JPH04501718A - きよう膜多糖類アドヘシン抗原、製造、精製および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 きよう膜多糖類アトへシン抗原、製造、精製および用途発明の背景 背景の分野 この発明は、スタフィロコッカス・エビデルミゾイスの特定の株から単離された 実質的に純粋なエキソ多糖類アトへシン、上記化合物を実質的に純粋な形で分離 し得る一般的方法、並びに上記純粋なアトへシン生産物の、ポリマー物質に対す る同族（ホモローガス）細菌細胞の結合を妨げるに有効な抗体の産生用ワクチン としての、およびカテーテルおよび医用補てつ材として有用なポリマー物質の開 発用プローブとしての使用に関するものである。

背景技術の記載 スタフィロコッカス・アウレウス（コアグラーゼ陽性）およびスタフィロコッカ ス・エビデルミゾイス（コアグラーゼ陰性）の両者とも、血管内力テーテノ呟髄 液透析シャント、血管移植片、長期装用コン゛タクトレンズを含む医用補てつ装 置の部位で皮ふおよび隣接組織を侵す性向特性を有する。４８−７２時間以内に 、相当多数のスタフィロコッカス類がこれらの外来物体の挿入部位に証明される 。アーチャー、Ｇ、Ｌ、ｒスタフィロコッカス・エビデルミゾイス：有機体、そ の疾患および治療」、レミントン、Ｊ、Ｓ−等編、カレント・クリニカル・トピ ックス・イン・イン７エクシヨン・デイジージズ、マグロ−ヒルにューヨーク、 １９８６年）、２５−４６頁、ユーマンス、Ｇ、Ｐ、等、ザ・バイオロジック・ アンド・クリニカル・ベーシス・オブ・イン７エクシヨン・デイジージズ、サン ダース（フィラデルフィア、１９８５年）、６１８−６２５頁、７３８−９頁。

スタフィロコッカス・エビデルミゾイスの細胞は、その組成（ポリエチレン、ポ リ塩化ビニル、ポリぶつ化ビニルまたはポリエステルをベースとする物質）の如 何にかかわりなくカテーテルの内外面に付着し増殖することが証明された。

コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類の毒力は外来物体の存在下で明らかに増 大するが、これらの正常な皮ふ共生生物を院内病原体にする微生物因子は充分間 らかにされていない。付着がコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス外来物体感染 の疾病成立における必須第１段階であると考えられているので、ポリマー補てつ 物質に対する付着とその上でのコロニー形成を仲介する可能性がある微生物の表 面特性に関心が集中している。

特異的スタフィロコッカス性アトへシン厚として最も有効な候補は、しばしば「 スライム（ねと）」と称される細胞外物質である。スライム物質がスタフィロコ ッカス・エビデルミゾイス細胞を抗体および天然の宿主防衛機構から保護すると 仮定されている。ユーマンス等、前掲、ビータース、Ｇ等、ジャーナル・オブ・ イン７エクシヨン・ディジージグ１４６巻４７９−８２頁（１９８２年）。

１９７２年以来、髄液シャント感染部から分離されたコアグラーゼ陰性細菌が、 アルシアンブルーで染色され、したがって多糖類と思われる粘液物質を作り出す ことが知られていた。ベイストン、Ｒ等、デベロプメンタル・アンド・メディカ ル・チャイルド・ニ巻−コロジー１４巻（補遺２７号）２５−８頁（１９７２年 ）。スライム産生菌の細胞外多糖類物質は、一般にＤ−グルコース、Ｄ−ガラク トース、Ｄ−マンノース、Ｌ−７コースおよびＬ−ラムノースのような中性単糖 類からなり、アミノ糖、ウロン酸並びにリビトールおよびグリセリンのようなポ リオールをも含む一連の低分子量および高分子量ポリマー類からなる、ゆるい無 定形物質である。グリスチナ、Ａ、Ｇ、サイエンス２３７巻１５８８−９５頁（ １９８７年）。グルコース、ガラクトース、フェニルアラニン、マンノース、ヘ キソースアミン、りん、グリシンおよびアラニンが、生物材料感染に無関係な臨 床試料中のスタフィロコッカス・エピデルミゾイス株が産生ずるスライムの成分 であることがわかっている。イチマン、Ｊ、ジャーナル・オプ・アプライド・バ クテリオログ−５１巻２２９頁（１９８１年）。このような感染部位から得た細 菌分離株は、皮ふからの無作為分離株よりスライム生成傾向が大きいようである 。イシャク、Ｍ、Ａ、等、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ ー２２巻１０２５−９頁（１９８５年）。さらに、スライム産生株は種々のポリ マー物質によく付着する。クリステンセン、Ｇ、Ｄ。

等、イン７エクシヨン・アンド・イムニティ３７巻３１８−２６頁（１９８２年 ）。

コアグラーゼ陽性スタフィロコッカス類（スタフィロコッカス・アウレウス）は 、熱抽出で細胞から分離し、インフルエンザウィルス感染いぬ腎細胞に結合する ことを証明し得る多数の細胞表面蛋白を産生ずることが報告されている。スタフ ィロコッカス・アウレウスは、多数の細胞表面蛋白アトへシン類を産生ずると考 えられた、サンフォード、Ｂ、Ａ、’ｌ、イン７エクシヨン・アンド・イムニテ イ５２巻６７ｉ５頁（１９８６年）、プロシーデインダス・オブ・ソサイアティ ・フォー・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディスン１８１巻１ ０４−１１頁（１９８６年）。

そのほかの微生物性アトへシン類の同定も報告されている。ビール（米国特許第 ４２８５９３６号、１９８１年８月２５日、米国特許第４５２８４５８号、１９ ８６年３月２５日）は、シュードモナス・エルギノーザのスライムから多糖類抗 原を部分的に精製する方法を記載している。エシェリヒア・コリのフィンプリン 蛋白アドヘ゛　シン類が数人の研究者により同定され部分的に精製されている［ オルスコア、Ｉｌ、イン７エクシヨン・アンド・イムエフ４４フ巻１９１−２０ ０頁（１９８５年）、チャンター、Ｈ，ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロ バイオロジー１２５巻２２５−２４３頁（１９８３年）、フエレイロス、Ｃ，Ｍ 、等、レブ・エスパノル・デ・アイジオログ３９巻４５−５０頁（１９８３年） およびモック、Ｔ。

等、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン クズ８４巻３４６２−６頁（１９８７年）］。

レクチン株糖蛋白のアトへシン類がバクテロイデス・フライリス群で同定され、 ７０ｋＤａのアトへシンがアフィニティクロマトグラフィーで精製されたＬログ モンド、■０等、イン７エクシヨン・アンド・イムニティ５３巻９９−１０２頁 （１９８６年）］。］モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィが、標 的細胞に対する細菌の付着を仲介するマイコプラズマ・ニューモニエの１６５ｋ Ｄａ表面蛋白の精製に使用され［レイト、Ｄ、に、等、ジャーナル・オブ・バ巻 テリオウジ−１５フ巻６７８−８０頁（１９８４年）１、またストレプトコッカ ス・サンギスＦＷ２１３からの１５０ｋＤａアトへシン蛋白の分離に使用された ［エルダー、Ｂ、Ｌ、等、イン７エクシヨン・アンド・イムニティ５４巻４２１ −７頁（１９８６年）１゜１７．５ｋＤａの泌尿上皮細胞アトへシン蛋白が、尿 管感染症にしばしば病因となるプロテウス・ミラビリスのアイプリンから部分的 に精製された［レイ、Ｓ、に、等、イン７エクシヨン・アンド・イムコテ４５４ 巻４３−９頁（１９８６年）］。

ルドウィッカ［ルドウィッ力、Ａ１等、ツェントラルブラット・７ユル・バクテ リオロギー・ラント・ビギーネ、Ａ２５８巻２５６−６７頁（１９８４年）］は 、スタフィロコッカス・エビデルミゾイスのスライムのフェノール食塩水抽出液 をイオン交感クロマトグラフィーで７ラクシヨン化し、４種の粗分−を得ｔ；。

フェノール食塩水抽出物も４種中２種の粗分−も、ポリマー物質への細菌細胞の 付着を阻害した。分画中の単糖類の存在、分画とレクチン類との反応、および細 胞をツニカマイシン（糖蛋白合成阻害剤）で前処理することによる４種分画産生 の完全阻害に基づき、著者等は細胞外スライム物質がゴリココンジュゲート複合 体（すなわち糖蛋白）特性をもつと結論した。

ホグト［ホグト、Ａ、Ｈ，等、イン７エクシヨン・アンド・イムニティ５１巻２ ９４頁（１９８６年）］は、スタフィロコッカス・エビデルミゾイスの同族株の スライムから得た粗細胞外産生物が、カテーテルおよび補てつとして使用された ポリマー物質に対する同族細菌細胞の付着を阻害することを観察した。この報告 には、細胞外産生物の化学的性質に関しては何らの情報も含まれていなかった。

細菌細胞およびこのような細胞の表面から得られた物質が、同族細菌に対する抗 体産生のためのワクチンとして使用された。フランク［フランク、Ｒ等、フラン ス特許出願８５−０７３１５号、１９８６年１１月２１Ｅｌ公開］は、ストレプ トコッカス・ムタンスから得たきよう膜蛋白アトへシンと（血清型的に）同じ生 物から得た多糖類との共有結合コンシュケートの使用を記載している。ビール（ ビール、Ｇ、Ｂ、等、米国特許、上掲）は、シュードモナス・エルギノーザ２１ ９２株のスライムから得た高分子量ムコイドエキソ多糖類を含み宿主動物に上記 微生物に対する免疫を誘導するワクチンを記載している。サトウスキ（サトウス キ、Ｐｏ、米国特許第４４４３５４９号、１９８４年４月１７日、米国特許第４ ６５２４９８号、１９８４年３月２４日およびヨーロッパ特許第８２４０１５０ ６゜１号、１９８３年４月２７日公開）は、ひとおよび動物においてアトへシン 保有同族細菌により起る疾患の治療処置に使用し得る、エシェリヒア・コリおよ びシュードモナス・エルギノーザ表面アトへシンに特異的なモノクローナル抗体 を記載している。ナギー［ナギ＋、Ｌ、に、等、デベロブ・バイオ口・スタンド ５３巻１８９−９７頁（１９８３年）］は、エシェリヒア・コリ感染症に対する 新生子豚の保護用マルチ・アトへシン・ワクチンを記載している。

発明の要約 この発明者は、！［性スタフィロコッカス・エピデルミゾイス株のスライムから 実質的に純粋なきよう膜多糖類アトへシン抗原を分離することができれば、この ような抗原から、ひとまたは動物にお゛いてインビボでポリクローナル抗体を誘 導し、またはハイブリドーマ細胞においてモノクローナル抗体を生ずるのに用い 得るワクチンを製造できると考えた。疾患の成立にアトへシン仲介コロニー形成 が必要であるとの推定に立ち、発明者は、この発明のアトへシンに対して生じた ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、宿主組繊細胞まｔ；はモリマー性 医用補てつもしくはカテーテルに対するアトへシン保有病原菌の付着を妨げるこ とにより、スタフィロコッカス・エビデルミゾイスによる疾患および感染を予防 または治療する新規な手段を提供すると考えた。

さらに、この発明の実質的に純粋なきよう膜条糖類アトへシンは、医用装置のた めの新規なポリマー物質を試験するプローブとして有用である。

それ故、好ましい態様において、この発明は、ポリマー物質に対する付着を仲介 し、下記微生物のカプセルとなると思われる、スタフィロコッカス・エビデルミ ゾイスＲＰ−６２株（多量のスライムを生ずるカテーテル関連細菌をもつ患者か らの分離株）の抽出物から得た実質的に純粋な多糖類を提供する。別の好ましい 態様において、この発明はスタフィロコッカス・エビデルミゾイスＲＰ−６２株 の抽出物からの実質的に純粋な多糖類アトへシンの製造法を提供する。

他の好ましい態様において、この発明の実質的に純粋な多糖類アトへシンは、ポ リマー物質に対するアトへシン保有細菌の付着を阻害する抗体を動物中で生じさ せるためのワクチンとて使用される。

この発明の実質的に純粋な多糖類はまた、ハイブリドーマ細胞でモノクローナル 抗体を産生させるための抗原として使用することができる。このようなモノクロ ーナル抗体は、コアダラーゼ陰性スタフィロコッカス類による感染を防止または 減少させるためひとまたは動物に予防または治療目的で投与することができる。

さらに別の好ましい態様において、この発明の実質的に純粋な多糖類アトへシン は、細菌付着に対する抵抗性に関してポリマー物質を選別するために用いること ができる。

図ＩＡは、粗抽出物（Ａ）、精製ティコ酸（Ｂ）及びニス、エビデルミゾイスＲ Ｐ−６２Ａ株の全細胞に対して作られた抗血清に対する精製アトへシンの免疫拡 散様式を示す。

図ＩＢは、ニス、エビデルミゾイス抗原の免疫電気泳動を示す。

溝槽をＲＰ−６２Ａ株全細胞に対する抗血清で満たした。Ａ１粗抽出物：Ｂ１テ ィコ酸；Ｃ１精製アトへシン；Ｄ１ティコ酸と精製アトへシンの混合物。

図２は、ＲＰ−６２Ａ株（各対の左側様式）及びＲＰ−６２ＮＡ株（各対の右側 様式）からの細菌ＤＮＡの制限酵素分解物の電気泳動様式を示す。レーン１及び １２、ファージラムダＤＮＡのヒント■分解物：レーン２及び３、ＲＰ−６２Ａ 及びＲＰ−６２ＮＡからの未分解ＤＮＡ、レーン４及び５、ＥｃｏＲＩ分解物； レーン６及び７、ＳａｕｍＡ分解物；レーン８及び９、ＲｓａＩ分解物；レーン １０及び１１、ＣｌａＩ分解物。

図３は（細菌の懸濁液（１０６細菌／ｍｌ）に浸漬する前に種々の細菌抗原の指 示濃度液１２管をインキュベートした後の）ニス、エビデルミゾイスＲＰ−６２ 株細胞のシラスティックカテーテル管への結合の阻止を示す。

有意な（ｐ＜０．０５．ｔテスト）阻止は、０．１２−０．５０ｍｇ／ｍｌの濃 度でＲＰ−６２Ａ株からの粗製抽出物及び０．０６−０．５０ｍｇ／ｍ１の濃度 で精製アトへシンに関してのみ見られた。

図４は、ニス、エビデルミゾイスＲＰ−６２Ａ株からの異なる抗原標品（０，１ ｍｇ／ｍｌ濃度）によるシラスティックカテーテル管へのコアグラーゼ陰性ブド ウ球菌の種々の株の付着阻止を示す。星印は有意な（ｐ＜０．０５．ｔテスト） 阻止を示す。

図５は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の種々の株の、正常ウサギ血清との、全Ｒ Ｐ−６２Ａ細胞又は精製アトへシンに対するラット抗血清のいずれかに対して作 られたウサギ血清との、及びウサギ又はラットＩｇＧに対するフェリチン標式ヒ ツジ抗体との、以下のインキュベーションの透過電子顕微鏡法を示す。Ａ）は正 常ウサギ血清で染色したＲＰ−６２株である（Ｘ７５．０ＯＯ）；　Ｂ）全細胞 に対するウサギ抗血清で染色したＲＰ−６２株（Ｘ６２．０００）：　Ｃ゛　） 精製アトへシンに対するラット抗血清で染色したＲＰ−６２Ａ株（Ｘ４８．０Ｏ Ｏ）：　Ｄ）ＲＰ−６２Ａ株全細胞に対するウサギ抗血清で染色したＲＰ−１４ 株（Ｘ３５．０００）：　Ｅ）精製アトへシンに対するラット抗血清で染色した ＲＰ−１４株（Ｘ６５．０００）；　及びＦ）ＲＰ−６２全細胞に対するウサギ 抗血清で染色したＲＰ−６２ＮＡ株（Ｘ５０．０００）。各グラフ中のバーは２ ００ｎｍを示す。

本実施態様の詳細な説明 本発明は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌細菌から本質的に純粋形のが外部多糖ア トへシン抗原の分離、該アトへシンに対するポリクローナル及びモノクローナル 抗体を作るためのワクチンとしての該アトへシンの用途、該細菌のポリマー材料 への付着を防止するための該アトへシンの用途及び該アトへシンの、該細菌が付 着しないポリマー材料に関し試験するためのプローブとしての用途を含む。

材料及び方法 細菌株　以下の株はゴートン・クリステンセン博士、メンフィス・テネシーから 提供され、既に記載されている（クリステンセン、ジー、デー、等、アンナルズ ・オブ・インターナル・メディシン９６：１−１０（１９８２）；インフェクシ ョン・アンド・イムニティ３７：３１８−２６（１９８２））：　（ａ）スタフ ィロコッカス・エビデルミゾイスＲＰ−６２Ａ株（スライム生成、高粘着、カテ ーテルの関連敗血症患者から）、ＲＰ−６２ＮＡ株（ＲＰ−６２Ａの変異株で粘 着性が少なく顕微鏡実験でスライムを生成しない）及びＲＰ−１２株；（ｂ）ニ ス、ホミニスＲＰ−１４株並びに（Ｃ）ニス、ヘモリティクス５Ｐ−２株。

ニス、エピデルミゾイス株のＤＮＡ分析、細菌細胞を酵素リゾスタフィンにより 溶菌する。溶解質をＲＮアーゼＡ（シグマ）及びびＲＮアーゼＴＩ（シグマ）で 分解して細菌ＲＮＡを破壊し、界面活性剤溶液、例えばドデシル硫酸ナトリウム 並びに蛋白質分解酵素、例えばプロナーゼ及びプロテインナーゼＫ（ベーリンガ ーーマンハイム）で分解した蛋白に溶解する。ＤＮＡを多回抽出により分解細胞 からフェノールに抽出し、−２０℃でエタノールを添加し、最終濃度６０−７０ ％アルコールとしてフェノール溶液から沈澱させる。沈澱ＤＮＡを遠心で集め、 ７０％水性エタノールで洗浄し、真空乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｃｏ ＲＩ　、　５ａｕＩＩ　Ａ、　Ｒｓａ　Ｉ及びＣ１ａＩ（二ニー・イングランド ・バイオラブ、ベヴアリー、マサチューセッツ））で分解する。制限分解物を１ ％寒天ゲル上で電気泳動し、制限断片をエチジウムプロミド染色により視覚化す る。

粗抽出物、精製アトへシン及びティコ酸の特徴づけ、分析前に資料を１００℃で ６Ｎ　ＨＣｌ中で４から４８時間加水分解する。炭水化物含量減少はフェノール −硫酸反応（ヅボイス、エム、等、アナリテイカル・ケミストリー、２８：３５ ０−６（１９５６））により、蛋白はブラッドフォード染色試験（ブラッドフォ ード。

エム、アナリテイカル・バイオケミストリイ、７２：２４８−５４（１９７６） ）での陽性反応により、核酸はＤＮＡ標準に対する２５４ｎｍでの吸収により、 リン酸はケンの方法（ケン、ピー、ニス、等、アナリテイカル・ケミストリー２ ８：１２５６（１９５６）での陽性反応により、脂質は標準としての脂肪酸メチ ルエステルに対する気−液クロマトグラフィ−（リー、ジエイ、シー、等インフ エクション・アンド・インムニティ、投稿中（１９８７））により、そしてアミ ノ酸及びアミノ糖は、クエン酸リチウム系を用いるアミノ酸アナライザー（モデ ル１２１ＭＢ、ベックマン、インスッルメンツ、インコーホレーテッド、フラー トン、カリフォルニア）により検出し、評価する。多糖は、ＲＳＬ−３１０（オ ールチック・アソシェイッ、ディアフィールド、イリノイ）及び５Ｐ−２３３０ （スペルコ、デルフォント、ペンシルヴ工ニア）の２５一本毛管力ラム上への同 一試料の同時注入を用いるヒユーレット−パラカード５８８０装置中、トリメチ ルシリル誘導単糖メチルエステル（チャンパース、アール、シー、等バイオケミ カル・ジャーナル１２５：１００９．１８（１９７１））の気−液クロマトグラ フイーにより個々に同定する。注入器及び初めのオーブンの温度は１４０℃で、 この温度を３分間保ち、次いで５℃／分で１５０℃で上昇させ、続いて３０℃／ 分で２１０℃に上昇させ、この温度で９分間保つ。炎色イオン化検出器は２５０ ℃に保つ。試料を標準と比較した保持時間により同定する。血清分析は二重拡散 及び免疫電気泳動法（オウクターロニイ、オウ９等、イムノケ゛ミストリイ、１ 巻、ブラックウェル、オックスフォード、　１９７８年、１９章）により実施で きる。

付着検定　コアグラーゼ陰性ブドウ球菌株のポリマー（即ちシラスチック）カテ ーテル管（フレンチ３、ジェスコ・インターナシュナル・インニーポレーテッド 、サン・アントニオ、テキサス）への付着は、以下のように測定する。トリプシ ン大豆ブイコン中細菌の一夜培養物を希釈して１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ ）／ｍｌ含量とする。２１ゲージ針に合せた３ｃｍ長の管をエチレンオキシドガ スで滅菌し、次いで、培地中に室温で１５分間浸漬する。管を生理的食塩水中で 激しく攪拌することにより、又、針に通した３ｍｌ注入器で管に生理的食塩水を （り返し通すことにより洗浄する。洗浄を洗液がｌ　ｃｆｕ／１００μｍより以 下になるまで続ける。約３回の洗浄で達成する管の１ｃｍ部分を廃棄後、細菌の 残り２Ｃ１への付着を、管をトリプシン大豆寒天プレート表面上に幾方向にも回 転させ、次いで一晩３７℃でインキュベートすることにより定量する。ｃｆｕ／ カテーテルは翌日測定する。プラスチック管から寒天プレートへの細菌の移転効 率は、細菌を放射標識し、予備的に一晩培養した培地に１μｃｉの［ＩＣ］−酢 酸ナトリウムをインキュベートすることにより評価する。寒天プレート上への回 転の前後の管へのｃｆｕ付着の数は、液体シンチレーション計数により測定し、 そして、同一試料を塗布することにより得られる細菌数と相関する。

精製アトへシンのカテーテル管への直接付着は、０．５ｃ１１長の管を４０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７，２中、アトへシンの０．５ｍｑ／ｍｌ溶液と３７℃で２ 時間インキュベートし、管をリン酸緩衝衛生理的食塩水０．０５％ツイーン２０ 中で洗浄し、そして、管の感作部分を標準エリザ又はＲＩＡアッセー（ブリアン 、エル、イー、等、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー、１ ８：２７６−８２（１９８３））することにより測定する。用語「エリザ」は固 相酵素免疫検定を意味する。用語ｒＲＩＡＪはラジオイノムアッセーを意味する 。

細菌のカテーテル管への付着の粗抽出物及び精製アトへシンによる阻止は、カテ ーテル管をこれらの材料の溶液中に３７℃で２時間、インキュベートし、被覆し た管を無菌生理的食塩水中で洗浄し、これを細菌培養株（１０’ｃ　ｆ　ｕ／＋ ＋Ａりに置き、そして上記した付着検定を終えることにより実施される。ニス、 エビデルミゾイスの付着がすぐれない株（例えばＣＬ株及び５Ｐ−２株）を阻止 検定に用いる場合は、入力接種材料を１０７　ｃ　ｆ　ｕ／＋＋Ａ’に増加すべ きでこれは細菌付着数が５倍に増加することである。付着の阻止は、以下のよう に計算する。

精製アトへシン（以下参照）に対するウサギ抗体による付着の阻止は、細菌を指 示濃度の正常及び免疫血清と４℃で、２時間インキュベートし、細菌をトリプシ ン大豆ブイヨン中で３回洗浄し、そして上記した付着検定を続けることにより実 施する。付着の阻止は以下のように計算する。

阻止データはスチューデントの検定により有意に統計学的に分析すべきである。

透過電子顕微鏡法、ニス、エピデルミゾイス株の透過電子顕微鏡法は、既に記載 された（ビール、ジービー、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロ ジー、２４　：　１８９−９６（１９８６））ように実施する。細胞外構造を視 覚化するため、細菌細胞を、全細胞に対するウサギ抗体の１＝２希釈液又は精製 アトへシン（以下参照）に対して作られた希釈しないラット抗体のいずれかと、 或いは正常血清コントロールとインキュベートする。生理的食塩水で３回洗浄後 、細菌をウサギ又はラットＩｇＧのいずれかに対するフェリチン接合抗体とイン キュベートする。

粗細菌抽出物の調製 粗抽出物は、細胞懸濁液を酵素リゾスタフィン及びリゾチームとインキュベート することにより調製する。不溶性材料を連続的遠心により除去し、微小孔フィル ター（０，４５μｍ）で濾過し、濾液を水で遠析、次いで凍結乾燥する（低温度 で真空中、凍結乾燥する）。

アトへシンの分離 ニス、エピデルミゾイス株の１８時培養株を約ｐＨ５，０で熱ショック（９５− １００℃）に付す。混合物を中性ｐＨ（好ましくは６゜８）、室温にもどし、連 続的遠心及び微小孔フィルター通過により清潔にする。清潔な抽出物を遠心し、 中性にし、そして、１０，０００ダルトン遮断膜通過の限外濾過をくり返して水 で洗浄することにより伝導率を下げる（好ましくは１０ミリジーマン以下）。１ ０゜０００ダルトンより大の大きさの巨大分子を含む残った濃縮物を、次いで中 性ｐＨ（好ましくは約７．０）でイオン交換クロマトグラフィーにより分別する 。好ましい系は、ディーイーエイイー（ＤＥＡＥ）ゼータ−プロップ２５０カー トリツジ（エルケービー・インスツルメンツ、ロックヴイル、メリーランド）で ある。アトへシンを０゜２ＭＮａＣ１により中性ｐＨ（好ましくは約７．０）で 溶出し、付着検定（以下）により測定する。次いでアトへシン含有区分をコンカ ナバリンＡ−セファロースカラム（エルケービー・インスツルメンツ）上アフィ ニイークロマトグラフィーに付し、元の細菌トリプシン大豆ブイヨン増殖培地に より供され、且つ細菌多糖アトへシンと共精製するマンナン汚染物を除去する。

非結合区分を水に（り返し透析して塩及び小分子を除去し、次いで凍結乾燥する 。カルシウム含有緩衝液中、酸性ｐＨ（好ましくは５，０）でアトへシン含有粉 末を再構成したのち、溶液をＤＮアーゼ（汚染ＤＮＡを除去するため）、ＲＮア ーゼ（汚染ＲＮＡを除去するため）及びプロナーゼ（汚染蛋白を除去するため） と連続的にインキュベートする。次いで精製アトへシン溶液を炭酸アンモニウム 緩衝液中、中性ｐＨ（好ましくは約７．０）で分子節カラムで分別する。溶出液 をＡ２Ｏ５ｎｍを測定することによりモニターする。０．０−０．２のＫａｖと 共に溶出するアトへシン区分を集めてプールする。この区分は本質的に純粋な莢 膜多糖アトへシンを含む。

ティコ酸の分離 ティコ酸、ニス、エビデルミゾイスのスライムの他の成分は、アトへシン分別に 用いたディーイーエイイー　ゼータ−プレグ２５０イオン交換カラムから、溶出 アトへシン（０，２Ｍ）よりも高濃度（０，６Ｍ）のＮａＣ１と共に溶出する区 分に回収される。次いで本材料を上記したようにヌクレアーゼ酵素で分解する。

蛋白を酸性ｐＨ（好ましくは約４．０）で１００℃に加熱することにより変性し 、次いで炭酸アンモニウム緩衝液中、中性ｐＨで分子節カラム（セファロース　 ＣＬ−４Ｂ）でクロマトグラフィーに付す。０．３３−０．５７のＫａｖと溶出 する、血清学的に活性な区分をプールし、透析し、そして凍結乾燥する。

アトへシンワクチン ポリクローナル抗体、精製アトへシンのエピトープ部位に対するポリクローナル 抗体は、該アトへシン抗原の宿主動物への相対多数の注入により作りつる。好ま しい態様では、ウサギ内に、完全フロインドアジュバント中０．５肩９の抗原の 皮下投与により、次いで７日後、週３回、生理的食塩水中０．５＊ｑの抗原を静 脈注射することにより抗体を生成させる。週３回の注射は３連続週の間実施し、 次いで、最終注射から５日後に血液を抜き取る。正常（免疫前）血清を全ケース で得る。精製アトへシンに対するポリクローナル抗体は、又、ラットに５日間隔 で３回、５０μ９注射し、最終注射から５日後に血液を抜き取ることで作りうる 。

ニス、エピデルミゾイス株の全細胞に対するポリクローナル抗体は、既に記載さ れた（ピアー、ジー、ビー、等、ジャーナル・オブ・インフエクション・ディジ ーシーズ、１４７　二４９４−５０３（１９８３））ようにウサギ内に作る。

モノクローナル抗体、モノクローナルは、抗原の特異的エピトープ部位に向けら れたイムノグロブリンである。本発明の本質的に純粋な多糖アトへシンに対する モノクローナル抗体は、ケーラー及びミルシュタインのハイブリドーマ技術（ケ ーラー、ゲー、、サイエンス　２３３　＋　１２８１−６（１９８６）；ミルシ ュタイン、ラニー０．サイエンス　２３１　：　１２６１−８（１９８６））に より生成できる。

要約すると、精製アトへシンは、−回感作又は抗体生成体Ｂ細胞（例えばリンパ 球）の過免疫動物ドナーに用いる。リンパ節及び免疫動物の膵臓は便利な供給源 である。マウス及びラットリンパ球は、マウスミエローマラインと共に高いパー センテージの安定な溶解を与えるが、ウサギ、ヒト及びカエル細胞の使用も可能 である。好ましい態様では、過免疫マウス膵臓細胞を融合細胞ハイブリッドを作 るのに用いる。

特異的ミエローマ細胞系はハイブリドーマ生成融合手順（ケーラー、グー１等、 ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ、６　：５１１−９（１，９７ ６）：ンユルマン、エム、等、ネイチャー２７６　：　２６９−７０（１９７８ ））で使用することができる。抗アトへシン抗体生成膵臓又はリンパ節細胞とミ エローマ細胞のハイブリッド産生方法は、通常、融合を促進する試薬の存在下、 体細胞とミエローマ細胞を１０・１の割合で（割合は２０：１から１．１までそ れぞれ変化できる）混合することを含む。同一種の動物が体細胞とミエローマ細 胞の両方の供給源であることが好ましい。融合方法は、ケーラー及びミルンユタ インにより（ケーラー、ゲー　等、ネイチャー２５６　：４９５−７（１９７５ ）・ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ、６　：　５１１−１９（ １９７６）、ここではセンダイウィルスが融合剤である、又、ゲッターにより（ ゲッター、ニス、等、ツマチック・セル・ゲネット　３　：　２３１−６（１９ ７７））、ここでは、ポリエチレングリコールが融合剤である、に記載されてい る。好ましい態様では、ゲッター等の方法を修飾して付加的融合剤としてジメチ ルスルホキシドを含める。

クローンの分離及び抗体検出は、標準的技術により行なう。融合細胞ハイブリッ ドは、ハイブリドーマの増殖を支持するが未融合のミエローマ細胞の増殖を阻止 する培地に細胞を培養することにより選別する。（未融合の体細胞はインビトロ 培養で生存度を維持できない、従って問題を起こさない）好ましい態様では、ヒ ポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＰＲＴ→ミエローマ細 胞を用いる。これらの細胞は、ハイブリドーマ細胞が膵臓細胞のＨＰＲＴ＋遺伝 子型であることにより延命するが、未融合ミエローマ細胞は延命しないヒポキサ ンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地から選択する。遺伝子型適格 性のハイブリッドの増殖を支持する培地で選択できる、異なる遺伝的欠損である ミエローマ細胞も可能である。

抗アトへシン抗体生成ハイブリッドの検出は、文献（ケネットアール１等、出版 、モノクローナル・アンティボディズ、ハイブリドーマ細胞ア・ニュー・ディメ ンジョン・イン・バイオロジカル・アナリシス、プリーナム、ニューヨーク、１ ９８０．３７６−８４頁、ブライアン、エル、イー、等、ジャーナル・オブ・ク リニカル・マイクロバイオロジイ、１８　：　２７６−８２（１９８２））に記 載されている、エリザ及びＲＩＡ技術を含む、幾つかの標準的アッセーのいずれ の一つによっても達成できる。

一度望ましい融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗アトへシン抗体生成細 胞系にクローンされると、各細胞系は、二つの標準的方法のいずれかで繁殖しう る。ハイブリドーマの組織適合動物への注入及び動物の体液（例えば血清又は腹 水）からの高濃度でのモノクローナル抗体の回収、又は培養培地から抗体を高濃 度に回収可能である、インビボ組繊培養での繁殖。

抗アトへシン抗体の治療用途 転移増殖仲介アトへシン上のエピトープ部位に特異的なモノクローナル抗体、及 び上記の非特異的ポリクローナル抗体は、このようなアトへシンを生成し担う病 原性細菌に起因する疾病の予防又は処置に臨床的に用いることができる。例えば 、本発明の莢膜多糖アトへシンに特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗 体は、病原性スタフィロコッカス・エビデルミゾイスに起因する感染、例えばポ リマー移植組織医療器具及びカテーテルに移転増殖するものの予防及び／又は処 置用にどのような動物種にも投与できる。用語「投与」は、本発明の目的のため の、動物を物質で処理するどのような方法、例えば経口的に、鼻腔内に、又は、 非経口的に（静脈内に、筋肉内に又は皮下に）を意味する。用語「動物」は、ヒ ト、農場動物、家庭動物又は動物園動物を含む、ブドウ球菌感染にかかる全での 生物を意味する。これらの抗体の投与の様式は、好ましくは非経口である。抗体 は、幾つかの適当な液体伝播体（ｖｅｈｉｃｌｅ）のいずれかに懸濁又は溶解し 幾つかの非経口手段のいずれか一つにより患者に分与しうる。ある場合、そして 特にヒトの処置を含む場合には、゛　精製は望ましいか、又は政府の法規に従っ て必要でありうる。もし抗体が薬理学的に有効量存在する場合は、他の液体組成 物も又、抗体とスキムミルクの混合物及び／又は血清アルブミンの水性塩溶液中 の抗体を含む、他の液体組成物も又、薬理学的に有効である。ヒトに、抗体は好 ましくは非経口形で投与しうるし、どのような適合担体をも使用しうる。もちろ ん、投与される用量は、レシピエンドの年齢、健康状態、及び重量、同時に行な われる処置の種類、もしあれば処置の頻度、及び必要とする効果の性質に依存す る。好ましくは、用量は、血液ミリリットル当り少なくとも約１μ９の特異的抗 体の濃度であるべきである。

抗−アトへシン抗体の診断的利用 アトへシン特異的抗体はまた医学的および研究目的に有用である。例えばこの抗 体は一般的な細菌のうちのスタフィロコッカス・エビデルミジス株類の存在を非 常に確実に検知するべく診断的に利用し得る。他の利用方法には、スタフィロコ ッカス・エビデルミジス多糖類アトへシンの精製のためのアフィニティークロマ トグラフィー系に、またはアトへシンの定量的測定のためのアッセイ系にアトへ シン特異的モノクローナル抗体の利用がある。

プローブとしての精製付着系の利用 本発明の精製きょう膜条糖類アトへシンは、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカ ス細菌類が付着しない新規なポリマー材料の設計にプローブとして上記付着アッ セイと共同して利用し得る。この新しいポリマーはカテーテルその他の医療用人 工器官およびシャントを有する患者およびこのような細菌の院内感染に罹った患 者に非常に有効である。

一般的な用語を用いて本発明を記載したが、下記の具体的実施例は本発明の特徴 をより具体的に説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施何重 ＰＲ−６２Ａ株アトへシンの分離 スタフィロコッカス・エビデルミジスＰＰ−６２Ａは通気（０，５１／分）およ び攪拌（２００ｒｐｍ）しつつ、ＬＳＬバイオラファイト発酵槽中トリプシン大 豆ブロス１５１中で、５０％酢酸および５ＮａＯＨで滴定し、ｐＨ７，２に調節 しながら培養した。３７℃にて１８時間培養した後、５０％酢酸でｐＨを５．０ に調整し、培養温度を１時間で９５−１００℃まで上昇させた。冷却後ｐＨを６ ．８に調整し、発酵槽から培養物を取り出し、バクテリア細胞を遠心分離により 除去した。上清を０．５μのフィルターを通過させ、分子量１００００ダルトン カツトオフ膜を用いペリコン限外濾過装置（ミリポアー社、ベッドフォー　ド、 マサチューセッツ）を用いて、約４００ｍ１に濃縮した。ついで上清を脱イオン 水２１で希釈し、４００ｍ１に再濃縮した。この工程は溶液のｐＨが６．８、伝 導度をおよそ４ミリシーメンスになるまで繰り返した。ついで溶液の一部（１／ ４）を、あらかじめ０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ６，８中で平衡化したＤＥＡＥ ゼータープレプ２５０カートリッジ（ＬＫＢインスッルメンツ、ロックビル、メ リーランド）にかけた。充填後、カートリッジを０゜０５Ｍトリス緩衝液６００ ｍ１で洗浄し、溶出液は捨てた。シラスデック製カテーテルチュービング（後記 参照）にＲＰ−６２Ａ株の付着を妨げる物質を溶出するＮａＣ１のモル濃度であ ることを予備アッセイにより決定した後、０．０５Ｍ　トリス緩衝液中０．２Ｍ ＮａＣ１で溶出する画分中からアトへシンを回収した。この０．２ＭＮａＣ１溶 出液を集め、脱イオン水を数回交換して透析し、凍結乾燥した。ついでこの物質 を０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６，０に２５ｍｇ／ｍｌで懸濁させ、コンカナ バリンＡ−セファローズ（ＬＫＢインスッルメンツ）のアフィニティーカラムク ロマトグラフィーにかけ、アトへシンと共精製されている、トリプシン大豆ブロ スからのマンナン成分を除去した。未吸着アトへシン含有画分を回収し、脱イオ ン水を数回交換して透析し、凍結乾燥した。ついでこの物質を０．１Ｍ’ＮａＯ Ｈ，１，ＯｍＭ　ＭｇＣ１，および１．０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、ｐＨ５，０中に溶 解しく２５ｍｇ／ｍｌ）、１６時間、３７℃にて、ＤＮエース（１ｍｇ／ｍ１） およびＲＮエース（３ｍｇ／ｍｌ）にて消化させ、その後、プロナーゼを添加（ １，０ｍｇ／ｌｌ１ｌ）Ｌ、さらに４時間３７℃にて消化を行わせた。この溶液 を０．２Ｍ炭酸アンモニウム中で平衡化したセファローズＣＬ−４Ｂの２．６× ９０ｃｍカラム（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・ピスキャタウエイ、ニ ューシャーシー）にがけた。

画分（８ｍｌ）を採取し、Ｋａｖｏ、　０−０．２（ピーク＝０．０２）で溶出 した２０６ｎｍでＵＶ光を吸収する画分を集めた。

実施例■ ＰＲ−６２Ａ株ティコ酸の分離 ティコ酸は０．６ＭＮａＣ１で溶出する画分中ゼータ−ブレラ２５０カートリツ ジから回収した。この物質は上記と同様にヌクレアーゼ酵素で消化させ、１００ ℃、ｐＨ４，０で約１時間加熱し、ついで０．２Ｍ炭酸アンモニウム中セファロ ーズＣＬ−４Ｂの２．６Ｘ９０ｃｍカラムクロマトグラフィーにかけた。Ｋａｖ ｏ、３３　０．５７（ピ一り＝０．４８）で溶出する血清学的活性画分を集め、 脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。

実施例■ 粗抽出物の化学的成分 スライム（Ｓ　ｌｉｍｅ）のティコ酸画分および精製アトへシン上記の操作を用 いて、アトへシンの性質を持つと思われる、Ｓ。

エビデルミジスの培養上清から分離した画分を分析した。粗抽出液の化学的成分 、分離ティコ酸および精製アトへシンを第１表に示す第１表 スタフィロコッカス・エビデルミジス株ＲＰ−６２Ａ粗抽出物中同定された化学 的成分、ティコ酸および精製アトへシン生成物 成分　粗抽出物　ティコ酸　精製 アトへシン ＊ 還元糖　１２　２０　５４ アミノ糖　５　２５　２０ ＊＊ ウロン酸　２　＜１　１０ リン酸塩　１１　１４　＜０．０２” タンパク　３　２　１ 核酸　７　１　１ 脂質　＜０．０１”　＜０．０１”　＜０．０１”未知物質　６０　３８　１４ 単糖 （糖の総％） グリセリン　２０　＜０．１” ガラクトサミン　＜０．１＊＊５ ＊　総重量に対する％ ＊＊　検知下限 粗抽出物は種々の成分を含むが、その大部分は炭水化物とりん酸塩である。スラ イムのティコ酸画分は主にりん酸塩、グリセリン、グルコースおよびルコサミン からなる。精製アトへシンは検出不可能な程度のわずかな蛋白、核酸およびりん 酸塩とともに主に炭水化物からなる。精製アトへシン中には脂質は検出されなか った。同定された主な単糖類はガラクトース、グルコサミンおよびガラクトサミ ンであり、グルコースは存在しない。さらに、単糖類の複雑なりロマトグラムは ガラクツロン酸、グルクロン酸および少量のマンノサミン、フコサミンおよびノ イラミン酸の存在を示している。リポースおよびムラミン酸の痕跡量も検出され たが、恐らく、低濃度のＲＮＡおよびペプチドグリカンが混合していたためであ る。

実施例ＩＶ 粗抽出物、ティコ酸および精製アトへシンの血清学的性質血清学的に、粗抽出物 は、二元拡散法において、ＲＰ−６２Ａ株の全細胞に対して作ったウサギ抗血清 について試験したとき、３個の沈降線を示したが、ティコ酸および精製アトへシ ンは単一の沈降線を示した。免疫電気泳動法によれば（第１Ｂ図）、粗抽出物は 全細胞に対する抗血清について多数の沈降線を形成する。これに対し、精製アト へシンは電気領域において動かない単一の沈降線を形成する。精製ティコ酸はゲ ルの陽極端方向に移動している強い沈降線を形成し、高濃度の抗体を用いたとき は、よりマイナスに負荷した゛　弱い線を形成する。ティコ酸と精製アトへシン の混合物は各々の精製成分に対応する２個の沈降線をもたらす。

実施例Ｖ ポリマーチュービングに対するＳ、エビデルミジス株の付着止揚の付着測定法を シラスチック製カテーテルチュービングに対するコアグラーゼ陰性スタフィロコ ッカス類株の結合の定量に用いた。ＲＰ−６２Ａ株の接種量は１０２−１０’ｃ ｆｕ／ｍＨＤ間で変化させ、直線的結合が注入接種物１０３−１０’の間で得ら れた。放射線標識細菌１０６、トリプシン大豆寒天平板上で転がす前後で計数し たカテーテルチュービングの破片をこの付着測定に使用し、３種の別々の実験に おいて、計数の６７−７５％は除去されており、付着細菌数の大部分はこの方法 で測定されていることを示しているコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類株は 付着測定法において接種物１０’ｃ　ｆｕ／ｍ１で選抜した。ＲＰ−６２Ａの他 に３種のコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類高付着株（ＲＰ−１２、ＲＰ− １４、Ｆ−３２８４）および弱付着株（第２表）。

第２表 スライムおよびアトへシン、シラスチック製カテーテルチュービングに対するコ アグラーゼー陰性スタフィロコッカス類の付着生成物 平均Ｎｏ、　ＣＦＵ 株　種　スライム１　アトへシン　吸着（±５Ｄ）ＲＰ−６２Ａ　Ｓ、エビデル ミジス　＋＋十　陽性２２３３±２０ＲＰ−１２Ｓ、エビデルミジス　＋＋十　 陰性　２９５±４０ＲＰ−１４Ｓ、ホミニス　＋　陽性　１６７±２４Ｆ−３２ ８４Ｓ、エビデルミジス　＋十　陽性　１４４±３ＲＰ−６２ＮＡ　Ｓ、エビデ ルミジス　−　陽性８６８±３０ＳＰ−２３，ヘモリチークス　−　陰性　７± ７ＣＬ　Ｓ、ヘモリチークス　−　陰性　１９±５１＝クリステンセン、Ｇ、　 Ｄ、ら、インフェクション・アンド・イムニティ、３７：３１８−２６（１９８ ２）に記載による半定量測定２：二元免疫拡散法により測定したアトへシンの存 在（陽性）または不存在（陰性） ３：ＲＰ−６２ＮＡ株のみアトへシン生成につき、弱陽性であった３種の高付着 株のうち、２種は二元拡散法でＲＰ−６２Ａ株の精製アトへシンと同一の沈降線 を示す抗原を発現したが、２種の弱付着株は検出可能な抗原を発現しなかった。

ＲＰ−６２ＮＡ株の付着性も付着測定法により評価した（第２表）。ＲＰ−６２ ＮＡ株はその親株と同じく約１／３だけが付着し、ＲＰ−６２ＮＡ株の培養上清 を１０倍に濃縮したときだけ、精製アトへシンに対応する沈降線を二元拡散法で 検出し得た。

ＲＰ−６２Ａ株およびＲＰ−６２ＮＡの総細胞ＤＮＡの制限酵素消化は親株およ びその変種は密接に関連しており、４種の異なる制限酵素を用いた分解パターン は同一であった（第２図）。

実施例ＶＩ 精製アトへシンの性質 Ｓ、エビデルミジスＲＰ−６２Ａ株から精製したアトへシンにつき、シラスチッ ク製カテーテルチュービングへの同族株の付着阻害性を検討した。投与量と付着 阻害関連性はＲＰ−６２Ａからの粗抽出物および精製アトへシンのいずれにも見 られた（第３図）。ティコ酸はＲＰ−６２Ａ株の付着を阻害しないし、ＲＰ−６ ２Ａ株からの抽出物の方法と同様の方法で調製した弱付着性５Ｐ−２株からの抽 出物も阻害しなかった。これらの物質（０，１ｍｇ／ｍｌ）をシラスチック製カ テーテルチュービングに対するコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類の他の株 の付着阻害能につき検討すると、付着抗原を発現する２種の株だけが有意に（ｐ ＜、０５、ｔテスト）精製アトへシンにより付着を阻害された。数種の株はＲＰ −６２Ａ株からの粗抽出物によりカテーテル材料への付着が阻害された。５Ｐ− ２株の付着はＲＰ−６２Ａ株からのティコ酸により阻害された。

同様の方法で、ＲＰ−６２Ａ株からのＲＰ−６２Ａ株精製アトへシンに対して形 成したウサギ抗体は、血清濃度≧０．２５％で投与量とともに変化してこの株の 付着を阻害した。１％血清濃度を用いると、アトへシンを発現するコアグラーゼ 陰性スタフィロコッカス類株付着阻害は有意（ｐ＜、０５、ｔテスト）であった が、抗原陰硅株はこの血清濃度ではシラスチック製カテーテルチュービングへの 付着を阻害されなかった（第３表）。

第３表 スタフィロコッカス・エビデルミジス株ＲＰ−６２Ａから精製したアトへシンに 対するウサギ抗体によるシラスチック製カテーテルチュービングへのコアグラー ゼ陰性スタフィロコッカス類の付着阻害 アトへシン陽性 ＲＰ−６２Ａ　５９±１７＊ ＲＰ−１４５３±１＊ Ｆ−３２８４６５±１４＊ ＲＰ−６２ＮＡ２　１±１３ ＲＰ−１２’　６２±８ アトへシン陰性 ５Ｐ−２１７±９ １：　血清濃度　１％ ２：　Ｐ＜０．０５、ｔテスト ＊：　著しく減少したアトへシンを産生している。

３：　初期の実験ではＲＰ−１２は陰性であった。しかし、より最近の実験では 、ＲＰ−１２が実際に産生じている。明らかに、初期に用いた血清ではＲＰ−１ ２からのアドヘシン産生の検知に失敗している。

精製アトへシンでコーティングしたシラスチック製カテーテルチュービングは容 易に全細胞および精製アトへシンに対して形成したウサギ抗体と結合するが、前 免疫血清中の抗体はコーティングカテーテルチュービングと僅かに反応するだけ であった（第４表）。

第４表 精製アトへシン被覆シラスチック製カテーテルチュービングとスタフィロコツ　 カス・エビデルミジス株ＲＰ−６２Ａからの精製アトへシンに対　するウサギ抗 体の反応免疫前　０．１５０＊　０．２０２ 対免疫 全細胞　０．１９１　１．２１２ 実施例ＶＩＩ 透過型電子顕微鏡 正常なウサギまたはラット血清、全細胞に対して形成したウサギ抗血清および精 製アトへシンに対して形成したラット抗血清で処理した後、ＲＰ−６２Ａ、ＲＰ −６２ＮＡ、ＲＰ−１４、ＲＰ−１２およびＣＬの細菌細胞の外観を検査するた めに、透過型電子顕微鏡を使用した。これらの抗血清にはいずれも正常な血清で は見られないきょう膜（第５Ａ−Ｄ図）と見られるＲＰ−６２ＡおよびＲＰ−１ ４株を取り巻く細胞外構造が観察された（図中には正常なウサギ血清およびＲＰ −６２Ａ株のみが示されている；正常な血清で処理された他のすべての株は第５ Ａ図と同一に見えた）。ＲＰ−６２Ａ株は、全細胞（第５Ｆ図）および精製アト へシン（図なし）に対する抗体と反応させたとき、僅かな量のきょう膜物質のみ が見られ、これは上記の血清学的知見と一致する。ＲＰ−１，２およびＣＬ株の いずれも、ＲＰ−６２Ａ全細胞および精製アトへシンに対する血清を使用したと き、検出可能なきょう膜は見られなかった（図なし）上記により本発明を十分開 示したが、これにより当業者がここに述べた本発明の要旨および範囲を逸脱する ことなく変更および修飾が可能であることは自明である。

ＦＩＧｔＪＲＥ　１ ＦＩＧＵＲＥ　２ 抱恥ｔｈ７ｔ（−４１） ＦＩＧ３ ＦＩＧ　４ ＦＩＧＬＩＲＥ　５ 国際調査報告

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）実質的に純粋な形態で産生されたコアグラーゼ陰性細菌のきよう膜多糖類 アドヘシン。
2. （２）細菌がスタフィロコッカス・エピデルミディス株を含む、請求項１記載の アドヘシン。
3. （３）株がＲＰ−６２Ａ株を含む、請求項２記載のアドヘシン。
4. （４）株がＲＰ−６２ＮＡ株を含む、請求項２記載のアドヘシン。
5. （５）株がＦ−３２８４株を含む、請求項２記載のアドヘシン。
6. （６）株がＲＰ−１２株を含む、請求項２記載のアドヘシン。
7. （７）細菌がスタフィロコッカス・ホミヌス株を含む、請求項１記載のアドヘシ ン。
8. （８）株がＲＰ−１４株を含む、請求項７記載のアドヘシン。
9. （９）アドヘシンがポリマー物質に対する同族細菌細胞の付着を阻害するもので ある、請求項１記載のアドヘシン。
10. （１０）ポリマー物質がポリマーカテーテル及びシャントチュービングを含む、 請求項９記載のアドヘシン。
11. （１１）ポリマー物質がポリマー性医療用補てつ装置を含む、請求項９記載のア ドヘシン。
12. （１２）下記段階 （ａ）細胞きよう膜からアドヘシンを抽出し、（ｂ）上記（ａ）のアドヘシン抽 出物をイオン交換カラムでクロマトグラフィー的に分離し、 （ｃ）（ｂ）のカラムからアドヘシンを溶出し、（ｄ）（ｃ）のアドヘシン含有 フラクション（複数も可）をアフィニティーカラムでクロマトグラフィー的に分 離し、（ｅ）（ｄ）から得たアドヘシンを分子ふるいカラムでクロマトグラフ処 理することによりさらに精製することを含む、コアグラーゼ陰性細菌からきよう 膜多糖類アドヘシンの精製法。
13. （１３）コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類に特異的な、実質的に純粋なき よう膜多糖類アドヘシン抗原を含有する医薬的に許容される非毒性担体を含む、 上記スタフィロコッカス類に対するワクチン。
14. （１４）担体がフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、 食塩水、血清アルブミンおよびサポニンから選ばれたものである、請求項１３記 載のワクチン。
15. （１５）ほ乳類種に治療有効量の請求項１３記載のワクチンを投与することから なる、ほ乳類種の１員におけるコアグラーゼ陰性細菌感染に対する免疫増強法。
16. （１６）ほ乳類種がひとである、請求項１５記載の方法。
17. （１７）コアグラーゼ陰性細菌がスタフィロコッカス・エピデルミディス株を含 む、請求項１５記載の方法。
18. （１８）株がＲＰ−６２Ａ株からなる、請求項１７記載の方法。
19. （１９）株がＲＰ−６２ＮＡ株からなる、請求項１７記載の方法。
20. （２０）株がＦ−３２８４株からなる、請求項１７記載の方法。
21. （２１）株がＲＰ−１２株からなる、請求項１７記載の方法。
22. （２２）コアグラーゼ陰性細菌がストレプトコッカス・ホミヌス株を含む、請求 項１７記載の方法。
23. （２３）株がＲＰ−１４株を含む、請求項１７記載の方法。
24. （２４）アドヘシンに対する抗体を産生し得る細胞とミエローマ細胞を融合させ て生ずるハイブリドーマを繁殖させ、上記ハイブリドーマが産生する抗体を採取 することを含む、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類のきよう膜多糖類アド ヘシンに対するモノクローナル抗体の製造法。
25. （２５）コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類のきよう膜多糖類アドヘシンに 対するモノクローナル抗体。
26. （２６）コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類のきよう膜多糖類アドヘシンに 対する抗体および医薬用担体を含む、医薬組成物。
27. （２７）抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６記載の医薬組成物。
28. （２８）抗体がポリクローナル抗体である、請求項２６記載の医薬組成物。
29. （２９）細菌がスタフィロコッカス・エピデルミディス株を含む、請求項２６記 載の医薬組成物。
30. （３０）細菌がスタフィロコッカス・ホミヌス株を含む、請求項２６記載の医薬 組成物。
31. （３１）（ａ）ポリマー物質をけんだく培養物中のスタフィロコッカス類と接触 させ、 （ｂ）ポリマー物質を食塩水で洗浄して非付着細菌を除去し、（ｃ）付着細菌を 固体培地の表面で培養し、（ｄ）上記板上に成長した細菌コロニーを定量するこ とを含む、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス類細菌付肴に関するポリマー物 質の評価法。
32. （３２）ポリマー物質を実質的に純粋なきよう膜多糖類アドヘシンの溶液と接触 させることを含む、ポリマー物質に対するコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス 類の付看阻害法。
33. （３３）請求項１記載のアドヘシンに対するそノクローナル抗体を共有結合した 固体マトリックスを含む、きよう膜多糖類アドヘシンの分離に有用なアフィニテ ィークロマトグラフィー組成物。