JPH04501809A - 因子ｉｘ発色アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 因子［Ｘ発色アッセイ 発咀Ω公野 本発明は一般的には発色アッセイ（活性測定）の分野に関するものであり、そし てより特に血漿および他の流体中に含有されている血液凝固水準測定用の発色ア ッセイに関するものである。

発咀Ω背景 血友病は、ある種の循環血液凝固因子の不足により引き起こされる伴性疾病であ る。血友病Ａは、凝固因子Ｖｌｌ＋の不足に関連しているそのような疾病の一種 である。血友病Ｂは、凝固因子ＩＸの水準不足から生じる他のそのような疾病で ある。

血友病Ｂは血友病Ａより５−７倍はど一般的でなく、そして人間中では染色体χ −関連劣性特徴として伝達される。従って、疾病の発生はほとんど保菌者である 母親からの欠損遺伝子を受け継いでいる男性だけである。

血友病Ｂ用の欠損遺伝子型を有する患者は血清因子！Ｘが不足しているのである が、そのような患者は不足の程度力伏きく異なっているであろう、臨床的には、 正常血清中で典型的に観察される水準の５−２５％の因子ＩＸが不足している血 清を有する患者は軽症であると分ｉされる。正常値の１−５％が不足している患 者は中程度であるとみなされ、そして１％以内が不足している患者は重症である とみなされる。正常な因子ＩＸの約２０−５０％が最小止血用に必要である。こ の範囲以下では出血する傾向があり、さらにひどい出血は生命をおびやかす、従 って、血友病Ａ患者における血清因子ＩＸの水準を正確に監視できることがＨｇ 床的に重要であり、時宜を得た適当な治療法である。

正確な因子ＩＸ測定を必要とする他の医学的症状も存在している０例えばワルフ ァリン治療の如きある種の薬品療法は因子ＩＸ水準に影響を与えることが知られ ている０例えば血栓症またはジスアヴイエーテス血管内ａ固（ＤＩＣ）の如き結 核性凝血異常症に罹っている患者も、注１！深い臨床的管理を必要とする因子Ｉ Ｘ水準の異常があるかもしれない、これらの症状の成功を収める治療にも同様に 、血清因子ＩＸ水準の正確な測定が必要である。正常な血液凝固に関する因子Ｉ Ｘ不足性疾病の生理学的および生化学的面のｍｍ的な論議に関しては、Ｒ，コア マン（Ｃ。

ｒｅｍａｎ）編集、止血および血栓症：基本的原理および臨床的診療（Ｈｅｍ。

５ｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ ｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、２ｅ版、リツビンコン ト、ジュイラデフィック、１９８９を参照のこと。

上記の医学的症状の処置においては、−治療方式では専門家に周知の技術を利用 する全血血漿の分別により得られる外因性因７−ＩＸの投与が包含される。その ような技術により得られる因子ＩＸは通常は使い易い寸法の投与量で投与される ように濃縮されている。そのような治療投与量の正確な濃度を測定し１、そし、 て因子Ｉｙの量を精製工程の各段階で注意深く監視することが、必須である。

従って、血液凝固因子■χの定量的測定方法が先行技術では利用されている。こ の分野において標準的アッセイ法になり始めている最も重要な方法は、活性化部 分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）として知られている。この方法では、 血漿を因子ＩＸ不足血漿に加えた時に得られる補正度により試験試料中に存在し ている因子ＴＸの百分率が測定される。補正度は、活性化部分的トロンボプラス チン時間により測定される。その結果を、正常血漿の希釈物を因子■Ｘ不足の対 照用血漿に加えた時に得られた補正度と、比較する。

マチ１　”）ト（Ｍａｔｃｈｅｔｔ）およびイングラム（Ｉｎｇｒａｒｎ）のカ オリンを用いる部分的トロンボプラスチン時間試験（Ｐａｒｔｉａｌ　Ｔｈｒｏ ｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　Ｔｉｍｅ　Ｔｅ５ｔ　ｗｉｔｈ　Ｋａｏｌｉｎ）、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、　、１８：４６５　（１９６５）に従うＡＰＴＴアッセイ 法では、血漿試料をカオリンを含有している緩衝溶液中で培養し、次にそれにイ ノシチンの懸濁液を加える。凝固時間を測定し、そしてデータを標準曲線に対し てプロットする。

先行技術の方法は何回も研究されそして改良されており、そしてｌまたは２段階 のいずれかで実施することができる。しかしながら、全ての変法が特に低水準の 因子ＩＸの測定における結果に関する高い変動性という欠点を有している。この 感度および再現性における欠陥は、正確さが最も重要である時の検出水準におい てまさに生じるのである。

ＡＰＴＴ方法の別の主要な欠点は、ヘパリンの如き薬品がアッセイを妨害して偽 の結果または誤った結果を与えることである。さらに別の欠点には、入手が難し くしかも高価である大量の因子ＩＸ不足血漿が必要であること並びに工程の自動 化の困難さなどが包含される。最後に、ＡＰＴＴおよび関連方法は因子ＩＸに特 異的でな（、アッセイしようとする因子に対して個別的に放血されたＳＵＡを使 用する数種の凝血因子のアッセイにも適用できる。全てのこのようなアッセイ法 は、「正常」血漿はトロンボプラスチン時間において１００％の補正を与えると いう仮定に基づいている。このことは、アッセイをする人間はアッセイを行う時 点毎に標準曲線を作成するという不便さを被ることを意味している。

発朋Ω要宣 本発明は、血液血清、血漿、および他の流体中に含有されている血液凝固因子Ｔ Ｘ水準を測定するための高感度で、再現性があり、しかも簡便なアッセイ法を提 供するものである９本発明のアッセイ法では、血液血清、血漿、および他の因子 ＩＸ−含有流体の試験試料を、活性化された血液凝固因子ＸＩ（以下では因子Ｘ ｌａと称されている）およびカルシウムイオンを含有している溶液に加える。因 子ＴＸが実質的に完全に活性化された因子ＩＸ（以下では因子ＩＸａと称されて いる）に転化される培養期間の後に、血液凝固因子ＶＩＩＩ、Ｘ、燐脂質および カルシウムイオンを含有している第二溶液を培養混合物に加え、そしてさらに培 養する。この培養中に、最初の培養中に生成した因子ＩＸａが作用して因子Ｘか ら活性化された因子Ｘ（以下ではＸａと称されている）への転化を促進させる。

この反応で生成する因子Ｘａの割合は生成した因子ＩＸａの量と正比例している 。このようにして生成した因子Ｘａと反応して簡単に測定可能な信号分子を放出 させる指示剤を反応混合物に加える。下記の反応式が本方法の各段階をさらに示 している：１）　因子ＩＸ　−因子氾互一　因子ＩＸａＣａ” ２）　因子Ｘ　−因子■互−因子Ｘａ 燐脂質 因子Ｖｌｌｌ Ｃａ” ３）　指示剤　−因子Ｘ互−信号分子。

本発明の方法に従うと、特に低めの範囲の因子ＩＸｆｉ度において高い感度およ び再現性を有するアッセイ法が提供される。本発明の他の目的は、因子ＩＸ−含 有流体の日常的な研究室アッセイを簡便に実施するためのキットを提供すること である８本発明の別の目的は、ヘパリンおよび他の凝血相互作用性物質の存在に より影響を受けない因子ＩＸ用アッセイ法を提供することである６本発明のさら に別の目的は、大量の試験試料のアッセイを処理できる自動化装置の操作を容品 にさせるアッセイ部品の大原料を提供することである。

本発明の利点および実施法は下記の詳細な記載および実施例を参照することによ りさらに良く理解されるであろう。

好適犀実施働Ω詳和μ説朋 本発明のアッセイ方法は下記の段階からなっている：１、既知または未知量の因 子ＩＸを含有している流体試料をカルシウムイオン（Ｃａ　”）の存在下で血液 凝固因子Ｘｌａと一緒にして混合物状とし、２、実質的に全ての因子ＩＸを因子 ＩＸａに転化させるのに充分な時間にわたり該混合物を培養し、 ３、さらに該培養混合物を燐脂質、因子ＶＩＩＩおよびカルシウムイオン（Ｃａ ”）の存在下で因子Ｘと一緒にし、 ４、全てのまたは一部の因子Ｘを因子Ｘａに転化させるのに充分な時間にわたり 該混合物を培養し、 ５、該培養混合物に因子Ｘａと反応可能な指示剤を加え、それにより信号分子を 放出させ、そして ６、該信号分子を測定する。

前記の方法は簡単には下記の反応式を参照することにより定義することができる ： １）　因子ＩＸ　−因子■互−因子ＩＸａＣａ” ２）　因子Ｘ　−因子■互−因子Ｘａ 燐脂質 因子ｎ１ｌ Ｃａ” ３）　指示剤　−因子】Ｊ−信号分子。

本発明の方法の実施においては、因子ＸＩ、　Ｖｌｌｌ、およびＸは事実上動物 または人間原料から得ら相〜そして当技術で周知の分別または濃縮方法により製 造することができる。さらに、高純度のそのような因子原料は適当な寄主細胞系 統中で繁殖された組み換え媒介体からものである。動物または組み換え媒介体源 からの因子を使用する利点は、生成物因子が例えばＡおよびＢ型肝炎、ＨＴＬＶ −ＨＩ、または他のそのようなウィルスの如き人間の病原体で汚染されていない ことである０本方法の好適態様では、血液凝固因子は生原料のものである。

・　因子ＸからＸａへの転化は燐脂質の存在下で最も効率的に進行する。これら の燐脂質は、例えばホスホチジルコリン、ホスホチジルセリン、またはコレステ ロールおよび種々の割合でのそれらの混合物の如き典型的化合物であることがで きる。他の脂質および燐脂質組成物で代用することもできるが、好適な燐脂質組 成物は約６０％のホスホチジルコリン、２３％のホスホチジルセリン、および８ ％のコレステロールからなっている。

因子ＸからＸＩへの転化用には、カルシウムカチオンのいずれの化学的原料を使 用することもできる。因子Ｘを因’ｊ’Ｘａに転化させる反応を誘導するのに充 分なカルシウムイオンを最初の培養混合物に加えることもでき、または因子Ｘが 転化される時点で第二量のカルシウムイオンを加えることもできる。カルシウム カチオン（Ｃａ’つの原料はＣａ　ＣＩ　ｒ　、Ｃａ　（Ｎｏｔ　）　ｚ、Ｃａ ５（Ｌ、または他の無機もしくは有機カルシウムカチオン含有化合物であること ができるが、好適原料はＣａＣＩｇである。

本発明のアッセイ法を実施する際には、蛋白質濃度、培養時間、試薬濃度、およ び温度は大きく変動させて使用することができる。特定のアッセイ要素のｊＺ択 は、アッセイしようとする原料、型、および寸法、そこに含有されている因子■ χの予測水準、並びに希望する感度しきい値により影響を受けるであろう、これ らの環境を考慮に入れると、アッセイ要素の選択は当技術の専門家には明らかと なろう、当技術の専門家が該アッセイ法を好適Ｂ様に従い実施できるようにする ためのアッセイ要素は下記の実施例中に示されている。

試験試料中に存在している因子ＩＸの水準は因子Ｘが因子Ｘａに転化される速度 と比例するため、反応の開始後のある決められた時点で指示剤から放出される信 号分子を測定することによりこのアッセイ法を行うことが有利である。従って、 本アッセイ法における任意の追加段階は因子χを因子Ｘａに転化させる反応の開 始後のある決められた時点で培養混合物中にクエンチング組成物を加えることか らなっている。クエンチング組成物は蛋白質−介在化学反応を中断させることの できる物質であればよいが、好適組成物はトリス、エチレンジアミン四酢酸、塩 化ナトリウム、およびナトリウムアジドからなる緩衝溶液である。好適組成物中 の該成分類の濃度は実施例中に示されている。

本アッセイ法の血液凝固因子およびアッセイしようとする因子ｒＸ蛋白質は脆い 機能性蛋白質であり、そして安定化用物質または物質類を培養中に含有してアッ セイ条件を最適にしそしてアッセイ成分類の機能性を保護することが望ましい。

そのような安定化用物質類は、湿潤または乾燥凍結状態に保たれている貯蔵中に も機能性を保護する１種々の安定剤が当技術で周知であり、好適物質は単独のま たは組み合わされたポリエチレングリコールおよび牛血清アルブミンである。

本発明の指示剤は、血液凝固因子Ｘａと反応できる分子である。そのような反応 では、化学反応の副生物が生成するはずであり、それが測定可能な信号部分を生 じる。米国特許番号４，４８０，０３０および４，６６６．８３１は、因子Ｘａ と反応可能な種類の色素産生化合物を記載している。特に本アッセイ法に適して いるこの種類の化合物は下記の反応式に従い因子Ｘａと反応する。

ＣＨｓＯＣＯｄ　ＣＨＧ　Ｇ１３’　、ｘｒｇ　ＰＮＡ　ＦＸａ＝ＣＨ３０ＣＯ ｄ　ＣＨＧ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＯＨ＋Ｐ−ニトロアニリンここで、Ｇｌｙはグリ シンであり、Ａｒｇはアルギニンであり、そしてｐＮＡはパラニトロアニリンで ある。この好適な指示剤の化学名は、Ｎａ　（２−ナフチルスルホニルグリシル ）−Ｄ、Ｌ−アミノフェニルアラニン−ピペリドＰ−ニトロアニリン（ａ−ＮＡ ＰＡＰ）である、因子Ｘａとの反応時に、信号分子Ｐ−二トロアニリンが放出さ れ、それは４０５ｎｍにおける分光光度計測定により簡単に測定することができ る。

本発明で適用可能な他の発色指示剤を使用することもできる。前記の開示から、 目標指示剤の信号部分を好適にはトリチウムまたは炭素１４により放射標識何け することもでき、そし、て放出時に信号分子をゲットエクスクル−ジョンクロマ トグラフィー、透析、免疫吸着、または他の一般的な分離技術により単離できる ことは当技術の専門家には明白であろう、放射ｔ１ｍの付いた指示剤は使用が比 較的やっかいであるが、異例の大感度が要求されるような状況では比較的大感度 という利点を有している。

因子χ１アッセイ法の成分類を大量の該アッセイを簡単にしかも日常的に実施す るためのキットとして利用できるとい・うことも本発明の範囲内であると考えら れる。アッセイキットは、１回または複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の 因子Ｘｒａを含有している容器、１回または複数回の因子Ｉｘアッセイ用に充分 な量の因子ＶＩ１１およびＸを含有している第二容器、１回または複数回の因子 ＩＸアッセイ用に充分な量の指示剤を含有している第三容器、および任意の１回 または複数回の因子ＩＸアンセイ用に充分な量のクエンチング組成物を含有して いる第四容器からなっている。キットの成分類の貯蔵寿命を最適にするためには 、それらを上記の容器中で凍結乾燥することが望ましい。該成分類はアッセイを 実施しようとする時に水を加えることにより容易に還元させることができる。ア ッセイ成分類を含有している容器は自動化アッセイ装置に容易に通用される。

本発明の他の有利な面は下記の実施例から明らかになるであろう。

実施例 ９部の採血したての血液を１部の０．１３Ｍクエン酸ナトリウムに加え、その後 、約３００Ｏｒｐｍにおいて１０分間遠心することにより、患者の試料を製造し た。

患者の血漿試料を、４．５Ｐモルの生因子Ｘｌａ、０，２ｕモルの牛トロンビン 、０．０６ｍモルの塩化カルシウム、０．０６ｕモルの燐脂質であるｐＨ８のト リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）緩衝液、並びに安定剤で あるＢＳＡおよびポリエチレングリコール６０００を含有する水で再構成された 凍結乾燥調剤に加えた０次に培養を選択的に２５°Ｃ１３０°Ｃ１および３７° Ｃにおいて約１０分間行った。

培養後に、約１ｍモルの牛因子Ｘ、約３単位の牛因子ＶＩＩＩ、およびｐＨ８の トリス緩衝液を含有する水で再構成された凍結乾燥調剤を培養混合物に加えた。

１０分後に、３．４ｕモルのトロンビン抑制剤であるＣＨｓ　ＯＣＯｄ　ＣＨＧ −Ｇ　１　ｙ−Ａ、ｒ　ｇ−ｐＮＡ、および蛋白質安定剤を含有する水で構成さ れた凍結乾燥調剤調剤を加えた。トリス緩衝液（２０ｍＭ）　、エチレンジアミ ン四酢酸（１０ｍＭ）　、塩化ナトリウム（５ｍＭ）、およびナトリウムアジド （、ＯＩＭ）からなるクエンチング物質の添加により、反応を終結させた。ペッ クマン２Ｄ分光光度計上で、４５０ｎｍにおける分光光度吸着を測定した。

１０３人の患者からの血漿試料を因子ＩＸ含有量に関して分析した。これらの患 者の多くは血友病患者であることがわかっており、そして一部の愚者は先行技術 の古典的アッセイ法を妨害することが知られている種々の薬品を用いる治療を受 けていた。

結果は、ヘパリン治療を受けている患者の血漿中のヘパリンの存在が本発明のア ッセイ法を妨害しなかったことを示している。試験管内で３Ｕ／ｍｌのヘパリン を血漿に加えてもアッセイには重要な影響を与えなかった。さらに、図１に示さ れている如く、新規なアッセイ法および先行技術のアッセイ法により試験された 分割試料の比較研究では因子ｌＸ４ｔＬの非常に重要な相互関連性があった：２ 種の試験部位におけるＮ＝９８、ｒ＝０．９４およびＹ＝０．９７、並びにＮ＝ ９８、ｒ＝０．９３およびｙ＝１．０１ｘ＋３゜国際調査報告 ＋ｍ−１．−−＋　Ａ、、：＝ｍ−ｍ−ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４６３０国際調 査報告 Ｓ＾　３９９１１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）液体試料をカルシウムイオンの存在下で血液凝固因子式ＸＩａと一緒に して混合物状とし、 ｂ）実質的に全ての因子ＩＸを因子ＩＸａに転化させるのに充分な時間にわたり 該混合物を培養し、 ｃ）さらに該培養混合物を燐脂質、因子ＶＩＩＩおよびカルシウムイオンの存在 下で因子Ｘと一緒にし、 ｄ）全てのまたは一部の因子Ｘを因子Ｘａに転化させるのに充分な時間にわたり 該合物を培養し、 ｅ）該培養混合物に因子Ｘａと反応可能な指示剤を加え、それにより信号分子を 放出させ、そして ｆ）該信号分子を測定する ことからなる、流体試料中で血液凝固因子ＩＸの水準を測定する方法。
2. ２．因子Ｘを因子Ｘａに転化させる反応の開始後の決められた時点においてクエ ンチング組成物を加える別段階も一緒になされる、請求項１記載の方法。
3. ３．因子ＸＩａ、ＶＩＩＩ、およびＸが動物原料から得られる、請求項１および ２記載の方法。
4. ４．因子ＸＩａ、ＶＩＩＩ、およびＸが宿主細胞中で繁殖した組換えベクターか ら得られる、請求項１および２記載の方法。
5. ５．指示剤がＮａ−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ，Ｌ−アミノフェ ニルアラニンピペリドＰ−ニトロアニリンである、請求項１および２記載の方法 。
6. ６．信号分子がＰ−ニトロアニリンである、請求項１および２記載の方法。
7. ７．ａ）因子ＸＩを含有している容器、ｂ）因子ＶＩＩＩおよびＸを含有してい る第二容器、およびｃ）指示剤を含有している第三容器 からなる、因子ＩＸアッセイを行うためのキット。
8. ８．ａ）因子ＸＩａを含有している容器、ｂ）因子ＶＩＩＩおよびＸを含有して いる第二容器、ｃ）指示剤を含有している第三容器、およびｄ）クエンチング組 成物を含有している第四容器からなる、因子ＩＸアッセイを行うためのキット。
9. ９．ａ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の因子ＸＩを含有している容器 、ｂ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の因子ＶＩＩＩおよびＸを含有し ている第二容器、および ｃ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の指示剤を含有している第三容器か らなる、因子ＩＸアッセイを行うためのキット。
10. １０．ａ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の因子ＸＩを含有している容 器、ｂ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の因子ＶＩＩＩおよびＸを含有 している第二容器、 ｃ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量の指示剤を含有している第三容器、 および ｄ）複数回の因子ＩＸアッセイ用に充分な量のクエンチング組成物を含有してい る第四容器 からなる、因子ＩＸアッセイを行うためのキット。
11. １１．因子ＸＩａ、ＶＩＩＩ、およびＸが動物原料から得られる、請求項６、７ 、８および９記載のキット。
12. １２．因子ＸＩａ、ＶＩＩＩ、およびＸが宿主細胞中で繁殖した組換えベクター から得られる、請求項６、７、８および９記載のキット。
13. １３．指示剤がＮａ−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ，Ｌ−アミノフ ェニルアラニンピペリドＰ−ニトロアニリンである、請求項６、７、８および９ 記載のキット。