JPH04501951A - 網膜芽腫診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

網膜芽ＩＦ！診断剤 発明の背景 本出願は１９８６年８月１１日出Ｈ（ＵＳＳＮ８９５゜１６３ドライジヤ、ＤＲ ＹＪＡ）の一部係虜出願における１９８８年１月２１日出１ｆＭ（ＵＳＳＮ１４ ６．５２５ドライジヤエトアル　ＤＲＹＪＡ　ｅｔ　ａｌ、）の一部係属出願で ある。両出願は参考文献として木明柚書中に含まれている。 本発明は網膜芽腫遺伝子に関するものであり、欠ｌｉｔ網躾遺伝子に苦しむ患者 の発見及び治療に関する方法である。 網膜芽腫とは網膜細胞が腫瘍になった状態を指し、０才から４才迄の了（！（に のみ見られる病気である。合衆国では新生児の内、３万４千人に１人から１万５ 千人に１人の割合テｗｒＪＩＦ！Ｊ芽腫ニ侵されティる（Ｌ、Ｅ、ＺＩＭＭＥＲ ＭＡＮ、１９８５．網膜芽腫及び網膜細口、Ｗ。 Ｈ，５ＰＥＮＣＥＲ，ｌｌＴｌ科病理学　アトラス　アントチ　キスドブツク出 版、！Ｊ２巻、フィラデルフィア、Ｗ。 Ｂ、５ＡＬＩＮＥＲＳ　Ｃｏ、、ｐｐ、１２９２−１３５１、）。木病気が治療 されない場合、眼球内ｌ！１！病の悪性！１１瘍紹１胞は、生体内の別の場所に 転移し、もはや制御することができないほど病巣が発達することとなり、これが 致命傷となる。眼球内の肝癌が大きい場合の現在行われているｍ膜芽腫の治療方 法というものは、病気に侵された眼球を摘出することである。また、腫瘍の大き さが小さい場合には、放射線療法、レーザ療法あるいは冷凍療法が好んで用いら れる。しかし、現在このような転移した網膜芽腫に対する効果的な治療方法とい うものはまだ確立されていない。一般的な癌治療の場合と同じように、病気進行 の初期の段階において診断を行えば、罹病率と死亡率は療法とも減少することが できる。 網膜芽腫の病例の内３０−４０％においては、病気にかかった患者は、網膜芽腫 の遺伝性素因を保有しており、患者の子孫に優勢的な特徴として伝えてい＜　（ Ａ、　Ｇ。 ＫＮＵＤＳＯＮ、１９７１．突然変異と腫瘍：網膜芽腫の統計的研究、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、、Ｖｏ　１．６８．　ｐｐ、８２０−２３） 、このような網膜芽腫素因の特性を保有する者は、原始的な腫瘍が様々な形態の 腫瘍へと発達するきわめて高い危険性に晒されている。特に、悪名高いものとし ては、骨肉腫及び軟度肉腫等に発達する可能性がある。 血統的な網膜芽腫と関連する遺伝子因子座は、人間染色体のｑ１４バンドに割り 当てられている（Ｒ，Ｓ、５ＰＡＲＫＥＳ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０．５ｃｉｅ ｎｃｅ、Ｖｏｌ、２０８．　ｐｐ、１０４２−４４）、多くの場合、網膜芽腫は 網膜芽腫遺子座に正常で優勢の同族対立遺伝子が欠落している細胞から発生する 。しかし、１つの欠損対立遺伝子を保有する子供（個体）は病気に罹り易い。片 目を網膜芽腫に侵された子供あるいは網膜芽腫に罹った患者と血縁関係にある子 供は、遺伝的にいって病気に罹り昌く、従って病気が悪化しゃすい危険性を持っ ている。このような病気に侵された個体は、通常２〜３月毎に麻酔状態で行わな くてはならない癌検診法で検査される。 発明の要約 本発明は、精製された核酸（１００ｋｂ以下の大きさ）及び一部が少なくとも１ ５塩基から構成される核酸であり、Ｒｂ遺伝子をコード化するものである。本発 明はまた前記核酸とともに変換され、また前記核酸からコード化されたポリペプ チドが遊離されている細胞と前記ポリペプチド若しくは自然発生した網膜芽腫ポ リペプチドに対する抗体に関するものである。網膜芽腫ポリペプチドとは、Ｒｂ 遺伝子によってコード化されたポリペプチドのことである。さらに。本発明は欠 ｆｊｌＲｂ遺伝子を持った患者の治療を行うのに適しており、網膜芽腫ポリペプ チドを含む組成に関するものである。又はその組成の一部が素因保有者にとって 薬学的に受容可能である組成に関するものである。 本発明は、さらに網膜芽腫が発達する危険性がなく、従来行われていた検査方法 を必要としない患者を決定するために患者を選別する方法である。本選別方法で は、例えば患者の核酸と、人間Ｒｈ遺伝子をコード化する精製された核酸とを比 較するもの、若しくは患者の核酸と精製された核酸の一部との比較を行うもので ある。 このように、本発明は患者が網膜芽腫素因を持っているか否かを分析する方法を 特徴として備えており、その方法とは網膜芽腫遺伝子内の大小のサイズの欠損若 しくは部分的突然変異を、あるいは特定ＲＦＬＰ　（ｒｅｓ　ｔｒｆｃｔｉｏｎ 　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）と結び付い ている欠損の共同遺伝を、またあるいは網膜芽腫遺伝子用検査で患者から取り出 した核酸サンプルを異種混合（ｈｙｂｒｉｄｓ）することにより正常又は欠損網 膜芽腫の存在を検知するものであり、また、前記核酸サンプルを異種混合する検 査物（プローブ、ｐｒｏｂｅ）の精度を決定するものである。核酸へ異種混合す ることがてきないということは、遺伝子内に大規模な欠損が存在することである 。網膜芽腫遺伝子用検査物は次のように異種混合されたものである。すなわち、 特定された物理的特性によって患者のサンプルから分離されたフラグメント、検 査から得られた異種混合物及び検知されたフラグメント、検査における異種混合 過程で検出された異種混合物と比較対象され、また正常網膜芽腫遺伝子と核酸フ ラグメントとを切り離して得られた異種混合物である。 正常患者に比べ規模が小さい異種混合物（ｈｙｂｒｉｄｓ）が存在するか否かで 患者の網膜芽腫遺伝子内に大規模な欠損があるか否かが判別される。網膜芽腫遺 伝子用プローブは、ｐ４．７ＲでクローンされたＤＮＡ若しくはこのクローンさ れたＤＮＡのフラグメントが好ましく、特定の物理的特性とは分子量である。 小ｉｔｓ欠損部分突然変異というのは、次のような方法により検出可能である。 すなわち、患者から取り出した網膜芽腫対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）のヌクレオ チド連続体−、’５ｅｑｕｅｎｃｅ）を判断すること、また前記ヌクレオチド連 続体と網膜芽腫に感染していない人から取り出した網膜芽腫対立遺伝子のヌクレ オチド連続体若しくはその並置とを比較すること、またあるいは患者から得られ た核酸サンプルと網膜芽腫に感染していない人から得られた網膜芽腫遺伝子用プ ローブ間のずれを検出することにより検知できる。特定遺伝多形体と網膜芽腫遺 伝子とが共同遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）した場合には、患者は網膜 芽腫の素因を備えている可能性が高いといえる。本方法によれば、核酸フラグメ ントは患者から得られたサンプルから精製され、そのフラグメントの持つ特定の 物理特性（分子量）に応じて分離されるものであり、網膜芽腫遺伝子に用いられ る検知可能なプローブは前記フラグメントの形に異種混合されたものであり、前 記プローブの異種混合物と前記フラグメントは検出されるものであり、また前記 異種混合物は同一のプローブの異種混合過程で検知された異種混合物と比較され るものであり、患者の両親から得たサンプルと核酸フラグメントとを切り離して 得られたものである。 本発明の他の特徴は、欠損Ｒｂ対立遺伝子を備えていると判断された患者の治療 に用いられるＲｂポリペプチドを合成するために、正常な人間の網膜芽腫遺伝子 から分離して得られた物質を使用することにある。 本発明のさらに他の特徴は、網膜芽腫ポリペプチドに対する抗体を精製し、前記 抗体と腫瘍サンプルを接触させ、網膜芽腫ポリペプチドの腫瘍サンプル内での存 在を示す識別として突然変異複合体（ｃ　ｏｍｐ　ｌ　ｅ　ｘ）を検知すること により、患者から得られた腫瘍サンプル内に網膜芽腫ポリペプチドがあることを 検知することにある。 ポリペプチドが存在するということは、網膜芽腫対立遺伝子内の欠損−こよって 腫瘍が発生しているということを示している。本方法においては、網膜芽腫ポリ ペプチドあるいはそのフラグメントと特に結び付きの強い抗体（すなわち単クロ ーン抗体）と患者から得られた腫瘍サンプルとを接触させ、また皮膚標本の細胞 と抗体が結び付くか否かを判定する。突然変異複合体が存在しないということは 、欠損網膜芽腫遺伝子により腫瘍が生じたということを示している。 本発明の特徴及び作用は、以下に続く本明細書の好適な実施例及び請求の範囲か ら明らかである。 好適な実施例の説明 本発明の好適な実施例の説明は、以下にあげる図面の簡単な説明に続くものであ る。 図面 第１図はクローンｐ４．７Ｒ，内におけるインサートされた制限マツプの概略図 である。 第２図は網膜芽腫遺伝子のゲノミック（ｇ　ｅ　ｎ　ｏｎ　ｉＣ）因子塵の制限 マツプの概略図である。 第３図は本願（７）ｐ２ＡＲ３，８及びｐ２ＡＲ０，９ベクトルの概略図である 。 第４図は正常網膜芽腫遺伝子のスケールマツプである。 第５図（５−１〜５−３）は側面領域（フランキングリージョンズ）を備える正 常網膜芽腫遺伝子のｃ　ＤＮへの核酸連続体（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す。 第６図（６−１〜６−９）は側面領域を備える正常網膜芽腫遺伝子のエクソン（ ｅ　ｘ　ｏ　ｎ）の核酸連続体を示す。 第７図はＤＳＰの配置を示す網膜芽腫遺伝子の制限マツプである。 第８図はゲル及び網膜芽腫ブローン（−ｐｒｏｎｅ）ファミリー内の多形体ＲＢ １．３の遺伝形質を示すダイアグラムである。 第９図は遺伝双網膜芽腫を持つ３フアミリー内のＤＳＰＲ８１，３の分離状況を 示すダイアグラムである。 網膜芽腫ポリペプチド Ｒｂポリペプチドは、正常網膜芽腫遺伝子の核酸連続体によってコード化された 特定アミノ酸連鎖である。本発明のＲｂポリペプチドは次の組成物を含む。（１ ）自然発生する網膜芽腫タンパク質（２）合成された網膜芽腫ポリペプチド（３ ）生体外形質発現システムを経て精製された核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノミッ クＤＮＡ）から製造された網膜芽腫ポリペプチド。さらにま、た、自然発生する Ｒｂポリペプチドの生物学的活性又は本ポリペプチドのエピトープ（抗原決定基 ）を含むＲｈポリペプチドの生物学的活性フラグメントが含まれており、このた めＲｂ＊定抗体の生産に適している。 網膜芽腫遺伝子 Ｒｂ遺伝子は人間ゲノーム内の特定核酸連続体であり、Ｒｂ遺伝子の欠損若しく は突然変異が起こると網膜芽腫が発生する。網膜芽腫遺伝子をコード化する精製 核酸は細胞内に蓄積されるベクトル方向に伝搬されるのである。 遺伝子をコード課する精製された核酸を複合形成土塊かにおいてに網膜芽腫遺伝 子を複合形成する自然環境から遊離された核酸として定義することにある。網膜 芽腫をコード化しベクトル方向へ電波される精製された核酸のもう一つの例とし てはｃＤＮＡクローンｐ４，７ｒがあるこのクローンは次のような方法によって 精製することが可能である。 　ＤＮＡ 人間染色体１３λフアジーライブラリイから分離された人間ＤＮＡプローブｐｈ ３−８、（Ｍ、ＬＡＬＡＮＤＥＥＴ　ＡＬｏ、１９８４．×××遺伝子、細胞遺 伝子、、、ＶＯＬ、、１３．ｐｐ、、２８３−９５）Ｈ３−８連続体を・取り囲 む３０にペーシイーズ（ＫＩ　ＬＯＢＡＳＥＳ）のケノムＤＮＡを分離しまたそ の地図を作成するために作成する染色体移動技術に使用されている。この技術に よって作り出されまたｐ７Ｈ３０，７ｒを預けられたフラグメントは人間染色体 １３内におけるフラグメントと動揺にマウスゲノウム内のＤＮＡ連続体を見付は 出すということが発見されている。（Ｔ、Ｐ、　ＤＲＹＪＡ　ＥＴ　ＡＬ、、１ ９８６．ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ。 ＡＣＡＤ、　ＳＣ１，ＵＳＡ、ＶＯＬ、８３．ｐｐ。 ７３９１−９４）人間とマウスＢＮＬの両方に対するｐ７Ｈ３０−７Ｒの騒動関 係からｐ７Ｈ３０ピリオド７Ｒは構造遺伝子のコード化連続体を含んでいること が分かる この可能性を試すためにｐ７Ｈ３０，７Ｒは放射性同位元素を使って識別され３ つの脳幕芽腫腫瘍から遊離された北側ＲＮＡのプロット（ＢＬＯＴ）及びアトロ ウィルス１２変形胎児網膜細胞列を突き止めるために使用されている。（ＶＡＥ ＳＳＥＮ　、ｅｔ　ａｌ、、　１９８６、　ＥＭＢＯＪＯＵＲＮＡＬ、ＶＯＬ、 　５゜ｐ　ｐ、　３３５−）前記ｐ７Ｈ３０，，７Ｒプローブは網膜細胞列から およそ４．７ｋｂをＲＮＡ遺伝子情報引き写しに関し複合形成を行ってきたが３ つの主要サンプルから見られるＲＮＡ引き写し情報に関しては複合形成を行って いない。 したがってアデノウィルス変形型網膜細胞列から分離されたＲＮＡはｃＤＮＡラ イブラリィを建設するために使用された。このライブラリィはｐ７Ｈ３０，７Ｒ とラベル付けされたプローブから遮断されている。ｃＤＮＡクローンの中には類 似した制限マツプを持つクローンから分離されている。ｐ４．７Ｒの持つとも長 い者は４゜７ｋｂのｄｎａを含んでいる。 クローンｂ４，７Ｒにインサートされている制限マツプは一図に示す通りである 。 ｐ４．７Ｒクローンは４つの網膜芽腫、骨肉腫、アデノウィルス変形型脳膜細胞 から分離されたＲ　Ｎ　Ａ遺伝情報を遮蔽するために使用されている。分離され たＲＮＡを北部ブ冒・ソトを分析する際においてｐ４．７Ｒプローブは網膜芽腫 及び−・つの同肉腫細胞ナンブルの中には存在しない変形された網膜細胞内の４ ．７ｋｂ引き写

【７情報と交差は反応を起こしている。 ゲノムＤＮＡ 脳膜芽腫遺伝−心を含むゲノミックＩ）　Ｎ　Ａを内在させているクローンは以 下に説明する方法で分離することが−Ｃきる。人間ゲノミックＤＮＡブラグメン トを念、７．ｙｘｘファジィクローニングベクターＥＦν１ＢＬ−３内イ、ニイ ンサードさｉｌだくめ代えかたのバ１クリョウファジイラ、イブラリイは既に公 知となっている方法によって形成されている（ＳＥＥＤｅ　ｔ　ａ　１．、１９ ８２．　遺伝子ＧＥＮＥ、ＶＯＬ、　１９．ｐｐ、　２０１−２０９）脳膜芽遺 伝子のフラグメントを含むｍＡ替えがたバクテリオファジィ斑（ＰＬＡＱＵＥＳ の複合形成によって当初は検知されていました。部分的に重なり合いを持つ人間 ゲノームＤＮＡフラグメントを含む３６種のことなった組み替えかたバクテリョ ハアジイは分離されそのうち選択されたバクテリョハアジイはプラグ浄化され増 大されるそして各ファジィインサートの制限マツプはＲＡＣＫＷＩＴＨｅ　ｔ　 ａ　！、、ＧＥＮＥ、ＶＯＬ＞　３０＜　ｐｐル　１９５−２００に開示されて いる方法によって決定されでいる。 これらのベクテリョハアジイを用いろことで約２００ｋｂにわたる領域の制限マ ツプが作成され２図、４図に示す通りである。脳膜芽腫遺伝子からＩｎ　ＲＮ　 Ａ内に存在する周知の連続体はすべてこのクローン領域内に存在するのである。 全体としてはこれら一連のバクテリアハアジイ内に存在する人間ＤＮＡ連続体は Ｒｂ遺伝子の染色体の位置部を現１．ているといえる。第２図においてこの土の 垂直なマークはＨｉｎｄＩＩザイトの場所を示しておりまた地図の下方にある垂 直マークはＥＣ０ＲＩサイトの場所を現している。これに囲まれた領域はｅＤＮ Ａ（ＥＸＯＮＳ）内で発見された連続体を含むＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩフラグメント をよ現している。ＸＸＸ両端に矢印を持つ記号はそれぞれことなった組み替えか たバクテリアハアジイクローンを現している・第４図では６種の制限酵素の認識 サイトがすべて現されておりそれぞれＢｉｎｄｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａ　Ｉ 、　Ｓａｃ　Ｉ。 Ｓａｃ　Ｉ　Ｌ　ＢａｍＨＩＲ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢＩＯＬＡＤＳ、Ｉ ｎｃ、）ｘフランを含む制限エンドのフレアーゼフラグメントはｃＤＮＡクロー ンとの複合精製若しくはｃＤＮＡ連続体に基づく合成されたオリ：ヌクレオチド 連続他意によって判別されるものである。これらの制限フラグメントはプラスミ ドベクルブルースクライブ（ＢＬＵＥＳＣＲＩ　ＢＥ）内でサブクローンとなる （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、Ｓａｎ　ＤＩＥＧＯ，ＣＡ）２４のことなるプラスミ ドの全体は二のような方法によってサブクローン化される。核エクソンの数及び その大きさは以下の方法の繰り返しによって決定される。第１にオリオヌクレオ ウチドはｃＤＮＡ連続体の×××ヌクレオチドの第１場面と対応するように合成 される。このオリオヌクレオチドをプライマ（ＰＲＩＭＥＲとして使用しながら 大部分の５エクソンを含むゲノウイ〉・サートともにプラスミドは連続体として 形成される。その結果得られた連続体ハンドピースｃＤＮＡ連続体に揃えられる こととなり第１エクソンの長さを決定するプラスミド及びｃＤＮＡ連続体が鈍器 する地点が第１イントロン（ＩＮＴＲＯＮ）の機転としてマークされる。 このエクソン及びフランキングリージョン側面領域は５プロモ一タ連続体から構 成される継続的なヌクレオチド連続体及びイントロン１の始点を精製するために 合成オリオヌクレオチドプライマーを使用しながらさらに連続体として形成され る。第２及びそれに続くエクソンにあらかしめ割当てられてはいないｃＤＮＡ連 続体の次の２０のニュークレオチドに対応する連続プライマーを構成することに よって基底されるすべてのエクソンと側面に近接しているイントロン連続体はあ る方向またそれとは反対の方向の両方向に連続させられるのである。 伝差を連続形成している連続形成を終了する方法としてはスイケンザー５ＱＵＥ ＮＡＳＥ酵素の製造者のプロトコルに従えばこの酵素を使用することによ利達成 される（ＵＮＩＴＥＤ　５ＴＡＴＥＳ　ＢＩＯＣＨＥＭＹＣＡＬＣＯＲＰＯＲＡ ＴｒＯＮ、　ＣＬＥＶＥＬＡＮＤ。 ０ＨＩＯ）エクソン２０の下流行きにあるイントロン領域はこの方法によって連 続体とはならない。なぜならばこの領域においては異常なほどに問題の多い繰り 返し連続体というものが存在し４５のグイレメを表裏させている（連続ゲルの４ ０００すべてにおいてバンドが現れている）。この領域を分解するため（Ｔａｇ ）ポリメラーゼ（ＰＥＲＫ　ＩＮ−ＥＬＭＥＲ／ＣＰＴＵＳ）を用いて連続反応 を起こす。すべてこれら一連のデータはＭＩＣＲＯＧＥＮＩ　５ＤＱＵＥＮＣＳ ＯＮＴＷＡＲＥ（ＢＥＣＫＭＡＮ、ＰＡＬＯＡＬＴＯ，ＣＡ）を用いながら分析 され重複領域に関し選別される。 遺伝子の制限マツプ内の各エクソンの位置はｃＤＮＡフラグメントの復号精製若 しくは様々な制限ヌクレアーゼと共に消化される組み替えバクテリオファジィＤ ＮＡと合成されるオリゴマ（ＯＬ　ＩＧＯＭＥＲ）連続体を合成により決定され る。多くのエクソンの正確な位置というものはエンドヌクレアーゼの認知連続体 がイントロンエクソン連続体内で判別されマツプと相関関係にある場合演鐸的に 推論することが可能である。残りのエクソンの各位置というものは複合精製され ていく最小制限フラグメ〉トの中心部分に位置している。 第４図に示すように、脳膜芽腫遺伝子のゲノミクマ・ンプに沿って２７エクソン が構成されている。第４図においてはロク制限エンドネクレアーゼ用の認知サイ ト−の詳細が描かれておりこれらのサイトに関連するエクソンの位置が詳述され ている。エクソン１．　２．　３．６．　９゜１０．１３．２１，２２，２３． ２４，２３５，２６゜２７は地図の上に正確に配列されている。残りのエクソン は小さな制限フラグメントの中に地図化されておりこれらのフラグメントの真ん 中に描かれている。この技術によってエクソン１１．１７及びエクソン１４〜１ ６の一塊は２．Ｏｋｂ以下の正確さをもって地図上に位置付けられている。残り のエクソン（エクソン４，５．７゜８．１２．１８．１９及び２０）は真の位置 より０．８に、　ｂ以下の誤差を持ってすべて地図上に位置付けられている。参 考までにこのマツプではまた自然発生する制限フラグメント調タケダイの位置も 示している。 第６図（かく−１〜６−９）は側面及び各エクソンを含む連続体を現している。 これらエクソンの大きさは３１ヌクレオチド（エクソン２４）から１９７３ヌク レオチド（：エクソン２７）までにその範囲が亘っている。最も短いイントロン 連続体は８０ヌクレオチド調であることが分かっておりエクソン１５及び１６の 間に位置している一方で最も長さが長いイントロン連続体は約７０゜５ｋｂ上で ありエクソン１７と１８の間に存在している。 すべてのインドロンドナー（ＤＯＮＯＲ）及びアクセプター１：ＡｃｃＥＰＴＯ Ｒ）の２点を接合する際とはすべてＧＴ−ＡＧ接合法１１１１に従っている。値 我々の連続体形成方法は従来報告された方法に比べ脳膜芽腫遺伝子を含むエクソ ンの正確な数を定義しゅえるという点において依然にもまして正確なものである 事が証明された。 第１エクソン及びこのエクソンにきわめて近い５−領域はＧ−Ｃが大変豊富な領 域でありこれがプロモータ領域（ＦＲＯＭＯＴＥＲ）の特徴である。この領域に はＲｐａ　ＩＩ制限サイト−を９つ含むことができ６６％Ｃ＋Ｄフクレオチドか ら構成され折りＣｐＧ抑制をすることはない。これらの基準はＨＴＦアイランド （ＩＳＬＡＮＤ）の存在を示している。このプロモータ領域にはスイケン・ザー あるいはバッグポリメラーゼのどちらかを用いながらセンス（ＳＥＮＳＥ）若し くはアンチセンス（ＡＮＴＩ　５ＥＮＳＥ）方向のどちらにも分解されることの ないフクレオチドを含んでいる。この事はおそらくこのプロモータ領域において 形成されている第２構造によるものであろう。 ＬＥＥ　ＥＴ　ＡＬ、（１９８７ｄ）の特許によって開示されている転写開始サ イトからおよそ３０ヌクレオチド上流の連続体を分析から他のプロモータ領域内 において発見されているＴＡＴＡＢＯＸの存在を明らかにすることは出来ない。 この事はあらかじめ発行されているヒニシエシジンサイトが実際は正確に定義さ れていなかったことを視差するものであり、あるいはまた脳膜芽腫遺伝子にはプ ロモータ領域の基本的ＴＡＴＡ及びＣＡＡＴＢＯＸが掛けていることを現してい るのでもあろう。 連続体５−からエクソン１まてさらに分析すると６−１において示されるＮｏ、 １２２をラベルされた塩基対−２７４においてＴＡＴＡＢＯＸは存在することが 示されている。７つの塩基領域の双度関係は５７％に過ぎず最も頻繁に保存され ている塩基である最初の４つの塩基Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａは１００％双度染色体である 。予測されるキャビングサイト（ＣＡＰＰ　ＩＮＧ）、ＣＡＣ，は１４塩基程離 れた所に位置しておりそこからさらに４９塩基離れている。この領域は一般的に Ｇ−Ｃが豊富であるにもかかわらずＣＡＡＴＢＯＸは見出だされていない。 イ〉トロン連続体は他がいに８７ヌクレオチド離れているＴＴＴ　（Ｔ）Ｃ連続 体の２１循環連続体から構成されるエクソン２０の酸アコストロフィサイド側に 直面配置されている。繰り返しユニットの数は個人と遺伝性ＢＮＡｘｘｘｘの用 に振る舞う繰り返しの数によってけってされる対立遺伝子殿間て相違が生じる。 連続体データのコンピュータサーチによればイントロン領域の幾つかはＡＬＵ反 復制連続体に異体同形であることが判明している。Ａｌｕ反復連続体は以下に示 す領域に存在している。 第６図に符号で示したｂｐ４９２とｂｐ７０４との間のエクソン２の下流；２） ｂｐ１９とｂｐＨ７との間に位置するエクソン９の上流；）ｂｐ５０４とｂｐ６ ０８との間に位置するエクソン１１の下流：４）エクソン１４の両側であるＭ２ Ｂ５とｂｐ２７０との間、及びｂｐ４２０とｂｐ７４１との間に位置する連続イ ントロン：及び５）ｂｐ３６からｂｐ２１０の間に位置するエクソン１７の上流 。 エクソン２の下流に位置するＡｌｕは、Ａｌｕ繰返しシーケンス内に高いレベル で保存された２個の内部シーケンスを含む。その一つは、ＳＶ４０オートオリジ ンのＴ抗体結合シーケンスに対応するシーケンス（ＧＡＧＧＣＮＧＡＧＣ）であ り、他の一つは未知関数の対称シーケンス（ＣＣＡＧＣＣＴＧＧ）である。この 短い対称シーケンスは、またエクソン１４の両側に位置する各ＡＩＵシーケンス にも存在する。エクソン１４及び１５は、はぼ全てＡｌｕシーケンスにて構成さ れたショートイントロンにより分離されており、これによってエクソン１４及び １５はおそらく単一のエクソンとなり、そしてその進行期間中にＡｌｕエレメン トを挿入することによってこれらを分離されることが予測される。 レトロポソンは互いに密接して一体化する傾向を持つことから、このＡｌｕシー ケンスはエクソン１４の５一端部に位置する他のＡｌｕシーケンスによりこの位 置に向けられる可能性がある。 網膜芽腫遺伝子の３′端部は、周知のボリアデニレーシジン信号シーケンスであ るＡＡＴＡＡＡを含む。このヘクサマーの下流にて３２のベースか配置されてな る−のシーケンス（ＴＧＴＧＴＴＣＴ）は、ＭｃＬａｕｃｈＩａｎ等（１９８５ ）において記述された保存下流コンセンサスシーケンス（ＹＧＴＧＴＹＹ）に相 当するー、このシーケンス及び包囲しているベースは、一般にボリアデニレーン ヨン信号シーケンス（［’１ｉｒｎｓｔｉｅ１等。 １９８５）の下流に位置する領域、３０ヌクレオチド内に見出だされるＧ　／／ 　Ｔクラスター”を構成している。 ｐ４のプローブ７Ｒはまた、５０個の互いに関連性の無い個体（網膜芽腫４０個 、オステオサルコーマ８個、及びレチーノブラストーマを持つ行名に生しる未知 細胞起源の未分化腫瘍２個）の各腫瘍から分離されたスクリーユゲ、／ムＤＮＡ に幻Ｉ〜用いられる。これらに付き、以下に詳細にのべろ。　これらのＤＮＡサ ンプルは）ｉ　ｉ　ｎ　ｄＩＮＮによって消化されるとともに、放射綿栓、２さ れたｒ＋４．７をプローブとして用いるＳ　ｏ　ｕ　ｔ、　ｋｌｅ　ｒ　ｎ　ブ Ｌ】ノド交配により分析さ才する。この分析により、３種類のゲノムＤ　Ｎ　Ａ 抑制フラグメントの分離パターンか明らかにされた。すなわち、完全なホモ接合 体消失を表す完全不在フラグメント、完全へテロ接合体消失を表４−リブリゼン トフラグメント、及び部を〕的消失または制限位置の変化のいずれかを反映する 大きさの変化したフラグメント、である。ＤＮＡ使用の少なくとも３０％はこれ ら３種類の異常のいずれかを示していた。 これに対し、１８の正常な個体から得た白血球ＤＮＡのＳ　ＯＩＪ　ｔ　ｈ　ｅ 　ｒ　ｎプロット分析では、制限フラグメントは均一なパターンを示した。 使用 例えばこれらｐ４．７Ｒ内などにおけるｃＤＮＡ及びゲノムシーケンスは、本発 明によればまたＲｂ遺伝子の変異対立遺伝子の存在を確認するために個体を撮影 するためにも用いられる。 この撮影処理により、一方の目に網膜芽腫の家系的あるいは先天的要因を持つた めに網膜芽腫が進行する危険を持つ個体が通常の眼球検査を定期的に受診する必 要があるかどうかが判明する。すなわち、この撮影処理によって個体が変異Ｒｈ 対立遺伝子を持つことが判明した場合にのみ、前記眼球検査を定期的に行う必要 が生じる。 一方、２個の正常なＲｂ対立遺伝子を個体が持つ場合には、このような個体内で 網膜芽腫が成長するケースは約１　、／　２００００または０．００５％である ことから、もはや検査を継続的に行う必要がない。なお、対立遺伝子を不活性化 するに十分な変異を持つＲｂ対立遺伝子を持つ個体の場合には網膜芽腫が成長す る危険性は８０−９０％にのぼる。 このように、現在定期的に検査を受けている個体の実質割合は全人口に対しごく わずかを占めるに過ぎず、網膜芽腫の家系的素因も先天的素因も、−の個体か遺 伝的にこの病気にかかることの結論的証明に用いることは出来ない。 従−って、現在２個の１１−常なＲｂ遺伝子のコピーを持つ１述した個体か、こ れまで不必要にもかかわらず高価でまた眼球を傷−）けるおそれのある眼球検査 を繰返【７受は続ＩＪ７’；％たということがいえる。 本発明に係る撮影方法は、以下の各ステップを含む。 すなわち、（ｉ）Ｒｂ遺伝子軌跡性大幅に消失さゼ乙ために。患者の（−り酸ナ ンブルを検査するステップ＋　（２）　Ｒｂ逍伝−ｆ軌跡のノ」１部分の消失ま たはポイント変異を起こさせるために患者の核酸サンプルを検査するス戸ツブ； 及び（３）ｉｚｂ遺伝子軌跡にリンクＬ　ｊ、−ＲＦ　Ｌ　Ｐを得るためにφ者 の核酸サンプルを検査するステップである。 Ｒｈ遺伝ｒにおける大規模消失の検出 Ｒｂ遺伝子に対しＤＮＡプローブを使用可能であることにより、網膜芽腫素因対 立遺伝子を生成ずろ遺伝子の損傷を１ｎ接検出可能な手段を確保できることにあ る。すなわち、このような好適なプローブは完全な正常網膜芽腫遺伝子シーケン ス、あるいは網膜芽腫遺伝子の特定の部分を符号化した１５またはそれ以上のベ ースからなるフラグメントを含む。そして、５ｏｕｔｈｅｒｎ　プロット及びド ントブロソト処理が行イっれた場合、この分析は多数のベース対の消失等Ｒｂ遺 伝子内の大きな構造的変化を起こし、τいる損傷の検査に通常は限定される。 ５ｏｕｔｈｅｒｎプロツトまたはドツトプロット分析に用いられるＤＮＡは通常 周辺白血球から分離されるが、患者か−の眼球に腫瘍を持つ場合にはこのＩ）ｌ ！瘍から抽出される。 白血球ＤＮＡの検査に際［２ては、まず個体から１０ミリリットルの血液サンプ ルを採取し、この血液サンプルの白血球から周知の技術を用いてゲノ、ＡＤＮＡ を分離する。このＤＮＡはＢ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　１．１などの制限エンドヌクレ ア・−ゼによって消化され、これによって生しるフラグメントは、分子形状また は分子質２等の物理的特性に応じてアカローゼエレクトロフオレシスゲル状で分 離される。本発明の目的に対応するため、分子形状は線状、円形状、２重螺旋ま たは単一螺旋などの構造形態として特定されている。 ゲル内のＤＮＡは吸収作用によりニトロセルロースのフィルタへ転移される。こ のフィルタはその後放射線標識されたｐ２ＡＲ３，８、及びＥｃｏＲ１消化作用 により得られたｐ４．７Ｒの小断片を含むｐ２ＡＲ０，９を用いて検査される。 （ｐ２ＡＲ３，８及びｐ２ＡＲ０゜９のベクトルのダイアダラムを第３図に示す ）。 検出された種々の異常の存在位置をより正確に特定するためには、ｐ４．７Ｒ挿 入プロ一ブ全体を用いるよりも２個またはそれ以上の小断片プローブを分けて使 用したほうが良い。試験されたフィルタの放射線写真から、被検体の体細胞また は腫瘍ＤＮＡ内におけるＲｂｌの限定マツプを構成するために必要なデータを得 ることが可能となる。この限定マツプは、同様の抑制消化酵素及び同じ試験によ り特定された抑制マツプと比較される。同じような複数の被検体の組から得られ たアデノビールス−変換網膜細胞ラインまたは白血球ＤＮＡから得られたＤＮＡ が好適な制御効果を発揮する。もし、被検体がかなりの消失部を含むＲｂ　網膜 芽腫を持つ場合、そのＤＮＡの抑制マツプは制御の場合と比較すると、−または 複数の付加的バンド及び／またはその強度が５０％低下した１または複数のバン ドを含む。この強度低下はＲｂ１における１の対立遺伝子内における消失により 生じた１または複数の抑制フラグメントの大きさの変化または完全消失により引 き起こされるものである。 このような５ｏｕｔｈｅｒｎ分析による撮影処理によって、大きな消失部を持ち 、これによって非機能的なＲｂ　対立遺伝子の存在を検出することができる。 もし、この分析によって個体の被検ＤＮＡが制御マツプと異なる限定マツプを有 することが判明した場合には、当該個体は非機能化型の変異Ｒｂ　対立遺伝子を 持つ可能性が高い。このような個体はその後網膜芽腫の成長状態について綿密な モニタをうける必要がある。もし、検査限定マツプと制御マツプが一致した場合 には、当該個体が消失部またはポイント変異を持つＲｂ対立遺伝子を有している かいなかを判定するために他の異なる撮影処理を行うことが可能である。小消失 及びポイント変異は対立遺伝子を不活性化するには十分であるが、試験による交 配を防ぐことは出来ない。このような撮影処理の一例につき以下に概要を述べる 。 その他の突然変異の検出 Ｒｂ因子座におけ小規模欠損若しくは部分的突然変異に関し患者のＤＮＡサンプ ルを調べるためにはＲｂ遺伝子の相同物が両方とも患者からクロンされなくては ならない。クロンされた対立遺伝子は以下に示す二つの内のどれ化一つの方法に よってｐ４．７Ｒによって代表されるような正常対立遺伝子とはことなるヌクレ インサン連続体の存在を調べることが可能である。第１の方法はクロンされた対 立遺伝子及びｂ４．７Ｒのヌクレオチド連続体を検出しそれらを比較する若しく は第２の方法としてｐ４．７Ｒから移されたＲＮＡを検査される患者から取り出 された単一螺旋完全ゲノミツクＤＮＡへと複合形成していく。その　異質２０構 造の率はりボヌクレアーゼＡ＜ＲＮａｓｅ　Ａ）場所における何らかの誤差を発 見するためにを××××をちととして作用する。つまりこれらの方法は以下の手 順に従って実行されるものである。 検査される患者のＲｄ遺伝子の対立遺伝子は従来の周知の技術を使用用いてクロ ンされるのである。例えば、一般的な方法としてはバクテリオファージベクトル ＥＭ１３Ｌ３（ｒｉｓｃｈａｕｆ　ｅｔ　ａｌ　、、　１９８３、　Ｊ、　Ｍｏ ｂ　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　１７０、１）ｌ）、　８２７−）ｘｘｘリットル の血液サンプルを患者から取り出します。このサンプル内の細胞から分離された ゲノミックＤＮＡはＭｂｏｌによって部分的に消化され約２０ｋｂ程度の平均的 フラグメントサイズに消化されてしまいます。１８−２１ｋｂの範囲にある（す なわちｐＵＣ９）フラグメントは分離されます。この結果得られるＭｂｏＩで終 結しているフラグメントはＢａｍＨＩで完全に消化されアルカリホスターで処理 されまた１０分間６８℃に熱せられその破片を完全に分際されたＥＭＢＬ３ベク トルＤＮＡに欠紮されます。生体外でのラムダ一括反応で用いられる方法であり 一括処理されたファージはプレートストックを成長させることによって増加しま す（このクロン技術はＭａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、１９８２の特許で一般に知 られており分子クローニング、研究所マニュアル、Ｃｏ１ｄ　Ｓｔｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。 ｂｐ、　２５６−２９３．） このプレートステップからの約５Ｘ１０３プラク（斑）形成ユニット（ｐ　ｆ　 ｕは異種混合及び放射性同位幻想を使って識別されたｐ４．７Ｒによって遮蔽さ れます。ｐ４．７Ｒプローブに異種混合されるプラーク精製され上記の手続きに 従って再度遮蔽されます。 ｄスクリーニング（再遮蔽から降られた正プラークは分離されＲｂ対立遺伝子を 含んでいると思われるＤＮＡを官舎から得るために使用されます。 これら分離されたＥＭＢＬ３ベクルＢＮＮサンプル内のＭｂｏｌゲノミックイン サートはサザンアナリシスを用いｐ４．７Ｈに対する異体同形の連続体に関して の試験が行われます。完全なＲｂ遺伝子を含むせいえんフラグメントはサンプル の中から持つとも適切なベクトルへとす〉クロンされていきまず。 たたのサンクロンは上記のように検査されるべき患者から得たＤＮＡの１個若し くは対となったＲｈ対立遺伝子の写を含でいる。もし両対立遺伝子が倒れている 可動を判断するには遺伝多形体が存在するか否かっていう試験をイニシャルファ ージ分離物に対して行います。これらサブクロン化された対立遺伝子は以下の技 術のどれ化一つを用いて９４．７Ｒ戸の相違点に関しこれらのサブクロン課され た対立遺伝子は検査を行われます。 まず、第１にｐ４．７内に存在する正常Ｒｈ遺伝子のクレオチド連続体が決定さ れます。およそ５００塩基対（ｂｐ）の制限フラグメントはｐ４．７ＲからＭ　 １３　ｍによって連続体にされます（Ｓａｌｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ。 、　１９７７、、、　ＢＲＯＣ，Ｎａｐｌ、　ＡＣＡＤ、　ＳＣ１，ＵＳＡ、Ｖ ｏ　１．　７４．　ｐｐ、５４６３〜）次にＲｄ遺伝子の複合連続体はこれら患 者から得たサブクローン連続体から作られます。正常網膜芽腫遺伝子の完全連続 体と直面配置の連続体は第５図及び６図に示されています。 分離されたＲｂ遺伝子対遺伝子は以下の方法に従って連続体として配列されます 。対立遺伝子の制限フラグメント（，２ｋｂ）はＭ１３ｍｐ８ベクトルへとサブ クローン化されジョートスエソチーズの拡大域（０−５００ｂｐ）はｐ４．７Ｒ から分離された小制限フラグメントを二重化ニュークレオチド連続反応における プライマーとしてそれぞれ用いることにより連続化されます。分離された対立遺 伝子の複合ニュークレオチド連続体はそれぞれ満たされている連続体から作り出 されます。この連続体は正常Ｒｂ遺伝子の連続体と直接比較されｐ４．７Ｒから 判断され分離された対立遺伝子内に欠損若しくは部分的突然変異が存在した場合 その存在を示します。 対立遺伝子ＢＮＡと正常Ｒｂ遺伝子を比較するもう一つの方法はｐ４，７Ｒ連続 体と対立遺伝子連続体の間における差異ズレを検知するためにＲＮａｓａを使用 します。この比較は順次ｐ４．７Ｈの小制限フラグメントをプローブとして用い ることにより達成されます。第１にｐ４．７Ｒは制限酵素によって評価されこの 制限酵素はＲｂ遺伝子連続体を約５００ｂｐ強のフラグメントに切断します。こ れらのフラグメントは受けるから精製され各それぞれエフロン化された電気エイ ドギャルに基づいて分断されそれぞれの方向へは分断されていきます。すなわち 、ＳＰ６ベクトル方向です（例ｐｓＰ６４ｏｒｐＳＰ６５；　Ｍｅｌｔｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８４゜付サン研究、Ｖｏ１．１２．ｐｐ、７０３５−）ｐ４ ゜７Ｒフラグメントのインサートを含むＳＦ３に基づいたプラスウィードは従来 技術として良く知られているＳＰ６転写システムを用いる。 ｒＫｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｊ。 Ｕ　Ｓ　Ａ、　Ｖｏｌ−７４，１）９．１２４５−４９Ｊ　１．：、示された方 法に従い対象となる家族構成員複数の静脈血液を白面球核からＤＮＡが抽出され た。与えられたＲＦＬＰを有するｋ　ｉ　ｎｄ　ｒｅｄの分析のために、前記家 族構成員からのＤＮＡは好適な制限エンドヌクレアーゼにより消化された。この 消化作用により生じたフラグメントは、アガローゼゲルエレクトロフォレシイス により分離されると共に、ニトロセルローゼフィルターへ転移され、さらに標識 試験による交配作用をおけることとなる。 これらの家族において、網膜芽種遺伝子内におけるＤＮＡポリモルフォルフイズ ムにより決定される対立遺伝子の遺伝性が追跡され、網膜芽腫素因特性の遺伝性 と比較される。 例えば、プローブｐ６８ＲＳ２．０　（テーブル１参照）により検出されたボリ モルフイズムを通してみる。ゲノムＤＮＡが制限酵素Ｒｓａｌにより消化される と、このプローブは互いに異なる長さを持つアレリックＤＮＡフラグメントに交 配される。これら各フラグメントの大きさは、１．５ｋｂから２．Ｏｋｂの範囲 内にあり、これらが互いに５０ｂｐの間隔を有している。 ｐ６８Ｒ５２，０内にクローンされた２、ＯｋｂゲノムフラグメントのＤＮＡシ ーケンスは、５０〜５３ｂｐのセグメントを持ち、該セグメントは約３０回繰り 返された形となっている（テーブル２参照）。 この５３ｂｐセグメントは、各分析におけるプローブとして用いられる。前記繰 り返しシーケンスの一部は、種々の文献（Ｙ、　Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ 、、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ。 Ｖｏｌ、２３５．ｐｐ、ｌ６１Ｂ−２２）などにより報告さレテイルｖＮＴ　Ｒ （Ｖａｒｉａｂｕｌｅ　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏ「　Ｔａｎｄｅａ　Ｒｅｐｅａｔ　） のコアシーケンスと相同性を有している。（繰り返しユニット上方のテーブル２ 内に示した１ｌｂｐシーケンス）多形性のマツプ位置は第１図に示した遺伝子の 制限マツプ状の位置に対応させている。 ＭｂｏＩＩの位置はおおよその門でありマツプ内での正確な位置は今だ解明され ていない。 対立遺伝子の大きさは基準としてラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフ ラグメントを用いた幾つかの独立的な算出方法により算出される。 対立遺伝子頻度は、４０〜６０の互いに関連制のない固体に基づくものである。 ｐ８８ＰＲＯ，６、ｐ３５ＲＯ，６，ｐ２Ｐｏ、３及びＢＩｐ９５Ｈ３０，５は 、第２図に示した網膜が種遺伝子の他の領域から分離されたプローブである。 Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ、ａｌにより観察された幾つかのＶＮＴＲにより報告さ れたクワシーケンスを現す。 このｙ９おうなタンデムに繰り返されるシーケンスは遺伝的に不安定な傾向を示 すので、繰り返し回数は大きく変化する。このような５ｉｔｅにおいて８この異 なる対立遺伝子が検出されているが、更に、多数存在する可能性がある。 このような共通対立遺伝子数のため、互いに関係のない各個体の７５％がこの多 形性に対しへテロ接合的である。そして、ヘテロ接合制の高い頻度により、この 多形性は極めて有用なものとなる。テーブル２に於て、ブラケットは繰り返し、 単位内における変化領域を示しており、害ブラケット領域上方及び下方でアンダ ーラインされたベースはこれら変化ｔ４Ｂ域の可変ベースを示す。 網膜が種を持つ１４の家族がこのＤＮＡ多形性における対立遺伝子の配列を持っ ていた。この変化性によって、網膜芽腫素因特性を持つ部分の共通遺伝性の頻度 を検出することが可能となる。例えば、これら各家族内の各個体のゲノムＤＮＡ はＲｓａｌによって消化され、欠陥Ｒｂ対立遺伝子を持つ任意の−のＲｓａｌフ ラグメントの共通遺伝性が決定されることになる。 シーケンス分析 ＲＦＬＰ分析によって明らかにできるのは、正常な拡散を特徴とする限定フラグ メントからの５ｏｕｔｉｅｒｎプロツト上の検出特性上火なる限定フラグメント に生じるシーケンス変化に限られる。 このような検出される多形性の大部分は限定エンドヌクレアーゼ錦部分内におけ るＤＮＡシーケンス変化に寄り生じるものである。このような部分は希であり、 それらを発見するには、幾つかの互いに関連制の内個体空得られたゲノムＤＮＡ が５０の互いに異なる制限酵素をもいいて消化されるという困難かつ高価な撮影 処理か必要となる。 特定位置におけるすべてのゲノムＤＮＡシーケンス多形性（ＤＳＰｓ）のフラグ メント（断片）が検出可能であり、ＲＦＬＰが小さくそして撮影に用いられる酵 素の数に依存することに基づく。通常、人体ゲノム内におけるＤＮＡシーケンス 多形性の９０％またはそれ以上がＲ３ＬＰに基づく分析対象外にある。 数１０または数１００もの潜在的に有用なりＳＰは最も病気原因性の強い遺伝市 内またはその近傍に存在ｓｔｅいるが、これらＤＳＰの内のわずかがＲＦＬＰと して検出可能である、時には全く検出不可能ということもある。 第４図は人体網膜芽腫遺伝子の２７エクソンを含む２００キロベースゲノム領域 のスケールマツプを示す。２７のエクソンによって４．７キロベースのトランス クリプトが精製される。 第７図はこの遺伝子内で確認されたＤＮＡシーケンス多形性（ＤＳＰｓ）の位置 を示す。制限酵素という名前で確認された多形性はＲＦＬＰＳであり、ＲＢｌ、 ２゜ＲＢｌ、３．ＲＢｌ、２０ＲＢ１．２６の各多形性はＲＦＬＰとして検出不 可能であり、これらはＰＣＲ増幅作用及び直接シーケンス作用により、見出ださ れれた物であり、これをいかに述べる。 ２００キロベースのゲノム領域は、３５の異なる再接合バクテリアファージラム ダクローンからのオーバラップインインサート列内で分離されたものである。 エクソンを含むセグメントはブルースクライブブイラスミドクローンベクトルへ サブクローンされた。 クローンされたプラスミドインサートの初期シーケンスはプラスミドシーケンス のための周知の方ｙｈｏ卯を用いて遂行される。このゲノムシーケンスに基づき ２０ベースオリゴヌクレオチドプライマの各対は、３２０〜１２００ｂｐの大き さを持つ領域がＭｕｌｌｉｓ等のチェーン反応によりゲノムＤＮＡから増幅亜ｋ ｎｏ卯となるように合成される。 このようなそれぞれの象ひうくはんのうのため２００ｎｇから１．Ｏｕｇのゲノ ムＤＮＡが、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，４または８．６）　、３０ｕｇｍｌ牛 の血清アルブミン、３００ｍＭ　〜７．５ｍＭ、１０〜５０ｐＭの各オリゴンク レオチドパライマ、及び１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ　Ｃｅｔｕｓ）を含む反応バッファ内に準備される。 最良のＭｇＣ１２ａ度及びＰＣＲ反応ｐＨは、■プライマ対に因って変化する。 ＰＣＲ増幅（３０〜３５ラウンド）は、プログラマブルサーマルシクラーを用い 、９４℃（デナチュレーション）においては、１０秒サイクル、４２〜５５℃（ アニーリング）においては、１０秒サイクル、そして７０℃（ポリメライゼーシ ョン）においては、３０秒サイクルで遂行される。すべての時間はサンプル温度 に基づくもので、ヒートブロック温度てひゃなく、またヒートブロックの立ち上 がり時間も方眼紙逓ない。最良アニーリングは各プライマエア毎に異なる。 このプロトコルによって、各領域を２５００ｂｐ二までＰＣＲ増幅可能となる。 ９〜２０１ｋｏの個体から得たゲノムＤＮＡは各領域の増幅及びＤＳＰの撮影に 供されることとなる。 網膜芽腫遺伝子内に存在するＤＮＡ多形性のより大きな断片を検出及び使用する ため、本発明者らは一般にＫ。 ｂ、Ｍｕｌｌｉｓ　等、１９８７の開示察れているポリメラーゼチェーン反応（ ＰＣＲ）、及びＣ，Ｗｏｎｇ等１９８７に感じされた直接シーケンス技術を用い 、当該位置における正常アレビック変化の分析を行った。 オリゴヌクリオチドブライマは大きさが３２０〜１２００ｂｐｎの間て変化する 遺伝子の閣僚行きを増幅された合成された。 前記増幅及びシーケンス作用は、少な（とも９この他かいん関連性の無い個体か ら得たＤＮＡのじょですべての撮影領域に対し遂行され、１５またはそれ以上の 領域のための分析された。 はとんどのケースにおいて、各プライマ対は遺伝子の２７エクソンーにフランク したイントロンシーケンスから導出されており、これによってＰＣＲ増幅された 両７息はオイントロンシーケン及びエクソンシーケンスの双方を含有することと なる。 この撮影処理の結果をテーブル３及び４に示す。増幅されたＤＮＡシーケンスは 、互いに比較されると共に同じ領域から漏出されあらかじめクローンされたプラ スミドインサートからのシーケンスデータのチェックを受ける。 技術的な人口走査他のあいまいさに起因して不明瞭となったベースは表から省い た。 ３７１１ｂｐのゲノムＤＮＡシーケンスの内、４このヂ士ケンスのパイニージョ ンが確認された。テーブル３マツプ１は第７図に示した。 これら４このバイリエーションはイントロン内で見出だされており、その内の１ つは積度化型（シーケンスされた１、１５の固体内でのみ）であり、３個は真性 ＤＮＡシーケンス多形性を示した。 代表的な例（ＲＮ１３）を第７図に示す、この多形性は網膜芽腫遺伝子のエクソ ン３近傍で生じる。多形性シーケンスのどれも週限定酵素の認識位置を構成して おらずＤＳＰはＲＦＬＰとして検出できない。 浄ＩＦ（内容に変更なし） 表１ １．９５　０．０２ １．９０　０．０７ １．８５　０．０７ １．８０　０．３５ １．７５　０．２０ １．６５　０．０９ １．５０　０．０９ ５．５　０．４５ ｐ３５Ｒ０，８Ｔｔｈ　１１１１　１９５　ｋｂ　４．９５　０．２０４Ｊ５　 ０．１１０ ０．８　（，０５ ０，８（，０５ ０，３（，０５ 浄書（内容に変更なし） ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＲＥＰＥＡＴ　ＵＮＩＴ　ＷＩＴＨＩＮ　ｐ ６８Ｒ３２，０ここに行われたＤｓｐｓ検出についてのアプローチは、慣用のＲ ＦＩＰへイス選別（スクリーニング）に対し幾つかの利点がある。上述したよう に、増幅及び直接ンーケンンングによるＤＳＰ選別は、クーロンされたローカス （ｆｏｃｕｓ）における利用可能な多形体マーカーの数、強さのオーダを増加さ せることができる。この技術は、制限酵素ベースド選別を取り巻き（ｅｎｃｏｍ ｐａｓｓｅｓ）、スーパーセード（ｓｕｐｅｒｃｅｄｅ）する。何故なら、ＲＦ ＬＯｓ及びＶＮＴＲｓも検出されるからである。このようなマーカーの利用の為 の唯一の要求は拡大初期（ｐｒｉｍｅｒ）シーフェンス及び多形体そのものの唯 一のセットについての知識である。多形体の出版は全ての読者に直ぐに利用可能 である。このため、研究室間におけるプラスミドＤＮＡ５物理的な移動に伴う問 題及び遅延は避けられた。またプラスミド貯蔵維持のコストは最終的に減少され た。さらに、これらの多形体マーカーの早い解析は大規模に実行することができ る。 この実行には拡張ＤＮＡの直接異種混合の為の対立型遺伝子特定オリゴヌクレ万 チドブローブの使用を伴う。最後に、同一の染色性因子圧における両ｅ、ｌｌｌ ３を伴う我々の経験に基づいて、我々は比較可能なそれぞれの方法によってＤＳ Ｐｓを設置する費用と努力を発見した。 Ｒｂ遺伝子の欠損を持つ患者の治療 選別に追加して、この発明は、ポリペプチド治療を含む。この治療は、欠陥Ｒｂ 対立遺伝子を保有する個体及び網膜芽腫の発達の棄権を持つ個体にたいするもの である。 個体に対する網膜芽腫の形成を抑制するために、Ｒｂポリペプチドが施される。 この量は網膜芽腫腫瘍の形成および成長抑制するのに十分な量（アンチ網膜芽腫 形成量）とされる。アンチ網膜芽腫形成のＲｂポリペプチドの投与は１〜５００ μｇ／ｋｇ・体重・日である。Ｒｂタンパクは薬学的に受け入れられるキャリア と一緒に駐車によって投与される。この投与は単独でも他の薬との組み合わせで もよい。前記キャリアはＲｂポリペプチドを溶解する物でも浮遊して保持するも のでもよい。ただし、患者に有毒なものであってはならない。食塩の水溶液やノ ンイオン化合物（グルコース）等が考えられる。 Ｒｂポリペプチドの反応を阻害しないその他の薬剤としもよい。当業者は通常の 実験によって、この構成の特別な薬物キャリアに確かめることができる。 治療に的したＲｂポリペプチドは以下の３つの伝統的手段のいずれかによって製 造することができる。第１に、Ｒｂポリペプチドは適切な哺乳類の表現ベクトル 内へ栄養繁殖させたＲｂｃＤＮＡによって製造することができる。すなわち、ぐ ラス表現システムにおけるこのベクトルからの明示されたＲｂ遺伝子の製造及び 表現システムの媒介物又は細胞からのＲｂポリペプチドの分離である。 一般的表現ベクトル及びシステムは、この技術においてよく知られている。 第２に、Ｒｂポリペプチドは、タンパク科学技術を用いて製造することができる 。ここにおいて、適切な連続中で、特殊な残余アミノ酸は一緒に結合合成されて いる。 第３は、自然に生じるＲｂプロティンは類縁クロマトグラフィーによって全体の プロティンサンプルから分離することができる。Ｒｂプロティンの為の抗体特性 は、標準の手順（下記参照）によって調整され、そして、選択的にＲｂプロティ ンを繋ぐ為に用いられる不活性マトリックスに結合される。 網膜芽腫の免疫診断法 この発明は、また特別の腫瘍がＲｂ遺伝子異常の結果であるかいなかの為の方法 を包含する。骨肉腫及びある区別できない腫瘍前ることができる。Ｒｈ遺伝子に お蹴る検出可能な障害から得ることができる。免疫診断法はこのような腫瘍の診 断においての助けとなる。 アンチＲｂ二うあちの製造の為に、上述のようにして製造されたＲｂポリペプチ ド及び自然発生Ｒｂタンパクによりラビットが免疫性にされる。製造されたアン チＲｂ抗体はその後ラベルされる。例えば、放射能、螢光性、アルカリ性リン酸 塩のような酵素に酔ってラベルされる。 これは従来からの方法によって行われる。３例えば、腫瘍サンプルは液体化（１ ｉｑｕ　ｉ　ｆ　ｆｅｄ）され、テストはラベルされた抗体に対し従来のＥＬＩ ＳＡ（酵素リンクド免疫ソルベント分析）法に酔って行われる。 また、人の皮膚サンプル（例えば生体サンプル）は、網膜芽腫の表現の為に、他 の免疫診断技術（例えば、Ｉ。 ＲＯＩＴＴ、ＩＮＴＥＲＡｃＴＩＮ　ＯＦ　ＡＮＴＩＧＥＮ　ＡＮＤ　ＡＮＴＩ ＢＯＤＹ、ＩＮ　ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、５版、ボストン ：ＢＬＡＣＫＷＥＬＬ　５ＣＩＥＮＴＩＧＦＩＣＰＵＢＵＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、 　１９８４．　ｐｐ、　１４５−７５）によってもよい。 免疫性の複合体は、アンチＲｂ抗体に対し反応する抗原（例えば、網膜芽腫ポリ ペプチド）を持つ腫瘍サンプル内において検出される。このような抗原を持たな い腫瘍は網膜芽腫遺伝子に欠陥を持つと推定される。 二二に行われたＤ　ｓ　ｐ　ｓ　ｂｔ出についてのアプローチは、慣用のＲＦＩ Ｐベイス選別（スクリーニング）に灯し幾つかの利点がある。上述したように、 陀・幅及び直接シーケンシングによるＤＳＰ選別は、クーロンされたローカス（ ｌｏｃｕｓ）における利用可能な多形体マーカーの数、強さのオーダを増加させ ることができる。この技術は、制限酵素ベースド選別を取り巻き（ｅ　ｎ　ｃ　 ｏｍｐ　ａｓｓｅｓ＞、スーパーセード（ｓｕｐｅｒｃｅｄｅ）する。何故なら 、ＲＦＬＯｓ及びＶＮＴＲｓも検出されるからである。このようなマーカーの利 用の為の唯一の要求は拡大初期（ｐｒｉｍｅｒ）シーフェンス及び多形体そのも のの唯一のセットについての知讃である。多形体の出版は全ての読者に直ぐに利 用可能である。このため、研究室間におけるプラスミドＤＮＡ５物理的な移動に 伴う問題及び遅延は避けられた。またプラスミド貯蔵維持のコストは最終的に減 少された。さらに、これらの多形体マーカーの早い解析は大規模に実行すること かできる。 この実行には拡張ＤＮＡの直接異種混合の為の対立型遺伝子特定オリゴヌクレオ チドプローブの使用を伴う。最後に、同一の染色性因子座における両戦略を伴う 我々の経験に基づいて、我々は比較可能なそれぞれの方法によってＤＳＰｓを設 置する費用と努力を発見した。 Ｒｂ遺伝子の欠損を持つ患者の治療 選別に追加して、この発明は、ポリペプチド治療を含む。この治療は、欠陥Ｒｂ 対立遺伝子を保有する個体及び網膜芽腫の発達の棄権を持つ個体にだいするもの である。 個体に対する網膜芽腫の形成を抑制するために、Ｒｂポリペプチドが施される。 この量は網膜芽腫腫瘍の形成および成長抑制するのに十分な量（アンチ網膜芽腫 形成＠）とされる。アンチ網膜芽腫形成のＲｂポリペプチドの投与は１〜５００ μｇ／ｋｇ・体重・日である。Ｒｂタンパクは薬学的に受け入れられるキャリア と一緒に駐車によって投与される。この投与は単独でも他の薬との組み合わせで もよい。前記キャリアはＲｂポリペプチドを溶解する物でも浮遊して保持するも のでもよい。ただし、患者に有毒なものであってはならない。食塩の水溶液やノ ンイオン化合物（グルツース）等が考えられる。 Ｒｂポリペプチドの反応を阻害しないその他の薬剤としもよい。当業者は通常の 実験によって、この構成の特別な薬物キャリアに確かめることができる。 治療に的したＲｂポリペプチドは以下の３つの伝統的手段のいずれかによって製 造することができる。第１に、Ｒｂポリペプチドは適切な哺乳類の表現ベクトル 内へ栄養繁殖させたＲｂｃＤＮＡによって製造することができる。すなわち、ぐ ラス表現システムにおけるこのベクトルからの明示されたＲｂ遺伝子の製造及び 表現システムの媒介物又は細胞からのＲｂポリペプチドの分離である。 一般的表現ベクトル及びシステムは、この技術においてよく知られている。 第２に、Ｒｂポリペプチドは、タンパク科学技術を用いて製造することができる 。ここにおいて、適切な連続中で、特殊な残余アミノ酸は一緒に結合合成されて いる。 第３は、自然に生じるＲｂプロティンは類縁クロマトグラフィーによって全体の プロティンサンプルから分離することができる。Ｒｂプロティンの為の抗体特性 は、標準の手順（下記参照）によって調整され、そして、選択的にＲｂプロティ ンを繋ぐ為に用いられる不活性マトリックスに結合される。 網膜芽腫の免疫診断法 この発明は、また特別の腫瘍がＲｂ遺伝子異常の結果であるかいなかの為の方法 を包含する。骨肉腫及びある区別できない腫瘍得ることができる。Ｒｂ遺伝子に お蹴る検出可能な障害から得ることができる。免疫診断法はこのような腫瘍の診 断においての助けとなる。 アンチＲｂこうあちの製造の為に、上述のようにして製造されたＲｂポリペプチ ド及び自然発生Ｒｂタンパクによりラビットが免疫性にされる。製造されたアン チＲｂ抗体はその後ラベルされる。例えば、放射能、螢光性、アルカリ性リン酸 塩のような酵素に酔ってラベルされる。 これは従来からの方法によって行われる。１例えば、腫瘍サンプルは液体化（ｌ 　ｉｑｕ　ｉ　ｆ　１ｅｄ）され、テストはラベルされた抗体に対し従来のＥＬ ＩＳＡ（酵素リンクド免疫ソルベント分析）法に酔って行われる。 また、人の皮膚サンプル（例えば生体サンプル）は、網膜芽腫の表現の為に、他 の免疫診断技術（例えば、！、ＲＯＩＴＴ、ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＮ　ＯＦ　ＡＮ ＴＩＧＥＮ　ＡＮＤ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ、ＩＮ　ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＩＭＭＵ ＮＯＬＯＧＹ、５版、ボストン、ＢＬＡＣＫＷＥＬＬ　５ＣＩＥＮＴＩＧＦＩＣ ＰＵＢＵＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、１９８４．ｐｐ、１４５−７５）によってもよい 。 免疫性の複合体は、アンチＲｂ抗体に対し反応する抗原（例えば、網膜芽腫ポリ ペプチド）を持つ腫瘍サンプル内において検出される。このような抗原を持たな い腫瘍は網膜芽腫遺伝子に欠陥を持つと推定される。 浄書（内容に変更なし） ダイレクト　シーフェンシング（ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　）とし て認められた　ＤＮＡ　連続性多形性現象選択された基本的な組合せ　多形性 Ｉｎｔｒｏｎｓ　２０７２　４ （イントロン） Ｅ　ｘ　ｏ　ｎ　ｓ　１６４０　０ ＤＮＡ　シーケンス　多形性は、人体網膜芽腫部位の１３個の分離されたＰＣＲ 増幅された増幅領域を直接シーケンスすることにより見い出された互いに関連性 のない９つの最少の個体から得たＤＮＡサンプルは、最影を行なうための全ての ベースを得るために検査に供される。明確に記録され得なかったベースは、表記 から外した。 ３３７ＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＴｃＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡｃ ＡＴＡＧＡＡＡＴＣ３７＠５ｉＦｒＦ置ＱＸＮＩＥ（ コア９ＡＧＴＧＴＣＣＡＴ＋ＬＡＡ７７（ＴＴＴＡＡＣＴＴＡＣ丁ＡＡＡＡｌａ ＡＡＡＴＴＧＡＴＡＣ（ａｚ。 ５ＶＨＫＦｒＮＬＬＫＥ！ＤＴ ４２１ムＧＴ＾Ｃ（＆＾＾ＧＴＴＧＡＴ＾＾ＴＧＣＴＡ丁［ｉＴＣ＾ＡＧＡＣｒ ＧＴＴＧＡＡＧ＾＾Ｃ４６２ＳＣ４６２ＳＴＫＶＯＮＡにに ４６：ｌ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴ（ＴＴＣ＾ ＧＣＡＪ偽ＴＴＣ隔＾ＧらＡＣＡ　５０４Ｙｌ）ＶＬＦＡＬｆＳＫＬＥＲＴ ５Ｄ５ＴＧ７Ｇ４＾ＣＴＴＡＴＡＴ＾丁ＴＴＧ＾ｒＪＣＡ＾ＣＣＣ＾ＧＣ＾（、 ｒＴＣＧ＾Ｔム５丁ＣＴ５４６ＣＥＬ！ＹＬＴＱＰＳＳＳＸＳ ５４７ＡＣＴＱＡＡＡＴＡｕＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＡＧＵＴｒ ＣｒｒＧＧＡＴＣ５１１８τ　ＥＫＮＳＡＬＶＬＫＶＳＷｒ ５８９ｔｅａＴＴＹｎｔＴＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＧＩａＡＡＧＴＡｔｒｉＣＡＡ Ａ丁Ｇ（ＪＡＣＡＴ６３０ＴＦＬＬＡにＧＥＶＬＱＭＥ口 ５：１１ＧＡＹＣＴＣＧＴＧＡＴ’Ｔ丁仁ＡＴＩＴｕＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＴＧ ＴＧＴＣＣ丁Ｔ（ＪＣ６７２０ＬＶＩＳＦＱＬＭＬＣＶＬＯ ６７３ＴＡｒＴＴＴ＆ＴＴ＾Ａ＾ＣＴＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＴ’ＴＧ（Ｔ ＣＪＩＡ＾ＧＡ＾ＣＣ＾７１４Ｙ　Ｆ　Ｋ　Ｋ　Ｌ　ｔ　Ｆ　、１’　Ｍ　Ｌ　 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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．網膜芽腫遺伝子又はそのフラグメントであって１５以上の塩基を含むものを 含み、サイズが１００ｋｂ以下である精製された核酸。
2. ２．請求の範囲１における核酸を含むベクトル。
3. ３．網膜芽腫ポリペプチド又はそのフラグメントをエンコードするＤＮＡを変換 して得られたセル。
4. ４．請求の範囲１の核酸において、前記核酸は前記網膜芽腫遺伝子を特定するよ うに異種混合状態において異種混合する。
5. ５．請求の範囲１の核酸によってエンコードされた遊離ポリペプチド。
6. ６．請求の範囲５のポリペプチドに対する抗体。
7. ７．自然発生網膜芽腫ポリペプチドに対する抗体。
8. ８．患者を網膜芽腫にかかり易くする網膜芽腫遺伝子における大規模欠損を検出 する方法であって、網膜芽腫遺伝子用の検査物と前記患者からの核酸サンプルを 異種混合する工程と、 前記検査物の異種混合能力を決定する工程と、含み、 前記核酸の異種混合の欠如は前記遺伝子の大規模欠損の存在を示す。
9. ９．患者を網膜芽腫にかかりやすくする人間患者の網膜芽腫遺伝子における大規 模欠損を検出する方法であって、前記患者サンプルから核酸フラグメントを精製 する工程と、 決定された前記フラグメントの物理的特性に基づいて前記フラグメントを分離す る工程と、 網膜芽腫遺伝子の為の検査物を前記フラグメントに異種混合する工程と、 前記検査物及び前記フラグメントの異種混合物を検出する工程と、 前記異種混合物と、前記検査物の異種混合によって検出された異種混合物及び正 常網膜芽腫遺伝子から分離された核酸フラグメントとを比較する工程と、を含み 、 異種混合物の欠如又は前記患者のサンプルからの異種混合物のサイズが小さいこ とは前記患者の網膜芽腫遺伝子における大規模欠損を示している。
10. １０．請求の範囲８又は９において、 網膜芽腫遺伝子用の検査物はｐ４，７ＲでクローンされたＤＮＡ若しくはこのク ローンされたＤＮＡのフラグメントである。
11. １１．請求の範囲９の方法において、前記物理的特性は分子量である。
12. １２．患者を網膜芽腫にかかり易くする患者の網膜芽腫遺伝子における小規模欠 損又は部分突然変異を検出する方法であって、 患者から取り出した網膜芽腫対立遺伝子のヌクレオチド連続体又はその亜区を決 定する工程と、前記ヌクレオチド連続体と網膜芽腫に感染していない人からの網 膜芽腫対立遺伝子又はその領域のヌクレオチド連続体とを比較する工程と、 を含む。
13. １３．患者を網膜芽腫にかかり易くする患者の網膜芽腫遺伝子における小規模欠 損又は部分突然変異を検出する方法であって、 網膜芽腫に感染していない人から得られた網膜芽腫遺伝子用検査物のずれを検出 する工程を含み、前記ずれは患者の網膜芽腫遺伝子における小規模欠損又は突然 変異を示している。
14. １４．患者の網膜芽腫へのかかりやすさを診断する方法であって、 遺伝解析におけるＤＮＡ多形体を用いて、患者の網膜芽腫対立遺伝子の共同遺伝 を検出する。
15. １５．患者の網膜芽腫へのかかりやすさを示す網膜芽腫遺伝子おける遺伝的な多 形体を検出する方法であって、患者のサンプルから核酸フラグメントを精製する 工程と、 前記フラグメントの決定されている物理的特性に基づいて前記フラグメントを分 離する工程と、ワイルドタイプの網膜芽腫遺伝子の異種混合を可能とする検出可 能な核酸プローブを前記フラグメントと異種混合する工程と、 前記プローブの異種混合物と前記フラグメントを検出する工程と、 前記異種混合物と、前記プローブの異種混合から検知された異種混合物及び患者 の両損のサンプルから分離された核酸フラグメントとを比較する工程と、を含み 、 網膜芽腫遺伝子を伴う特定の遺伝的多形体の共同遺伝子は患者の網膜芽腫に対す るかかり易さを示している。
16. １６．請求の範囲１５において、 前記物理的特性は、分子量である。
17. １７．欠陥のある網膜芽腫遺伝子を持つ患者を治療方法であって、 患者のアンチ網膜芽腫形成量の網膜芽腫ポリペプチドを投薬する。
18. １８．欠陥網膜芽腫遺伝子を持つ患者の治療のためのものであって、 網膜芽腫ポリペプチド及びその為に受容可能なキャリアを含む。
19. １９．その欠如はネオプラズムに関係する腫瘍中のタンパクの存在を検出する方 法であって、 前記タンパクに対する抗体を製造する工程と、この抗体を腫瘍サンプルに混合す る工程と、前記タンパクの腫瘍サンプル中の存在を示す突然変異複合体を検出す る工程と、 を含む。
20. ２０．患者からの腫瘍サンプル中の網膜芽腫タンパクの存在を検出する方法であ って、 腫瘍サンプルと網膜芽腫タンパクと特に反応する抗体とを接触させる工程と、 抗体と一緒に突然変異複合体が形成されているか否かを決定する工程と、 を含み、 前記突然変異復号体の形成は腫瘍は網膜芽腫でないことを示しており、突然変異 復号体の欠如は腫瘍が網膜芽腫であることを示している。
21. ２１．請求の範囲２０において、 前記抗体は単クローン抗体である。