JPH04501852A - 冠動脈血栓の映像形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 冠動脈血栓症は、狭心症患者の臨床症状の不安定性および心筋梗塞発生に主要な 役割を担っている。血管内での血栓形成の過程は複雑である。この過程の最初の 現象の一つはトロンビンによる血小板の活性化で、その結果血小板細胞が変化も しくは損傷した血管壁へ付着する。トロンビン自体もフィブリノーゲンの開裂を 促進する機能を持ち、架橋ポリマーであるフィブリンを形成させる。この凝固機 構が血栓形成をもたらす。

急性心筋梗塞をひきおこす冠動脈閉塞の共通的最終経路は、潰瘍化したもしくは 亀裂を生じたアテローム性プラーク部位での血栓の形成である。例えば、チャン ドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）、Ａ、Ｂ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｌ、、３解 を行うためには、冠動脈内への血栓溶解剤および静脈内へのストレプトキナーゼ の投与が用いられている。例えば、ガンマ（Ｇａｎｚ）、Ｗ、　ら、　Ａｍ、　 Ｈｅａｒｔ　Ｊ、、１０２：１１４５−１１４９　（１９８１）：ガンマ（Ｇａ ｎｚ）ら、Ａｍ、Ｊ、Ｃａｒｄｉｏ、、５３　：１２０９−１２１７　（１９８ ４）を参照。

縦坑（クロット）の溶解には成功するであろうが、残存する血栓が再開した冠動 脈の新たな詰まりの原因となる可能性がある。ガラシュ（Ｇａｓｈ）、Ａ、Ｋ。

ら、Ａｍ、Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｌ、、５ヱ：１７５−１７７　（１９８６）；シェ アー（Ｓｈａｅｒ）、Ｄ、Ｈ，ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、７６：５７−６２ 　（１９８７）を参照。冠動脈の血管整形術は再閉塞を防止することすら不可能 で、そしで残存する血栓の存在下で血管整形術は急速な再閉塞の沈澱物を生じる であろうため、バイパス手術が必須となる。スゲルー（Ｓｕｇｒｕｅ）、Ｄ、ら 、Ｂｒ。

Ｈｅａｒｔ　Ｊ、、５６：６２−６６　（１９８６）を参照。加えて、バルーン 式血管整形術は血管壁を損傷させ、上皮上細胞層を露出させるので、この方法は 血小板の集積、血栓およびプラークの形成の刺激をひきおこす可能性がある。

これらの臨床上の問題のために、血栓の映像形成方法の開発が促進されている。

血小板は１０年以上前に初めてガンマ線放出性のインジウム−ＩＩＩ　（Ｉ　ｎ 　−ＩＩＩ）で標識された。タクール（Ｔｈａｋｕｒ）、Ｍ、Ｌ、ら、Ｔｈｒｏ ｍｂ、Ｒｅｓ。

、９　：　３４５−３５７　（１９７６）およびパワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら、 Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３２：９３８−９４３　（１９８２）参照。この動脈内も しくは静脈内血栓の映像形成方法は、次に示す理由から広く臨床応用されるにい たらなかった；１）小血栓の視覚化が困難である、２）血液プールの「バックグ ラウンド」活動性が相当あるために、冠血管の血栓の視覚化が困難である、３） Ｉｎ　−ＩＩＩ血小板の映像形成は、血小板を活発に取り込んでいる新たな血栓 においてのみ効果的である、４）ｉｎ　ｖｉｔｒｏの血液分離、洗浄および標識 が必要なので血小板の標識に時間を消費し、費用がかかり、そして熟練した作業 員に限られる。

従って、この方法の容易な応用のためのキットを開発する余地は小さい。

血栓溶解療法に続く臨床応用においてのみならず、動脈の再閉塞の病理学的研究 における、標識血小板法の欠点を克服するために、冠動脈血栓の信頼性の高い且 つ迅速な視覚化方法が必要とされている。

発明の概要 本発明は、血栓の成分例えばフィブリンに対して特異的な放射性標識モノクロー ナル抗体を冠動脈血栓症することによる、冠動脈血栓の迅速な映像形成方法に関 する。本発明の方法は血栓特異的映像形成剤を、冠動脈血栓を持つ疑いのあるヒ トの冠動脈内に投与することよりなる。この映像形成剤は、血栓の一成分に特異 的な放射性標識モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。冠動脈内に 直接投与すると、冠動脈血栓の部位における標識の集積は実質的に瞬時におきる 。標識が発生するシグナルを検出しそしてガンマカメラのような光学スキャニン グ装置で視覚化し、そしてプラークの映像に変換する。

本発明の方法および組成物は、従来の血栓映像形成技術に比べて種々の利点を提 供する。特に、映像形成剤の標的である血栓の成分（例えば、フィブリン）は血 栓特異的であるため、循環血液の放射活性による「バックグランド」は、非常に 減少する。さらに、冠動脈血栓症による映像形成は、映像形成剤が血栓の部位に 直ちに到達するために、殆ど瞬間的である。

図面の簡単な説明 第１図は、イヌにおいて放射標識モノクローナル抗体の濃度を増加したときの血 栓による取込みとの直接的関係を示すグラフである。

第２図は、小サイズのヒト血栓中での、放射標識モノクローナル抗体Ｔ２Ｇ１の ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの取込みと抗体への暴露時間との関係を示す。

第３図は、大サイズのヒト血栓について、標識抗体への暴露の時間が抗体のｉ旦 　ｖｉｔｒｏの取込みに及ぼす効果を示す。

第４図は、Ｔｃ−９９ｍ　７２Ｇ１モノクローナル抗体の冠動脈内注射後の、イ ヌの冠動脈血栓症ｉｎ　ｖｉｖｏ映像形成を示す。

第５図は、Ｔｃ−９９ｍ　７２Ｇ１を用いた、イヌの頚動脈の小さい、部分的に 詰まった血栓の検出を示す。

第６図は、Ｔｃ−９９ｍモノクローナル抗体　Ｔ２Ｇ１をイヌの動脈内へ注射し た後の、部分的に閉塞した頚動脈の小血栓の±ｎ　ｖｉｖｏ映像形成を示す。

第７図は、Ｔｃ−９９ｍモノクローナル抗体　Ｔ２Ｇ１のイヌの冠動脈内への注 射による、部分的に閉塞した冠動脈の血栓の映像形成を示す。

第８図は、Ｔｃ−９９ｍモノクローナル抗体　７２Ｇ１の直接静脈内注射を用い た、ヒト患者の静脈血栓のｉｎ　ｖｉｖｏ検出を示す。

第９図は、ヒト患者に投与した後の血液からのＴｃ−９９ｍモノクローナル抗体 　７２Ｇ１の消失を示す。

第１０図は、モノクローナル抗体Ｔ２Ｇ１投与が、引き続くストレプトキナーゼ −誘発血栓溶解に及ぼす効果を示す。

第１１図は、モノクローナル抗体７２Ｇ１による予備処理をしもしくは該予備処 理を行わずに血栓を溶解させた後の血栓重量の変化を示す。

第１２図は、血栓溶解の間のＴｃ−９９ｍ−放射活性の変化を、血栓溶解処理を 受けていない血栓と比較して示す。

第１３図は、ストレプトキナーゼ−誘発血栓溶解の間の、血栓冠動脈の放射活性 の変化を示す。

発明の詳細な説明 本発明の冠動脈血栓の迅速映像形成方法は、血栓特異的成分に対する放射性標識 モノクローナル抗体（もしくはフラグメント）を、直接冠動脈に投与することよ りなる。これにより冠動脈血栓の瞬間的映像形成が可能である。

本発明の方法のための好ましい血栓−特異的抗体はフィブリンに特異的である。

特に好ましい抗体は、フィブリンＩＩのベータ鎖のＮＨ，−末端に対して開発さ れた７２Ｇ１のような抗−フィブリンモノクローナル抗体である。カドリフ（Ｋ ｕｄｒｙｋ）、Ｂ、ら、Ｍｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２１　：８９　（１９８４ ）を参照。合成ペプチドのヘモシアニン−複合体を用いて製造されたフィブリン 特異的モノクローナル抗体５９Ｄ８も又有用である。これらの抗体５９Ｄ８およ びＴ２Ｇｌは、明らかに同じエピトープに結合するため、同等である。

本発明の方法に有用な他のフィブリン−特異的抗体は、フィブリンの消化産物と 反応する抗体ＧＣ４（ＩｇＧ１．カッパ）である。この抗体はフィブリノーゲン 、フィブリンモノマーまたはフィブリノーゲンの三つの鎖成分のどれをコーティ ングしたＥＬＩ　ＳＡプレートにも結合しない。この抗体はフィブリノーゲンま たはフィブリンの離れた領域の−もしくは一以上の鎖に伴うコンホメーションに 依存するエピトープに対する抗体であると思われる。従って、この抗体は部分的 に溶解した血栓と結合するであろう。

活性化血小板に特異的な放射標識抗体によっても冠動脈血栓のイムノシンチグラ フ映像を得ることが可能である。冠動脈映像形成のための好ましい血小板−特異 的抗体は、活性化された血小板のマーカーであるＧＭＰ−１４０蛋白質のエピト ープに特異的なものである。ステンベルグ（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ、　Ｃｅ １］、　Ｂｉｏｌ、を参照。冠動脈血栓の映像形成に有用な殊に好ましい抗−血 小板抗体は、モノクローナル抗体Ｓ１２である。マクエバー（ＭｃＥｖｅｒ）。

Ｒ，Ｐ、およびＭ、　Ｎ、マーチン（Ｍａｒｔｊｎ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、。

ｌ互旦、９７９９　（１９８４）を参照。

フィブリンおよび／または血小板に特異的な本発明の他のモノクローナル免疫グ ロブリンは、所望の抗原に対する抗体を産生ずるリンパ球細胞から得ることが可 能である。

本発明の方法において、全抗体分子よりも抗体フラグメントが一般に好ましい。

抗体は直接血管内に注射されるため、抗体フラグメントは血栓部分により迅速に 集積する。従って、映像は皮下注射を用いて可能であるよりも少ない時間で得ら れる。これらのフラグメントは、組織からより迅速に除去することも可能で、そ の結果バックグラウンドのシグナルを低くすることができる。例えばハーバ−（ Ｈａｂｅｒ）ら、米国特許４，０３６．９４５；ゴールデンベルグ（Ｇｏｌｄｅ ｎｂｅｒｇ）ら、米国特許４，３３１．６４７を参照。抗原へ結合するフラグメ ントＦａｂ’　およびＦ（ａｂ’）ｇも好ましい。Ｆ（ａｂ’）！フラグメント は、数ある公知の方法のいずれかにより、全免疫グロブリン分子をペプシン消化 して調製可能である。Ｆａｂ’　フラグメントは、Ｆ　（ａｂ’　）　２フラグ メントの化学的還元により調製可能である。最も好ましい形において、７２Ｇ１ はＦａｂ’　フラグメントとして投与される。さらに、フラグメントはまたは組 み換えＤＮＡ技法で調製することも可能である。例えば１９８８年５月１８日に 出願された米国特許出願筒１９５，７２０号（ＣｏｌｌｅｒおよびＫｎ　ｉ　ｇ ｈ　ｔ）を参照せよ。

その内容は言及により本明細書に含まれる。

抗体または抗体フラグメントは外部からのシンチグラフで検出するために適する ラジオアイントープで標識可能である。ガンマ線放出性のインジウム−ＩＩＩお よびテクネチウム−９９ｍが好ましい、何故ならこれらの放射性金属はガンマカ メラで検出可能で、そして生体内での好ましい半減期を有するからである。テク ネチウム−９９ｍは、その核特性の故に、シンチグラフイメージングに理想的な 放射性核種である。その単一フォトンエネルギーは１４０ＫｅＶであり、半減期 は約６時間であり、そして”Ｍｏ−’”Ｔｃジェネレーターから容易に得ること ができる。

抗体は免疫化学分野で知られている多くの技術のいずれかによって標識すること が可能である。テクネチウム−９９ｍ標識のために好ましい方法は、バク（Ｐａ ｋ）　、　Ｋ、　Ｙ、らが１９８７年４月２日に出願した、米国特許出願筒０３ ４゜００３号に記載されており、その内容は言及により本明細書に含まれる。抗 体はまた、キレート剤例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を抗 体と複合させてから標識することもできる。この間接標識法においては、放射性 金属は抗体に結合されたキレート剤によってキレート化される。例えばカラ（Ｋ ｈａＷ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２０９：２９５−２９７　（１９８０）；クレジ カレク（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ、７７：５８１−５８５　（１９７７）；チャイルズ（Ｃｈｉｌｄｓ） 、Ｒ，Ｌおよびナトピッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）、Ｄ、Ｊ、、Ｊ、Ｎｕｃ　１ ．Ｍｅｄ、。

旦：２９３　（１９８５）を参照。

抗−フィブリンモノクローナル抗体（Ｔ２Ｇ１）をテクネチウム−９９ｍで標識 する簡単な方法は、次のとおりである：１、バイアルから所定量（即ち、０．　 ５ｍｇ）の７２Ｇ１を取り出して、クエン酸バッファーを含む第二のバイアルに 添加する。バイアルを数回逆さにして混合する。

２、バイアルを鉛の遮蔽体中に置く。新たに溶出した所定レベル（例えば１５ｍ ｃｉ）の放射活性を含む過テクネチウム酸ナトリウムをバイアルに添加する。

３、内容物を混合するためにバイアルを数回逆さにする。室温でインキュベート する。

４、蛋白質−結合性の低い０．２−０．２２ミクロンのフィルターを通して、遮 蔽された注射筒に放射標識されたものの投与量を吸入する。

５、放射標識された抗体は、所望により注射用の０．９％食塩水で希釈してもよ い。

本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、注射 可能組成物の形で冠動脈血栓をもつ疑いのある患者に投与される。本発明の好ま しい方法においては、標識された抗体の溶液は、直接冠動脈に注射される。冠動 脈への直接的注射は実質的に瞬間的な標識モノクローナル抗体の血栓部位への集 積を可能にする。映像形成剤の典型的注射組成物は、ヒト血清アルブミンおよび 所定量の放射標識特異抗体を生理的濃度の食塩を含む中性リン酸バッファー中に 含んでよい。

標識された免疫グロブリンの局在化を果たすに十分な時間の後、標識から発生し たシグナルをガンマカメラのような光学スキャニング装置で検出する。

冠動脈血栓の迅速映像形成の好ましい方法は次の工程からなる：ａ、直接冠動脈 内注射により、テクネチウム−９９ｍ　（Ｔｃ−９９ｍ）で標識した抗−フィブ リンモノクローナル抗体例えばＴ２Ｇ１またはＴ２Ｇ１のＦａｂ’　フラグメン トを投与し、ｂ、Ｔｃ−９９ｍ標識抗体を血栓部位に集積させ、Ｃ，ガンマカメ ラでガンマ線放出シグナルを検出し、そしてｄ、標識抗体から発生したシグナル を冠動脈血栓の可視化映像に変換する。

本発明の方法は冠動脈血栓を持つ患者の血栓溶解をモニターするためにも使用可 能である。これは例えば、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはス トレプトキナーゼを用いた血栓溶解療法との関連で行うことが可能である。この 態様においては、標識された血栓−特異的モノクローナル抗体は、冠動脈から患 者に投与され、そして放射性標識により生じたシグナルを検出して、所定時間ス キャンする。そのシグナルを適当な時間にわたって一連の可視映像に変換するこ とが可能である。この方法により、血栓溶解の程度および時間経過を解明する一 連の映像を得ることができる。

本発明の方法はいくつかの重要な利点を有する。

１）映像形成剤は血栓特異的であるため、循環している放射活性による「バック グラウンド」を減少させることが可能である：２）本発明の方法は、Ｉｎ−ＩＩ Ｉ血Ｉｂ法に比べて、血栓の古さに影響を受けにくいので、血栓が発生している 時点において有用であるばかりでな（、血栓が安定化した時点または溶解してい る時点においても有用であり：そして３）標識抗体の血栓への取込みに要する時 間が非常に短いので、冠動脈的注射による瞬間的映像形成が可能である。

本発明は以下の実施例によりさらに説明される。

の量の増加とともに増加する。テクネチウム−９９ｍで標識されたＴ２Ｇ１モノ クローナル抗体（Ｔｃ−９９ｍＭＡｂ）の１０通りの希釈物を抗血清希釈技術を 用いて１０のビーカーにｒＩｉ製し、０．２９から１５０μｇ／ｍｌの濃度の範 囲にする。

それぞれの抗体の実験について、３０のキャピラリー管を１０ずつ３セツトに分 割し、それぞれのセットをヒト、イヌ、あるいはブタの血液で満たす。Ｔ２ＧＩ ＭＡｂは、プラスミン消化によりすばや（分割され得るさ二ｌ鎖の領域に位置し ているエピトープに対するものであるから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの凝固は１００Ｋ ＩＵ　Ｔｒａｓｙｌｏｌ／ｍｌ存在下において行われつる。キャピラリー管を２ 時間インキュベートする。３つの種からの同じサイズの凝塊をさまざまな濃度の Ｔｃ−９９ｍ　７２Ｇ１を含んだビーカーの内部に入れ、水浴中で３７″におい て２時間インキュベートする。第１図は＋　１）Ｔｃ−９９ｍ　Ｔ２ＧＩＭＡｂ の濃度の増加に伴って血栓の放射活性が上昇すること、および２）血栓と抗体の 結合に関して３種間で顕著な相違は見られない事を表す。これらの予備的なデー タは、マウス抗ヒトフィブリンＭＡｂがイヌおよびブタフィブリンＭＡｂとｉｎ モデルがテクネチウム標識されたＴ２ＧＩ　ＭＡｂをもちいて血栓を映し出す実 験において使用される事を示唆している。さらに、ｉｎ　ＶｉｔｒＯにおけるＭ Ａｂの血栓への取り込みはＭＡｂ量の増加とともに上昇することが明らかである 。

実施例２　Ｔｃ−９９ｍ標識されたモノクローナル抗体の取り込みこの実施例は 普通のサイズの血栓について、短時間の抗体への暴露で十分な取り込みが見られ ることを証明する。

７つの同じサイズのヒト血栓を５ｍＭ　塩化カルシウム存在下においてトロンビ ンとともにヒトの血液を凝固させる（２時間、３７℃）ことにより調製する。血 栓の重量は３２から４２ミリグラムの範囲である。２番目の実験において、７つ の追加の同じサイズのヒト血栓を同じ方法によりただしそれらのサイズを１０１ ０から１１３０ミリグラムにすることにより調製する。それぞれの洗浄された凝 塊は、同じ濃度のＴｃ−Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂ　（５ｍｃｉのＴｃ−９９ｍパーテク ネテートで標識された０、２５ｍｇ／ｍｌのＭＡｂ）に入れられる。凝塊を５お よび３０秒並びに２．　４．　１５．　３０及び６０分間ＭＡｂ溶液中に放置す る。凝塊を徹底的に洗浄し、シンチレーシジンウエルカウンターで計数する。第 ２図は、小さな血栓（約３５ｍｇ）を用いて１旦　ＶｉｔｒＯのＭＡｂの取り込 みが暴露後５秒以内に起こること、および血栓への取り込みはさらに長時間の暴 露によってそれ以上増加しないことを証明する。第３図は、比較的大きな血栓（ 約１．　ＯＯＯｍｇ）を用いて被爆時間を長くすると、血栓によるＭＡｂの取り 込みが大きくなることを表す。これらの結果は、冠血管系において通常見られる サイズの範囲内の比較的小さな血栓においては短時間の被爆によって十分なＴｃ −Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂの取り込みが見られることを示唆する。

実施例３　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける大変小さな閉塞性の凝塊の血栓の映像化動物 の調整：２５−３５ｋｇの雑種犬を調査する。約０．５から１．　０ｍｇ／ｋｇ のアセプロマシンを最初に筋肉内に投与する。知覚麻痺のために、３０分以内に １０　ｍｇ／ｋｇのチアモロールを静脈内に投与する。その後知覚麻痺を維持す るために使用されるＦＴ管を通して実験の間中、エンフルシン１０２混合物を処 理する。

動物を挿管し、そして人工的に部屋の空気を呼吸させる。冠動脈血栓の実験の間 に心室の不整脈がおきたときは、連続的な静注によりリドカイン（１ｍｇ／分） を与える。この静脈内への投与は大腿静脈を経て確保する。全身の血圧及び表面 の心電図を実験中監視する。

銅コイル技術による血栓の誘発：！Ｊ！動脈実験のために、動脈を切り裂いて、 露出しモして遠位を結紮する。小さな切れ込みを動脈壁の中につくる。前もって 重量を量りそして測定された銅コイルをその小さな切れ込みを通して挿入する。

コイルを挿入した後に、切れ込みの近位部位において２番目の結紮を行う。大腿 動脈実験のために、ガイドの針金を頚動脈のうちの一つから大腿動脈に進ませる 。

次に銅コイルをガイドの針金の上に通し、そして血管撮影カテーテルによりガイ ドの針金に沿って押し込んで所定位置に据える。冠動脈実験のためには、銅コイ ルを針金の上に通し、そして冠状カテーテルをもちいて冠動脈のうちの一つに沿 って押す。望まれた位置に銅コイルが据えられているから６０分間待った後、コ ントラストＸ線透視検査法により血栓の存在することを証明する。

銅コイルを用いない血栓の誘発二　二の技術は末梢動脈において血栓を誘発する ために利用される。動脈を切り裂き、露出させる。２つのクランプを１センチメ ーター離して置いてその２つのクランプの間の動脈の部分が血液を含むようにす る。血栓の形成を誘発するために、クランプの部分の内側にトロンビンを注射す る（薬剤量：５　ＮＩＨユニット）。そして動脈を遠位のクランプの部位におい て結紮し、そして近位のクランプを除去する。続いて動物にヘパリンを与える（ 薬剤量：　２００　Ｕ／ｋｇ）。

ｉｎ　ｖｉｖｏ映像化 胸を閉じたイヌにおいて冠動脈内部に血栓を誘発するために、銅コイル（直系２ ！１ｍで長さ１０關）を斜行的な冠動脈に挿入する。コントラストＸ線透視検査 法により冠動脈の血栓の存在を確認した後、イヌにヘパリンを与える。引き続き 、１．２ｍＣ１のＴｃ−９９ｍ抗フィブリン抗体を、注入カテーテルを通して凝 塊から数ミリメーター離れた冠動脈内部に注射する。第４図は、Ｔｃ−Ｔ２ＧＩ ＭＡｂ注射の３分後の冠動脈内部の凝塊１旦　ｖｉｖｏの映像化を表す。見られ るように血液の放射活性は最小である。犠牲にした後、冠動脈の凝塊における放 射活性の位置を血栓および血管壁の■　ｖｉｖｏにおける映像化により確かめる （第４図）。そして凝塊を３つの部分に分けてウェルカウンター内において別々 に重量を量りそして計数する。この特定の実施例において、凝塊の近位の部分は ５ｍｇであり、最大の活性を示した（１．　２Ｘ１０’ｃｐｍ）。参考までに述 べれば、１ｍｍ”の体積の凝塊はおよそ１ｍｇである。この近位の部分は、素早 （ｉｎ　ｖｉＶＯにおいて視覚化される凝塊の部分を象徴する。近位の凝塊の■ 　ｖｉｖ。

における活性は中位および遠位の部分（それぞれ領　６Ｘ１０Ｓおよび１．６× １０　’ｃｐｓ）より著しく高い活性を示した。これらのデータが示唆すること は、完全閉塞した冠動脈の内部の５ｍｇの凝塊は、少量のＴｃ−９９ｍ　抗フィ ブリンＭＡｂの冠動脈内への投与により素早く視覚化されうるということである 。この実験は、放射標識されたＭＡｂの冠動脈内部への注射により血液貯蔵活性 がご（僅かになり、そして高い「標的対バックグラウンド率」をうろことができ る事もまた示唆している。完全に閉塞した凝塊の近位の部分（標識されたＭＡｂ に露出された部分）は最大の放射活性を示す。

実施例４：　小さく、部分的にブロックされた血栓を映像化する血栓動脈内部の 実験のために、雑種犬の頚静脈に銅コイルを挿入することにより静脈血栓を形成 する。１時間後、静脈血栓を採取する。洗浄された血栓を含むコイルを２分間Ｔ ｃ−Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂ　（４ｍＣｉのＴｃ−９９ｍで標識された０、５ｍｇのＭ Ａｂ）溶液に浸す。そしてコイルを頚動脈に移植する。ベースラインのシンチグ ラムの後、７５０，０００ユニツトのストレプトキナーゼを静脈内部に注入する 。３０分後、第５図および第６図に表された実験において、血栓の放射活性が減 少したがまだ存在した。次に動物を犠牲にしてそして頚動脈の凝塊を切り取り、 重さを量りモしてｅｘ　ｖｉｖｏにおいてカメラの下で映像化する。血栓は僅か に０．４ｍｇ（第５図）でありモしてｅｘ　ｖｉｖｏの映像は活性が血栓の中に 存在し、しかしその周囲の構造には存在しないことを証明した（第６図）。

０、　４ｍｇの部分的な閉塞性の動脈内部の血栓がＴｃ−９９ｍ　７２ＧＩＭＡ ｂによりｉｎ　ｖｉｖｏにおいて視覚化されつることをこの予備実験が証明した 。

部分的に閉塞された冠動脈内部の血栓に関わる実験のために、銅コイルを胸を閉 じたイヌの回旋冠動脈の周辺の枝の内部に挿入した。血栓の形成はコントラスト 血管撮影により確認した。次の６０分の間、合計で２５０．０００ユニツトのス トレプトキナーゼを冠動脈内に注入しそして冠動脈の開通性をマルチプルコント ラスト動脈造影により評価した。１時間の終わりにおいて部分的な再開通が認め られた。正確に２．　５　ｍｃｉのＴｃ−９９ｍ　７２ＧＩ　ＭＡｂを冠動脈内 に注入した。コイルを挿入した部分における強い放射活性が認められた（第７図 ）。映像化後直ちに動物を犠牲にし、そしてコイルを直接試験することにより銅 コイル内に部分的に閉塞された血栓が残存することを確かめた。部分的に閉塞性 の血栓は０．　５ｍｇであった。この予備的な知見は冠動脈の小さな残存凝塊が Ｔｃ−抗フイブリン　ＭＡｂの冠動脈内部への投与により素早く検出されること を示唆している。

実施例５：　ヒトの末梢静脈血栓の検出この実施例は、ヒト末梢動脈の血栓をｉ ｎ　ｖｉｖｏにおいて映像化することが、放射標識されたＭＡｂの静脈内部への 注入により実行されることを証明するものである。患者の承認が得られた後、１ ５ｍＣ１（０，５ｍｇ　ＭＡｂ）の量のＴｃ−Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂを、重度の静脈 血栓をもっていると疑われる患者の静脈内部に注入した。注入後５分、４時間お よび２４時間後に、両方のふくらはぎの平面映像（脛骨後方からの映像）を得た 。第８図はＴｃ−Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂ　注入後４時間後にすてに左脛側領域におい て放射活性が増加したことを表す。Ｔｃ−Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂの血液中の消失速度 （Ｔ　１／２）は１８０分で、むしろ速かった（第９図）。末梢静脈血栓はＴｃ −Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂを静脈投与することにより適切な「標的対バックグラウンド 率」で映像化されうることを、この観察が証明する。

実施例６：　モノクローナル抗体法の血栓の溶解に対する効果この一連の実験は 、１ｎｖｉｖｏおよびｉｎ　ＶｉｔｒＯにおける抗−フィブリン（ＭＡｂ）での 血栓に対する処理が、引き続く血栓の破壊に対してほとんど影響を与えないとい う重要な点を証明する。

１、外的な血栓の破壊処理を伴わない場合の血栓の放射活性における経時変化の ベースラインの率。胸を閉じたイヌにおいて、冠動脈の血栓が斜行した冠動脈内 部への銅コイルの挿入により誘発された。１．　５ｍＣ１のテクネチウム−９９ ｍ−７２ＧＩ　ＭＡｂの冠動脈内部への注入に先立ちもしくは引き続き、心臓の 領域の連続的な２分間の映像が１５０分間得られた。血栓の領域における時間に 対する放射活性曲線が明らかにしたことは、放射活性が１２０分のＴ１／２率で 時間とともに対数的に減少する傾向にあるということである。これらの結果は、 おそらく内因性の血栓の溶解のために、血栓へのＴｃ−９９ｍ　７２ＧＩ　ＭＡ ｂの付着に引き続いて放射活性が徐々に消失することを表す。

２、放射標識された映像化用抗体の注入は血栓の溶解に悪影響しない。

ａ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験：　１５ｍ１のヒトのクエン酸塩添加血液を２０ｍＭ の塩化カルシウム（２００μｌ）およびＩＱｍｃｉヨウ素（１）　−１２５標識 されたフィブリノーゲン（２ｍｌの通常生理食塩溶液中）と混合させた。２ＯＮ ＩＨユニツトのトロンビンを血液に加え、次に水浴中で３７°において２時間イ ンキュベートする。インキュベートの終わりに、ｌ−１２５を取り込んだフィブ リノーゲンをもった形で血栓がつくられる。血栓を９８４ｍｇおよび１１１２ｍ ｇの２つの部分に切り分け、２つの別々のチューブに移す。ひとつめのチューブ の中の血栓を０゜２５ｍｇのＭＡｂ　（２，５ｖｌ中）で３０分間インキュベー トする。両方のチューブに、１２５．０００ユニツトのストレプトキナーゼ（１ ｍｌ中）および１０ユニツトのヘパリン（１墓１中）を加える。そして両方のチ ューブを水浴中で３７°においてインキュベートする。いくつかの時間間隔で、 ２ｍｌの上清中のｌ−１２５活性をウェルカウンター内で計数する。その活性は フィブリンの溶解により血栓から解放されたｌ−１２５の量を反映する。第１０ 図は抗フィブリンＭＡｂ中で既にインキュベートした血栓と、ＭＡｂにさらされ ていない対照の血栓との溶解率の比較である。血栓の溶解率および最終の％溶解 率は抗フィブリンＭＡｂとの前処理にかかわらず同じであることは明らかである 。このｉｎ　ｖｉｖｏの実験において、ＭＡｂの薬剤量は１旦　ｖｉｖｏ映像化 の間の薬剤量の５倍である。これらのデータから映像化のためのＭＡｂの使用は 引き続いて起こるストレプトキナーゼによる標識された凝塊の溶解を阻害しない 。

ｂ）ｉｎ　ｖｉｖｏ実験：　雑種犬において、同じ大きさの銅コイルを左および 右頚静脈内部に挿入しそして血栓の形成のために１時間そこに放置した。そして 血栓を採取する。２１０ｍｇの重さをもつ血栓のうちのひとつを０．　５ｍｇの Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂを含む溶液に入れ、そして右の大腿動脈に植え付ける。１７１ ｍｇの重さの２つめの血栓を通常生理食塩溶液中に入れそして対照として左の大 腿動脈に挿入する。そしてさらに血栓が増殖するのを防ぐために４０００ユニツ トのヘパリンを加える。ベースラインコントラスト血管造影図は、血栓の移植に よる両大腿動脈の完全な閉鎖を証明する腸骨動脈の分岐におけるカテーテルによ り得られる。そして百万ユニットのストレプトキナーゼを静脈内部に投与する。

ストレプトキナーゼを投与してから６０分後、２つの大腿動脈の選択的なカテー テル法が開存性を明らかにした。移植された銅コイルを直ちに回収し重さを量っ た。抗−フイブリンフ２ＧＩ　ＭＡｂで前処理するかしないかの血栓の比較にお いて、血栓の重さはほぼ同じであることがこの結果から証明された（第１１図） 。この結果は、１旦　ヱ土ヱ旦における抗フィブリン（７２Ｇ１）　ＭＡｂの血 栓に対する前処理は血栓の溶解に悪影響を示さないというｉｎ　ｖｉｔｒｏのデ ータを確認するものである。

３、放射標識されたＭＡｂの映像化により非侵入的に監視された血栓。　ａ）末 梢動脈の血栓の実験：　雑種犬において、銅コイルを頚静脈に挿入してから１時 間後に、静脈血栓が形成される。血栓を採取しそして２１Ｃ１のＴｃ−９９ｍ− Ｔ２ＧＩ　ＭＡｂにさらしそして頚動脈に挿入する。そして百万ユニットのスト レプトキナーゼを静脈内部に投与する。多数の、２分づつの静止映像が全部で３ ０分間、頚静脈領域の上に得られる。時間に伴う血栓の放射活性の変化を測定す るために、興味のある領域を血栓の映像に指定する。第１２図は血栓の溶解の間 の血栓中の放射活性の一様の低下を証明する。比較のために、対照カーブも示さ れている。血栓の溶解の間の血栓中の放射活性の低下率は対照に比べて顕著に速 い。

ｂ）冠動脈血栓の実験：　イヌにおいて、左の回旋冠動脈の周辺の枝において冠 動脈内部の血栓を誘導した。正確に２．　５ｍＣ１のＴｃ−９９ｍ抗フィブリン ＭＡｂを冠動脈内部に注入しそして血栓を即座に視覚化した。連続した２分間毎 の静止映像が無処理で６０分間得られた。２５０．０００ユニツトのストレプト キナーゼ（ＳＴＫ）を冠動脈内部に６０分かけて注入した。再び、連続映像を６ ０分間撮影した。第１３図は、対照の観察期間（２３Ａ−Ｃ）およびストレプト キナーゼの冠動脈内部への投与後（２３Ｄ−Ｆ）の、血栓の放射活性の変化を説 明する。ストレプトキナーゼの冠動脈内部への投与に先立って、血栓の放射活性 は２４分間に僅かに低下した。ストレプトキナーゼの冠動脈内部への投与に伴っ て、血栓の放射活性および大きさは急速に減少した。これらの結果は、冠動脈の 血栓の溶解が血栓の溶解における変化を測定することにより非侵入的に監視され 得ることを示唆している。

均等範囲 当業者は、日常的な実験以上のものを使用せずに、ここに記述された本発明の特 定の態様と均等な多くの態様を認識しあるいは確認することができる。それら浄 書（内容に変更なし） ５．ｅ　３０什　２＃　５＋　＋５＋　３０４　１９ＴＣ−抗−ブ１ル、抗イ手 トｉ！１栓とて９ｄ二糟問浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 第　４　図 インじ゛牛゛スイ木　エ７ス〔ネ゛吠像浄書（内容に変更なし） 竿　５Ｔ７Ｊ 浄書（内容に変更なし） 第　ｂ　凹 ＦＸＧＵＲＥ　７　りｍ−ｐｈｉ’ｌ；　ｃ丁浄書（内容に変更なし） ｙｆ斧　４時開 浄書（内容に変更なし） 羊　デ　凹 注入１ｔの対間 （Ｊｙｒ閏） 浄書（内容に変ｙなし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更ない ？’！−１２ロ 浄書（内容に変更なし） 手続補正書 平成　３年　６月）−６日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の段階よりなる患者の冠動脈の血栓の映像化の方法；ａ．冠動脈に血栓 をもつと疑われている患者の冠動脈に放射標識された血栓の成分に特異的なモノ クローナル抗体あるいは抗体の断片を投与し；ｂ．血栓の部位に放射標識された モノクローナル抗体あるいは抗体の断片を蓄積させ； ｃ．光学スキャニング装置により、放射標識により生じるシグナルを検出し；ｄ ．生じたシグナルを血栓の視覚映像に変換する。
2. ２．モノクローナル抗体あるいは抗体の断片がフィブリンに特異的なものである 請求項１に記載の方法。
3. ３．モノクローナル抗体あるいは抗体の断片が血小板に特異的なものである請求 項１に記載の方法。
4. ４．抗フィブリンモノクローナル抗体あるいは抗体の断片がテクネチウム−９９ ｍあるいはインジウム−１１１で標識されたものである請求項２に記載の方法。
5. ５．抗体の断片がＦａｂ′，Ｆ（ａｂ′）２あるいはＦ▼断片である請求項４に 記載の方法。
6. ６．フィブリンに特異的なモノクローナル抗体のテクネチウム−９９ｍで標識さ れたＦａｂ′断片。
7. ７．以下の段階よりなる冠動脈に血液の凝塊をもつと疑われている患者の冠動脈 の血栓の映像化の方法： ａ．直接患者の冠動脈にテクネチウム−９９ｍで放射標識された抗−フィブリン 抗体断片を注入することにより投与し；ｂ．血栓の部位に放射標識された反応性 のあるモノクローナル抗体あるいは抗体の断片を蓄積させ； ｃ．生じたシグナルをガンマカメラにより検出し；ｄ．生じたシグナルをプラー クの視覚的な映像に変換する。
8. ８．放射標識された抗フィブリンモノクローナル抗体がＧＣ４，Ｔ２Ｇ１および Ｔ２Ｇ１およびＧＣ４の断片からなるグループから選択される請求項７に記載の 方法。
9. ９．抗体の断片がＦａｂ′，Ｆ（ａｂ′）２あるいはＦ（Ｖ）断片からなるグル ープから選択される請求項８に記載の方法。
10. １０．以下の段階からなる冠動脈をもつと疑われている患者において血栓を監視 する方法： ａ．直接患者の冠動脈にテクネチウム−９９ｍで放射標識された抗−フィブリン Ｆａｂ抗体断片を注入することにより投与し；ｂ．血栓の部位に放射標識された 反応性のあるモノクローナル抗体あるいは抗体の断片を蓄積させ； ｃ．生じたシグナルを光学スキャニング装置を使用してある時間に亘って定期的 に検出し； ｄ．血栓の溶解の範囲および進行を測定するために、生じたシグナルを血栓の映 像の時間的系列に変換する。
11. １１．放射標識された抗フィブリンモノクローナル抗体がＧＣ４，Ｔ２Ｇ１およ びＴ２Ｇ１およびＧＣ４の断片からなるグループから選択される請求項１０に記 載の方法。
12. １２．抗体の断片がＦａｂ′，Ｆ（ａｂ′）２あるいはＦ（Ｖ）断片からなるグ ループから選択される請求項１１に記載の方法。
13. １３．血栓の映像化が血栓の溶解の治療とともに行われる請求項１０に記載の方 法。