JPH04501870A - 腫瘍の血管新生を抑制するための治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の分野は、腫瘍を治療するための治療薬および方法である。

発明の背景 一β溶血性ストレプトコッカス（β−ｂｅｍｏｌｙｔｉｃ　鋤ツ卦ｃｏｃｃｕｓ ）（Ｇ　Ｂ　Ｓ　）群は、広く存在する微生物である。ＧＢＳは、新生児を除く 人間に、有害な感染をもたらすものとしては知られていない、″早期発症病（ｅ ａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ　−ｄｉｓｅｉｓｅ）”とも呼ばれるＧＢＳ肺炎は、新生 児の高い罹患率および死亡率に関係している。ＧＢＳ感染は、誕生の日におこり 、とくに未熟児に頻繁に見られる。感染が年令数週間に起こり、且つ通常の肺の 発達が見られたときには、もはやＣＢＳ肺炎にはかからない。

カール・ジー・ヘラピスト（Ｃａｒｌ　Ｇ、　Ｂｅ１ｌｅｒｑｖｉｓｔ）と彼の 関係するバング−ビルト・ユニバージティー・スクール・イン・メディスン（Ｖ ａｎｄｅｒｂｉｌｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｂｏ。

Ｉ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ナッシュビｌしくＮａ５ｂｖｉｌｌｅ）、テネ シー（Ｔｔｏｎｅｓｓｅｅ）で行われている連続的な研究において、ポリサブカ ライドのＣＢＳ毒素が同定された。この毒素は、Ｂ　β溶血性ストレプトコッカ ス群によって生産され、ＧＢＳ肺炎の合併症の主要因子であると考えられる。

ＧＢＳ毒素は、ＣＢＳ培地から分離され、生成され、部分的に特徴付けられた（ ヘラピストら、ビジアトリック・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、）、１ ５巻、８９２〜８９８頁（１９８１年）；ロジャス（ｌ（ｏｊａｓ）ら、ビジア トリック・リサーチ（Ｐｅｄｉｍｔｒ、　Ｒｅｓ、）、１５巻、８９９〜９０４ 頁（１９８１年）；ロジャスら、ビジアトリック・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒ、 　Ｒｅｓ、）、１７巻、１００２〜１００８頁（１９８３年）およびヘラピスト ら、プロシーディンゲス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエン シイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ１ｔ１．＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ）、８４巻、５ １〜５５頁参照）。これらの研究において、肺に対するＣＢＳポリサッカライド 毒素の効果を試験するための実験モデルとして羊を用いた。ヒトと異なって、若 い羊に加えて成熟した羊もＧＢＳ毒素にかけた。この毒素を羊に感染させたとき 、肺高血圧症が見られ、膝皿管の浸透性が増加した。これらの変化は、Ｂストレ プトコッカス敗血症の新生児に起こるものと同様である。

ＣＢＳ毒素は、推定分子量約２０万のポリサッカライド複合体である。このポリ サッカライドは、上記のへラビストら（１９８１年）に報告されているように、 抗原基となる免疫学的な構造特性を有している。また、毒素の機能と直接的であ れ間接的であれ重要な関係があると考えられるホスホジエステル構造を含む（上 記のへラビストら、（１９８７年））。

発明の要旨 本発明は、ＧＢＳ毒素が、血管新生を阻止することよって、腫瘍を除去する治療 薬として使用できるという新規な概念に基づいている。約１　ｅｓｉ’のサイズ をこえて成長するためには、固化した腫瘍（ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒ）は、これ が拡大するように、腫瘍に血液を供給する新しい血管の形成を含む血管新生を行 わなければならない０本発明の基礎をなすことは、新しく形成される血管系は、 誕生のときの未熟児および新生児の腋芽の膝皿管系に匹敵する成長状態にあると いう認識である。このような腫瘍の血管系細胞は、ＧＢＳ毒素と相互作用できる ような状態にある。とくに、発生論的に腋芽である腫瘍の血管系の肺細胞は、Ｃ ＢＳ毒素の重要構造部位のａ脂性のレセプターをもつと考えられる。このような レセプターは、毒素が腫瘍体の血管系と相互作用し、その結果、新しく形成され た毛細管の宿主で仲介された（　ｈｏｓｔ■ｅｄｉａｔｅｄ）破壊もたらし、腫 瘍の血管系を抑制させる。この相互作用は、腫瘍の血管系の部位に特異的である 。成熟した通常の血管系、例えば膝皿管系は、もはやＣＢＳ毒素と相互作用する レセプターをもたない、さらに、この毒素を静脈内への注入によって患者に投与 しても、系統的に安全である０通常の大人は、ＣＢＳおよびこれが生産する毒素 に耐性があることが知られているが、大人へのＣＢＳの感染は、他の合併症、例 えば真性糖尿病、肝不全および悪性疾患のある種類に関連がある（アーチブス・ インターナル・メディスン（＾ｒｅｈｉｖｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ）、１４５巻、８４１〜６４５頁（１９８８年））。

本発明の方法は、最初に肺腫瘍について示しである。

しかし、腫瘍に血液を供給するための新しい毛細管を成長させる固化した腫瘍に 一般的に適用できると考えられる。とくに、この方法は、ガンおよび腺ガンに有 効であると思われる。この方法の目的は、固化した腫瘍、ガン、腺ガン、または 肺腫瘍の血管系の成長を少なくとも部分的に抑制することである。成長する腫瘍 に血液を供給するための新しい毛細管の成長を抑制することは、腫瘍の成長を阻 止することになり、固化した腫瘍を抑制するまたは撲滅するのに役立つ。

詳細な説明 本発明は、ヒト患者の成長する固化した腫瘍の治療のための治療薬として、Ｂ　 β溶血性ストレプトコッカス細菌により生産されたポリサッカライドの毒素を利 用する。この毒素（以下、ＧＢＳ毒素という）は、精製された形状で使用され、 これは、ヘラピストら、プロシーディンゲス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ −・イン・サイエンシイズ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ ＳＡ）、８４巻、５１〜５５頁に記載されているように、ポリサッカライドのポ リマーとマンノシルホスホジエステル基との複合体からなる。成長する腫瘍の血 管新生を抑制する目的のために、ＣＢＳ毒素を、抑制に有効な量を非経口的に投 与することができる０例えば、この毒素は、患者体重１ｋｇあたり１〜１０マイ クログラム（ｓｃｇ）の投与量において、水溶液として静脈内に注入することが できる。さらに具体的には、投与のビヒクルは、滅菌した通常の食塩水を含有す ることができ、さらに溶液の３０−１につき０．５〜２−１ｒの量の毒素を含有 することができる。この治療のプロトコルは、最大の効果が得られるように変化 させることができる０例えば毒素の投与は、必要に応じて繰り返す、すなわち週 を基本として繰り返すことができる。

投与量およびＧＢＳ毒素の進行は、循環する顆粒球の数を調べることにより測定 することができる。毒素が成長する腫瘍の血管系のレセプターと相互作用すると き、循環する顆粒球は影響される。治療のプロトコルは、治療された固化した腫 瘍の種類によって変化する。この見地をもとにして、この方法は、人間すべての 部分の固化した腫瘍、とくにガンまたは腺ガーンとして分類される腫瘍に適用で きる。効果の程度は、成育する腫瘍の血管系が、ＣＢＳ毒素のレセプターをどの 程度提供するかに依存する。肺腫瘍の血管系は、このようなレセプターをもつこ とが見いだされた。さらに、人間の大細胞（ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ）および小細 胞（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ）のガンの分析によって、これらの腫瘍気団の血管系 の部位と結合するＣＢＳ毒素が示された。さらに、本発明に導くマウスの研究に おいて使用されたヒト大細胞の腺ガンは、ヒト胸部の腺ガンに単一特異的な抗体 により免疫学的に同定された。確かに示されたわけではないが、一般に、成長す る固化した腫瘍の血管系は、少なくともいくつかのＧＢＳ毒素と結合する部位を 提供し、従って本発明の方法は、血管系の成長の少なくとも部分的な阻止を得る ために使用され得る。

腫瘍における成長する毛細管と毒素のレセプターとの相互作用は、顆粒球の減少 を導き、続いて顆粒球から酵素のエラスターゼが放出されると考えられる。減少 したエラスターゼが減少することは、ラジオイムノアッセイによってモニターす ることができ、これは、治療のモニターの他の手段として役立つ、さらに、顆粒 球により誘発された酸化損傷は、血漿中の共役ジエン類を測定することによりモ ニターすることができる。

本発明方法に用いるＧＢＳ毒素は、新生児に最近感染したまたは感染することの できるＢ　β溶血性ストレプトコッカス細菌群の菌株を培養することにより得ら れる。

従って、このような菌株の分離物は、ＣＢＳ肺炎に感染し、その症状をもつ新生 児の血液から得られる。連続的に試験管内で培養することにより維持されたＧＢ Ｓ菌株は、ＧＢＳ毒素の源として適切ではない、培地において生産された炭水化 物は、腋芽の肺１１１！胞のレセプターと相互作用するホスホジエステル残基で あると考えられるその特異的な構造特性におい不完全である。適当なポリサッカ ライド成分は、羊において試験することにより決定される。このことは、ヘラピ ストら、ビジアトリック・リサーチ、１５巻、８９２〜８９８頁（１９８１年） ；ロジャスら、ビジアトリック・リサーチ、１５巻、８９９〜９０４頁（１９８ １年）に記載されている。羊の肺での毒素の作用は、＃動脈の圧力を増加させる ことにより、また、膝皿管の浸透性を増加させることにより、肺高血圧症を増加 させることである。

ＧＢＳ毒素がレセプターと相互作用する能力は、ＧＢＳ菌株の生体内の通過によ り高めることができる。ｇ４えば、マウスま、たはうさぎは、腹腔内の注入によ り接種され得る。マウスまたはうさぎが明らかに病気となっ後、これらを層殺し 、肺臓を切除し、次のマウスまたはうさぎへの注入のために、切除した肺臓から ＣＢＳ培養物を回収する。多段階の生体内の通過が好ましく、例えばマウスを５ 回通過させるのがよい、この手順は、上記で引用したヘラピストら（１９８７年 ）に詳細に記載されている。

非常によく相互作用するＧＢＳ毒素の形状を生産するＣＢＳ菌株を使用するため に、この菌株は、培地においてＣＢＳ毒素を生産するように、試験管内で大きい スケールで培養することができる。このような培養を行うための手順の詳細は、 上記で引用したヘラピストら（１９８７年）に記載されている０例えば、上記で 引用したヘラピストら（１９８１年）に記載されているように、菌株を、トッド ヘラ４　”ｔドブロス（Ｔｏｄｄ　１１ｅｓ＋ｉｔｔ　Ｂｒｏｔｈ）を用いて３ ５℃で１８時間培培養ることができる。ｉｋ初の培養は、大きいバッチによって 接種物を生産するために用いることができる。これは、トッドヘライツトプロス で行うことができ、回転シェーカーの接種フラスコを用いて２５〜３７℃で２４ 〜４８時間インキ互ベートする。

ＧＢＳの培養の後、細患をＣＢＳ毒素を含む上清から分離する。好適な回収の手 順は、上記で引用したヘラピストら（１９８１，１９８７年）に記載されている 。その概要は、培養の後、上清をオートクレーブにかけ、エタノールを７０％の 濃度になるように加える。得られた沈殿物は、ガラノス（にａｌａｎｏｓ）ら、 ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｅ＋、）　９巻、２４５〜２４９頁（１９６９年）に記載されている手 順に従って、水性フェノール抽出にかけることができる０例えば、上記で引用し たヘラピストら（１９８１年）に記載されているように、抽出は、７０℃までの 温度で３０分間ゆっくりと加熱するような上昇する温度で、エタノール沈殿に適 用される同じ部の水とフェノールからなる抽出溶媒で行うことができる。抽出の 水相は、上記で引用したヘラピストら（１９８７年）に記載されているように、 水で透析し、且つゲルー過で精製することができる０代わりに、高分子量の形状 のＧＢＳ毒素（上記で引用したヘラピストら（１９８１年））は、フェノール、 水抽出手順を省略して、カラムクロマトゲラフイー手順（上記で引用したヘラピ ストら（１９８１年））によって、付随した沈殿物から回収される。さらに、Ｇ ＢＳ毒素は、細菌メンプランフラクションのプロテアーゼ消化の後、得ることも できる（ヘラピストら、未公表）。

腫瘍の成長抑制剤としての分離されたＧＢＳ毒素の有効性は、抗ＧＢＳ毒素Ｉｇ Ｇを用いる腫瘍組織標本のパーオキシダーゼ−抗パーオキシダーゼ（Ｐ　Ａ　Ｐ 　）検定により、および２μｇ、１〇−目モル／ｋｇで羊モデルに注入すること により（上記で引用したヘラピストら（１９８１年）（１９８７年））、確認す ることができる０本発明の目的のために、ＧＢＳ毒素という術語は、天然のすべ てのＧＢＳ毒素画分、あるいは溶解したＧＢＳ細菌の培地またはプロテアーゼ消 化から生産されたものを意味し、この毒性は、前記の特別な測定手段のいずれか によって、確認することができる。ＣＢＳ毒素は、レンチルレクチン（ｌｅｎｔ ｉｌ　Ｉｅｃｔｉｎ）で分画できる。最も有効なＣＢＳ毒素画分は、設置された レンチルレクチンカラムを連続的に２つ通過する。羊モデルにおいて低い特異的 な毒性活性のＣＢＳ毒素画分は、ａ−メチル−マンノサイドをもつレンチルレク チンカラムから浸出され得る（ヘラピストら（１９７１年）反応量図３参照）、 このことは、マンノシルホスフェート基での置換の増加したレベルは、毒性の有 効性を増加させるが、レンチルレクチン親和性を減少させることを示している。

最も有効性のある毒素の形状は、推定分子量約２０万を有し、明らかにラムノー ス、マンノース、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチル−グルコサミンおよ びＮ−７セチルガラクトサミンから構成され、そのモル比が、それぞれおよそ２ ：２：３：１：２：ｌであるものである。

本発明方法を、以下の実験実施例によってさらに説明する。

実施例Ｉ 精製したＧＢＳ毒素は、以下の手順によって調製された。

Ｂ５ １１五五Ｉ トッドヘライツトブロス（Ｔ）（Ｂ）１０鋤ｌに、罹患した新生児からの分離物 から得られた凍結保存した培養物を接種し、９〜１２時間インキュベートした。

このようにして得られた培養物は、上昇したプラスミド含量およびＧＢＳ毒素生 産能力のある培養物を得ることを目的とする以下に記載の手順の接種物として使 用された。

１星よ 培養物の１−１を、マウスの腹腔の孔に無菌的に注入した。ヘラピストら（１９ ８７年）０敗血症の動物を層殺し、肺臓を取り出した。羊血液寒天（ＳＢＡ）プ レートは、肺臓によって“汚染（ｅｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ）”され、プレート を白金耳で画線して単一のコロニーを得た。膵臓をトッドヘライツトブロスの１ ０−１中におき、この培養物は、第２のマウスを通過させるために使用され、β −溶血性ストレプトコッカス以外のコロニーが見られないＳＢＡプレートが得ら れた。５回の通過および任意のその後の通過によって、１５１のトッドヘライツ トブロスのバッチに、肺臓培養物由来の１０１の細菌を接種し、回転シェーカー で３７℃、４２時間インキュベートした。

１星１ ヒトまたは他の標本からの、血清を追加したＴＨＢが接種され、得られた培養物 は、連続的なマウスの通過の代わりとなるような、連続的な通過を行って用いら れた。

５回またはそれ以上の２次培養により、細菌は、Ｔ）ＩＢまたは血清およびグル コースを追加したＴＨＢの大きなバッチにおいて成長された。

ａＪＬ豊１ インキュベートが完了した後、各フラスコから一定量抜出し、以下の接種プレー トに用いた：ａ）サバロード・デキストロース・アガー（ＳｉｂａｒａｕｄＤｅ ｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ）（Ｓ　Ｄ　Ａ　）を２ケ、ｂ）エオシン−メチレンブ ルー（Ｅｏｓｉｎ　Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｂｌｕｅ）（ＥＭＢ）、 ｃ））リプチカーゼ・ソイ・アガー（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ＾＠ａｒ） （Ｔ　Ｓ　Ａ　）、 ｄ）ＳＢＡ。

このフラスコをオートクレーブにがけ、すべてのプレートが以下のことを示さな くなるのに十分な時間、３８時間、４℃で貯蔵した： １）３７℃でインキュベートされたＳＤＡグレートに１ケおよび室温のもの１ケ に、酵母およびカビ、２）ＥＭＢプレート上にグラム陰性菌の汚染。

確認可能なプレートの組および滅菌した標準品を使用し、これらがカラムクロマ トグラフィーのベッドまたは精製手順の間、透析袋にいかなる微生物も成長が起 こらないことを確認した。

ＴＨＢ ＴＨＢ培地を、血清およびグルコース２ｇ／ｌ追加して使用した。製造会社が培 地の各ロフトに、記録しないまま酵母エキスを加えているかどうかという問題を 解決するために、培地のバッチを、分子量１万以上を遮断するフィルターカセッ ト（ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）でｒ通することができる。もし、枦遇 していない培地を使用するならば、できる限り酵母マナナス（ｙｅａｓｔ　ａａ ｎａｎａｓ）を最も容易なレクチンクロマトグラフィーによって取り除かなけれ ばならない。

ＧＢＳの 続く手順は、我々のオリジナルである（ヘラピストら、ビジアトリック・リサー チ、１５巻、８９２〜８９８頁（１９８１年））、いかなる微生物の汚染のない ことが決定された、オートクレーブにかけた培養物の上清またはメンプラン１０ テアーゼ消化物を、７０％のエタノール濃度にすることにより沈殿させ、且つ２ 回フェノール水抽出を行った（ガラノース（にａｌｌａｎｏｓｅ）ら（１９６９ 年））、水相を水に対して透析することにより集め、続いてＤＥ５２クロマトグ ラフィーを行った。水中のＧＢＳ毒素は、ＤＥ５２に結合し且つヘラピストら（ １９８７年）による０〜０．４ＭのＮｉＣｌの傾斜溶出を適用すると、約０．２ ５ＭのＮａＣｌで溶出する。光学的旋光およびフェノール硫酸比色検出法により 両分をモニターした。続いて、セファシル（Ｓｅｐｈｉｅｅｌ）Ｓ　−３００を 用いるゲルＰ通によってＧＢＳ毒素を回収し、これはカラムにわずかに含まれる ものを溶出する。透析および凍結乾燥の後、ＧＢＳ毒素をりん酸でＭｗされた食 塩水（ＰＢＳ）で展開するレンチルレクチンアフィニティーカラムで２次分画す る。セファシルカラムから出たＣＢＳ毒素（２〜５−ｇ）をＰＢＳ（０，５ｍ１ ）に溶解し、レンチルレクチンカラム（ＩＸ５ｃｍ）に適用した。

２倍のカラム容量において溶出するカラムに保持されない物質（ＧＢＳ毒素ＬＬ ）を透析し、凍結乾燥し、再生したレンチルレクチンカラムに再度適用した。ピ ークによって流れをＧＢＳ毒素ＬＬＩとして集め、１．５倍のカラム容量の範囲 で溶出する部分的に保持された画分をＧＢＳ毒素ＬＬ２として集めた。酵母マナ ナスはこの調製を汚染してしまうので、もし−過していないＴＨＢ培地を使用す るならばこの手順は必要である。

予め濾過しであるＴＨＢを使用することを薦める。このことを薦める理由として は、ＣＢＳ毒素自身が、ａ−メチルマンノサイドで溶出するためのレンチルレク チンとの十分な親和性をもつ構造特性を有することである。

しかし、これらのＧＢＳ＠素の画分は、羊モデルに注入したとき、ＣＢＳ毒素Ｌ ＬＩまたはＬＬ２のいずれか１つよりも少ない特異的活性を示す。

ＧＢＳ　ＬＬ　お　ＬＬ２の ＧＢＳ毒素ＬＬ１およびＬＬ２は、単離された最も有効性のある病体生理学的反 応モディファイヤーであり、羊モデルにおいて、一般的な投与量の１／６０また は１０目／ｋｇの投与量で活性を示し、ポリサッカライドを含みさらにホスホジ エステルも含む特徴的なシグナルをもつことを実質上確認できるＩ″ＮＭＲＮＭ Ｒスペクトル（ヘラピストら（１９８７年））、糖類の分析を行ったところ、最 も有効性のあるＣＢＳ毒素を構成するポリサッカライドは、表１に示す組成を有 する。

表１：ＧＢＳＩ素ＬＬＩおよびＬＬ２の糖類の組成Ｎ−アセチル−グルコサミン 　２９，５Ｎ−アセチル−ガラクトサミン　９．７実施例■ 実施例Ｉに記載したように調製したＣＢＳ毒素の効果を、ヌードマウスにおいて 繁殖したヒト大細胞の腺ガンの成長割合について研究した。ＧＢＳ毒素ＬＬ１の 精製した画分を使用し、これは、実施例Ｉに記載したように調製した。

実験 １農１ １．４の比較ＤＮＡインデックス（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　１ｎｄｅｘ）を もつヒト肺大細胞腺ガン（ＢＲＸ　Ｌｕ　４）は、１０％子牛脂児血清を追加し たＲＰＭ１１６４０において成長した組織培養において得られた。培養物の細胞 は、軟らかい寒天中においてコロノジェニツク（ｃｏｌｏｎｏ［ｒｅｎｉｅ）で あり、比較ＤＮＡインデックスを１．４とした。化学的免疫細胞学的な特徴は、 細胞ケラチンへの有効性を示し、且つ胸部を源とした腺ガンの大細胞に対して向 かう２つのモノクローナル抗体の２つと交差反応した。

１１座１１ 腫瘍の接種物は、組織培養皿上で９０％の集合率に成長した細胞から調製された 。りんａ緩衝食塩水中（ＰＢＳ）で懸濁された１０７個の細胞を、２２匹のヌー ドマウスのそれぞれに、腹部の経路から皮下に個々のシリンジで注入した。１０ 日後、腫瘍のサイズの平均は、１００十１２ｍｍ’に達し、動物は、無作為抽出 したサイズの腫瘍をもつ７．７および８個体の３つのグループに分割された。７ 個体の腫瘍のない動物の４番目のグループを対照グループとした。

ＧＢＳの ポリサッカライド毒素（ＬＬ画分）を、それぞれ１注人中０．２５および２．５ ピコモルに対応する２μｓ／　ｋｇおよび２０Ｍｇ／ｋｇの接種となるような濃 度においてＰＢＳ中に溶解することにより、接種物を調製した。１注人中２０μ ｇ／ｋｇまたは７ピコモルで、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）　７０　（ファ ルマシア（Ｐｂａｒｍａｅｉａ）、アップサラ（Ｕｐｐｓａｌｍ）、スウェーデ ン）を対照として用いた。

良友１抹 グループ１〜３は、腫瘍を有するもの、および４は。

腫瘍のないものの４つのグループにおけるマウスに、ＰＢＳの１００μｌを静脈 末端から静脈内に注入した。これは、グループ１およびグループ４には２．５ピ コモルのＧＢＳ毒素、グループ２には０．２５ピコモルのＧＢＳ毒素、グループ ３にはデキストランの７ピコモルを含むＰＢＳを注入した。注入は、月曜日、水 曜日および金曜日に行い、各注入口に、腫瘍の容量を、高さ、幅および長さの測 定値から計算した。

結果 グループ４は、２０μｇ／ｋｇでのＧＢＳ毒素が、体重の増加に影響を及ぼさず 、動物は、毒性の徴候を示さなかった。４ｍｇ／ｋｇの投与量は、以前にヘラピ ストら（１９８１年）が、鉛に敏感な動物に使用したが、明白な影響は及ぼさな かった。予備的な組織学的な試験は、腫、肝臓、腎臓、肺臓または脳のいずれか に明白な組織の損傷がないことを明らかにした。異なるグループの腫瘍の成長は 、異なる割合で起こった。動物の屠殺時の腫瘍の予備的試験は、ＣＢＳ毒素を２ ０μｓ／ｋｇを受け入れたグループ１の７個体の動物の内、６個体において、腫 瘍部分の半分よりも多くに出血および壊死が見られたことを示した。

このような損傷は、等しいモル濃度でデキストランを受け入れたグループにおい ては明らかに見られなかった。

２μｓ／ｋｇを受け入れたグループは、中間の組織学的な容体を示した。

得られたデータは、ＧＢＳ毒素が治療の最初の６日間をこえて腫瘍の成長割合を 等しく有効に減少させ、且つ続く８日問をこえて、グループ１の成長割合は遅い 割合で残った。グループ２の成長は、デキストランを受け入れたグループ３に見 られる割合の傾向のように上昇した。

試験の終わりでの腫瘍のサイズの平均は（＋は平均の標準偏差）、 グループ１ ２．５ピコモルＣＢＳ毒素／１注入　４２２＋６８ｐ＜０．００５ グループ２ ０．２５ピコモルＧＢＳ毒素／１注入　５５０＋７１７．０ピコモルデキストラ ン／１注入　７３１＋１３体重増加における有意差の変化は、２．５ピコモルの ＧＢＳ毒素／１注入を受け入れた腫瘍発生と非腫瘍発生との間、あるいはいかな るグループ間でも見られなかった。

検討 このデータは、投与量に依存した関係で、ＧＢＳ毒素が単独で、２０μｇまたは ２．５ピコモル／ｋｇの投与量ではデキストランよりもおよそ４５％まで、およ び２μｇまたは０．２５ピコモル／１注大の投与量では２５％までヒト鳳瘍細砲 の成長割合を減少させることを示している。羊モデルにおいて、１μｇ／ｋｇで のＧＢＳ毒素は、激しい呼吸困難を誘発し、これは、マクロファージＢおよびＴ リンパ球および顆粒球を伴う全炎症性および免疫学的反応によるものであると考 えられる。ここで選ばれたマウスのモデルにはＴ細胞がなく、従ってまたＴ細胞 に依存１−たＢ細胞の反応がないので、このようなことは、毛細管内皮上の作用 によって、おそらく腫瘍の成長の抑圧遺伝子としての薬剤活性としてＧＢＳ毒素 の価値を示している。Ｗ瘍の発生した通常の個体において、この作用は、血管の 破壊、続いて腫瘍の壊死を導くと仮定される。羊の肺およびヒト腫瘍組織で、Ｇ ＢＳ毒素および抗ＧＢＳ毒素ＩｇＧおよび対照ＩｇＧでおこなった組織化学的研 究は、この仮定を確証させるものである。

ＧＢＳ！！素が異なるヒト腫瘍組織の毛細管と特異的な結合を示し、且つ免疫欠 損動物モデルにおいて、ヒト腫瘍の成長割合を指数的に減少させるという事実は 、ＣＢＳ毒素に冒された羊の肺およびヒト新生児の＃または早期発症病において それぞれ見られるものと同様な病体生理学を導入することにより、ＧＢＳ毒素が ヒト腫瘍の血管新生を阻止し、従って、これらの成長を抑制することを示してい る。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト患者の成長した固化した腫瘍の血管新生を少なくとも部分的に抑制する 方法であって、ＧＢＳ毒素として知られるＢβ溶血性ストレプトコツカス細菌に より生産されたポリサッカライド毒素を患者に非経口的に投与することを包含し 、該ＧＢＳ毒素は、精製され、毒性活性を示す形状であり、且つ該ＧＢＳ毒素が 該抑制のために有効な量で投与される、ヒト患者の成長した固化した腫瘍の血管 新生を少なくとも部分的に抑制する方法。
2. ２．腫瘍が、血管新生に関し且つ依存するガンである、請求項１に記載の方法。
3. ３．腫瘍が、血管新生に関し且つ依存する腺ガンである、請求項１に記載の方法 。
4. ４．ＧＢＳ毒素が、該毒素の水溶液の状態で静脈内に注入されることにより、非 経口的に投与される、請求項１または２に記載の方法。
5. ５．ＧＢＳ毒素が、ヒト患者の体重の１ｋｇあたり、１〜１０μｇに対応する投 与量において非経口的に投与される、請求項１または２に記載の方法。
6. ６．腫瘍が、成長する血管系をもつ肺腫瘍である、請求項１に記載の方法。
7. ７．ＧＢＳ毒素として知られるＢβ溶血性ストレプトコッカス細菌群により生産 されたポリサッカライド毒素の水溶液を患者の静脈内に注入することを包含し、 該ＧＢＳ毒素は、精製され、毒性活性を示す形状であり、且つ該ＧＢＳ毒素が該 患者の体重１ｋｇあたり該毒素を１〜１０μｇの有効な投与量において投与され る、成長するガンまたは腺ガンによる血管新生を抑制する方法。
8. ８．ＧＢＳ毒素として知られるＢβ溶血性ストレプトコツカス細菌群により生産 されたポリサッカライド毒素の水溶液を患者の静脈内に注入することを包含し、 該ＧＢＳ毒素は、精製され、毒性活性を示す形状であり、且つ該ＧＢＳ毒素が誠 患者の体重１ｋｇあたり該毒素を１〜１０μｇの有効な投与量において投与され る、成長する肺腫瘍の血管新生を抑制する方法。
9. ９．成長する固化した腫瘍の血管新生を抑制するための治療薬としての、精製さ れ、毒性活性を示す形状であるＢβ溶血性ストレプトコッカス細菌群により生産 されたポリサッカライドＧＢＳ毒素の使用。
10. １０．血管新生に関係し且つ依存するガンの血管新生を抑制するために使用され る、請求項９のＧＢＳ毒素の治療的な使用。
11. １１．血管新生に関係し且つ依存する腺ガンの血管新生を抑制するために使用さ れる、請求項９のＧＢＳ毒素の治療的な使用。
12. １２．ＧＢＳ毒素が、該毒素の減菌された水溶液を含む非経口的に投与できる形 状である、請求項９ないし１１のいずれか１項に記載のＧＢＳ毒素を使用するこ と。