JPH04501663A - 黒色腫用免疫療法ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 黒色腫用免疫療法ワクチン 発明の背景 主型Φ分野 本発明は腫瘍ワクチンに関し、更に詳しくは温血動物の宿主又は患者における黒 色１ｍ　（＋ａｅｌａｎｏ＋ｉａ　ｔｕｍｏｒｓ）の治療を目的とした腫瘍結合 抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ）およびアジュバント からなるワクチンに関する。

従来技街Ωに載 悪性黒色腫の発生率は着実に増加しており、特に、アメリカ南西部のような「気 候の良い地帯（”５ｕｎｂｅｌｔ　”　）　Ｊにおいて、およびオーストラリア やハワイの白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ）の間で増加しつつある。これは、少な くとも一部分は、色の白い人間および室内の職業に従事している人間が周期的に 強烈な日光に身をさらすことに帰因する。カリフォルニアおよびオーストラリア の白人におけるこの疾患の現在の発生率は、ｉｏｏ、ｏｏｏ人に対し約１５人の 割合であり、ハワイにおける発生率の２倍である。エイチ・メンテおよびビー・ イー・ヘンダーソン（Ｈ，Ｍｅｎｃｈａｎｄ　Ｂ、Ｅ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、 「太平洋岸地域における癌の発生Ｊ　、Ｎａｔ　’　Ｉ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｎｓ ｔ。

匣匹肛並し、１９８５　；　６９　：　１０５−１１１を参照。

原発性黒色腫の初期の治療においては手術が効を奏してきたが、散在性タイプ（ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）の黒色腫は、化学療法や放射線療法のよ うなすべての従来の治療方法に対して耐性を示してきた。散在性悪性黒色腫は現 在、化学療法、放射線、非特異的生物学的応答変更因子（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｍｏｄＨ１ｅｒｓ）またはこれ らの併用によって治療されている。しかしながら、いったん転移が起きて癌が身 体中に広がるかまたは転移すると、この病に冒された宿主の長期にわたる生存は ほとんど期待できない。化学療法は１８−２０％の患者に有効であるが、わずか 約５カ月の平均応答期間（ｍｅｄｉａｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｐｏ ｎｓｅ）を有するのみである。放射線は、大量に放射する場合を除き、たいてい は効果がない。

化学療法、放射線又は非特異的生物学的応答変更因子は毒性があり、患者の「基 本条件（“ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　１ｉｆｅ　”　）　Ｊを強烈に低下させると いう望ましくない副作用を有している。この病気に対する最近の免疫学的研究の 結果、インターフェロン−αあるいはインターロイキン−２が使用されるように なったが、前位てシクロホスファミド単独またはエクス・ビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ ）で誘出されたリンフ才力イン活性化キラー細胞とともにシクロホスファミドを 投与する０診断時に黒色腫が深く浸潤していたり、あるいは局部リンパ節がかか わっている場合には予後が悪い。

その際、補助的な（“ａｄｊｕｖａｎｔ”）治療は、顕微鏡的に見た転移発生源 の部位を未然に防止する。即ち多分その部位を撲滅するという試みにおいては理 に適っているように考えられて来たが、これまで有効なものは何ひとつなかった 。

黒色腫全細胞又は溶菌液（Ｉｙｓａｔｅ）からなる種々の製剤を用いた黒色腫の 活性免疫治療法がこれまでに試みられており、患者に免疫性を与えるという点で 、時には望ましい臨床的回復をもたらすという点で、場合により変動があるもの の、ある程度成功している。これらのことについては次の文献に記載されている 。Ｊ。

Ｃ，Ｂｙｓｔｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　’多価ヒト黒色腫抗原ワクチンの調製お よび特徴」、ム且１゜如狂四胆」列、　１９８６　；　５　：　２１１　２２４ 　ＨＤ、Ｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ低薬量シクロホスファミドによるヒト細 胞性およびヒト体液性免疫の増強Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１９８４　； 　４４　：５４３９　５４４３　；Ｄ、Ｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　’進行した 癌患者に対するシクロホスファミド投与後のコンカナバリンＡｇ発性サプレッサ ー活性の損傷Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１９８４　；　４４１２７５−１ ２８０　；　Ｐ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｒ他見的培養黒色腫 細胞から得られたワクチンに対する黒色ＩＩ！患者の血清学的反応Ｊ　、Ｉｎｔ 、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　１９８３　；３１　：　５６７　５７５゜Ｊｏｈｎ　Ｌ 、Ｃａｎｔｒｅｌｌが１９８７年９月３０日に出願した米国特許出１！］１に１ ０２．９０９号（腫瘍抗原およびアジュバントを含有するワクチン）には、少な くとも１種の腫瘍結合性抗原、精製解毒エンドトキシンからなるアジュバントお よび他の免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）を薬剤学的に許容さ れる担体とともに用いた混合物として製造したワクチンが記載されている。　Ｃ ａｎｔｒｅｌｌ博士によって使用された精製解毒エンドトキシンはモノホスフォ リルリビッド＾（ＭＰＬ）であり、詳細は、同時係属の米国特許出願Ｎｏ、７３ ２，８８９号および米国特許ＮＣＬ４．４３６．７２７号（発行日：　１９８４ 年３月１３日、特許権者：　Ｅｄｇａｒ　Ｅ、Ｒｉｂｉ、発明の名称：精製解毒 エンドトキシン生成物）にも開示されている。また、Ｅ、Ｒｉｂｉ　ｅｔ　ａｌ 、、　ｒリピッドＡおよび免疫療法」、Ｒｅｖｔ−ｅｗ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｖｔｉ ｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｖｏｌ、６．　Ｎａ４．７−８月、１９８４．５６ ７−５７２頁を参照。

このアジュバントはまた、マイコバクテリア細胞壁部分（５ｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉ　ｃｅｌｌｗａｌｌ　５ｋｅｌｅｔｏｎ　）からなる群より選ばれた免疫刺激 剤を含む、この点の詳細は、米国特許出ＪｊｌＮｔｘ１０２．９０９号オヨヒ米 国特許Ｎｏ、４，５７９，９４５号（発行日：　１９Ｂ６年４月。

１日、特許権者：　５ｔｅｖｅｎ　Ｍ、ＳｃｈｗａｒｔｚｍｎおよびＥｄｇａｒ 　Ｅ、Ｒｊｂｉ、発明の名称二Ｆレハロースジマイコレーツの精製）に記載され ている。また、Ｅ、Ｒｊｂｉ　ｅｔ　ａｌ、、　’１１瘍抑制および退化におけ るマイコバクテリア細胞壁成分Ｊ　、Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ ｊ　Ｌｕｔｅ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｊ、Ｎｎ３９．１９７２年１０月、１１５−１ ２０頁参照。

このアジュバントは、更にトレハロースジマイコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　 ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）を含み、この点について米国特許出１ｉ１Ｎａ１０２． ９０９号および米国特許ＮＣＬ４．５０５．９０３号に詳細に記載されている。

アジュバントはまた、微生物から得た精製したピリジン可溶性エキスを含有して もよく、これについては、米国特許Ｎα４．５０５，９０３号（発行日：　１９ Ｂ５年３月１９日、特許権者：　Ｊｏｈｎ　Ｌ、Ｃａｎｔｒｅｌｌ＋発明の名称 ：微生物のピリジン可溶性エキス）に記載されている。

腫瘍結合性抗原を得る方法、Ｊ、Ｌ、Ｃａｎｔｒｅｌｌの米国特許出願ｋ１０２ ，９０９号およびＪ、Ｌ、Ｃａｎｔｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒネズミＥＬ− ４白血病の免疫療法における腫瘍細胞エキスの効果」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、３９　：　１１５９−１１６７．１９７９年４月号に詳しく記載され ている。腫瘍抗原の種々の例が、Ａ、Ｅ、Ｒｅ１ｆおよびＭ、５０Ｍ１ｔｃｈｅ １１、「癌に対する免疫」、アカデミツク・プレス株式会社（Ａｃａｄｅ＋ｗｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、）　二ｓ−ヨーク１９８５．４１３−４２７頁およ び４２９−４４２頁に開示されている。

上記の特許、刊行物および論文はこの明細書においてこれによって援用される。

剪獅 本発明の主要な目的は、温血は乳動物宿主又は患者における黒色腫の予防的およ び治療的処置のための改良されたワクチンを提供することである。

本発明の更に具体的な目的は、原発性腫瘍の除去後およびその疾、色そのものが 症状を引き起こしていない時点で主として有用性を発揮する、黒色腫の効果的な 非毒性治療法を提供することである。

本発明の別の目的は、宿主にほとんど又は全く副作用がなく、容易に投与できる 黒色腫用ワクチンを提供することである。

本発明の別の目的は、黒色腫の腫瘍の成長を抑制する方法を提供することである 。

更に別の本発明の目的は、メラノーマ腫瘍関連抗原に対する増強した免疫学的応 答を誘発することである。

更に本発明の目的は、患者又は宿主中のメラノーマ腫瘍の増殖を抑制することで ある。

本発明の更に別の目的は、メラノーマ腫瘍の増殖を防止または抑制できる、改良 したアジュバント処理ワクチンを提供することである。

更に別の本発明の目的は、転移又は増殖の進行段階のＩＩ瘍の増殖を減じている 範囲までさえ、幾らかの治療利点を与える、前述の特性をもつワクチンを提供す ることである。

本発明のその他の目的及び利点は、次の記載から明らかになるであろう。

本発明は、培養したメラノーマ細胞の溶解物とアジュバントとの混合物からなる ワクチンで具体化される。メラノーマ細胞混合物の組成は、殆どの宿主からメラ ノーマ癌中に存在すると予期されうる、範囲の腫瘍抗原（これらのうちの多（は モノクローナル抗体により同定できる）を含むように選択される０組織培養物か ら誘導される溶解物（粉砕細胞の均質物）の形体のメラノーマ細胞を、アジュバ ント及び担体と混合し、岡原メラノーマの免疫治療に適した、標準化同種異系ワ クチンを与える。

本発明に有用なアジュバントには、選択した騙内細菌群からの脱毒化精製エンド トキシン抽出物がある。これらの細菌から得られたエンドトキシン抽出物を酸で 加水分解し、凍結乾燥させて脱毒化粗エンドトキシン成分を得る０次いで、脱毒 化粗エンドトキシンを精製して所望の脱毒化精製エンドトキシン〔モノホスホリ ル・リビッドＡ　（ＭＰＬ）］を得る。このエンドトキシン（ＭＰＬ）を、米国 特許第４．４３６，７２７号、４，４３６，７２８号、４，５０５，９００号、 ４，５３５，３８６号及び４，５０５，８９９号各明細書に記載されているよう にして、細胞壁骨格（ＣＷＳ）及びトレハロースシミコール酸（ＴＤＭ）を合わ せることができる。

脱毒化精製エンドトキシン及び細胞壁骨格アジュバントと混合状態のメラノーマ 細胞溶解物は、メラノーマ癌を減じる又は可能な限り撲滅するために、予防的に 又は治療的に利用できるワクチンを与える。ワクチンは、宿主の免疫系を刺激し 、腫瘍抗原に対して特異的に反応性である特異的キラー免疫細胞を合成すること により仲働すると思われる。

ワクチンは、いずれの方法によっても、未変化の外部膜結合抗原、細胞内（内部 膜）抗原、及び細胞質抗原を与える。ワクチンを、一定の抗原のその内容分につ いて標準化でき、従って、再現能力を有する。

ワクチンの有効性を例証するために、２２人のメラノーマ患者（１７人が顕著な 病変を有する）を新規なワクチンで処置した。メラノーマ関連抗原のワクチンの 含量を定量し、その毒性を決定し、メラノーマ抗原に対する抗体及び細胞性免疫 における影響を決定し、そして腫瘍におけるその影響を測定した０群当たり６又 はそれ以上の患者に、ワクチンの１００．２００又は４００抗原単位を皮下注射 した。１７、愚者のうち５人（２９，４％）は寛解し、そのうち２人は完全に寛 解し、３人は部分的に寛解し、３人が追加のより少ない応答であって、１人の完 全な寛解は、５．５力月持続し、その患者は、おおよそ２年後も発病せず生存し ている。リンパ節、皮下及び肺の結節は退縮したが、肝、副腎及び骨の病変は退 縮しなかった。メラノーマ細胞に対する細胞溶解リンパ細胞が１２患者において 増加し、臨床的な応答のある８患者すべてを含んだが、増加のない７患者のうち 誰もＨ”Ｊ的な寛解はなかった。メラノーマ抗原に対する抗体が５患者で増加し 、その総てが同バッチのワクチンを受けており、臨床的な応答に関係なかった。

好通笠実施態様少起述 本発明は、選択した同種異系メラノーマ腫瘍抗原及び有効量の一種以上の選択し たアジュバントの組み合わせからなる免疫治療用ワクチンで具体化される。この ワクチンは悪性メラノーマ細胞の混合物で構成され、該細胞は均質化されており 、キラー胸腺誘導リンパ細胞、即ち“Ｔ−細胞”の生成物を刺激することにより 細胞免疫を増幅する免疫性物質を放出する。このような細胞は、次に、悪性メラ ノーマＬＩ瘍細胞の進行と戦う。

ワクチンは、治療と潜在的予防との双方をになう。即ち、確立した腫瘍を塊を処 置した患者の約２０％の割合で顕著に収縮させることができ、一旦起こった広が り又は再発から疾病を防ぐのにも有効でもありうる。ワクチンは、メラノーマの 前癌症状からの進展を防止しうる可能性がある。ワクチンの目的は、腫瘍の転移 の部分的又は完全な寛解をもたらすことにあり、悪性細胞の宿主の身体のその他 の部位への広がりを防止することにある。散型のＴ−細胞、及び、ワクチンによ り授けられた、多分その他の免疫学的に活性な出血細胞は、悪性メラノーマ細胞 の進行と戦う、ワクチンとアジュバントは、温血動物宿主又は患者中の上記のよ うな免疫学的に活性な血細胞の産生を刺激するのに有効である。

ワクチンを生成させるために、メラノーマ細胞のバイオプシー腫瘍フラグメント を、数種のメラノーマ源から病変部のバイオプシーにより取り出す、これらのメ ラノーマ細胞のインビトロでの培養を開始し、適当な組織培養フラスコ中の抗生 物質不添加培地中で増殖させる。牛胎児血清を、約１０％の濃縮物中に、約２ミ リモルの［縮物に１７−グルタミンと共に加えることもできる０次に、こうして 得られたマスター・シード培養物を、液体窒素中で凍らせ、将来の使用のために 貯蔵した。

使用しようとする種培養物の選択された量を液体窒素中での保存からいったん取 り出したらすぐ、適当量の生育培地を含有する遠心管中に入れて２００Ｇで５分 間遠心分離する。この上清を傾しゃし、細胞を染色して生育を調べ、計数し、生 育フラスコに接種した。−貫して無菌で滅菌された生育操作を行う、メラノーマ （黒色腫）細胞株を含有する数個のフラスコに最初のフラスコから接種する。接 種後、３７°Ｃ１５％ＣＯ□／９５％空気中でインキュベーター中で生育を続け る。腫瘍細胞を血清を含まない生育培地中に２−４日保持してから回収してウシ 胎児蛋白質を除去した。細胞単層を洗ってから回収する。細胞懸濁液を遠心管中 で凍結させる。これらの細胞を、目的とする抗原に特異的な適当なマウスモノク ローナル抗体によって抗原性について試験する。酵素イムノアッセイにもとづく 結合阻害アッセイによって抗原性単位を決定する。

ワクチンを製造するために、回収物からあるいは回収物から得られた７０°Ｃで 保存された凍結細胞から新しく得られた細胞を高速組織ホモジナイザーで破壊し 、細胞株全体からの熔解物を集める。凍結と融解を２周期行うことにより同等活 性ある安定した腫瘍細胞が残らないようにする。メラノーマ溶解物の混合物を、 滅菌性、−ｉ的な安全性と発熱性、肝炎うイルスの混入、マイコプラズマの混入 およびＡｌｌｌ５ウイルス（ＨＩＶ）の混入について試験した０組織培養物およ びヌードマウ゛　ス中の生きた腫瘍細胞の存在についても試験した。

メラノーマ溶解物とアジュバント（米国特許Ｎｃｔ４．４３６．７２７に詳述さ れ、商標名“ＤＥＴＯＸ″で市販されているようなアジュバント）との適当量を 徹底的に混合する。このワクチンを希釈するのには適当な医薬として受容できる 溶液が利用できる。

メラノーマ細胞溶解物とアジュバントの混合物からなる上記ワクチンを徹底的に 混合後、ヒト宿主に皮下注射する。１回の投与量たり、約５百万−４千万個の細 胞から得られたメラノーマ細胞溶解物を約２５０μｇのＣＷＳと約２５μｇのＭ ＰＬを含むアジュバントのある量とともに、約１−４％のスクアレン中で乳化し て使用する。　ＣＷＳとＭＰＬの比は、一般に約８−１２部のＣＷＳ対１部のＭ ＰＬの範囲である。

該ワクチンの注射は６−８週間の期間で投与され、必要なら、毎月補助薬としで あるいは周期的に完全なコースとして繰り返し投与できる。

下記具体例により本発明はより詳細に説明されよう。

実施例　■ １２王ペヱ上Ω周裂 １、亨１　れ無　れたエンドトキシンの［至Ｚ法スホリル１ピ７ドＡ　（ＭＯＬ ）粗エンドトキシンをザルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎ ｅｓｏｔａ）　（菌株１１５９５）の多糖類欠損へプトース不存在のＲｅ変異株 から有機溶媒抽出により単離した。この菌株はＮＩＨ，ＮＩＡＩＤ　、ロッキー ・マウンティン・ラボラトリ−（Ｒｏｃｋｙ　ＭｏｕｎｔａｊｎＬａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）　、　ハミルトン（Ｈａｓ＋１ｌｔｏｎ）、モンタナ（Ｍｏｎｔａｎａ ）から得られた。このエンドトキシン（ＫＤＯとリビッドＡからのみなる）は典 型的なエンドトキシンであるリポポリサッカライドというよりむルろ糖脂質であ り、適当な極性の有機溶媒で分別沈澱して精製した。ついで、還流している０、 ＩＮ塩酸で処理して無毒性モノホスホリルリピッドＡ　（ＭＰＬ）の遊離脂肪酸 と構造同族体からなる複合体混合物を得た。これらの成分をシリカゲルクロマト グラフィーで分離した。薄層クロマトグラフィによって同定されたＭＰＬの構造 同族体に相当する溶出フラクシヨンを集め、毒性を試験した。静脈注射で接種さ れたニワトリ胎児を５０％死亡させる投与量（ＣＥＬＤｓ。）が１０ｄｇを越え るとき動物実験に適合するものとした。（もとのエンドトキシンのＣＥＬＤｓ。

は一般に０．０１ｄｇ未満である。）精製され無毒化されたエンドトキシンは同 等検出し得る２−ケト−３−デオキシオクタノエート（ＫＤＯ）（約５００−約 ８００ｒ＋＋ｗｏｌｅｓ　／　ｍｇのホスホラスおよび約１７００−約２０００ ｎｍｏｌｅｓ／■の脂肪酸）を有しない。

２、ミコバクテリア　フｎ（Ｃ−３）の−ＮＩＨ，ＮＩＡｒＤ　、ロッキー・マ ウンティン・ラボラトリ−（Ｒｏｃｋｙ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｌａｂｏｒａ−ｔ ｏｒｙ）　＋ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、モンタナ（Ｍｏ１ｔａｎａ）か ら得られたミコバクテリウム°ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉ ｓ）ＢＣＧ株の細胞壁をソルバルーリビ・セル・アフラクシオネーター（Ｓｏｒ ｖａｌｌ−Ｒ３ｂｉ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）　（ＲＦ　−１型 ）によって調製した。　１０−１５°Ｃで３５，０００ｐｓ＋の圧力でミコバク テリア細胞壁を“砕き”、原形質を溶は出させた。細胞壁を遠心分離して回収し 、遠心と水中懸濁とを繰り返すことによって精製した。ついで、細胞壁をＲＮ＾ 分解酵素とＤＮＡ分解酵素で処理して核酸を除去し、一連の蛋白分解酵素と洗浄 剤での処理によって各々蛋白質とペプチドを除去した。最後にこの調製物を徹底 的に有機溶媒で抽出して“遊離リビッド”を除去した。得られたＣＩは重合性ミ コール酸−アラビノガラクタン−ムコペプチド複合体からなっていた。

３、トレハロース−シミコレート　ＴＤＭ）の　とミコバクテリアの全細胞をま ずエタノールで、ついでアセトンで、最後にクロロホルムとメタノールの２対１ 混合物（ＣＭ２：Ｉ）で抽出した。このＣＭ抽出物はＴＭＤおよびＴＤＩＩより は低いか高い極性を有する混入脂質を含有していた。これらの脂質を、それらは 溶かさないがＴＭＤを溶解状態に保持する有機溶媒の組成物で沈澱させることに よって選択的に分離した。得られた“粗ＴＭＤ″をシリカゲルクロマトグラフィ ーで精製した。ＴＬＣで同定された純粋なＴＭ［ｌを含有する溶出フラクシヨン を集めた。

コ１ネバクーｉウム・パルブム（虹と■叩）ＶＰＩ　０２０４　（バージニア・ ポリテクニック・インスチテウードのＣ，ＣｕＩＩＩｍｉｎｇｓ博士より入手） の加熱死金細胞を３７℃で２回ピリジンで抽出し、ピリジン可溶性抽出物をいっ しょにしてフラッシュ蒸発させ、透析し、凍結乾燥した。コ！ネバクテリウム・ バルブム（Ｃ０ａｅνｕＩ１１）０２０４はタイプ■であるＰ、ａｃｎｅｓ　０ ２０４であり、３７．７％の炭水化物、４．５％の蛋白質、５６．５％の脂肪酸 を有するＰａＰＥを生じた。これらの成分の範囲はもっと広く、約１０−約４％ の炭水化物、約３−約２０％の蛋白質、約３５−約７０％の脂肪酸を含んでも良 い、　Ｂｅｒｅｋ、Ｃａｎｔｒｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４ ４　：　１８７１−１８７５参照。好適範囲は３−６％のＰａＰＥ、　１５　４ ０％の炭水化物、および４５−７０％の脂肪酸である。

５．７ジエバント　のためのＭＰＬおよびＣ？ＩＳの　人１つの例示的なアジュ バントは、ミリリットルあたり約６．２５から約２５０マイクログラム（μｇ／ ｌ１１）の間のＭＰＬ　、およびミリリットルあたり約１２５から７５０マイク ログラム（μｇ／ｄ）の間のＣＷＳ　、好ましくはそれぞれ１対１０の割合で、 特に約２５μｇ／ｄ　ＭＰＬと２５０μｇ／ｄ　ＣＷＳの割合で混合して作成さ れる。

実施例　■ メーノーマ　ｒ″　の メラノーマ細胞のインビボでの培養は、２人の異なる女性の２種の皮下腺生検材 料から開始された。１つの細胞株は、ＭＳＭ　−Ｍ　−１（Ｍ−１）と名付けら れ、１人の女性の腓の２つの病巣からの生検材料で１９８０年から開始された。

この細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクシジン（Ａｍｅｆｌｃａｎ　 Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））に寄託番号ＣＲ Ｌ　９８２２として寄託された。もう１つの、ＭＳＭ　−Ｍ　−２（Ｍ−２）と 名付けられた細胞株は、他のもう１人の女性の背中の病巣からのもので、１９８ １年に開始された。この細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ　ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ ＣＣ）　）に寄託番号ＣＲＬ９８２３として寄託された。これらの細胞は両方と も現在は、南カリフォルニア大学ガンセンター、（２０２５ゾーナル通り、１０ −４２２ジーエイチ、ロサンジェルス、カリフォルニア９００３３　：　Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、２O２５ Ｚｏｎａｌ　Ａｖｅｎｕｅ＋　１０　４４２　ＧＨ，Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｊａ　９００３３）のマルコルム　ニス　ミツシェル博士（Ｄ ｒ、Ｍａｌｃｏｌｍ　Ｓ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）の研究室から入手できる。

細胞株門−１およびＭ−２は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原に対するモノクローナル 抗体Ｗ６／３２およびＨＬＡ　−ＤＲに対するモノクローナル抗体Ｑ５／１３で フェノタイプされた。

ト」はメラニン欠乏であり、成長が遅く、ＩＩＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（クラス１）抗 原を発現し、ＨＬＡ−ＤＲを適度に発現することが観察された。Ｍ−２は高度に 沈着しており、成長がより速（、ＨＡＬ−Ａ、Ｂ、Ｃを強く発現するがＨＬＡ− ＤＲを欠いていることが観察された。

メラノーマカルチャーの純度は、定期的にマイコプラズマの混入をチェックされ た。それらは抗生物質を含まないカルチャー中で成長させたので、抗生物質感受 性に対する注意を払う事な（患者に与えることができた。

ト」および？Ｉ−２の双方ともＰＲＭ１１６４０培地にウシ胎児血清（１０％） およびＬ−グルタミン（２ｃＭ）を加えてＴ−１７５およびＴ−７５組織培養フ ラスコ内でほぼ集合体に近くなるまで成長させた。それぞれ約２０および２５ｍ ２の生育培地が各々のフラスコに使用された。

マスターシードカルチ＋　（Ｍａｓｔｅｒ　５ｅｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）は液体 窒素中で２１１１の凍結ビン内に凍結された。ビンあたりの平均細胞数は、５百 万であった。一度液体窒素を除去したら、ビンは、水浴中で完全に溶解するまで ３７℃にあたためられた（約５分）、ビンの内容物は、３０−の成長培地を含む 遠心管に移され、２００　Ｘｇで５分間遠心され、上澄み液を別に移した。細胞 は生存能力のため着色しており、数を数えられ、５０ｄの成長培地を含むＴ−１ ７５フラスコにばあたり約ｌＯＳの数で植えられた。細胞は、３７°Ｃ１４−７ ％ＣＯ，存在の雰囲気中で成長し集合体となった。無菌技術および滅菌、脱パイ ロジエン処理したガラス容器をすべての成長過程に使用した。

４つのＴ−１７５集合体を０．０２％ＥＤＴＡを含む２５ｄのダルベツコＢＳで 処理し、１０分間インキュベートした。細胞と液体は、５０ｄのファルコンチュ ーブに移され、２００ｘｇで１０分間遠心し、上澄みを別に移した。４つの試験 管の内容物を合わせて、８ｄのＲＰＭ１１６４０培地に再懸濁した。５００−の ＲＰＭ１１６４０培地を吸引ビンに加えた。８ｄのＲＰＭ１１６４０培地懸濁液 を撹拌しながらそれに加えた。８ミリリツターの懸濁液をその後採取し、１７ｄ のＲＰＭ１１６４０培地をＴ−７５フラスコに加え、これは細胞の成長をモニタ ーするための対照として使用した。さらに１５００−のＲＰＭ１１６４０培地を ５００　ｄの吸引ビンに加えた。この２リツトルの細胞懸濁液は、滅菌チューブ を取り付けた吸引ビンに含まれ、細胞工場（Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｙ）と称せ られる１０段フラスコ（ｔｅｎｔｉｅｒｅｄ　ｆｌａｓｋ）の１つに植えるため に使用された。各々の細胞工場には、約１０１の細胞が植えられた。

細胞工場は、ＣＯ□インキエベーター内で３７°Ｃにて５日から９日管置かれた 。培地は別に移され、各々の細胞工場あたり２リツトルの血清を含まない培地に 交換された。成長は、インキュベーター内で２４日間、３７℃で続行した。ト１ およびＭ−１およびト２細胞系の成長は、フラスコまたは細胞工場の下部の不透 明の単層により特徴づけられた。

培地は、細胞工場から別に移され、細胞は２リツトルのＰＢＳで洗浄されて残存 する培地、死んだ細胞および血清を除去した０次に０．０２％ＥＤＴＡを含む２ リツトルのＰＢＳを加え、細胞は３７°Ｃで４５分間あるいは容器の表面から分 離するまでインキュベートされる。収穫に先立ち、残る細胞は、細胞工場の定期 的に穏やかな“スランプ（ｓｌａｐｓ）″でゆるめられた。

インキュページ町ン期間の終わりに、細胞工場の内容物は、２５０　Ｘｇで１ｏ 分間遠心された。上澄み液を別に移し、細胞を２０ＩｄのＰＢＳ中で再懸濁し、 ２５０　Ｘｇで１０分間遠心した。上澄み液を再び別に移し、細胞を最終容量２ ０ｄのＰＢＳ中で再懸濁した。細胞の数を数えた。約１０”の細胞が各々の細胞 工場から収穫された。

細胞懸濁液は、−７０°Ｃで２０ｄのＰＢＳを含む、５０ｄの遠心管中（細胞工 場あたり１つの管）で凍結された。

Ｍ−１およびＭ−２細胞工場の内容物の抗原性は、その抗原に特異的なマウスモ ノクローナル抗体（Ｍａｂ）　９．　２．２７を用いて、１つのメラノーマー関 連抗原（ｐ２５０）の量を測定することにより試験した。この抗体は、ラジジー ラ　ヵリホオルニアのスクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファンデ ーション（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕ ｎｄａｔｉｏｎ　ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のラルフ@ラ イスフェルト博士（Ｄｒ、Ｒａ１ｐｈ　Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ）より得た。

酵素イムノアッセイに基づいた結合阻害アッセイが、抗原単位（ａ、　ｕ　、） を決定するのに用いられた。セイヨウワサビ・ペロキシダーゼでラベルされたマ ウス・モノクローナル抗体Ｍａｂ　９．　２．２７．１５０μｍを、３７℃で約 １時間、ＰＧＳ、　１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）の媒質中において、メ ラノーマ溶解産物３０ｔ！ｌでインキュベートした。この混合物５０μｍを、ポ リビニル・フアシヨン・ミクロフィルター・ウェルに固定されたメラノーマ細胞 を目標とするために、３倍にして（ｔｒｉｐｌｔｃａｔｅ）加え、３７℃で１時 間、インキュベートした。洗浄後、０−フェニレンジアミンを含むペロキシダー ゼ基質溶液を加えた。　３０分後、反応が止まり、ＩＪＡプレート・リーダーで の吸光度は４９０ｎ−を指し示した。

標準的な結合曲線は、腹腔腫瘍に由来するメラノーマ溶解産物で作成される。

この曲線から、試験試料の抗原内容が決定された。１抗原単位（ａ、ｕ、）は、 Ｍａｂ　９゜２．２７に対して最大限に（少なくとも２０％の阻害率で）結合す る純粋標準メラノーマ抽出物１０μｌに存在する抗原の量として定義される。エ プスタイン、ミッチェルおよびブラックフォード・コンピュータ・コンサルタン ッ（コネチヵット州、二ニー・ヘブン）のシェフエリ−・Ｓ・ミッチェルによっ て開発された「カーブ・フィツト」と呼ばれるコンピュータ・プログラムが標準 曲線によって表された方程式から直接メラノーマ溶解産物を新しいロフトごとに おける抗原単位の数を計算するのに用いられた。さらに、相当する腫瘍細胞の数 が記録された。約１０７個の細胞が１００　ａ、ｕ、に相当する。

実施例　■ ２１土２の調製 実施例Ｈの細胞を一７０℃で冷凍し、氷上にて解凍した。この細胞をポリトロン ・ステンレススチール・高速組織ホモジェナイザー（チクマールＣｏ、、シンシ ナチ、オハイオ）で機械的に粉砕した。顕微鏡下で完全な細胞が認められなくな るまで、繰り返し細胞を粉砕した。各セル・ファクトリの細胞は独立に粉砕され た。

それから細胞ラインおよびセル・ファクトリ両方からの溶解産物がプールされた 。

プール後、細胞溶解産物にＰＢＳを加えて、溶解産物濃度をｄあたり２０Ｘ１０ ’τ、Ｃ，Ｅ。

（腫瘍細胞等りに調整した。

その溶解産物を計量中、エタノール／水バスに保持した。５０ｍのプラスチック の管に細胞溶解産物２５ｄが満たされ、１ｄのアリコートが２ｍの無菌で空のピ ロゲンのないバイアルに、２５ゲージ針を使った１ｄのシリンジを用いて、注入 された。管は、シリンジ注入の前に手でもってよく振った。各バイアルの上部は アルコールのスポンジで拭った。バイアルは氷上に置かれ、それから−７０’Ｃ に冷凍した。これに適合する他の適当な方法が用いられてもよい。

メラノーマ・ワクチン溶解産物の、ＦＤＡガイドライン下での無菌性（ｓｔｅｒ ｉｌｉｔｙ）と発熱性についての試験が、アメリカン・マグロウ・バイオロジカ ル・テストセンター（アーヴイン、カリフォルニア州）によっておこなわれ、満 足すべき結果が得られた。

メラノーマ・ワクチン熔解産物の、Ｉ（ＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）汚染について の試験が、南カリフォルニア大学のドクター・スライ・ラシード研究所において 行われ、満足すべき結果が得られた。

メラノーマ・ワクチン溶解産物の、一般的な安全性と発熱性についての試験が、 アメリカン・マグロウ・バイオロジカル・テストセンター（アーヴイン、カリフ ォルニア州）によっておこなわれ、満足すべき結果が得られた。

メラノーマ・ワクチン溶解産物の、肝炎汚染についての試験が、南カリフォルニ ア大学血清学研究所でおこなわれ、満足すべき結果が得られた。

メラノーマ・ワクチン熔解産物の、ミクロソーマ汚染についての試験が、コリエ ール・インスティチェートのメヂカル・リサーチ（カムデン、ニューシャーシー 州）で行われ、満足すべき結果が得られた。

注射の直前に、メラノーマ・ワクチン溶解産物はＣＷＳ／ＭＰＬアジュバントと ｌＯＯ１２割合で十分に混ぜ合わされた。２００　ａ、ｕ、／ｄ濃度の溶解産物 のｌｄバイアルが０．２５ｍｆｆ１のＣＷＳ／ＭＰＬアジュバントと混合された 。

実施例　■ ユ２チヱΩ使里上ヱΩ結果 患者はおよそ１Ｏ１２０および４０百万ＩＩ！！瘍細胞等量、すなわち、２５０ μｇのｃ−ｓおよび２５ｄｇのＭＰＬを含むアジュバントＤＥＴＯＸと混合した ワクチン１ＯＯ１２００および４００抗原単位を投与された。１抗原単位はマウ ス・モノクローナル抗体９．２゜２７に最大限（阻害率８０％以上で）結合する 純粋な標準メラノーマ抽出物１０ｕｌ中に存在する抗原の量として定義される。

１７名の患者のデルタ帯または殿部に播種性メラノーマを皮下注射し、５名の患 者にも同様にして再発性の危険性が非常に高いが、転移性の予見のないメラノー マを皮下注射した。少なくとも６名の患者が各投与レベルのワクチン（１００， ２００または４００抗原単位）を投与された。ワクチンに対する正の皮膚試験を うける患者１名がわずか５０抗原単位の投与を受けた。

身体的な試験、エックス線照射、　ＣＴスキャンなどによって、センチネル（ｓ ｅｎｔｉ−ｎｅｌ）な病変として選ばれた腫瘍のマスの最長の直径を１週問おき に測り、治療後は２週問おきに測った０反応の程度と持続期間の両方を含む厳し い標準定義が、完全寛解、部分寛解、少反応、無反応として臨床反応を分類する のに用いられた。

この結果、「完全寛解」は少なくとも４週間の間、いがなる病変部も再発・再現 しなかったことを示す、「部分寛解」はすべての病変部の最大直径の合計が５０ ％に減少したのが少なくとも４週間続いたことを示す。「少反応」は、すべての 病変部の最大直径の合計が２５−５０％に減少したか、または５０％減少が４週 間未満続いたことを示す。そして「無反応」は、少反応より劣った反応しか示さ なかったことを表す。

注射後１日たって、注射部位にわずかな痛みが残った以外は、なんの毒性もみら れなかった。２名の患者の注射部位数箇所に粒子状のものができたが、それは皮 下ごく上層に注射をしたためであった。全身的な副作用は観察されず、１週間ご との一般的な血液検査、化学血液検査でも、生体器官に毒性を与えた証拠が認め られなかった。同様に、発疹やアナフィラキシ−などの逆の免疫的影響も認めら れなかった。

ワクチンの免疫効果はいくつかの方法で観察した。最も劇的な方法は、幾人かの 患者における測定可能な病巣の収縮であった。表１の「フエーブＩトライアルの 要約」に示されるように、活性な免疫治療薬により、測定可能な病巣を持つ１７ 人の患者のうちの５人（２９，３％）についてメラノーマの完全又は部分的回復 をもたらした。２名の患者はその病気から完全に回復し、他の３名は部分的回復 を示した。別の３名についてば軽微な応答がみられた。このうちの１名は大結節 の５０％以上の回復がみられた。しかしながら、４週間は続かなかった。９名の 患者については応答がなかった。即ち、治療にもかかわらず進行性の症状であっ た。

最も興味があるのは２名の完全回復であった。患者り、Ａ、　（３０才の女性） は毎週２００　ａ、ｕ、　（抗原性単位）のワクチンを投与され、最初の投与後 １週間以内に右大腿部及び臀部の多数の皮下結節の縮小が始まった。この消散の 速かな始まりは２００　ａ、ｕ、投与に対応する全ての患者に共通していた。一 方、５０又は１００　ａ、ｕ、の投与では、治療開始から３〜５週後に回復が始 まった。Ｌ、Ａ、の結節の多くは３週間以内に触知不可能になり、６週間内に全 て消滅した。その患者は４ｃｍの壊死性結節をもっており、それはゆっくりと縮 小していたが、座る際に不快であるため第５週目に切除した。消滅が最初に始っ た時、患者の皮膚は硬化していたが、数ケ月の間に、徐々に以前の組織に戻った 。患者はソ経部靭帯の直上の右下四分の−の皮膚に新たな５閤の病巣を１個を生 じた。これは消炎が始ってから５ケ月半後に直ちに切除した。同じサイズの別の １個も１０ケ月後に切除した。このこと以外、この患者は、肺、肝および脳の通 常ＯＣＴスキャンによって証明されたようにほぼ２年間この病気の再発はなかっ た。

１：フェーズＩ−の　、 （ａ）＋−認められた評価；　ｎ１＝最初の認識口ｎ２＝最高の日； （ｂ）０−−十　陽性への転化；＋−−＋十最初の領域よりも２５％以上の増加 （Ｃ）：治療前に存在したが、その後有意には増加しなかった抗体略語：ａ、ｕ 、抗原性単位、ＥＩＡ、酵素免疫検定；ＣＲ完全消散；２２部分消散；ＭＲ１微 小応答；ＮＥ評価不能（検知不能の症状）患者Ｊ、　Ｂ、はこのテスト開始前の ３ケ月前に右わきの下からメラノーマを含む大きいリンパ結節を切除していた。

これはそれ以前のわきの下の病気の明らかに過激な切除によるものであった。患 者は、唯一の病巣である２、５　ｃｔｓ径のリンパ結節が、最初の注射１週間後 に検知し得る縮小を示した。注射は物理的試験及びＣＴスキャンで完全に消失す るまで６週間のあいだ毎週行われた。８週の試験の間及びその後５．５ケ月間、 リンパ節疾患は生じなかった。腹膜後のリンパ節疾患はその際ＣＴスキャンで見 つからず、この患者の試験は終了と考えられた。

問題の患者等は嵩高又は多数の皮下又はリンパ節腫瘍塊を持っていたので、部分 消散では満足しなかった。患者Ｃ，Ｃ，は右下肢からソ径部の領域にわたって、 病巣が散らばっていた。この病巣は０．８〜２．２ｃｍ径であった。全ての病巣 は、４回目の注射の後、１週間の間隔をおいて縮小し、２回目のワクチン投与コ ース（５〜６週後）の中間まで大部分は小さくなったままであった。２つの結節 は３週間以内に検出不可能になった。残っている結節の生体組織片検査では、腫 瘍細胞の相当の壊死を示し、若干の末梢リンパ球浸潤を伴っていた。この両コー スの間、特に第２のコースでは、結節は、特異なしたがってとても説明できない ような３〜４日のサイズの変動を示した。患者Ｃ，Ｃ，は試験において最も少い ５０ａｕ／週の投与量を与えた。これは患者が、治療前にメラノーマ皮膚試験で 陽性であった唯一の者であったためである。

患者？１．　Ｒ，は３個の大きい（４〜５ｃ＋＋＋）皮下結節、左副腎および肺 に塊を持ち、予しめ低投与量のシクロホスファミドを投与された後、２００ａｕ 　７週のコースを受けた。１週間以内に患者は、全ての皮膚結節の速やかな軟化 が認めら娠８日間の測定では病巣は小さく、平らになっていた。全ての病巣は１ ケ月以内に最小に達しており、治療後までには１つの病巣は検知不能になってい た。

第３番目の患者、Ｇ、Ｇ、は、シクロホスファミド投与後に、４００ａ、ｕ、７ 週の投与を行い６週間で多くのほぼ１ｃ１１径の皮下結節が平らになった。７週 間後、５個の注目している病巣の全てが縮小し、元のサイズの５０％以下の凝集 体になった。

患者Ｔ、　Ｂ、は、低投与シクロホスファミド及び週１００ａ、ｕ、のワクチン での治療の開始後３週間で始まったが、わずか３週間続いた皮下及びリンパ結節 塊の５０％以上の縮小を示した。しかし、この患者の皮下小結節の一つは、極微 となりそしてそのままでいる。彼は、次いでシクロホスファミド＋ｒＬ−２を受 け、存続ＰＲを有しており、そして今や免疫治療開始後１８月維持治療を受けて いる。患者Ｔ、Ｗ、は、四つの大きな皮下転移を有しており、その一つは１週間 以内に縮小を開始し、直径が１．８　ｃｔｓから０．７５ｃｍに減少し、そして その後５１１Ｉ１１の寸法のままであった。他の三つの皮下塊及び肝臓中の病巣 は縮小しなかったので、彼の相互的応答はＰＲより小さかった。患者Ｇ、Ｇ、は 、わずか３週間続いた彼の皮下小結節のほぼ３０％の後退を有した。

ここに記載された発明は、１９８８年１０月１５日発行Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 　４８巻第５８８３〜５８９３頁のＭ、Ｓ、ミッチェル（Ｍｉ　ｔｃｈｅｌ　Ｉ ）等のｒＡｃｔｉｖｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏ ｒ　Ｍｅｌ＝| ｎｏｍａ；Ｐｈａｓｅ　Ｉ　Ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ＡＩｌｏｇｅｎｅｉｃ　Ｌｙｓ ａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｎｏｖｅｌ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｊにさ轤■■ しく記載されており、その刊行物及び開示は参考のためここに導入される。

本発明のある例示的具体化が詳しく記載されてきたが、本発明をその開示された 特定の形態及び方法に限定する意図がないことは了解されるべきである。それど ころか、添付された請求の範囲中に表現された発明の精神及び範囲内に入るすべ ての変更、均等物及び使用を包含することが意図である。

手続補正書（方式） 平成　４年　１月　６日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物；とマイコバ クテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽出 物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上の生物学的免疫刺激物 および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなる免疫治療用黒色 腫瘍ワクチン。
2. ２．前記精製し無毒素化した内毒物には、約５００〜約８００ｎｍｏｌ／ｍｇの リンおよび約１７００〜約２０００ｎｍｏｌ／ｍｇの脂肪酸が含まれており、検 知しうる量の２−ケト−３−デオキシオクタノエートは含まれていない請求項１ のワクチン。
3. ３．前記精製し無毒化した内毒物がモノホスホリル脂質Ａである請求項１のワク チン。
4. ４．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格である請求項１のワクチン。
5. ５．前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項１のワクチン。
6. ６．前記免疫刺激物が微生物のピリジン可溶性抽出物である請求項１のワクチン 。
7. ７．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と二ミコール酸トレハロース との混合物である請求項１のワクチン。
8. ８．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と微生物のピリジン可溶性抽 出物との混合物である請求項１のワクチン。
9. ９．前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースと微生物のピリジン可溶性抽出 物との混合物である請求項１のワクチン。
10. １０．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロー スおよび微生物のピリジン可溶性抽出物の混合物である請求項１のワクチン。
11. １１．前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約３〜約２０重量％の蛋白質、 約１０〜約４０重量％の炭水化物および約３５〜約７０重量％の脂肪酸が含まれ ている請求項１のワクチン。
12. １２．前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約４．５％の蛋白質、約３７． ７％の炭水化物および約５６．５％の脂肪酸が含まれている請求項１のワクチン 。
13. １３．異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物；とマイコ バクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽 出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上の生物学的免疫刺激 物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなるワクチンを、 黒色腫患者に抗腫瘍効果を奏する量投与することからなる患者の黒色腫瘍治療法 。
14. １４．前記精製し無毒素化した内毒物には、約５００〜約８００ｎｍｏｌ／ｍｇ のリンおよび約１７００〜約２０００ｎｍｏｌ／ｍｇの脂肪酸が含まれており、 検知しうる量の２−ケト−３−デオキシオクタノエートは含まれていない請求項 １３の治療法。
15. １５．前記精製し無毒素化した内毒物がモノホスホリル脂質Ａである請求項１３ の治療法。
16. １６．前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項１３の治療法。
17. １７．前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項１３の治療法。
18. １８．前記免疫刺激物が微生物のピリジン可溶性抽出物である請求項１３の治療 法。
19. １９．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と二ミコール酸トレハロー スとの混合物である請求項１３の治療法。
20. ２０．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と微生物のピリジン可溶性 抽出物との混合物である請求項１３の治療法。
21. ２１．前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースと微生物のピリジン可溶性抽 出物との混合物である請求項１３の治療法。
22. ２２．前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロー スおよび微生物のピリジン可溶性抽出物の混合物である請求項１３の治療法。
23. ２３．前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約３〜約２０重量％の蛋白質、 約１０〜約４重量％の炭水化物および約３５〜約７０重量％の脂肪酸が含まれて いる請求項１３の治療法。
24. ２４．前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約４．５％の蛋白質、約３７． ７％の炭水化物および約５６．５％の脂肪酸が含まれている請求項１３の治療法 。
25. ２５．異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物；とマイコ バクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽 出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上の生物学的免疫刺激 物および精製し無毒化した無毒素からなる抗原性補強剤とからなるワクチンをホ ストに抗腫瘍効果を奏する量投与することからなるホストの黒色腫治療法。
26. ２６．異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞をインビトロ培養することによって産生する 黒色腫細胞溶解物；とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース 、微生物のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択され る１以上の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補 強剤とからなる、ホストの黒色腫の治療および予防に有用なワクチン。
27. ２７．薬剤学的に許容される担体をさらに含有する請求項２６のワクチン。
28. ２８．ＭＳＭ−Ｍ−１およびＭＳＭ−Ｍ−２およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物；とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫瘍ワクチン。
29. ２９．ＭＳＭ−Ｍ−１およびＭＳＭ−Ｍ−２およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物；とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫ワクチンを黒色腫患者に抗腫瘍効果を奏する量投与する ことからなる患者の黒色腫瘍治療法。
30. ３０．ＭＳＭ−Ｍ−１およびＭＳＭ−Ｍ−２およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物；とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫ワクチンをホストに抗腫瘍効果を奏する量投与すること からなるホストの黒色腫瘍治療法。
31. ３１．セルラインＭＳＭ−Ｍ−１およびセルラインＭＳＭ−Ｍ−２およびこれら の混合物からなる群より選択される異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞をインビトロ培 養することによって産生する黒色腫細胞溶解産物；とマイコバクテリア細胞壁骨 格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽出物およびこれらの 混合物からなる群より選択される１以上の生物学的免疫刺激物および精製し無毒 化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなる、ホストの黒色腫瘍を治療および 予防するのに有効なワクチン。
32. ３２．薬剤学的に許容される担体をさらに含有する請求項３１のワクチン。
33. ３３．ＭＳＭ−Ｍ−１およびＭＳＭ−Ｍ−２およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物；とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される１以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる免疫的な効果を奏 する量の抗原性補強剤とからなることを特徴とする免疫治療用黒色腫ワクチン組 成物。
34. ３４．セルラインＭＳＭ−Ｍ−１。
35. ３５．セルラインＭＳＭ−Ｍ−２。
36. ３６．セルラインＭＳＭ−Ｍ−１から産生する黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞溶解産 物。
37. ３７．セルラインＭＳＭ−Ｍ−２から産生する黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞溶解産 物。
38. ３８．セルラインＭＳＭ−Ｍ−１およびＭＳＭ−Ｍ−２から産生する黒色腫傷細 胞の黒色腫細胞溶解産物。