JPS58147639A - 連続電気泳動分離法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高分子両性電解質を電気泳動によって分離する
連続電気泳動分離法および装置に係る。

蛋白質を代表とする高分子両性電解質は、酵素あるいは
生体構成要素として重要な意味を持つ物質であって、其
の迅速な分離は生化学的に大きな意義を有している。蛋
白質その他の両性高分子電解質を分離する方法のひとつ
として電気泳動法が利用されているが、一般的に用いら
れている電気泳動法は、一定量の試料を各構成要素に分
離することを目的とした装置で行われ、ているため−回
の操作で分離できる量が極く小さく、これをスケール・
アップする場合にも問題と成る点が多い。また試料を連
続的に分離するように工夫された電気泳動装置もいろい
ろあるが、試料構成要素を同時に多数のフラクションに
分離することを目的としたものが主であるためプレパラ
ティプなスケールでの使用には不便なものも見られる。

本発明は上記の事情に基きなされたもので高分子両性電
解質混合物溶液を連続的に、構成成分を異にする二種類
の液に分離する事を基本゛とする電気泳動による分離の
方法および装置であって、多量の試料の分離に対して有
効な方法および装置を得ることを目的′としている。

各種両性電解質を電解質水溶液中において電気泳動する
とき各両性電解質分子は、その易動度に従って水溶液中
を移動するが、それぞれの移動する方向並びに速度は各
両性電解質の有する電荷、質量その他に依存する。両性
電解質の場合電荷はｐＨによって変化し、等電点に相当
するｐＨにおいては、両性電解質分子のもつ正負の電荷
の和がゼロとなり、その前後のｐＨにおいては正または
負の電荷を帯びるようになる。従って、特定の両性電解
質分子に対しては、溶液のｐＨ値を選ぶことによって溶
液中で帯びる電荷を正又は負に定めることが出来、本発
明においてはこれを利用して、二種類の両性電解質分子
を含む溶液にたいして、そのｐＨを適当に選ぶことによ
り、電気泳動に際するそれぞれの移動方向を反対方向に
定め分離を行うようにしている。

すなわち、このような条件を具えた溶液を、電気泳動に
際して電解質イオンを通過させる性質を持っている一方
、溶液の移動に対しては障害となるような性質の膜、例
えば電気泳動法で用いられる担体ゲルのような材料で作
られた膜（これを泳動膜と名付る）、で中間を仕切った
一容器に充たし、膜の両側に電極を設け、膜を介する方
向の電気泳動を行い、両性電解質のうち正電荷を帯びた
ものに負の電極に、負電荷を帯びたものに正の電極に向
かう移動を開始させる。結局、膜の正電極側に有る正荷
電分子は負側に、負電極側に有る負荷電分子は正側に膜
を透して移動し、電極面に於ける電気分解が無ければ、
最終的には各両性電解質は容器の膜で仕切られたそれぞ
れの側に集まることになる。

この分離法を実現するには、分離対象となる両性電解質
分子が電極と接触して電気分解されるのを防ぐこと、及
び電気泳動にともなって生じる溶液の声変化を無視でき
る程度に抑制することが必要な条件となるが、それはこ
の容器の電極の周辺を更にイオン伝導性を有しながら両
性電解質を通過させない材質の膜で仕切って、電極の部
分を緩衝液で満たした構造を作る事に依って１１両性電
解質分子と電極とが接触しな−・ようにすること、なら
びにその緩衝液を常時交換して液のｐＨを一定に保つこ
とに依って可能である。

これらの制限を充たす実験条件として、セロファンのよ
うな透析膜を電極周辺の仕切として使用し、蛋白質のよ
うな高分子両性電解質を分離試料として用いることがあ
げられるが、その実施に当っては、これらの仕切りにも
ちいられる泳動膜及び透析膜が共に通電時に電気浸透を
おこさないか、あるいｉそれが無視出来る程度のもので
あることが必要となる。この面から濾紙、セルロース・
アセテート膜は溶液の透過性が過大であることならびに
電気浸透が高いことのため泳動膜として不適当であり、
またセロファンは電気浸透が起ることならびに低分子蛋
白質に対して透過性があることのため透析膜として不適
当であって、これら以外の材質で作られた膜が必要とさ
れる。

これらの条件が充たされた装置を用いれば、当型点を異
にする二種類或いはそれ以上の高分子両性電解質を含む
溶液を、それらの当型点に基づいてそれぞれ異なる成分
を含む二種類の溶液に分離することが可能となり、更に
再度ｐＨを調整してその各々に対する分離を行うことに
より、より多くのフラクションに分けることも可能とな
る。

また多くの両性電解質を含む混合試料中から特定物質の
みを単離するには、目的物質の当型点を挾む二つのｐＨ
を設定し、試料溶液ならびに緩衝液のｐＨをその一方に
調整して分離操作を行ない、目的物質を含むフラクショ
ンを得たのち、これらをいまひとつのｐＨに再調整して
再び分離操作を行なうことにより目的成分だけを含むフ
ラクションを得る事ができる。

実際の分離操作は、試料を緩衝液に溶解し予め定メ？、
：　ＰＨＫ　ｙ４整して、中央の泳動膜を挾む二つの室
（分離室と名付ける）に充たし、分離室と透析膜で仕切
られた正及び負の二つの電極室に、試料液と均しいｐＨ
の緩衝液を循環させながら、電極間に電流を流すことで
完了し、極めて簡単である。

通電時に発生する阻害要因としてジュール熱の発生、及
び電気分解により両電極面で発生する酸・塩基が緩衝液
のｐＨを変化させ分離条件を不適切とすることなどがあ
るが、これらは緩衝液の還流速度を充分速くし、更にそ
れを冷却して温度を保持する事に依って条件の変動を極
く僅かに抑えることができる。また正・負両電極室から
戻った液に認められる僅かなｐＨ変動は、両液を合流さ
せ混合することによって元のｐＨを回復させることがで
きるから、長時間の運転に際しても多量の緩衝液を用意
することは不要である。

この分離法には分離された溶液の試料濃度が元の試料溶
液中より高濃度になると言う他に見られない大きな特徴
が有る。これは、同一の組成をもった試料液が二つの分
離室に送入された際、試料液中の溶質の一部がそれぞれ
隣りの区画に交換的に移動し、元の区画内に残った移動
しない溶質に加わる為に起る現象である。一般的に、物
質の分離は濃度の低下を伴う場合が多く、分Ｓ後の濃縮
が必要な場合が多いが、此の方法は其の数少ない例外と
言う事が出来る。又これを利用すれば試料液の送入速度
を調節するだけで、より大きな濃縮効果を得る事も可能
となる。

以下、上記本発明分離法を実施するに適した装置につい
て説明する。

第１図において、装置筐体ｌは絶縁物により構成さ−れ
、その内部は筐体中央に位置する泳動膜２およびこれと
筐体側壁間に位置する２枚の透析膜３．４とにより、一
端から他端に向って並ぶ電極室５、分離室６．７、電極
室８に区画されている。

なお、電極室５，８内にはそれぞれ電極９，１０が設け
である。各電極室５．８はその下面に緩衝液注入管１１
．１２をそなえ、上面に緩衝液排出管１３．１４をそな
えている。また、注入管１１．１２は中間に送液ポンプ
１５．１６を有し、それらの下端は緩衝液タンク１７内
の緩衝液１８中に浸漬されている。なお、排出管１３．
１４の端部はタンク１７の上方に位置させられている。

分離室６．７はその下面には試料液注入管１９゜２０を
そなえ、上面には試料液排出管２１．２２をそなえてい
る。また、注入管１７．１８は中間に送液ポンプ２３．
２４を有し、それらの下端は独立して設けた試料液タン
ク２５．２６内の試料Ｑ　２５　ａ　＋２６ａ中に浸漬
されている。なお、図示の都合上省略したが、排出管２
１．２２端部は対向する注入管１９．２０が浸漬されて
いる試料液タンク２５．２６上方に開口されている。

さらに、緩衝液タンク１７周面を包囲して冷却ジャケッ
ト２７が設けてあり、夕／り１７底面には例えばマグネ
チンクステアラ等の攪拌機２８が設けである。２８ａは
攪拌翼を示す。

上記構成の装置において、泳動膜２および透析膜３．４
は溶液の透過をほぼ阻止し、電気泳動に際してイオン伝
導性を示すものとする。ただし、透析膜３．４は高分子
イオンに対して透過性を示さない。

試料液タンク２５．２６には、溶質濃度およびｐＨを調
整した試料液２５ａ、２６ａを入れ、緩衝液タンク１７
には試料液と同一にｐＨを調整した緩衝液１８を入れる
。この状態として送液ポンプ１５，１６゜２３．２４を
起動し、各電極室５．８内に緩衝液を、また各分離室６
．７内に試料液をそれぞれ循環させる。なお、図示しな
い直流電源により電極９を＋、同１０を−になるように
電圧を印加する。すると、筐体１の中の十電荷を帯びた
イオンは一極に、−荷電のイオンは子種に向かってそれ
ぞれ泳動膜２を透過して移動を開始し、電流がながれる
。

而して二枚の透析膜３．４は通常のイオンを透過させる
が、高分子イオンは透過させないので、分離室６，７に
充たされた試料液中の高分子電解質イオンの可動範囲は
分離室６及び７の中に限られ、その結果として十荷電を
有している高分子電解質イオンは分離室７に、又−荷電
を帯びている高分子電解質イオンは分離室６に集まるこ
とになる。

”これらの高分子電解質が蛋白質その他の高分子両性電
解質であれば、ここで用いられたｐＨより高い等電点を
有する高分子両性電解質は十荷電を持つから分離室７に
、また低い等電点のものは一荷電を持つから分離室６に
それぞれ集り、最初に単一の溶液であった試料液はそれ
ぞれ異なる組成を有する二種類の液に分割される。

この方式の運転で最初に試料液を二分する際、それぞれ
の容量を等しくしておけば、分離完了時の各フラクショ
ンに含まれる溶質濃度はそれぞれ最初の濃度の二倍で有
るが、試料液の二分割に際してそれぞれの量を異にして
おけば、量の少ない方の試料液タンクに集まる溶質はよ
り高濃度になり、濃縮効果を際立たせることが出来る。

この間の電流に依って容器全域に亘ってジーール熱が発
生し、また電極面で溶液の電気分解が起って緩衝液のｐ
Ｈが変動する。しかし乍ら発生するジュール熱は、電極
室５及び８に送液ポンプ１５゜１６によって循環的に供
給される多量の緩衝液によって運び去られる為、温度上
昇はほぼ完全に防止でき試料の変性に対する特別の考慮
は必要としない。また同時に生じるｐＨ変動は電気分解
を受ける物質が水のみの場合には、供給される緩衝液量
が充分大きければ無視できる程度にとどまり、更に排出
口１３．１４から排出される緩衝液を緩衝液タンク１７
に戻し、マグネチックステアラ２８による攪拌翼２８ａ
の回転で混合することＫより元のｐＨが回復されるので
、ｐＨ維持のための特別の手段を設けることなく、装置
の連続運転を行うことができる。なお、運転中ジャケッ
ト２７には冷却水が通水され、これにより緩衝液１８の
温度上昇を防止する。

なお緩衝液用の送液ポンプ１５．１６の送液速度は、通
電によって発生する熱及びｐＨの変動に対して充分な抑
制効果を発揮するため、電極室内の通過に無理かがから
ない範囲で高速であることが望ましい。とくに運転に際
して泳動電流を大きくした場合には、ジーール熱がより
多く発生し同時に緩衝液のｐＨ変動もより著しくなる関
係上、両電極室に循環させる緩衝液の量をより太き（し
なければならないが、このような場合には電極室を幾つ
かの区画に分割してそれらの−っ一つに別々のポンプを
使用するようにすればよい。試料液を循環させる送液ポ
ンプ２３．２４の送液速度は、分離室内に試料液を滞留
させるためのものであるから低速のもので良い。また送
液ポンプ１５と１６、ならびに２３と２４の送液速度は
特に厳密さを要求されるものでなく相互間の速度の差は
問題にならない。

この装置で実際に試料の分離を行なってみると、分離さ
れて電極室側に移行すべき試料成分の小量がいつまでも
もとの分離室内に残存し、その完全な分離には長時間を
要する場合があり、その原因として分離室内の試料液の
ｐＨの変動が考えられる。

分離室内の試料液は透析膜を介して緩衝液と接しており
、緩衝性溶質は膜を透過できるから、試料液のｐＨ変動
は起り難（・筈であるが、長時間の分離操作の結果とし
てそれが生じている場合がみられ、その原因として分離
の結果生じる両性電解質の濃度変化、イオン種による膜
透過性の差なども考えられるが、何れにせよ分離のため
にはｐＨの蕎動を防止する必要がある。高分子電解質溶
液のｐＨ調整には透析がしばしば用いられ、この場合に
もそれが有効であるから、試料液を溜めている試料液タ
ンク２５．２６を透析膜で構成し、緩衝液タンク１７内
の緩衝液１８に浸漬して設置して分離室との間を循環し
ている試料液が常に透析をうけている状態を作ることに
よりこの問題を解決することができる。

第２図は本発明分離法を実施すべき装置の他の例を示す
。この装置においては、分離室６，７はそれぞれ泳動膜
２ａ、２ｂを介して試料液室２９と接している。

この装置においては、試料液中の各成分はその帯びてい
る電荷に応じて、中央の室から左右何れかの分離室に移
行することによって分離されるようになり、純度の高い
分離が容易に且つ速やかに行うことができる。またこの
装置においては、試料液に含まれている一物質の等電点
に等しいｐＨを運転条件とすることに依り、試料液中で
電荷を持たないので通電時に泳動しない物質だけを試料
液室２９に残し、他の高分子電解質をその左右の分離室
６，７にうつす形式の分離を行うこともできる。

これらの装置の処理能力を増大するには、泳動電流を増
やして装置の単位面積・時間肖り処理量を増加すること
、更に装置の寸法特に泳動膜面積を増大すること、試料
を連続的に処理できるようにすることなどが必要となる
。

これらの装置の運転に際して試料液の分離を一回の分離
室内通過だけで完了でとるようにし連続運転で多量の試
料を分離しようとするには、大型の装置を使用し試料液
の注入速度を充分遅くするような方法で試料液の分離室
内滞留時間を充分長くする必要がある。然しこの方法は
前掲の試料液のｐＨ変動等の影響が大きくなる可能性が
ありｐＨ維持のための何らかの手段を必要とするので、
むしろあまり容量の大きくない装置を幾つか列ね、それ
らの間で試料液を緩衝液で透析できるようにした形状の
装置を用いて行うことが好ましい。

大容量の装置を使って連続的に分離を行いながら高度濃
縮効果を挙げるには、試料液注入ポンプの速度を調節し
て、濃度を高める側の注入速度を遅く、もう一方の側の
速度を早くしてそれぞれの分離室を単位時間内に通過す
る液量を適当に選択すればよい。

なおこの分離装置に使用される泳動膜及び透析膜につい
て説明する。

泳動膜は溶液の自由な移動を妨げる一方、電気泳動に際
して高分子電解質イオンならびに電解質イオンを通過さ
せる性質を持つ膜で、電気浸透をおこさないものであっ
て、ある程度の物理的な強度をもったものでなければな
らない。これに適したものとして一般的に電気泳動用担
体として用いられているポリアクリルアミドゲルを、処
方を変え、支持体上で重合させてつくった膜を使用した
。

製法は、架橋度が低く密度の比較的高いゲルを得るため
、ポリアクリルアミド・モノマーに加えるＮ、Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミドの量を通常の　　　１３％よ
り減らしく１〜２％）、通常より濃い１０％程度の濃度
の水溶液としたものを、重合触媒その他を加えた後、濾
紙あるいはナイロン・メツシーのような支持体に充分つ
け、ガラス板のような平板の間に気泡を入れないように
注意して挾み空気との接触を断って放置し重合させるこ
とによった。

このようにして得た泳動膜は、丈夫で水溶液の保持性が
高く、分子量の大きい高分子両性物質にたいしても速い
泳動速度を示した。

透析膜は溶液を透過せず、電気泳動に際して通常の電解
質イオンを透過して電気伝導性を保持する一方、高分子
両性電解質の透過を妨げ、電気浸透をおこさない膜でな
ければならない。また物理的にも強いものであることが
要求される。この目的に適うものとして、ポリアクリル
アミドモノマーに２５％以上のＮ、Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミドを加えたものを、更に４０％以上の濃厚
な水溶液とし、泳動膜の場合と同様な支持体の上に重合
させ、高架橋度・高密度のゲルとしたものを使用した。

この場合、膜の電気抵抗が高くなり易いので使用する支
持体には厚さの少ないものを選び、薄い膜を作る必要が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明一実施例の模式図、第２図しま他の実施
例の模式図である。 １・・・筐　体、　　　２．２ａ、　２ｂ・・・泳動膜
、３．４・・・透析膜、　　５．８・・・電極室、６．
７・・分離室、　　９，１０・・電　極、１１、１２・
・緩衝液注入管、 １３．１４・・・緩衝液排出管、 １５、１６．２３．２４　・・送液ポン゛プ、１７・・
・緩衝液タンク、１９．２０・・・試料液注入管、２１
、２２・・・試料液排出管、 ２５、２６・・・試料液タンク 出願代理人　弁理士　菊　池　五　部 弗　ｌ　口 弗　２　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）両性高分子電解質を含む試料溶液のｐＨを両性高
   分子電解質の等電点に応じて調整し、透析膜を解して流
   動状態にある前記試料溶液と試料溶液にｐＨを一致させ
   られ同じく流動状態にある緩衝液とを接触させ、前記緩
   衝液側から前記試料溶液に電圧を印加して試料液中の両
   性高分子電解質に電気泳動を行わせ、両性高分子電解質
   を分離させることを特徴とする連続電気泳動分離法。 （２）装置筐体と、この筐体内を二分する泳動膜と、こ
   の泳動膜と筐体側壁間を二分する透析膜と、透析膜と筐
   体側壁間に形成された室内に設けた電極と、前記電極を
   含む室内に緩衝液タンク内の緩衝液を循環流動させる手
   段と、前記泳動膜と各透析膜との間に形成される室内に
   試料溶液タンク内の試料溶液を循環流動させる手段と、
   前記電極に直流電圧を印加する電源とを有することを特
   徴とする連続電気泳動分離装置。 （８）前記試料溶液タンクを透析膜により構成し、緩衝
   液タンク内の緩衝液中に浸漬して成る特許請求の範囲第
   ２項記載の連続電気泳動分離装置。