JPH04501659A - 泡応答性の生化学センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 泡応答性の生化学センサ 産業上の利用分野 本発明は生化学センサに関するものであり、特に、溶液中に存在する被分析物を 検出するための酵素と基質を組み合わせて用いたバイオセンサに関するものであ る。

発明の背景 静電容量親和センサ（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　５ｅｎｓｏｒ ｓ）は、センサの２つの電極間の電場に分子が出入り運動した時の静電容量の変 化を検出して被分析物の濃度を測定するのに用いられている。分子が上記電極表 面上に接近し、あるいは、そこから離れる運動をすると、２つの電極間の生化学 的に活性な層の誘電特性が変化する。運動する分子によって溶媒分子が移動・置 換されるすると、２つの電極間で測定される静電容量は小さくなる。従って、セ ンサによって測定される液分　゛折物の濃度を２つの電極間の静電容量の変化に 関連付けて測定することができる。しかし、この種の静電容量親和センサの感度 は、通常の生物分子によってセンサ面から移動・置換される水の量によって制限 される。

スタンプロ（Ｓｔａｎｂｒｏ）達の米国特許第４．７２８．８８２号には、液体 中に存在する炭化水素のような揮発性物質を測定するための静電容量センサが記 載されている。この特許に記載のセンサは非極性分子に対して高い親和力を有す る室温加硫された（ＲＴＶ）シリコーンゴムの濃縮層を有している。炭化水素は 非極性であるので、このシリコーンゴムの濃縮層に容易に入ることができる。そ の結果、炭化水素の濃度に比例してシリコーンゴムの濃縮層の表面上に泡の核が でき（ｎｕｃｌｅａｔｅ）、その分だけセンサの静電容量が小さくなる。このス タンプ口達の特許に記載のセンサは、揮発性物質の分子の量を測定するものでは あるが、揮発性物質の分子を発生させる手段は備えていない。従って、このスタ ンプ口達の特許は、本発明者の生化学センサはど融通性がない。なお、本発明者 は、スタンプロ特許の共同発明者である。

ルベンスタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅ　ｉｎ）達の米国特許第３．８１７．８３７ 号には、酵素活性に応じて有機物質の濃度をアツセーする方法が記載されている 。この方法では１つの分子が存在することによって多数の分子ができる増幅作用 が得られる。この特許にはさらに、特殊なイオン電極を用いて酵素をアッセーす る方法も記載されている。しかし、センサー表面で泡の核ができるということや 、このようにして生じた泡の核がセンサにどのような影響を与えるかということ については全く記載されていない。

一方、センサの表面で揮発性物質が泡の核として発生し、溶液から出て気相とな る泡機構（ｂｕｂｂｌｅ　ｍｅｅｈａｎｉｓａ＋）を利用することによって、生 化学センサの感度を簡単に向上させようとする要求がある。

発明の概要 本発明は、揮発性分子を生成させる手段と、生成した揮発分子からの泡の核を形 成させる手段を有する表面と、この表面上で核として発生した応答する手段とに よって構成される被分析物に応答する装置に関するものである。

本発明の１実施態様は、１対の導体の間のシリコーン表面と、酵素と、揮発性物 質を発生させることができる基質と有するセンサである。例えば、酵素はカタラ ーゼであり、基質は水と揮発性物質の０２を発生させるをＨ２Ｏ，である。この 揮発性物質はシリコーン表面で泡の核となることができ、この泡の核（ｎｕｃｌ ｅａｔｅｄ　ｂｕｂｂｌｅｓ）は被分析物の濃度に応じて急速且つ大幅にセンサ の誘電特性を変化させる。

図面の簡単な説明 図１は静電容量センサを上方から見た図である。

図２は第１のセンサの拡大横断面図である。

図３は図２のより詳細な図である。

図４ａは本発明のテストセンサ面の１実施態様を示す。

図４ｂは図４８のセンサと比較するために用いられる基準センサ面を示す。

図５ａは本発明のテストセンサ面の別の実施態様を示す。

図５ｂは図５ａのセンサと比較するために用いられる基準センサ面を示す。

図６３と図６ｂは本発明の別の実施態様を示す。

図７ａと図７ｂは本発明のさらに別の実施態様を示す。

図８は本発明のセンサのテストに使用される装置を示す。

図９はシリコーン上でカタラーゼを有するタンタル焼結ペレットを用いて０．０ □を検出した時のグラフである。

図１０は図１の平らな静電容量センサを用いてＨＩＶ抗体を検出した時のグラフ である。

図１１はシリコーン上でカタラーゼを有するタンタル焼結ペレットを用いて毒を 検出した時のグラフである。

図面の簡単な説明 図１〜図３は本発明の原理を概念的に示したものである。

図１は、チップ而１３上に支持された２つの電極１１．１２を有する静電容量セ ンサ１０を上方から見た図である。電極１１．１２は互い違いに挿入しあったリ ード線１４．１５を有している。これらの２つの電極１１．１２間の静電容量は これらの電極上および電極間にある物質の誘電特性によって決まる。この静電容 量は電極１工、１２間距離に対する物質の誘電定数の比に比例する。また、電極 １１．１２間の全静電容量は、２つの電極１１．１２を被覆する各層の静電容量 成分に依存する。この点は１９８７年５月１日に出願され且°つ本発明の譲渡人 に譲渡された「電場と干渉するための３次元結合サイト配列“Ｔｈｒｅｅ　Ｄｉ ｍｅｎｓｉｏｎａｌＢｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　Ａｒｒａｙ　Ｆｏｒ　Ｉｎｔｅ ｒｆｅｒｉｎｇ　１ｌｉｔｈ　Ａｎ　ＥｌｅｃｔｒｉｃａｌＦｉｅｌｄ”と題す る米国特許出願第０４４．７６１号に記載されている。

この特許出願第０４４．７６１号の明細書の内容は本発明の一部を成す。

図２は図１の静電容量センサｌＯの拡大横断面図である。２つの電極】１．１２ の互いに挿入しあったリード線１４．１５は互いに間隔を介して配置されている 。２つの電極１１．１２の各リード線１４．１５およびこれらのリード線間で露 出しているチップ１３の部分１７は不動態化層（ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ　１ａ ｙｅｒ）　１６で被覆されている。この不動態化層１６はＲＴＶシリコーンゴム （ＧＥ！　１１８）のようなシリコーンゴム面１８で被覆されている。すなわち 、センサ面は、チップ１３、リード線１４．１５、不動態化層１５．１６および シリコーンゴム面１８で構成されている。上記の不動態化層とシリコーンゴム層 は、スタンプロ（Ｓｔａｎｂｒｏ）達の米国特許第４．７２８．８８２号「液体 中で炭化水素を含む一定の被分析物を検出するための静電容量型化学センサ’Ｃ ａｐａｃｉｔｉｖｅ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌ　５ｅｎｓｏｒ　Ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃ ｔｉｎｇ　Ｃｅｒｔａｉｎ　Ａｎａｌｙｔｅｓ、ＩｎｃｌｕｄｉｎｇＨｙｄｒｏ ｃａｒｂｏｎｓｌｎ　Ａ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｍｅｄｉｕｍ″」に記載された方法で 堆積させることができる。この特許の明細書の内容は本発明の一部を成す。

上記のセンサ面は、燐酸塩を含む緩衝食塩水（ＰＢＳ）で構成れる水溶性環境（ ａｑｕｅｏｕｓ　ｅＩＩＩｖｉｒｏｎｓｅｎｔＨ９で被われる。従って、この場 合、静電容量センサ１０の２つの電極１１．１２間の誘電材料は、不動態化層１ ６、シリコーンゴム面１８および水溶性環境１９によって構成され、２つの電極 １１．１２を横切って電位が印加された時に生じる電界は、この誘電材料によっ て影響される。

上記シリコーンゴム面は浸透性が有り且つ多くの凹凸を有している。シリコーン ゴム面の機能は、溶液からくる揮発性物質をこの面を通過することによって気相 に変え、それによってセンサの電極１１または１２が酵素および基質活性に応じ た信号を発することができるようにすることにある。シリコーンゴム面１８のこ の機構は上記特許第４．７２８．８８２号に記載されている。

本発明では、揮発性物質がシリコーンゴム面の近くに来ると、それが泡の核とな り、その結果、この物質の誘電特性が２つの電極１１．１２間で急激に変化して 、センサ１９の静電容量が被分析物の１度に応じて変化する。

図３はシリコーンゴム面１８の拡大詳細図である。本発明の１実施態様では、シ リコーンゴム層１８はＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）　２０ で被覆されている。このＡＰ３２０はシリコーン層１８と共有結合して酵素層２ １を固定する。

酵素層２１が吸着によってシリコーン層１８に固定されている場合にはＡＰＳは 不用である。この固定酵素分子は他の生化学物質が存在しても付着状態を維持し 、固定されている。酵素層２０の実際の厚さは、シリコーンゴム面１８の凹凸に 比べればばかに薄いが、図３では、理解を容易にするために酵素層２１の厚さを 誇張して示しである。図３ではシリコーンゴム層１８、Ａ　Ｐ　Ｓ　２１よび酵 素層２１が連続している状態が図示されているが、これらの層は非連続的でもよ く、例えばシリコーンゴム面１８を格子パターンとして堆積させ、この格子内に ＡＰＳを収容することもできる。

酵素層２１に対する基質２２は、センサ面１ｏを被った水溶性環境１９に添加さ れる。この基質２２は酵素層２１の存在下で揮発性物質に変る。シリコーンゴム 面１８はこの揮発性物質が溶液から出て気相になることを可能にする面である。

従って、泡２３はセンサ面上で核となる。

本発明者は、センサ面に核となる泡が存在した場合には、センサ面に核となる泡 がない場合に比較べて、センサの誘電特性が劇的に変化するということを発見し た。センサ面２３上の気泡２３は水溶性環境１９の分子をセンサ面から移動させ 、その結果、センサ面ふよび誘電物質の成分内で相変化が起こる。

特に、泡の核ができると、シリコーンゴム面１８上を被った水溶性環境１９を構 成する液体分子が気泡２３によって移動される。

この気泡２３の誘電係数は１〜３であり、一方、水とＰＢＳとで構成される水溶 性環境１９の誘電係数は７８以上である。従って、この誘電物質内で水が気泡に よる移動されると、この物質の誘電特性は劇的に変化し、従って２つの電極１１ ．１２間の静電容量が変化する。

図４ａは、１％のＲＴＶシリコーンゴム（例えばＧＥＲＴＶ１１８）のアセトン 溶液に浸けた後、−晩、硬化させてシリコーンゴム面１８を形成して作った不動 態化層１６を有するセンサを図示したものである。酵素カタラーゼ２４はシリコ ーンゴム面１８に吸着されるか、共有結合される。水溶性環境１９フよびテスト 流体は、上記シリコーンゴム面１８および固定酵素カタラーゼ２４を被っている 。

図４ｂは、図４ａのセンサ１０を被った水溶性環境１９中に、Ｈ２Ｏ２を添加し た場合を図示したものである。このＨ２Ｏ２は酵素カタラーゼ２４の基質である 。酵素の基質とはその上で酵素が触媒として作用する物質のことである。この場 合、カタラーゼ２４は、センサ面の近傍に存在するＨ　２０２分子を化学的に０ ２と水とに変える。０２は核となり得る揮発性物質すなわちセンサ面上またはそ の近傍で溶液から出て気相となり得る揮発性物質である。そして、０２が気相に なると、センサ面上に既に存在していた泡が成長する。この核となる泡２３は、 拘束されていないカタラーゼがＨ７Ｏ２を触媒で０□と水とを生じさせた時に生 じた局部化した高濃度の０２で構成される。この泡２３は、センサ面から水溶性 環境１９の分子を移動させる。泡２３によってこの分子が移動させられると、セ ンサ面上またはその近傍の誘電特性が劇的に変化する。基準センサの出力とこの テストセンサの出力とを比較することによって、例えば、水溶性環境１９中での Ｈ２Ｏ２の濃度が分かる。図４ａ、図４ｂのセンサの製造方法と試験方法は、図 ９を参照した実験Ｉで説明する。この実験では、１〜２分間で計数が９０％増加 し、その時、静電容量は約３０Ｐｆ変化したことが示される。

図５ａ、図５ｂは、本発明を競合法に応用した実施態様を示している。図５ａは 、シリコーンゴム層１８に吸着または共有結合で固定されたハプテンまたは抗原 の層２５を有するテストセンサ面を図示している。水溶性環境１９内に添加され た酵素−抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　２６は、ハプテン２５または抗原 に対する抗体２６ａの生物学的特異性によってハプテン２５または抗原と結合す る。水溶性環境１９内に導入された遊離したハプテン２７は、センサ面上のハプ テン２５から酵素−抗体接合体２６を移動させるため、センサ面上またはその近 傍でのカタラーゼのような酵素２６ｂの量が少なくなる。センサ面上またはその 近傍に存在する酵素２６ｂの量は少ないので、基質のＨ２Ｏ。

をテスト流体中に添加すると、遊離ハブテン２７を添加する前より、生成する泡 の量が少なくなる。

図５ｂは、図５ａに示す本発明の競合センサで比較に用いられる基準センサ面で ある。酵素−抗体接合体を遊離ハプテン２７によってダミーハプテン２８から移 動させることはできない。この基準センサでは、遊離ハプテン２７による酵素− 抗体接合体の移動がないので、Ｈ３Ｏ２を添加した時に泡の生成が最大になる。

この基準センサ面の最大値を図５ａのテストセンサ面の最大値と比較することに よって、テスト流体中の抗体の濃度が分かる。以下、生化学結合系は、特定の被 分析物をテストするための競合結合として用いることができる。

生化学結合系　被分析物 抗原　抗体　抗体 ハプテン　抗体　ハプテン 多糖類　レクチン　多糖類 糖蛋白質　レクチン　糖蛋白質 糖脂質　レクチン　糖脂質 酵素阻害剤　酵素　酵素阻害剤 酵素阻害剤　酵素　酵素基質 神経伝達物質　神経受容体　神経伝達物質ホルモン　神経受容体　ホルモン 図６ａは本発明のテストセンサ面の別の実施態様を図示したものである。テスト 流体中に含まれたヒトの抗体２９は、センサ面上で抗原層３０と結合する。この 抗原は、シリコーンゴム層１８に吸着させるか、共有結合させる。ヒトの抗体２ ９は血液中のＨＩＶ抗体である。酵素−蛋白質接合体３１を含む流体をそのテス ト流体と混合すると、この酵素−蛋白質接合体３１はヒトの抗体２９と接合する 。ヒトの抗体２９のいくつかはセンサ面上の抗原３０と結合して、既に接合して いた酵素３１をセンサ面の近くへ移動させる。酵素３１ａが添加したＨ２Ｏ，に 対して触媒作用をしてセンサ面上に水と０２の泡が生成する。ヒトの抗体２９に 対する抗体は蛋白質３１ｂの代わりに酵素３１ａと接合することができる。この 蛋白質３１ｂはプロティンＧまたはプロティンＡのようなジェネリックな抗体結 合プロティンである。

図６ｂは、図６ａのセンサとの比較に用いられる基準サン上面を図示したもので ある。無意味な抗原３２（例えば、ＨＩ■抗体と反応しない抗原）がセンサ面上 にある。この無意味な抗原３２とヒトの抗体２９との間には特異的結合は起こら ない。

センサ面の近傍に特異的に結合する酵素３１ａはほとんどないので、この基準サ ン上面での泡の形成は最小である。図６ａのセンサを１０６ｂのセンサと比較す る。Ｈ２Ｏ２を添加すると、局部的にカタラーゼを有する図６ａのセンサ面は泡 を発生し７、静電容量センサの誘電特性に変化が起きる。図６ａと図６ｂのセン サの製造方法とテスト方法については、図１０を参照して下記実験２で説明する 。この実験では１〜２分間で計数が９０％の増加し、その間、静電容量は約１０ ｐｆ変化したことが示される。

図７ａは、本発明の別の実施態様のテストセンサ面を図示したものである。酵素 ３３は吸着または共有結合でセンサ面上のシリコーンに結合される。この固定酵 素３３にハプテン３４が共有結合される。テスト流体中の抗体３５はハプテン３ ４と結合し、立体障害特性によって酵素３３を阻害する。立体障害特性とは、抗 体３５と酵素３３との間の物理的な相互作用により酵素の触媒活性を妨害するこ とである。遊離ハプテン３６を試験流体に導入すると、遊離ハプテン３６は、競 合反応で固定ハプテン３４から抗体３５を移動させる。従って、酵素３３の阻害 要因が無くなり、酵素３３によりＨ，Ｏ□が触媒作用されて、センサ面上または その近傍に０２の泡をできる。

図７ｂは、図７ａのセンサとの比較に用いられる基準センサ面を図示している。

ハプテン３４のない酵素３３がセンサ面上に固定されている。この場合、酵素３ ３を阻害するものはないので、センサ面での泡の生成は最大になる。逆に、酵素 ３３によって核となる泡の量は、酵素３３上に固定されたハプテン３４に結合し た抗体の量に比例する。従って、泡の核が存在しない時と存在する時の静電容量 を比較することによって抗体の濃度が分かり、遊離ハプテンの濃度が分かる。変 形実施態様では、基準センサはその表面に化学物質を有さず、従って、泡の生成 量は最小である。この場合の酵素活性は、ルベンスタイ７　（Ｒｕｂｅｎｓｔｅ ｉｎ）達の米国特許第３．８１７．８３７号「酵素増幅分析（Ｅｎｚｙｍｅ　Ａ ａ＋ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ）に記載されている。図７ｄ１図７ｂ はこの米国特許第３．８！７．８３７号の技術が本発明のセンサでどのように実 施されているかを示すものである。

図８は、本発明のセンサを使用して測定する際に本発明者が使用した装置を図示 したものである。測定は高感度位相検出回路３９によって実施された。この回路 は、波形発生器４０からの波形と単純なＲＣ直列回路の中間タップから出た波形 との位相および振幅の差を比較するものであり、この回路の抵抗４２は公知の基 準インピーダンスとして選択され、コンデンサ４３はセンサを表す。この抵抗の 値はセンサの公称静電容量リアクタンスにほぼ等しい。センサの静電容量が変化 すると、それに対応した位相および振幅の変化がこの高感度位相検出回路３９に 生じる。高感度位相検出回路３９の出力は、センサ４３によって生じた位相およ び振幅の変化に比例する直流電圧である。その直流電圧をアナログ／デジタル（ Ａ／Ｄ）コンバータ４４に入れると、このコンバータはコンピュータ４５にデジ タル値を出力する。このデジタル数を実験グラフのＹ軸として記入した。センサ ４３の静電容量が小さくなるとこの値は大きくなる。

実験１ 固定カタラーゼを有するバイオセンサによるＨ　＊　０２の検出まず、１２０Ｖ 以下の電圧且つ一定電流で、次に、１２０Ｖの一定電圧で１時間、２つのタンタ ルペレットを陽極処理して、各タンタルベレットに不動態化層を形成する。この 処理については、ニューマン（Ａ、Ｎｅｗｍａｎ）の「生化学的に活性な層を備 える焼結ペレット（Ｓｉｎｔｅｒｅｄ　Ｐｅ１ｌｅｔ　Ｗｉｔｈ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅ　Ｌａｙｅｒ）　Ｊと題する米国特許第４．７６９ ．１２１号に記載されている。この特許の内容は本発明の一部をなす。得られた ペレットをエポキシ処理してプラスチック片とし、約３ａｍの一定の間隔を介し て保持する。次に、各ペレットを１０％シリコーン（ＧＥ　ＲＴＶ　１１８）の アセトン溶液中に浸し、−晩装置して硬化させる。最後に、このペレットの対を ４５０μｇのカタラーゼを含む２ｍｌのＰＢＳ中に浸てけ放置する。

室温で、ＰＢＳ中に１時間浸けることによって、過剰なカタラーゼを除去した後 、タンタルベレットの対を２ｄのＰＢＳ中に入れ、高感度位相検出器に接続する 。次いで、Ｈ２Ｏ２を添加する。

図９は、ペレットの表面上にカタラーゼを有するタンタルペレットに対するＨ２ Ｏ，の効果を示したものである。Ｈ２Ｏ２を添加すると、９−１の点でＡ／Ｄコ ンバータの計数、静電容量が劇的に減少する。この静電容量の減少は水溶性環境 中のＨ２Ｏ２の濃度に関係がある。この実験では、１〜２分間で、計数の９０％ が増加が起こり、これは、その時に静電容量が約３０ｐｆ変化したことを示して いる。

実験２ 固定抗原を含むバイオセンサによるヒトの抗体の検出熱的に酸化させて１ミクロ ンの５ｉ０＊絶縁層を形成した４インチシリコンウェファ上に平らなコンデンサ を形成した。

Ｓ　ｉＯ＊面上にアルミニウムを１ミクロン堆積させてた後、標準的なホトリソ グラフィ技術を用いてエツチングにより互いにフィンガーに交互に挿入されたパ ターンを製造した。この金属は３００人のＳｉＯ＝層を形成した後、１．０００ 人のＳｉ、Ｎ、の層を乗せ、最後に、３００人の５１０ｗ層を形成して不動態化 した。最後のＳｔｏｗ層は皮膜との結合を容易にするだめのものである。導電性 エポキシ（トランセン　ニッケル　ボンド型（Ｔｒａｎｓｅｎｅ　Ｎ１ｃｋｅｌ 　Ｂｏｎｄ　Ｔｙｐｅ）５０）を用いてチップの結合パッドにワイヤを接合し、 ワイヤ結合領域、チップ側面および背面を非導電性エポキシ（エマージン　アン ド　カミング（ＢＩＩＩｅｒｓｏｎａｎｄ　Ｃｕｍｉｎｇ）のスチキャスト＜５ ｔｙｃａｓｔ）　２８５　Ｆ　Ｔと触媒９または２４ＬＶとを使用）で封止した 。

センサチップの幾何学形状は以下の通り：チップの厚さ　１７　ミル チップ長　１０ｍｍ チップ幅　９關 うイン間隔　２５　ｕｍ 構造反復距離　５０　ｕｍ フィンガーの長さ　８　ｍｍ フィンガーの数　１２５ 基線の静電容量　２２００〜２３００　ｐｐヒトの免疫不全ウィルス（ＨＩＶ） 核蛋白質（ｐ　２４）　［燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、、ｐＨ７，４）Ｉｄ中に １■のサイトチク（Ｃｙｔｏｔｅｃｈ）　］をグルタルアルデヒドを用いてＲＴ Ｖシリコーン／ＡＰＳテストセンサ）に共有結合させた。センサをＨＰＬＣグレ ードのアセトン中に１％シリコーン（ＧＥ　ＲＴＶ　１１８）を溶かした溶液に ３回浸け、各浸漬の間に毎回空気乾燥し、室温で一晩乾燥させて、センサをＲＴ Ｖシリコーンで被覆した。

このＲＴＶシリコーンで被覆されたセンサを２分間、９５％エタノール（メタノ ールとイソプロパツールを含む）１９ｄ、脱イオン北本１ｄ１３−丁ミノブロビ ルトリエトキシシラン（ＡＰ　Ｓ　）　４００ｎｕｎｌの溶液中に浸し、室温で 一晩乾燥させて、センサをＡＰＳで被覆した。

こうして得られたＲＴＶシリコーン／ＡＰＳ被覆センサを、室温で３０〜６０分 の間、ｐｌ＋７．４の燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浸して過剰なＡＰＳを除去 した。ＰＢＳ中に２５％グルタルアルデヒドを溶かした１／１００の希釈液１０ ０μｌを表面に塗布してセンサを室温で１時間の間培養する。グルタルアルデヒ ド溶液を除去した後、テストセンサに１００μｌのＰＢＳ中にＨＩＶ　ｐ２４を １０μｇを含む溶液を添加する。また、１００μｌのＰＢＳ中に１０μｇのヒト の血清アルブミン（ＩＳＡ）ａ含むものを基準センサに添加し、両方のセンサを 湿ったチャンバ内で４℃で一晩培養する。

テストセンサ（ｐ　２４）および参照センサ（ＨＳ　Ａ）の両方を０．０５％の ＩＳＡを含むＰＢＳ　（ＰＢＳ／Ｈ３Ａ＞中で洗浄し、次に、ＰＢＳ／Ｈ３Ａ溶 液に１時間浸ける。希釈していないヒトの血清アルブミン（ＡＲＣ７０）　（Ｅ 　Ｉ　Ａによって予め、ＨＩＶ蛋白に対する抗体を含むことが証明されているも の）１２０μｌを両方のセンサの上に置き、室温で２時間培養する。各センサを ＰＢＳ／Ｈ３Ａで洗浄した後、ＰＢＳ中にカタラーゼと組換えプロティンＧとの 複合体の溶液１００μｌを用いて培養する。ＰＢＳ／ＩＳＡで最終的に洗浄した 後、各センサをファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）ミクロウェルプレートの別々の区画 にＰＢＳ／Ｈ３Ａ２ｄで入れる。

第１０図の１０−３の点に示すように、３０％Ｈ２Ｏ２を１０μ！添加すると、 テストセンサ（ｐ　２４）のセンサ応答性が高くなる。

しかし、基準センサ（ＩＳＡ）では変わらない。この実験では１〜２分間で計数 が９０％の増加し、その時、静電容量は約１０ρＦ変化したことが分かる。

プロティンＧ−カタラーゼ複合体を、ウシ肝臓カタラーゼ３．６■をＰＢＳ中の ０．２５％グルタルアルデヒドｌＯμｌと組み　、合わせ、室温で６５分間培養 させて得た。これにプロティンＧ溶液（ＰＢＳ中に１■）１００μｌを添加し、 室温で６５分間培養する。１Ｍエタノールアミン５μｌを添加し、過剰なグルタ ルアルデヒドと反応させ、室温で１時間培養する。次に、ぞのサンプルを直径１ ．５Ｃ１ｌ＋、高さ１７．５ｃｍのセファローゼ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　 Ｂのカラムに入れ、アジ化ナトリウム０．０１％を含むＰＢＳで溶離させる。カ タラーゼを含む分画の位置は４０５ｎｍでの光学濃度から測定する。カタラーゼ モノマーのピークの立ち上がり端部からの分画をセンサ実験では使用した。

実験３ 固定カタラーゼを有するバイオセンサによる毒の存在下でのＨ２Ｏ２の検出 実験２と同様にして、２つのタンタルペレットを製造する。

次に、これらのペレットを室温で、２時間、カタラーゼ４５０μｇを含む２μリ ツトルのＰＢＳ中に浸漬する。さらに、タンタルベレットを室温で１時間、ＰＢ Ｓに浸漬して過剰なカタラーゼを濯いで除去する。次に、これらのペレットを２ μｌのＰＢＳ中に入れ、高感度位相検出器に接続する。さらに、Ｎ２０．を２５ ｍＭを添加する。

全体を取り出し、新しいＰＢＳを２μｌに入れ、その後直ちにＨ２０ａ２５ｍＭ 、続いて、ＮａＮ５２５０　ＰＰＩＢを添加する。

図１１はペレットの表面にカタラーゼを有するタンタルベレットの毒の存在下で のカタラーゼに対するＨ２Ｏ２の効果を図示したものである。１１−１の点でＨ ３Ｏ２を添加すると、Ａ／Ｄコンバータからの計数は著しく増加し、静電容量が 著しく小さくなる。１１−２の点でＨ３Ｏ２を再度添加すると、Ａ／Ｄコンバー タからの計数は著しく増加し、静電容量は著しく小さくなる。それらのペレット をＰＢＳ中に入れると、計数は著しく減少する。さらに１１−３の点でＨ，Ｏ□ を再度添加し、その直後に酵素前　ＮａＮ５２５０ｐＰ”ｌを添加する。そのグ ラフは、当初、カタラーゼが泡を形成し始めて、上昇し始めるが、Ｎａ島を添加 してカタラーゼに毒を与えると、泡の生成量が少なくなるＥＮ、グラフはその数 値でプラトーになる。この実験では、１〜２分間で計数が９０％増加し、この時 、静電容量は約２０ｐｆ変化したことが分かる。

本発明のこの実施態様では下記のガス発生酵素が好ましい二３、デカルボキシラ ーゼ Ｌ−アルギニン　デカルボキシラーゼ Ｌ−グルタミン　デカルボキシラーゼ Ｌ−ヒスチジン　デカルボキンラーゼ Ｌ−オルニシン　デカルボキシラーゼ オキサレート　デカルボキシラーゼ Ｌ−フェニルアラニン　デカルボキシラーゼし一チロシン　デカルボキシラーゼ ピルベート　デカルボキシラーゼ ４、アスパルターゼ 本発明のセンサは水溶性環境中でＨ２Ｏ２濃度を変える任意のものを検出するこ とができる。例えば、ＨＯＣＩ　（次亜塩素酸）はＨ２Ｃ，を破壊するので、Ｈ ＯＣＩ　（＋Ｈ２Ｏ２）の存在下では、センサは泡を成長させない。また、グル コースと０２はグルコノラクトンを生成させ、この反応ではグルコースオキシタ ーゼ酵素が触媒作用を果たす。Ｈ，０２はまた生成物であるので、グルコースと グルコースオキシターゼと０２はより多くのＨ７Ｏ２を生成し、そのＨａ　Ｏ− はセンサ面上で０２の泡になる。

本発明のセンサを他の実施態様にすることもできる。例えば、センサ面に光学的 または音響学的な導波管を設け、この導波管の面上で泡の核を作ることによって 、例えば光フィイバー、光源、反射器または光検出器を用いた光の伝送や、圧電 結晶や導波管を用いた音響波の伝播を著しく変化させることができる。泡の核が できる面は、スタンプロ（Ｓｔａｎｂｒｏ）達の米国特許第４．７２８．８８２ 号よる「液体中に炭化水素を含む被分析物の検出用静電容量化学センサ」に記載 のような他の材料で作ることもできる。この特許の内容は本発明の一部を構成す る。また、イーストやバクテリア等のある種の微生物は核となる泡をガスとして 出す。そのメカニズムを圧力や温度の変化によって変更えることもできる。ＤＮ ＡやＲＮＡ分子をセンサ面に結合させて、テスト流体中のＤＮＡまたはＲＮＡ分 子の存在を試験することもできる。

本発明の実施態様は、化学的に揮発性物質を生成する酵素と基質に関するもので ある。揮発性物質は相を変えて泡の核となる。この泡の核はセンサ面の近傍で気 泡を形成する。この気泡はセンサ面の近傍から多量の溶液を移動させ、それによ って、センサの誘電特性を劇的に変化させる。

ＦＩＧ、４ｂ ＦＩＧ、５ｂ ＦＩＧ、７ａ ＦＩＧ、７ｂ イ立相検出器のデ゛ジタル出力（１０００隼位）イ立相攻出器のデ゛ジタル出カ （１ｏｏｏ単位）補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．揮発性物質を生成させる手段と、この揮発性物質から泡の核を作る手段で構 成される面と、この面上で核となった泡に応答する手段とによって構成される被 分析物に応答する装置。 ２．上記揮発性物質を生成させる手段によって生成した揮発性物質の量を変える 手段を有する請求項１に記載の装置。 ３．上記揮発性物質を生成させる手段の活性を変える手段を有する請求項２に記 載の装置。 ４．揮発性物質を生成させる手段が、酵素とこの酵素の基質とで構成される請求 項３に記載の装置。 ５．上記酵素に接合され且つ抗体と結合する手段を有する請求項４に記載の装置 。 ６．上記抗体と結合する手段に結合されるヒトの抗体を有する請求項５に記載の 装置。 ７．上記の活性を変える手段が、上記酵素機能を立体障害する手段で構成される 請求項６に記載の装置。 ８，上記の活性を変える手段が、上記酵素の毒となる手段で構成される請求項６ に記載の装置。 ９．上記の量を変える手段が、上記の面で酵素を外したり付けたりする手段で構 成される請求項６に記載の装置。 １０．２つの電極と、これらの電極間の不動態化層と、揮発性物質を生成させる 手段と、上記２つの電極間の上記揮発性物質から泡の核を作る手段と、核となっ た泡に応じてセンサの誘電特性を変化させる上記不動態化層上の面とによって構 成れることを特徴とする静電容量センサ。 １１．上記揮発性物質を生成させる手段が酵素と基質とを含む請求項１０に記載 のセンサ。 １２．上記の面がシリコーンゴムで構成される請求項１１に記載のセンサ。 １３．上記酵素がカタラーゼであり、上記基質がＨ２Ｏ２である請求項１２に記 載のセンサ。