JPH04501609A - 電気泳動法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 電気泳動法及び装置 本発明は、大分子、特に大きなりＮＡの分離に使用するためのアガロースゲルの ような従来の電気泳動媒体と組み合せて使用できる電気泳動法及び装置に関する 。

従来の電気泳動技術では、一定の長さを越えるＤＮＡ分子は、均一の速度を示し 、したがって分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）　Ｌ／ない。早くも１９８２年に大きなり ＮＡフラグメントが、大きさに応じて、従来のアガロースゲルで周期的な交互電 界ベクター（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｉｅｌｄ　ｖｅｃ ｔｅｒ）を適用することによって分離できることが分かった〔シュワルツ（Ｓｃ ｈｗａｒｔｚ）等、１９８２；シュワルツ及びキャンター（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　 ａｎｄ　Ｃａｎｔｅｒ）、１９８４）、種々の異ったパルスフィールドシステム （ｐｕｌｓｅｄ　ｆｉｅｌｄ　５ｙｓｔｅａ＋）が５０キロベースから少くとも １２．６メガベース（ｂの範囲でＤＮＡフラグメントの分離をなしとげている〔 オーバツク（Ｏｒｂａｃｈ）、１９８８）。パルスフィールドシステムによる大 フラグメント分離の理論的基礎は、かなり想像的であるが、パルスフィールドシ ステムは、分子をラジアルに再配向させることにより、この分離が得られると考 えられている。入手しうるシステムは、デザイン、ゲルディメンジョン（ｇｅｌ 　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）、電極配置（ｅｌｅ−ｃｔｒｏｄｅ　ｃｏｎｆｉｇｕ ｒａｔｉｏｎ）パルスアルゴリズム（ｐｕｌｓｉｎｇビリティ（ｉｎｔｅｒ−１ ａｎｅ　ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ）、操作容易性（ｅａｓｅ　ｏｆ　ｈａｎ ｄｌｉｎｇ）、及び融通性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）の点でかなり差がある（ キャンター等、１９８８）。

先行技術のパルスフィールドシステムは、２つの型に分けられる。第一の型は、 パルスフィールドシステムの電界ベクターが、アガロースゲルにより形成された 単一の面（ｐｌａｎｅ）内で配向するものである。このようなシステムでは、ゲ ルの面内で、分子をラジアルに再配向させる電界を変化させることにより、ゲル の各レーン中の分子の分離が達成される。ゲルタンク内で支持されたゲルは、一 般的に、ゲルの面を水平に配向させられ、そして２組の電極は事前に決定した角 度で配置させられている。

このようなシステムの例としては、垂直フィールドアガロースゲル電気泳動（０ ＰＡＧＥ）、水平及び垂直フィールドインバージョンゲル電気泳動（Ｆ［ＧＥ） 、回転ゲル／を極・電気泳動（ＲＧＥ／　ＲＥＥ）、及びカウンタークランプ・ 均一電界ゲル電気泳動（ＣＨＥＦ）及びその変形、例えば、プログラム可能、自 律制御電極ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）がある。

０ＦＡＧＢは、均一／非均−混合か又は非均−フイールドコンフィギユレーショ ンのいずれかを用いる典型的なシステムである。〔シュワルツ及びキャンター（ ＳＣｈＷａｒ−ｔｚａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、ｌ　９８４　；パンオーメン及びベ ルケルク（Ｖａｎ　Ｏｍｍｅｎ　ａｎｄ　Ｖｅｒｋｅｒｋ、１９８６　）　ｏ　 しかしながら、これは、ゲルの外側のレーンを著しくゆがめ、そのために分子及 び内部比較サンプルのサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）に使用可能なゲル面積を小さ な中央のレーンに限定してしまうという不都合を持っている。

Ｆ［ＧＥは、ゲルの両端に在るたった２つの平行な電極の間の極性を反転させ、 そして、各サイクルで非同−の正及び反パルス時間を用いて正味移動（ｎｅｔ　 （ｎｏｖｉｎｇ）を起こを作ることができる。しかしながら、パルスベクター間 の１８０度の角度は、長時間の運転において容認しがたいバンドの広範囲化をも たらし、特に大きな分子の分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を弱める。このシステ ムの垂直的変形では、ゲルの面での垂直配向は水平的変形のものよりもゲルを冷 却するのにより有効である〔ダウキンス等（Ｄａｗｋｉｎｓ）　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８７　）　ｏこの垂直的システムは、しかしＦ［ＧＥ固有のバンドの広域 化（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ）及び低いレゾリューシコンにやはり苦しんでいる。

ＲＧＥ　／　ＲＥＥは、ゲルが循環するか又は一対の電極が、周期的に回転して いるシステムである。〔セルフー（Ｓｅｒｗｅｒ）、１９８７．サザン（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ）等、１９８７）。分離させる分子は、交互に２つの一様な電界に一 定の角度でさらされる。このシステムは、かなり広い面積にわたって、真直なレ ーンを与えるが、その大きな欠点は、その可動する部品にあり、長期間の運転及 び連日の使用によって、機械的な故障を起こし奏がちである。

ＣＨＥＦは、事前に決定した電位（ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に クランプ（ｃｌａｍｐ）　Ｌ／た２４個までの電極の六角形の配列（ａｒｒａｙ ）に基づくシステムである。（チュー（Ｃｈｕ）等、１９８６；ポルラス及びデ ービス（Ｖｏｌｌｒａｔｈ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ。

１９８７））。このデザイン及びその変形〔クラーク（Ｃ１ａｒｋ）等、１９８ ８．ピレン（Ｂｉｒｒｅｎ）等、１９８８）は、かなり複雑な電極配列及び１３ ｃｍＸ１３ｃｍまでのゲル中の分子を分離する電気的コントロールを含む。

得られたレゾリュージョン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）はＲＧＥシステムよりも優 れてはいない。外側が変形するために使用できるレーンの数が制限される。

第２の型のシステムは、使用が３次元のゲルでなされる、即ち、ゲルの面に垂直 な使用からなっている。

このシステムのプロトタイプは、トランスバースオールタネイテング（ｔｒａｎ ｓｖｅｒｓｅ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）電気泳動である（ＴＡＦＥ）　（ガー ディナ（Ｇａｒｄｔｎｅｒ）等、１９８６．ラース（Ｌａｓｓ）等、１９８８） 。このシステムは、設けた２組の交互に活性化した電極を採用し、１１５度の角 度で横切る交流電界を与える。垂直にサスペンドされたゲルは、フィールドが横 切るところで角度を三等分されるような場合に位置する。

このシステムは、運転中、ゲル媒体の全てのレーンを同一のフィールド条件にさ らし、鋭いバンドを達成する。

しかしながら、大きな欠点は、操作上の限界内での内部を極及びタンク寸法を保 つためかせられた内部電極距離（ｉｎｔｅｒ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ｄｉｓｔａ ｎｃｅ）上の制限により、かなり短い長さのゲルに対してだけ許容されることで ある。即ち、分離距離が、普通１０ｃｍ（ラース（Ｌａａｓ）等、１９８８）と なる。

このようなゲルは小さすぎて、競合的レゾリュージョンを達成することができな い。

公知のパルスフィールド電気泳動システムの特別な欠点は、それらが大きな分子 の分離の手段のいくつかを達成するけれども、それによって小さな分子は分離し ないということである。この大分子と小分子とを同時に分離することが、今日ま で不可能であった。

本発明の第１の側面によれば、 カソードとアノードからなる第１の電極及びカソードとアノードに固定極性電位 差を供給する手段、及びアノードとカソードが使用時に保持ゲルのそれぞれ反対 側端に位置して、保持ゲルの面上に固定極性電界を作るように、使用時に装置内 でゲルを保持するのに適した保持手段を含み、 端に位置していることを含むことを更に特徴とする。

本発明の装置は、ゲルタンク内に含めて使用される。

ゲルタンクは、好ましくは、ガラス、プレキシガラス又はペルスペックス（Ｐｅ ｒｓｐｅｘ）のような電気的に絶縁した物質でできた上部が開口した四角い箱か らなる従来のデザインである。ゲルタンクは、電気泳動バッファー溶液で充たす 。好ましくは、電気泳動バッファー溶液は、従来の電気泳動バッファー溶液であ る。有利には、ゲルタンクは、バッファー溶液の循環手段及び恒温制御手段を備 えている。

保持ゲルは、大きな分子を運ぶことができるどのような電気泳動ゲルから成って いても良い。通常、保持ゲルは、アガロースゲルである。アガロースゲルは、ア ガロースゲルが固化する前に、カセット中にウェルホーマー（ｗｅｌｌ　ｆｏｒ ｍｅｒ）を挿入することにより形成されたサンプルウェルを有するガラスプレー トの間につめられる。

電気泳動用分子のサンプルは、アガロースゲルをバッファー溶液中に浸漬する前 にアガロースブロック中のアガロースゲル上にサンプルを充填しても良い。かわ りに、アガロースゲルをバッファー溶液中に浸漬した後で、溶液としてのアガロ ースゲル上にサンプルを充填しても良い。

ゲル保持手段は、ゲルタンク中で保持ゲルを保持且つ支持する従来の手段から成 る。好ましくは、保持ゲルは、ゲルタンク内に、垂直の配向で、適切な手段によ って、保持ゲルの上部及び底部水平端を確保することにより保持する。任意に、 保持ゲルは、追加的に、保持ゲルの垂直な各々の端に近接した取はずし可能なガ ラス捧で確保及び支持しても良い。

もし保持ゲルがアガロースゲルなら、バッファー溶液中のアガロースゲルの自然 浮力に対する位置に保持する必要がある。

カソードとアノードとの間の固定極性電位差を供給する手段は、普通最大出力３ ００ｍＡ、１５０Ｖと２．５Ａ。

５００Ｖとの間を有する従来の電源から成っていても良い。

交互極性電位差を電極に供給する手段は、普通最大出力３００ｍＡ、１５０Ｖと ２．５Ａ、５００ｖとの間を存する従来の電源、及び、電源により供給された電 位差の極性を変えることができ、パルス時間が、０．１秒と少（とも５０００秒 の間を有する従来の電源から成っていても良い。

好ましくは、スイッチユニットはパルス時間が６０秒から６０分の間で電位差の 極性を変えることができる。

任・意に、２つの電源は、同じ電源であっても良い。

好ましくは、交互極性電位差を供給する手段は、電源及びパルス時間が０．１秒 と少くとも５０００秒の間で、より好ましくは、６０秒と６０分の間を有する交 互極性電位差を供給且つランプ（ｒａｍｐｆｎｇ）することのできる電気スイッ チユニットから成る。

好ましくは、固定極性電位供給手段は、電源及びパルス時間が０．１秒と少くと も５０００秒、より好ましくは６０秒と６０分の間を有する固定極性電位差を周 期的にランプすることのできるユニットを含む。

より好ましくは、固定極性ディファレンスを周期的にランプできる単位及び交互 極性電位差を供給及びランプすることのできるスイッチユニットは、シンクロナ イザ−である。

有利には、固定極性及び交互極性電位差を供給する手段は、パルス時間が０．１ 秒と少くとも５０００秒の間を有し、５００ｍＡまでの電流で電圧勾配−１５０ Ｖと１５０ｖの範囲を供給できるシンクロナイザできる２つの機能信号発生器（ ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を含む。

本発明の特徴は、パルス時間及びフィールド強度パラメーターが高い融通性を有 することである。電気スイッチユニットは、第２の電極手段により作られたどの ような交互電界をも付加するのに使用することができる。例えば、線状又は指数 的なパルスランプ（ｒａｍｐ）、又は交互パルス時間である。加えて、その固定 極性及び交互極性電界を組み合せることは、交互極性電界オフ時間を許し、一方 間時にひきつづきアノードに向けてネットサンプルモーション（ｎｅｔ　ｓａｍ ｐｌｅ　ｍｏｔｉｏｎ）を与える。更に、固定極性及び交互極性電界に対する独 立的な制御は、それらの比率及び、従って、固定極性及び交互極性成分の総合（ Ｓｕｍｍａｔｉｏｎ）により作られた全有効電界に対して十分な制御を与える。

加えて、固定／交互極性電界比は、同一の極性のパルスの間、一度又は繰り返し て変えられ、有効電界ベクターの「内部パルスＪ　（ｉｎｔｒａ　ｐｕｌｓｅ） スィーブ（ｓｗｅｅｐｓ）を発生する。同様に、「内部パルス」ボルトランプ（ ｖｏｌｔａｇｅ　ｒａｍｐ）は、一定の固定／交互極性電界比又は有効電界ベク ターの［内部パルスパターンの頂きで供給することができる。このような「内部 パルス」パルスパターンは、本発明の装置と組み合せて使用された時に、分子の 強力な分離を達成するのに特に有効であることが判明した。固定極性及び交互極 性電解の独立的な制御は、分離される分子サイズのどのような範囲においても運 転時間を最少化させる。

本発明は、どのような大きさのチャージされた分子を分離するのにも使用できる 。向えば、ＤＮＡ、　ＲＮＡ及び蛋白質である。特に、１００ベース（ｂａｓｅ ）以上及び少くとも最大１２．６メガベースまでの大きさのＤＮＡを分離するこ とができる。

本発明のさらに特徴とするところは、細くて、且つ広い分子サイズの範囲の分子 を分離する時に、高いレゾリュージョンが得られることである。

装置は適切な電界強度、固定極性／交互極性電界強度、及びパルス時間を選択す ることによって、並びに電界パルスをランプすることを通じて、広範囲モードか 又は集中範囲モード（ｆｏｃｕｓｅｄ　ｒａｎｇｅ　ｍｏｄｅ）かいずれかで運 転することができる。広範囲モードでは分子サイズの広い範囲が同時に分離でき る。広範囲モードは、パルスフィールド電気泳動技術によってのみ分離される大 分子及び従来の電気泳動技術によって分離されるが通常パルスフィールド電気泳 動によっては分離されない小さな分子の両方を含むことができる。例えば、４キ ロベースから２メガベースの大きさのフラグメントが単一のアガロースゲル上で 分離することができる。集中範囲モードにおいては、特定の範囲の分子サイズを 拡大して強化したレゾリュージョンが得られる。例えば、単一のゲルで、３００ から５００キロベースの範囲のＤＮＡフラグメントのバンドの強化したレゾリュ ーシコンが得られる。この範囲外のＤＮＡフラグメントも、分離されるけれども 、より低いレゾリュージョンとなる。ＤＮＡ分子の分離用装置の操作上の限界は 、ｌＯＯベースもの小さな分子から少くとも！２．６メガベースに拡大される。

本発明の固定極性及び交互極性電界を同時に適用する組み合せ効果は、これまで のところ説明はしていないが、より優れたバンドの鋭さとレゾリューシコンをも たらす濃縮した効果があるように思われる。

第１の電極手段のアノード及びカソードと、第２の電極手段の電極は、どのよう なデザインの従来の電気泳動電極から成っていても良い。特に、それらは、プレ ート、ワイヤ若しくはストリップ（ｓｔｒｉｐｓ）、又はプレート、ワイヤ及び ストリップのどのように適切な組み合せであっても良い。アノード、カソード及 び電極の構成物質は、どのような適切な電導物質、例えば、プラチナ又はグラフ ァイトであって良い。好ましくは、アノード、カソード及び電極はプラチナであ る。

使用の際、アノード及びカソードは、保持ゲルの面にカソードとアノード間の実 質的に均一な固定極性電界を作る。この固定電極電界は、サンプルである分子を 保持ゲルを通して、アノードの方向に移動させる。同時に、電極は、保持ゲルの 平面を横切り、実質的に垂直な交互電極電界を作る。この交互電極電界の効果は 、分子をラジアルにゲル中に再配向することである。

本発明の特徴は、使用中、アノード、カソード及び電極の配置から生じた電界が 、保持ゲルの厚みを通して実質的に均一であることである。このことは、レーン 間で真直であり、等価である分子の移動、及び分子分離における高いレゾリュー ジョンを与える。

好ましくは、アノード、カソード及び電極はワイヤである。更に好ましくは、電 極手段は、４つの電極、並びにアノード及びカソードがアノードとカソードに平 行な軸の回りに等しくラジアルに配置され且つアノードとカソードの間の真中に あるようにアノードとカソードに平行に位置した４つのワイヤから成る。好まし くは、アノード９．カソード及び電極は、ゲルタンクの全体の厚さにわたってい る。

本発明の特徴は、当該装置に収容できる保持ゲルの寸法が大きい点である。保持 ゲルの最大長は、アノードとカソード間の距離により決まる。保持ゲルの最大中 は、ゲルタンクの１１を横切るアノード、カソード及び電極の最大１１１によっ て決まる。保持ゲルの最大使用可能な面積は、少くともｆ８０ｍｍＸｆ８０ｍｍ （長さ×巾）である。

ゲルタンクに与えられたどのような容量においても、アノード、カソード及び電 極の配置によって、他のシステムと比較して、より大きな分離を助長する。とい うのは、保持ゲルの長さは、アノードとカソード間の距離よりわずかに短いだけ だからである。

保持ゲルの長さとアノード、カソード間の距離との差を最少にすることが特に好 ましい。というのは、保持ゲルの与えられた長さに対して、より小さなアノード 、カソード間の電位差が与えられた電界強さを達成するために使用されるためで ある。このことは、電源出力に対する要求及び恒温バッファ一温度制御手段に対 する要求を低めるからである。

本発明の第二の側面によれば、ゲル内に含まれる分子がゲルの面内の固定極性電 界にさらされ、そして、分子が同時に、ゲルの面に実質的に垂直な交互極性電界 にさらされることを特徴とする分子の電気泳動分離方法を提供する。

任意に、固定極性及び交互極性電界のフィールド強度及び交互極性電界のパルス 時間は分子の分離の間、一定である。

代わりに、固定極性及び交互極性電界を変化させても良い。

更に、交互極性電界のパルス時間も変化できる。

好ましくは、各パルス期間が分離の途上で増加するようにパルス時間をランプす る。

任意に、ゲルの面と、固定及び交互フィールドベクターとの和により作られた有 効フィールドベクターの方向との間の角度が一定となるように、固定及び交互電 界の比率は、一定であっても良い。

代オ）りに、固定及び交互フィールドの比率は、有効フィールドベクターが変化 するように変化させても良い。

好ましくは、有効フィールドベクターは、単一パルス内で変化させる。更に好ま しくは、ゲルの面と有効フィールドベクターとの間の角度は、各々のパルスの間 で増加させる。

任意に、有効フィールドベクターの強度は一定である。

代わりに、有効フィールドベクターの強度をランプしても良い。好ましくは、有 効フィールドベクターの強度は、各パルス内でランプさせる。更に好ましくは、 有効フィールドベクターの強度は、単一のパルスの間でくり返してランプされる 。

好ましくは、この分子電気泳動分離法は、本発明の第１の側面による電気泳動装 置の使用から成る。

本発明の具体例を、次の図面を参照しながら更に詳細に述べる。

第１図は、本発明の特定の例の斜視的な模式図である。

第２図は、図１のＡ−Ａによる断面図である。

第３図は、Ｂ−Ｂによる図１の断面図である。

第４図は、本発明の電気泳動装置によるサツカロミセスセレビシェの３つの株の クロモシームの分離を示す。

第５図は、公知のＴＡＦＥ電気泳動装置によるサツカロミセスセレビシェの２つ の株のクロモシームの部分分離を示す。

図１において、本発明の電気泳動装置の特定の例が、！で示す電気泳動ゲルタン クに入れられて示されている。

ゲルタンクは、電気泳動アガロースゲル２を含んでおり、寸法が１６０ｍｍＸ　 １５０ｍｍＸ６ｍｍ　（長さＸ巾Ｘ厚さ）で示されている。ゲルタンクは、パー スペックス（Ｐｅｒｓｐｅｘ）でできており、外部寸法（高さｘ　ｉ１ｘ深さ） が、１９５ｍｍＸ　ｌ　６５ｍｍＸ２６０ｍｍで上部が開口した四角い箱である 。ゲルタンクは、従来の電気泳動バッファー溶液３、例えば、０．２　ＸＴＢＥ バッファーで満たされている。

タンクｌの底の巾にそって中央に固定されているのはアノードホルダー４である 。アノードホルダーは、パースペックス片９ｍｍＸ９ｍｍＸ　１５０ｍｍである 。アノードホルダーと共に要素をなすのは、アノード５で、ゲルタンクの巾に伸 びている。アノードホルダーに含まれ、アノードに平行なのが、グループ６で、 この内にゲルの底のアノードの端が、位置していて良く、これによって、タンク の巾を横切って、確保され支持されている。

ゲル２はさらに取はずし可能なカソードホルダー９の底側でグループ８のゲルの 上部カソード端７によって垂直の配向で確保され支持されている。

カソードホルダー９は、かくてゲルの上方向への位置ずれを防いでいる。好まし くは、ゲルは追加的に側部のガラス捧で支持される。

カソードホルダー９は、又パースペックス片９ｍｍＸ９ｍｍＸ　１５０ｍｍから 成っているが、取りはずし可能にゲルタンク１の壁に確保されている。カソード ホルダー９と共にカソードｌＯがあり、これは、ゲルのカソード端に平行に走っ ている。ゲル２の各側部上２個所に、４つの電極１１−１４がある。これらは、 アノード５、カソード１０及び電極１１−１４が、アノードとカソードに平行な 軸の回りで、アノードとカソードの真中で、ラジアルに等しく配置されるように ゲル２から等距離に配置されている。各電極１ｌ−ｉ４は、パースペックス管！ ５．１６．１５０ｍｍＸ　１０ｍｍ　（長さＸ直径）により、ゲルタンクに固定 され支持されている。各パースペックス管１５．１６の横で、各管の長軸に平行 に、グループ、１５０ｍｍｘ１ｍｍｘ　１ｍｍ　（長さｘ　１１ｘ直径）があり 、その中に、電極のひとつが位置している。

管１５．１６は、グループがカソードとアノードに平行な軸及びアノードとカソ ードの真中に面するように位置している。アノード、カソード及び電極は、プラ チナワイヤ、直径０．８ｍｍで、ゲルタンクｌの全中に伸びる長さを有している 。管１５．１６を支持する４つの電極は、又、管の上部周囲に位置する直径２ｍ ｍの７個の等距離間隔の穴１８によってバッファー溶液の循環用ボートとしても 働く。バッファーは、連続的に２つの頭部電極支持管１５中の穴を経てタンクか ら除去され、分離された第２の冷却サーキットによって、恒温された冷却コイル を通って汲み上げられ、２つの底部電極支持管１６の穴を経てゲルタンクｌに戻 る。

別の配置によれば、バッファーは連続的にタンクから、ゲルの各サイド上の各上 部の電極１１．１３上に位置するＴ−形出口を経て除去され、別の第２の冷却サ ーキットによって恒温化された２つの冷却コイルを通って汲み上げられ、ゲルタ ンクｌにゲルの各サイド上の各底部電極１２．１４の下に位置するＴ−形入口を 経てタンクｌに戻る。

操作」；、出力５００ｍＡ及び１５０Ｖ一定電圧モードの第１の電源（例えば、 モデルＥ４１１パワーサプライ、コンソルト供給）をアノード５及びカソードｌ Ｏに連結する。かくして、当初カソードに近接してウェル１７中に含まれる（従 来の電気泳動と同様）分子をゲルを通して、アノード方向に動するよう方向づけ る固定極性電界ベクター■（第２図）が作られる。

同時に、電気スイッチユニット〔例えば、ｅｆｓ／ｅｐｓシステム、フロウゲン 　インストルメンツ　リミテ・ソド（Ｆｌｏｗｇｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）供給〕を接続した同一又は第２の類似の電源で、インバート されたパルスで、パルス時間が０．１秒と５０００秒の間のパルスを周期的に供 給及びランプすることができるが、これを同−又は第２の電源の１つのボールが 第１の電極の対１１．１２に接続され、反対のボールが第２の電極の対１３．１ ４に接続されるように電極１１−１４に接続する。従って、第１の電極対１１． ’１２と第２の電極対１３．！４との間に向けて、実質的に固定極性フィールド １及びゲル２の面に垂直である、周期的に１８０度の角度でインバートされる、 交互極性電界ベクターＩＩが作られる。

普通、固定極性及び交互電界強度は０．ＩＶ／ｃｍから１０Ｖ／ｃｍの範囲にあ る。更には、本発明が広範囲モードで使用される場合は（例えば、４キロベース から２メガベースの範囲のＤＮＡ分子を分離するには）約３Ｖ／ａｍのフィール ド強度が使用される。集中範囲モードを使用するときは（例えば、２５０から１ ２００キロベースのＤＮＡ分子を分離するには）、より高いフィールド強度、約 ７−１０Ｖ／ｃｍが使用されうる。

２メガベースより大きいＤＮＡ分子の分離は、２チャンネル機能ゼネレーターの 使用により強化される。例えば、６０分期間の同期された線状“ソーツース”　 （”５ａＷ−ｔｏｏｔｈ”）電圧ランプが使用されうる。普通、アノード５及び カソード１０間の固定極性電位差はＩＶから５０Ｖに単−調にランプする一方、 第１の電極対１１，１２及び第２の電極対１３．１４間の交互電位差は、−１Ｖ から一５０Ｖ及び＋ｌｖから＋５０Ｖまで、交互的且つ同期的にランプする。

実施例１ 第４図は、本発明による電気泳動装置及び方法を使いてサツカロミセスセレビシ ェの３つの異なる株のクロモシームの分離（電気泳動的力りすタイプ）を示す。

サンプルウェルは頭部にあり、レーン、１，４．７，１０゜１３及び１６はＹＰ 　ｌ　４８．　レーン２．　５．　８．　１１及び１４はＸ２１８０−ＸＢ、レ ーン３．　６．　９．　１２及び１５はＭＤ４０−４Ｃである。すべてのクロモ シーム（ＹＰ　ｉ　４８の１７、Ｘ２１８０−ＩＢの１４、ＭＤ４０−４Ｃの１ ３）は分離される。

本実施例において、下記のプロトコールが実施された。

ゲル（１６０ｍｍＸ１５０ｍｍＸ６ｍｍ　（長さ×巾×厚さ）は、０．８％（ｗ ／ｖ）ＨＧＴアガロース（シーケムマリーンコロイズ）　（Ｓｅａ　Ｋｅｍ　Ｍ ａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ）を、０．２ＸＴＢＢ　（Ｉ　ＸＴＢＢはリット ル当りＩ　Ｏ，９ｇのＴｒｉｓ、　５２ｇのホウ酸、０．９３　ｇのＥＤＴＡ二 ナトリウム塩、ｐＨ８，３）に溶解して作る。これを２つのオートクレーブテー プで横にシールした２つのカバーグラスプレート（１５０ｍｍＸ　２２０ｍｒｎ ｘ　３ｍｍ　（ＩＩＩＸ長さ×厚さ）の間にはさまれたスペーサーガラスプレー ト（１５０ｍｍＸ６０ｍｍＸ６ｍ）（ｒｆｌＸ長さ×厚さ）から成る型（ｍｏｕ ｌｄ）に入れた。約５０度で型に液体アガロース溶液を注いだ後、サンプル用ウ ェルを１８個の歯を有するプラスチックの＜　Ｌ　（５ｍｍｘ６ｍｍｘ３ｍｍ） （ＩＩＸ長さ×厚さ）を、３ｍｍはなして、モールドの開口上部中にさし入れる ことによって形成した。ゲルを静置して１時間４℃にセットした。

０、２　ＸＴＢＥ電気泳動バッファーを連続的にアクアリウムポンプ（ａｑｕａ ｒｉｕｍ　ｐｕｍｐ）　（Ｄ　Ｐ　３５　／　３、トットンエレクトリ力ルブロ ダクツ（Ｔｏｔｔｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒ、１ｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）供給〕に よって循環させた。バッファーを循環バイブ／電極ホルダー１５の上部の対の中 の穴を通して入れ、ガラス熱交換器の内部コイルを通して移動させ、循環パイプ ／電極ホルダーの底部対１６の穴を経てゲルタンクに戻した。熱交換器の外部チ ャンバーは循環冷蔵槽〔フリゴスタト、（ＦＲ［ＧＯ３ＴＡＴ）　、デサガ（Ｄ ＥＳＡＧＡ）供給〕によって、蒸留水で満たした。運転中、ゲルタンク中のバッ ファー溶液温度が２０°Ｃとなるようサーモスタットを１４°Ｃにセットした。

サンプルを各法のＤＮＡを含む約１ｍｍ厚さスライスのゲルインサートとしてウ ェルにロードし、４０℃で、１％低ゲルアガロースでシールした。ゲルインサー トをパンオーメン（Ｖａｎ　Ｏｍｍｅｎ）等（１９８６）に従って、調製した。

固定極性及び交互極性電極にコンソルトＥ４１１（Ｃｏｎｓｏｒｔ　Ｅ４１１） パワーパックの２つの平行な出口ボートを用いて、初期電流が３３０ｍＡをもた らす１１０ボルトの一定電圧で、エネルギーを与えた。

交互極性電極セットの極性は、商業的に入手できる極性変換器及びソフトウェア （ＥＦＳ／ＥＰＳシステム、フローゲニノインストルメン゛ソリミテッド（Ｆｌ ｏｗｇｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ−ｔｓ　Ｌｔｄ、）１８Ｍコンパチブルマイク ロコンピュータ−結合〕を用いて、６０秒から１３０秒まで指数的にランプさせ た間隔でインバートした。プログラムセットは、アクションラン：４８時間、イ ニシャルホワード：６０秒、イニシャルリバース＝６０秒、ファイナルフォワー ド：１３０秒、ファイナルリバース：１３０秒、カーブ：Ｄ（平方根）。

ＤＮＡは、ゲルを０．５μｇ／ｍｌエチディウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ 　ｂｒｏｍｉｄｅ）を含むＴＢＢ５００ｍｌに１５分間ソーク（ｓｏａｋｉｎｇ ）　Ｌ／た後で可視可した。コダック（Ｋｏｄａｋ）　４４１５シヨートウエー ブＵＶイルミネーシヨン付テクニカルパンフイルムを用いて写真をとった。露光 時間は、インターフェアレンスコントラストフィルター付でｆ４．５　２分間で あった。

実施例２ １００Ｋｂから５．６ＭｂをこえるＤＮＡ分子の分離用内部ボルトランプを含む 実験において、ゲル注入（ｇｅｌｃａｓｔｉｎｇ）、バッファー、サンプルロー ディング（ｌｏａｄｉ−ｎｇ）及びＤＮＡ可視可手法は実施例１で述べたものと 同じであった。

固定極性及び交互極性電極は、ランプ期間ｌから６０分の間で１−１５０Ｖに直 線的に増加することのできるカスタムメートのＤＣ−電源の同一の出力ボートを 用いて両方にエネルギーをかけた。出力源をリセットして１８Ｍコンパチブルマ イクロコンピュータの平行ポート（Ｒ３２３２）を経て提供された低電圧信号に よって０ボルトからの新しいランプを開始するまで、様々な特定の電圧ランプを 繰り返した。

最大ボルト（ランプ終了点）は、７５ボルトにセットし、ランプ期間は１分間で あった。電流は、その最大ボルトで４００ｍＡに達した。水平電極セットの極性 は、カスタムメイドの極性変換器と１８Ｍコンパチブルマイクロコンピュータ− と結合したソフトウェアを用いて、指数的に６０秒から３２７６秒にランプされ た間隔によりインバートした。プログラムセツティングは、ランタイム：４８時 間、初期パルス時間：６０秒、最終パルス時間：　３２７６秒、５０％のパルス タイム増加に達するランタイムの比率：２５％。電源へのリセット信号を各極性 のりバーサル（ｒｅｖｅｒｓａりに同期的に与えた。

実施例３ ２００Ｋｂから３．５　Ｍ　ｂまでの範囲のＤＮＡ分子を分離するための同一の 極性のパルス内で反覆的に投与された固定及び交互極性フィールドの比率の変化 を含む実験において、ゲル注入、バッファー、サンプルローディング、及びＤＮ Ａ可視化手法は実施例１と同様に行なった。

内部電圧ランピング及びベクタースウィービングのそのような組み合せを履行す るために、固定極性電極用にはコンソルトＥ４１１パワーパック、定電圧を用い 、交互極性対電極用には実施例２で特定したカスタムメイドのＤＣ−電源を用い て固定極性及び交互極性電極に、独立的にエネルギーを付与した。固定極性電圧 を初期電流１００ｍＡを得るように１００Ｖにセットした。交互極性電極に適用 する最大電圧（ランプエンドポイント）は１２５ボルトにセットし、ランプ期間 は１分でセットした。電流は、最大電圧で４００ｍＡに達した。交互極性電極の 極性は、カスタムメイドの極性変換器及び１８Ｍコンパチブルマイクロコンピュ ータ−と接続したソフトウェアを用いて１９１秒の一定間隔でコンバートした。

プログラムセツティングは、ランタイム：４８時間、初期パルス時間：１９１秒 、ファイナルパルス時間＋１９１秒、電源に対するリセット信号は、極性の各リ バーサル（ｒｅｖｅｒｓａｌ）に同期的に付与した。

比較実験例１ 第５図は、ＴＡＰＥデザインの電気泳動装置を用いたサツカロミセスセレビシェ の２つの異なる株のクロモシームの部分分離（電気泳動的カリオタイプ）を示す 。サンプルのウェルは上部にあり、レーンｌと４は、Ｘ　２１．８０−ＩＢ、レ ーン２．　３．　５及び７は３３４゜Ｘ２１８０−ＩＢの１４のクロモシームの １２だけ、及び３３４の１４のクロモシームの１３だけが、分離した。第５図の 矢印は本比較実験例では分離しなかったが、本発明の実施例１では分離したＸ２ １８０−ＩＢ中の２対のバンドを示す。

本比較実験例では、下記のプロトコールを行なった。

完全ベックマン　シーンラインシステム（ＢＥＣＫ＆１ＡＮＪｅｎｅ　Ｌｉｎｅ 　Ｓｙｓｔｅｍ）に基づき、ＧＬ−ＩＭ−１使用説明書（１９８８年１月）によ る説明に従って、行なった。

制御器は、説明書の１５ｆｆページの記述のとおり２段階の“プログラム１″で プログラムした。第１の段階は４秒毎のパルスでトータル３０分間１７０ｍＡで ランした。第２の段階は、６０秒毎のパルスでトータル１８時間１５０ｍＡでラ ンした。

本発明は、実施例のみ説明したこと及び、詳細の変更は、本発明の範囲内に含ま れることが理解されるであるピレン　ビー　ダブリュー（Ｂｉｒｒｅｎ　Ｂ、Ｗ 、）　、レイイー（Ｌａｉ　Ｅ−）、クラーク　ニス　エム（Ｃ１ａｒｋ　Ｓ、 Ｍ、）、フードエル（Ｈｏｏｄ　Ｌ）、及びシモン　エム　アイ（Ｓｉｍｏｎ　 Ｍ、　１．）、（１９８８）、核酸レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、 ）　、７５６３−７５８１゜ カンタ−シー　アール（Ｃａｎｔｏｒ　Ｃ，Ｒ，）　、スミス　シーエル（Ｓｍ ｉｔｈ　Ｃ，Ｌ、）及びマチニー　エム　ケー（Ｍａｔｈｅｖ　Ｍ。

Ｋ、）（１９８８）アニュアル　レビュー　バイオフィジックス　バイオフィジ ックス　ケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｃｈｅｍ、）　ｌ　７．２８７−３０４゜ カール　ジー　エフ（Ｃａｒｌｅ　Ｇ、Ｆ、）、フランク　エム（Ｆｒａｎｋ　 Ｍ、）及びオルランエム　ブイ（Ｏｉｓｏｎ　Ｍ、Ｖ、）（１９８６）サイエン ス　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２．６５−６８゜チュー　ジー（Ｃｈｕ　Ｇ、）、ポ ルラス　ディー　（ＶｏｌｌｒａｔｈＤ、）及びデービス　アール　ダブリュー 　（Ｄａｖｔｓ　Ｒ，Ｗ）（１９８６）サイエンス　５ｃｆｅｎｃｅ　２３４． １５８２−１５８５゜ クラーク　ニス　エム（Ｃ１ａｒｋ　Ｓ、Ｍ）　、レイイー（Ｌａｉ　Ｅ、）ピ レン　ビー　ダブリュー（Ｂｉｒｒｅｎ　Ｂ、Ｗ、）及びフードエル（Ｈｏｏｄ 　Ｌ、）　（１９８８）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２０３−１２０５゜ ドーキンス　エッチ　ジエー　ニス（Ｄａｗｋｉｎｓ　Ｈ，Ｊ、Ｓ、）、フェリ アー　ディー　ジエー（Ｆｅｒｒｉｅｒ　Ｄ、Ｊ）及びスペンサー　ティー　エ ル（Ｓｐｅｎｃｅｒ　Ｔ、Ｌ、）　（１９８７）核酸レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）　ｌ　５．３６３４−３６３５゜ラース　ダブリュー　ニー （Ｌａａｓ　Ｗ、Ａ）、パターラン　ディー（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　Ｄ、）及び ガーディナー　ケー　ジエイ（Ｇａｒｄｉｎｅｒ　Ｋ、Ｊ、）　（１９８８）米 国特許第４７４０２８３号。

ガーディナー　ケイ（Ｇａｒｄｉｎｅｒ　Ｋ、）　、ラース　ダブリュ（Ｌａａ ｓ　Ｗ、）及びバターラン　ディ（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　Ｄ、）（１９８８）ツ マチック　セルＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１１．モレキュラー　ジュネティクス（Ｍ ｏ１．Ｇｅｎｅｔ）　１２．１８５−１９５゜ オルバック　エム　ジエ（Ｏｒｂａｃｈ、Ｍ、Ｊ、）　、ポルラス　ディー（Ｖ ｏｌｌｒａｔｈ　Ｄ、）　、デービス　アール　ダブリュ（Ｄａｖｉｓ　Ｒ，Ｗ 、）及びヤノフスキー　シー（Ｙａｎｏｖｓｋｙ　Ｃ，）（１９８８）モレキュ ラー　セル　バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、８．１４６９−１４ ７３゜シュワルツ　ディーシー（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｄ、Ｃ）、サフラン　ダブ リュー　（Ｓａｆｆｒａｎ　Ｗ、　）　ウェルシュ　ジｓ　−（Ｗｅｌａｈ　Ｊ 、　）、ハース　アール（Ｈａａｓ　Ｒ，）ゴールデンベルグ　エム（Ｇｏｌｄ ｅｎ　ｂｅｒｇ　Ｍ、）及びキャンター　シー７−ル（Ｃａｎｔｏｒ　Ｃ，Ｒ， ）　（１９８２）コールド　スプリング　ハーバ−シンポジウム　フォント　バ イオロジー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂ ｉｏｌ、）　４７．１８９＝１９５゜シュワルツ　ディー　シー（Ｓｃｈｗａｒ ｔｚ　Ｄ、Ｃ）、及びキャンター　シー　アール（Ｃａｎｔｏｒ　Ｃ，Ｒ）　（ １９８４）セル（Ｃｅｌｌ）３７．６７−７５゜ サーク−ピー（Ｓｅｒｗｅｒ　Ｐ、）　（１９８７）電気泳動（ＩＥｌｅｃｔｒ ｏ　ｐｂｏｒｅｓｉｓ）　８．３０１−３０４゜サザン　イー　エム（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ）、アナンド　アール（Ａｎａｎｄ　Ｒ，）ブラウン　ダブリ ュー　アール　ニー（Ｂｒｏｗｎ　Ｗ、Ｒ，Ａ）及びワルツチャー　ディー　ニ ス（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ　Ｄ、Ｓ）　（１９８７）核酸レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄＲｅｓ、）１５．５９２５−５９４３゜パン　オメン　ジージエービー（ Ｖａｎ　Ｏｗｍｅｎ　Ｇ、Ｊ、Ｂ）及びベルカーク　ジエーエムエッチ（Ｖｅｒ ｋｅｒｋ　Ｊ、Ｍ、Ｈ）（１９８６）ヒト遺伝病の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏ ｆ　ＨｕｍａｎＧｅｖｅｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）デーピース　ケーイー出版 （Ｄａｖｉｅｓ、に、Ｅ、ｅｄ）ｐｐ　ｌ　ｌ　３−１３３、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ　。

ポルラス　ディ（Ｖｏｌｌｒａｔｈ　Ｄ、）及びデービス　アールダブリュー（ Ｄａｖｉｓ　Ｒ，Ｗ）　（１９８７）核酸レス（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ ｓ、）　１５．７８６５−７８７６゜補正書の翻訳文提出書　１許法ｌＫ１８４ 条の８）平成３年４月δ日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．カソードとアノードと固定極性電位差をカソード及びアノードに供給する手 段からなる第一の電極手段、及び 使用時にアノードとカソードが、保持ゲルのそれぞれの反対側に位置して固定極 性電界を保持ゲルの面内に作るように、使用時にゲルを装置内に保持するのに適 切なゲル保持手段を含む電気泳動装置において、第２の電極手段が、少なくとも ２つの電極及び電極に交互極性電位差を供給する手段からなり、使用時に第２の 電極手段が保持ゲルの面を横切りかつ実質的に垂直な交互極性電界を作るように 、少なくとも１つの電極が保持ゲルの面の各側面に位置していることを更に特徴 とする電気泳動装置。
2. ２．交互極性電位差を供給する手段が、電源及び０．１秒から少なくとも５００ ０秒のパルス時間で固定極性電位差を供給しかつランプすることができるスイッ チングユニットである請求の範囲第１項記載の電気泳動装置。
3. ３．固定極性電位差を供給する手段が、０．１秒から少なくとも５０００秒のパ ルス時間で交互極性電位差を周期的にランプすることができる電源及びユニット である請求の範囲第２項記載の電気泳動装置。
4. ４．固定極性電位差を周期的にランプすることができるユニット及び交互極性電 位差を供給しかつランプすることのできる電気スイッチングユニットがシンクロ ナイザーである請求の範囲第３項記載の電気泳動装置。
5. ５．第１の電極手段の第２のアノード及びカソード、及び第２の電極手段の電極 がワイヤである請求の範囲第１ないし４項のいずれかに記載の電気泳動装置。
6. ６．第２の電極手段が４つの電極を含む請求の範囲第１ないし５項のいずれかに 記載の電気泳動装置。
7. ７．４つの電極が、雪極、アノード及ひカソードが等しくラジアルにアノードと カソードに平行な軸の回りでアノードとカソードの間の真ん中に配置されている ように、アノードとカソードに平行に位置する請求の範囲第６項記載の電気泳動 装置。
8. ８．ゲル中に含まれる分子が、ゲルの面内で固定極性電界にさらされ、この固定 極性電界が第２の電極手段により作られる電気泳動分離方法において、分子が同 時に、第２の電極手段により作られる、ゲルの平面に実質的に垂直な交互極性電 界にさらされる電気泳動分離方法。
9. ９．請求の範囲第１ないし７項いずれか記載の電気泳動装置の使用を含む請求の 範囲第８項記載の分子の電気泳動分離方法。
10. １０．分子がＤＮＡ分子を含む請求の範囲第８又は９項記載の分子の電気泳動分 離方法。