礎
は、第６図に示されている通り、基体１０の ３表面上
に吸着した抗原蛋白質分子１１の一分子層を形成させる
工程に関係している。図解の便宜上、抗体蛋白質はＩｇ
Ｇ種のものとして示されているが、前述のごとき他の４
種の抗体蛋白質が本発明において使用できないというわ
けではない。免疫学的に複合した蛋白質の二分子層を形
成させるための基体１０を選択した後、第５図に関連し
て上記に記載された方法の場合と同じく、抗原蛋白質を
含有する塩水から通例成る第１の溶液中クにかかる基体
が浸漬される。

ただし上記の方法とは異なり、本発明方法の場合には基
体の浸漬に先立つて免疫学的に不活性な蛋白質が第１の
洛液に添加される。その結果、第６図に示される通り、
基体１０の表面上に形成された吸着層は不活性蛋白質分
子２０により互いに隔離され（かつ基体表面に沿つて包
囲され）た相対的に大粒径の抗原蛋白質分子１１から成
ることになる。以後の免疫反応時における抗体蛋白質分
子との結合のために抗原蛋白質１１の一層大きな表面積
（従つて一層多数の結合部位）が利用できるようにする
ため、不活性蛋白質分子２０は抗原蛋自質分子１１に比
べて少なくとも多少（好ましくは実質的に）小さな粒径
を有している。なお第１の酵液に添加される不活性蛋白
質の量は、一般に、不活性蛋白質が吸着層の全面積の１
／２〜９／１０を占め、それに対応して抗原蛋白質が全
面積の１／２〜１／１０を占めるように選ばれる。とは
言え、これは本発明に対する制限条件ではない。なぜな
ら、隣接する抗原蛋白質分子同士の平均間隔を決定する
要因としては、個々の抗原蛋白質分子上における結合部
位の数およびかかる分子が基本に付着する様式、換言す
れば露出状態に維持される結合部位の数もまた考えられ
るからである。要するに、本発明の利益を最大限に活用
するためには、抗体蛋白質分子１２が抗原蛋白質分子１
１よりも遥かに小さければ抗原蛋白質分子同士の間隔を
大きくすることが望ましいのに対し、抗体蛋白質分子１
２が抗原蛋白質分子１１より僅かに小さいだけならば抗
原蛋白質分子同士の間隔が小さくても差支えない。この
ように抗原蛋白質分子１１が不活性蛋白質分子２０より
も犬きい粒径を有する結果、抗原蛋白質分子の表面の大
部分が露出状態に維持され、従つてそれに対応した結合
部位が以後の免疫反応時における抗体蛋白質との結合の
ために利用できるわけである。こうして（抗原蛋白質お
よび不活性蛋白質の）一分子層で被覆された基体１０が
第１の洛液から取出され、次いで第１の洛液中の抗原蛋
白質に対して特異的な抗体蛋白質を含有する第２の溶液
中に浸漬される。

第５図と違つて第６図の場合には、抗原蛋白質分子が小
粒径の不活性蛋白質分子によつて包囲されているため、
抗原蛋白質分子上には一層大きな表面積（従つて一層多
数の結合部位）が露出されている。従つて、第５図中の
抗原蛋白質分子は第５図中のものより多数の抗体蛋白質
と免疫学的に結合することが容易である。このように第
６図の場合には、一般的に言つて、第５図の場合よりも
多数の抗体蛋白質分子１２が各々の抗原蛋白質分子１１
と結合する。

ここで第５図と第６図とを比較すれば、（第２の一分子
層中に存在する抗体蛋白質分子の数が多いことから見て
）蛋白質の一分子層およど二分子層の間のコントラスト
は第６図の場合の方が大きいことは明らかである。実例
を述べれば、第１の洛液は肝炎関連抗原が一分子層の全
面積の１／４を占めかつウシ血清アルブミンが残りの３
／４を占めるような濃度で肝炎関連抗原およびウシ血清
アルブミンを含有する？液であり、また第２の溶液は肝
炎抗体の希薄な洛液である。このように上記の方法は、
相対的に大粒径の抗原蛋白質に対する抗体蛋白質の存在
を容易に検出することを目的とする溶液の分析のために
利用できる。こうして二分子層で被覆された第６図の基
体はまた、第７図に示されるような第３の一分子層を形
成させるため、第２の一分子層中の抗体蛋白質に対する
第２の抗体蛋白質を含有する第３の醇液または血清中に
引続いて浸漬することができる。

第２の一分子層中の抗体蛋白質分子１２の各々は数個の
抗原デテルミナントを有するから、一般にそれは第２の
抗体蛋白質の数個の分子３０と結合し、それによつて相
対的に稠密な第３の一分子層を形成し得る。かかる稠密
な第３の一分子層の存在は、第２の一分子層の存在を表
わすのは勿論のこと、（抗原蛋白質の）一分子層および
（抗原蛋白質一第１の抗体蛋白質の）二分子層の間のコ
ントラストの著しい改善をもたらす。この場合、第１の
一分子層中において大粒径の抗原蛋白質分子１１同士の
間に不活性蛋白質分子２０が存在することはまた、第２
の抗体蛋白質を含有する血清中の非特異的蛋白質が基体
に付着するのを防止するためにも役立つ。このように、
不活性蛋白質を用いて大粒径の抗原蛋白質分子同士を隔
離しかつ各各の抗原蛋白質分子周囲の基体表面を被覆し
た結果、各々の抗原蛋白質分子に対して特異的に結合す
る抗体蛋白質分子の数が増加すると同時に、基体上に非
特異的に結合する蛋白質分子の数が減少するという二重
の利益が得られることになる。結局、第３の溶液中に被
覆基体を浸漬することが一子層および二分子層（最終的
には三分子層）の間のコントラストを著しく改善する点
から見れば、第７図中の第３の一分子層を形成させるた
めの工程は第１の抗体蛋白質を含有するかどうか疑われ
る第２の洛液の分析に際して有用であると言える。第６
図の場合における第２の（抗体蛋白質分子１２の）一分
子層の存在、そしてまた第７図の場合における第３の（
抗体蛋白質分子３０の）一分子層の存在は、楕円偏光計
のごとき光学機器を用いて被覆基体を観察することによ
つて容易に確認できる。あるいはまた、前述の米国特許
出願第２６６２７８および３８４１１３号明細書中に詳
しく記載されかつ上記にも説明されているごとく、かか
る蛋白質層を電気的に検査することもできる。そのため
には、金属基体または金属被覆体と水銀滴またはその他
の適当な電極とによつて形成された導電板および蛋白質
層によつて形成された誘電体から成る蓄電器の電気容量
を測定すればよい。更にまた、前述の特許出願明細書中
に記載されかつ蛋白質の多分子膜に関して上記にも説明
されているごとく、かかる蛋白質層を肉眼観察によつて
光学的に検査することもできる。そのためには、蛋白質
層上に設置された水銀滴と基体上に被覆された金属薄膜
との間で可視的なアマルガムが生成されるまでの時間を
測定すればよい。最後に、最も重要なものであるが、前
述の特許出願明細書中に記載されかつ蛋白質の多分子膜
に関して上記にも説明されているごとく、かかる蛋白質
層を反射光または透過光によつて光学的に検査すること
もできる。ただしこの場合には、被覆基体を第２の躊液
から取出した後、第２の浩液中の蛋白質と特異的に反応
する蛋白質（たとえば第１の抗体蛋白質に対する第２の
抗体蛋白質）を含有する第３の后液中への浸漬により、
第２の一分子層が存在するならばその上に第３の一分子
層（または部分的な一分子層）が形成させられる。かか
る被覆基体が透解光によつて観察される。そして被覆基
体の外観から、それに付着した蛋白質層の膜厚、従つて
第２の一分子層の有無に関する判定が下される。蛋白質
の一分子層および二分子層の間のコントラストをなお一
層改善するためには、抗原蛋白質および不活性蛋白質を
含有する醇液の１滴を基体１０上に設置すればよい。こ
うして液滴で被覆された基体が不活性蛋白質のみを含有
する洛液中に浸漬されれば、第８図に示されるごとく、
不活性蛋白質２０によつて完全に包囲された小さな抗原
一不活性蛋白質領域から成る一分子層が形成される。か
かる方法は、抗体蛋白質が血清中に存在する場合におけ
る非特異的な吸着の問題を解決するのに役立つ。すなわ
ち、基体の残りの表面を被覆した不活性蛋白質は血清中
の非特異的な蛋白質が基体に付着するのを防止し、それ
によつてコントラストの改善をもたらすものである。上
記のごとき簡単な方法が開発された結果、今や、標準的
な放射線免疫検定試験と同じ感度を有する試験によつて
肝炎を検出することが可能となつた。

最後に、上記のごとき方法はウイルスや酵素を免疫学的
に同定するためにも重要である。

全てのウイルス型抗原はそれらに対して特異的な抗体よ
りも大きいのに対し、酵素型抗原は種類に応じて大きい
こともあれば小さいこともある。特定のウイルスまたは
大粒径酵素を同定するための方法は阻害試験として知ら
れるものであるが、それは次のようにして実施される。
特定のウイルスまたは大粒径酵素および不活性蛋白質を
含有する塩水から通例成る第１の溶液が調製され、そし
てその中に基体が浸漬される。あるいはまた、かかる溶
液の１滴が基体上に設置され、次いで不活性蛋白質のみ
を含有する醇液中に基体が浸漬される。ウイルスまたは
酵素（すなわち抗原）および不活性蛋白質の一分子層が
基体上に吸着した後、基体は第１の洛液から取出される
。他方、特定のウイルスまたは酵素の存在に関して試験
すべきヒト血清の試料には、特定のノイルスまたは酵素
に対する既知の抗体の混合による前処理が施される。そ
の際には、血清試料中に特定のウイルスまたは酵素が存
在すれば免疫学的に除去されてしまうだけの量の抗体が
使用される。次に、一分子層で被覆された基体が前処理
済むの血清試料中に浸漬され、そして血清試料から取出
した後に前述のごとき任意の技術に従つて検査される。
基体の検査によつて一分子層のみの存在が判明したなら
ば、試験すべきヒト血清は特定のウイルスまたは酵素を
含有していたことが知られる。しかるに二分子層が検出
されれば、試験すべきヒト血清は特定のウイルスまたは
酵素を含有していなかつたことがわかる。なぜなら、抗
体は血清試料中の抗原（すなわち特定のウイルスまたは
酵素）と免疫学的に結合することができず、従つて基体
上に吸着した第１の一分子層中の抗原と結合したことに
なるからである。以上の記載から明らかな通り、免疫学
的に活性な抗原蛋白質を含有する第１の溶液に十分な量
の免疫学的に不活性な蛋白質を添加することによつて表
面免疫試験における蛋白質の一分子層および二分子層の
間のコントラストを改善するための新規な方法もまた本
発明に従つて提供される。これまで、特定の実施例に関
連して本発明が記載されたけれど、上記の記載に照らせ
ばその他の変形や変更も可能なことは自明である。たと
えば、抗原蛋白質とは別個に不活性蛋白質のみの溶液を
調製し、そしてその中に基体を浸漬することもできる。
かかる浸漬は、予備工程として実施されるか、あるいは
抗原蛋白質の希薄醇液および抗体蛋白質の溶液中への浸
漬の間の中間工程として実施される。別の方法としては
、抗体蛋白質が血清中に存在する場合、抗原蛋白質の希
薄后液を用いて基体上に不完全な一分子層を形成させる
ようにすることもできる。その際、かかる后液中からは
不活性蛋白質が省かれる。なぜなる、血清中の（非特異
的な）蛋白質が不活性蛋白質として基体に付着し、そし
て抗原蛋白質分子同士を隔離するのに役立つからである
。本発明はまた酵素を検出するためにも利用できる。そ
のためには、抗原蛋白質としての酵素および不活性蛋白
質としてのウシ血清アルブミンを含有する第１の溶液中
に基体を浸漬し、（予め酵素を注射されたウサギから入
手される）酵素に対する抗体蛋白質を含有する第２の浩
液中に基体を浸漬し、酵素を含有するかどうか疑われる
第３の浩液中に基体を浸漬し、次いで酵素から成る第３
の一分子層の存在に関して基体を検査すればよい。更に
また、基体表面上に吸着した免疫学的に活性な蛋白質は
抗原蛋白質として記載されたが、かかる蛋白質が抗体蛋
白質であつてもよいことは言うまでもない。その場合、
第・２の一分子層を成す蛋白質はかかる抗体蛋白質に対
して特異的に抗原蛋白質、そして第３の一分子層を成す
蛋白質は再び抗体蛋白質である。最後に、第１の一分子
層を成す蛋白質が抗体蛋白質、そして第２の一分子層を
成す蛋白質が特異的な抗原蛋白質となるような方法が可
能なことも明らかである。ごのような方法は、たとえば
インシユリン抗体のごとく、抗体蛋白質分子の方がそれ
に対して特異的な抗原蛋白質分子よりも大きい場合に有
用である。次に、本発明の実施態様を列挙すれば下記の
通りである。

１．前記基体を免疫学的に活性な抗原蛋白質および免疫
学的に不活性な蛋白質の一分子層で被覆する前記工程が
、前記抗原蛋白質を含有する第１の浩液を調整し、前記
第１の醇液に十分な量の前記不活性蛋白質を添加し、前
記基体を前記第１の浩液中に浸漬することにより前記蛋
白質の分子同士が前記不活性蛋白質の分子によつて十分
に隔離されるように前記基体を前記抗原蛋白質および前
記不活性蛋白質の一分子層で被覆し、それからこうして
一分子層で被覆された前記基体を前記第１の溶液から取
出すことから成る、前記特許請求の範囲の方法。

２．前記基体を免疫学的に活性な抗原蛋白質および免疫
学的に不活性な蛋白質の一分子層で被覆する前記工程が
、前記不活性蛋白質を含有する第１の溶液を調製し、前
記基体を前記不活性蛋白質の部分的な一分子層で被覆す
るのに十分なだけ前記基体を前記第１０洛液中に浸漬し
、こうして部分的に被覆された前記基体を前記第１の溶
液から取出し、前記抗原蛋白質を含有する第２の洛液を
調製し、前記基体を前記第２の酪液中に浸漬することに
より前記抗原蛋白質の分子同士が前記不活性蛋白質の分
子によつて隔離されるように前記基体の残りの表面を前
記抗原蛋白質の部分的な一分子層で被覆し、それからこ
うして一分子層で被覆された前記基体を前記第２の浩液
から取出すことから成る。

前記特許請求の範囲記載の方法３．前記基体を免疫学的
に活性を抗原蛋白質および免疫学的に不活性な蛋白質の
一分子層で被覆する前記工程が、前記抗原蛋白質を含有
する希薄な第１の溶液を調製し、前記基体を前記抗原蛋
白質の部分的な一分子層で被覆するのに十分なけ前記基
体を前記第１の俗液中に浸漬し、こうして部分的に被覆
された前記基体を前記第１の溶液から取出し、前記不活
性蛋白質を含有する第２の爵液を調製し、前記基体を前
記第２の爵液中に浸漬することにより前件抗原蛋白質の
ＺＺ分子同士が前記不活性蛋白質の分子によつて隔離さ
れるように前記基体の残りの表面を前記不活性蛋白質の
部分的な一分子層で被覆し、それからこうして一分子層
で被覆された前記基体を前記第２の？液から取出すこと
から成る、，前記特許請求の範囲記載の方法。

４．前記基体を免疫学的に活性な抗原蛋白質および免疫
学的に不活性な蛋白質の一分子層で被覆する前記工程が
、前記抗原蛋白質を含有する希薄な第１の溶液を調製し
、前記基体を前記抗原蛋白質の部分的な一分子層で被覆
するのに十分なだけ前記基体を前記第１の爵液中に浸漬
し、こうして部分的に被覆された前記基体を前記第１の
溶液から取出し、次いで前記抗原蛋白質と特異的に反応
する抗体蛋白質の后液中に前記基体を浸漬することから
成る場合において、前記抗体蛋白質が血清中に存在して
いる結果、前記血清中の前記抗体蛋白質以外の蛋白質が
前記不活性蛋白質として作用して前記基体に付着し、そ
れにより前記抗原蛋白質の分子同士が前記不活性蛋白質
の分子によつて隔離されるように前記基体が前記抗原蛋
白質および前記不活性蛋白質の一分子層で被覆される一
方、前記血清中の前記抗体蛋白質の分子が第２の一分子
層を形成する、前記特許請求の範囲記載の方法。

５．前記二分子層で被覆された前記基体を前記抗体蛋白
質の緋液から取出し、引続いて前記第１の溶液中のもの
と同じ抗原蛋白質を含有するかどうか疑われる第３の醇
液に前記基体を暴露して前記抗体蛋白質との免疫反応を
起させ、それにより前記抗体蛋白質の分子上に残留する
活性部位を前記第３の后液中の前記抗原蛋白質の分子と
化学的に結合させ、それから前記基体上に第３の蛋白質
層が存在するかどうかを検査して前記第３の洛液中にお
ける前記抗原蛋白質の有無を判定することの諸工程が追
加包含される、前記第１項記載の方法。

５．前記抗原蛋白質を含有する第１の洛液を調製する前
記工程が、特定の細胞またはウイルスの最外部に存在す
る抗原蛋白質を分離し、次いでそれの陪液を調製するこ
とから成る場合において、前記二分子層で被覆された前
記基体を前記抗体蛋白質の溶液から取出し、引続いて前
記特定の細胞またはウイルスを含有するかどうか疑われ
る第３の洛液中に前記基体を浸漬して前記抗体蛋白質を
前記第３の醇液中の前記特定の細胞またはウイルス上の
抗原部位と結合させ、それから前記基体上に第３の蛋白
質層が存在するかどうかを検査して前記第３の溶液中に
おける前記特定の細胞またはウイルスの有無を判定する
ことの諸工程が追加包含される。

前記第１項記載の方法。７．前記二分子層で被覆された
前記基体を前記抗体蛋白質の溶液から取出し、引続いて
前記第１の？液中のものと同じ抗原蛋白質を含有する第
３の醇液に前記基体を暴露して前記抗体蛋白質との免疫
反応を起させ、それにより前記抗体蛋白質の分子上に残
留する活性部位を前記第３の洛液中の前記抗原蛋白質の
分子と結合させることの諸工程が追加包含される。

前記第１項記載の方法。８．前記基体を前記第３の洛液
から取出し、引続いて前記第２の醇液中のものと同じ抗
体蛋白質を含有する第４の酵液に前記基体を暴露して免
疫反応を起させ、一部の活性部位を活性状態に維持させ
ながら前記第４の溶液中の前記抗体蛋白質の分子を前記
第３の洛液に由来する前記抗原蛋白質の分子と結合させ
、それにより前記基体の表面から抗原一抗体蛋白質複合
体の連鎖を伸長させることの諸工程が追加包含される、
前記第７項記載の方法。

９．表面から伸長した前記抗原一抗体蛋白質複合体の連
鎖を有する前記基体を前記第４の溶液から取出し、引続
いて前記抗原一抗体蛋白質複合体の連鎖中の抗体蛋白質
に対して特異的な細胞またはウイルスを含有するかどう
か疑われる第５の洛液に前記基体を慕露し、前記基体を
前記第５の溶液から取出し、それから前記抗体蛋白質の
分子上に残留する活性部位が前記細胞まなはウイルス上
の抗原部位と結合しているかどうかを検査して前記第５
の溶液中における前記細胞またはウイルスの有無を判定
することの諸工程が途加包含される、前記第８項記載の
方法。

１０．前記第１の？液に十分な量の前記不活性蛋白質を
添加する前記工程が、前記基体の表面上に吸着した前記
抗原蛋白質の隣接する分子同士の平均間隔を一般に数百
オングストロームとするように選ばれた量の前記不活性
蛋白質を添加することから成る、前記第１項記載の方法
。

１１．前記抗体蛋白質が免疫゛グロブリンＩｇＧ種のも
のである。

前記第１項記載の方法。１２．前記第１の洛液中の前記
抗原蛋白質が酵素、前記不活性蛋白質がウシ血清アルブ
ミン、そして前記第２の洛液中の前記抗体蛋白質が予め
前記酵素を注射されたウサギから入手されたものである
。

前記第１１項記載の方法。１３．金属被覆スライドを選
択し、第１の蛋白質の分子同士が不活性蛋白質の分子に
よつて隔離されるようにして前記スライドを免疫学的に
活性な第１の蛋白質および免疫学的に不活性な蛋白質の
一分子層で被覆し、次いで前記第１の蛋白質と特異的に
反応する第２の蛋白質の浩液に前記スライドを暴露して
前記第１の蛋白質との免疫反応を起させることの諸工程
から成る結果、前記第２の蛋白質の分子は前記第１の蛋
白質の分子と結合して前記スライド上に二分子層を形成
する一方、前記不活性蛋白質の量が前記一分子層中の前
記第１の蛋白質の隣接する分子同士の平均間隔を十分大
きくするに足るものであることにより前記第２の蛋白質
の分子は以後の免疫反応のために活性部位を保有するこ
とを特徴とする、活性状態を維持させながら免疫学的に
活性な蛋白質を表面に結合させる方法。

１４．前記スライドを免疫学的に活性な第１の蛋白質お
よび免疫学的に不活性な蛋白質の一分子層で被覆する前
記工程が、前記第１の蛋白質を含有する第１の浩液を調
製し、前記第１の酵液に十分な量の前記不活性蛋白質を
添加し、前記スライドを前記第１の洛液中に浸漬するこ
とにより前記スライドを前記第１の蛋白質および前記不
活性蛋白質の一分子層で被覆し、それからこうして一分
子層で被覆されたスライドを前記第１の？液から取出す
ことから成る、前記第１３項記載の方法。

１５．前記第１の蛋白質が抗原蛋白質、そして前記第２
の蛋白質が前記抗体蛋白質に対して特異的な抗体蛋白質
である。

前記第１３項記載の方法。１６．前記第１の蛋白質が抗
体蛋白質、そして前記第２の蛋白質が前記抗体蛋白質に
対して特異的な抗原蛋白質である。

前記第１３項記載の方法。１７．金属被覆スライドを選
択し、免疫学的に活性な抗体蛋白質を含有する洛液を調
製し、前記溶液に十分な量の免疫学的に不活性な蛋白質
を添加し、次いで前記スライドを前記洛液に暴露するこ
とにより前記抗体蛋白質の分子同士が前記不活性蛋白質
の分子によつて十分に隔離されるように前記スライドの
少なくとも一部を前記抗体蛋白質および前記不活性蛋白
質の一分子層で被覆することの諸工程から成る結果、前
記抗体蛋白質の分子同士が密封していると仮定した場合
に比べると前記抗体蛋白質の分子は以後の免疫反応のた
めに一層多数の活性部位を保有することを特徴とする、
活性状態を維持させながら抗体蛋白質を表面に結合させ
る方法。

１８．適当な基体を選択し、抗原蛋白質の分子が不活性
蛋白質の分子により互いに隔離されかつ前記基体の表面
に沿つて包囲されるようにして前記基体を免疫学的に活
性な抗原蛋白質およびそれよりも粒径の小さい免疫学的
に不活性な蛋白質の一分子層で被覆し、次いで前記抗原
蛋白質と特異的に反応しかつそれよりも粒径の小さい抗
体蛋白質の醇液に前記基体を暴露して前記抗原蛋白質と
の免疫反応を起させることの諸工程から成る結果、小粒
径の前記不活性蛋白質の分子により前記基体の表面に沿
つて包囲されているため前記抗原蛋白質の分子上には相
対的に多数の結合部位が露出され、従つて相対的に多数
の前記抗体蛋白質の分子が前記抗原蛋白質の分子と結合
して前記基体上に二分子層を形成し、そのため小粒径の
前記抗原蛋白質の分子から成る第２の一分子層が相対的
に稠密となることにより、前記抗原蛋白質の分子同士が
密接していると仮定した場合に比べると前記基体の検査
時における蛋白質の一分子層および二分子層の間のコン
トラストが著しく改善されることを特徴とする、相対的
に大粒径の抗原蛋白質を用いた表面免疫試験の際のコン
トラストを改善する方法。

１９．金属被覆スライドを選択し、第１の蛋白質の分子
が不活性蛋白質の分子により互いに隔離されかつ前記基
体の表面に沿つて包囲されるようにして前記スライドを
免疫学的に活性な第１の蛋白質およびそれよりも粒径の
小さい免疫学的に不活性な蛋白質の一分子層で被覆し、
次いで前記第１の蛋白質と特異的に反応しかつそれより
も粒径の小さい第２の蛋白質に浩液に前記スライドを暴
露して前記第１の蛋白質との免疫反応を起させることの
諸工程から成る結果、前記不活性蛋白質の分子が前記ス
ライドの表面積の５０〜９０％を占めかつそれに対応し
て前記第１の蛋白質の分子が前記表面積の５０〜１０％
を占めるように前記不活性蛋白質の量が選ばれているた
めに前記第１の蛋白質の分子同士が密接していると仮定
した場合よりも多数の結合部位が前記第１の蛋白質の分
子上に露出され、従つて相対的に多数の前記第２の蛋白
質の分子が前記第１の蛋白質の分子と結合して前記スラ
イド上に二分子層を形成し、そのため小粒径の前記第２
の蛋白質の分子から成る第２の一分子層が相対的に稠密
となることにより、前記第１の蛋白質の分子同士が密接
していると仮定した場合に比べると前記スライドの検査
時における蛋白質の一分子層および二分子層の間のコン
トラストが著しく改善されることを特徴とする、相対的
に大粒径の免疫学的に活性な蛋白質を用いた表面免疫試
験の際のコントラストを改善する方法。

２０．金属被覆スライドを選択し、免疫学的に活性な蛋
白質を含有する？液を調製し、前記溶液に十分な量の免
疫学的に不活性で前記活性蛋白質よりも粒径の小さい蛋
白質を添加し、次いで前記スライド前記醇液に暴露する
ことにより、前記活性蛋白質の分子が前記不活性蛋白質
の分子により互いに十分に隔離されかつ前記スライドの
表面に沿つて包囲されるように前記スライドの少なくと
も一部を前記活性蛋白質および前記不活性蛋白質の一分
子層で被覆することの諸工程から成る結果、前記活性蛋
白質の分子同士が密接していると仮定した場合よりも多
数の結合部位が前記活性蛋白質の分子上に露出され、従
つて以後の免疫反応を受けた前記スライドの検査時には
蛋白質の一分子層および二分子層の間のコントラストが
改善されることを特徴とする、相対的に大粒径の免疫学
的に活性な蛋白質を用いた表面兎疫試験の際のコントラ
ストを改善する方法。

イ１面の簡単な説明 第１図は先ず公知の方法によつて抗原蛋白質の％液中に
浸漬され次いでかかる抗原蛋白質に対し？特異的な抗体
蛋白質の溶液中に浸漬された後における基体の立面図、
第２図は第１図の基体と同様にして２つの浸漬工程を施
されたが第１の浸漬工程が本発明に基づくものであつた
場合における基体の立面図、第３図は同じ抗原蛋白質を
含有する溶液中への浸漬によつて更に免疫反応を受けた
後における第２図の基体の立面図、第４図は同じ抗体蛋
白質を含有する？液中に再び浸漬された後に抗原一抗体
蛋白質複合体の連鎖末端の抗体蛋白質分子が免疫学的に
同定すべきウイルスまたは細胞上の抗原部位を見出した
場合における第３図の基体の立面図、第５図は先ず公知
の方法によつて大粒径の抗原蛋白質の浩液中に浸漬され
次いでかかる抗原に対して特異的な小粒径の抗体蛋白質
の浩液中に浸漬された後における基体の立面図、第６図
は第５図の基体と同様にして２つの浸漬工程を施された
が第１の浸漬工程が本発明に基づくものであつた場合に
おける基体の立面図、第７図は第２の醇液中の抗体蛋白
質に対する抗体蛋白質を含有する浩液中への浸漬によつ
て更に免疫反応を受けた後における第６図の基体の立面
図、そして第８図は本発明に従つて不活性蛋白質により
包囲された小さな抗原一不活性蛋白質領域を有する基体
の平面図である。

図中、１０は基体、１１は抗原蛋白質、１２は抗原蛋白
質１１に対する抗体蛋白質、２０は不活性蛋白質、３０
は抗原蛋白質１１と同じ抗原蛋白質、４０は細胞または
ウイルス、そして４１は抗体蛋白質１２と同じ抗体蛋白
質を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 適当な基体を選択し、免疫学的に反応性の第１の蛋
   白質の分子同士が免疫学的に不活性な蛋白質の分子によ
   つて隔離されるようにして前記基体を前記第１の蛋白質
   および免疫学的に不活性な蛋白質の混合物で一分子層に
   被覆し、次いで前記第１の蛋白質と特異的に反応する免
   疫学的に反応性の第２の蛋白質の溶液に前記被覆基体を
   暴露して前記第１の蛋白質との免疫反応を起させること
   の諸工程から成る結果、前記第２の蛋白質の分子は前記
   第１の蛋白質の分子と結合して前記基体上に二分子層を
   形成する一方、前記蛋白質の一分子層が免疫学的に不活
   性な蛋白質を含んでいない場合に比べると前記第２の蛋
   白質の分子は二分子層の形成後に以後の免疫反応のため
   に著しく多数の活性部位を保有することを特徴とする、
   免疫学的に複合した蛋白質の多分子膜を形成させること
   による抗原又は抗体の検出方法。 ２ 適当な基体を選択し、抗原蛋白質の分子が免疫学的
   に不活性な蛋白質の分子により互いに隔離されかつ前記
   基体の表面に沿つて包囲されるようにして前記基体を免
   疫学的に活性な抗原蛋白質およびそれよりも粒径の小さ
   い免疫学的に不活性な蛋白質の混合物で一分子層に被覆
   し、次いで前記抗原蛋白質と特異的に反応しかつそれよ
   りも粒径の小さい抗体蛋白質の溶液に前記基体を暴露し
   て前記抗原蛋白質との免疫反応を起させることの諸工程
   から成る結果、小粒径の前記免疫学的に不活性な蛋白質
   の分子により前記基体の表面に沿つて包囲されているた
   め前記抗原蛋白質の分子上には相対的に多数の結合部位
   が露出され、従つて相対的に多数の前記抗体蛋白質の分
   子が前記抗原蛋白質の分子と結合して前記基体上に二分
   子層を形成し、そのため小粒径の前記抗体蛋白質の分子
   から成る第２の一分子層が相対的に稠密となることによ
   り、前記抗原蛋白質を含む一分子層が免疫学的に不活性
   な蛋白質を含まない場合に比べると前記基体の検査時に
   おける蛋白質の一分子層および二分子層の間のコントラ
   ストが著しく改善されることを特徴とする、相対的に大
   粒径の抗原蛋白質を用いた表面免疫試験の際のコントラ
   ストを改善するのに有用な特許請求の範囲第１項記載の
   方法。