JPH04502013A - Ｈｉｖ―１ワクチンのための合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 方ｍ称 ＨＩ　Ｖ−１ワクチンのための合成ペプチド１１亘遣１ 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）によって起きる後天性免疫不全症 候群（ＡＩＤＳ）に対する合成ペプチドワクチンのデザインおよび調製に関する 。

特に１本発明は、ＨＩＶ−１のコアタンパク質、ｐ２４、の対Ｔ−細胞用エピト ープの同定と特徴づけ、および）ＩＩＶに対する効果的な免疫性を誘導すること ができる自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）　（ｐ　２４　）およびいくつかの異種 （ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　（ｐ　２４以外のＨｒＶタンパク質）対Ｂ−細 胞エビトープを用いて免疫原性オリゴペプチドを構築するためにこのエピトープ を利用する方法論に関する。

１１旦１遣 ＡＩＤＳは、ＨＩＶ感染の最終結果であって、この疾患のための治療手段は現在 まだなく、したがってＨＩＶ特異性ワクチンの開発が緊急に要請されている。

これまでに、特定疾患に対する防御抗体が、不活化されたまたは無毒性味（種） を得るために弱毒化された生仲体そのものを用いなくても、その疾患を起こす生 物の特定構成成分を投与することによって誘導され得ることが証明された。ＨＩ Ｖ−１のエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）タンパク質（ｇｐ１６０）は、ＡＩ ＤＳに対するワクチンの候補として用いられてきた。ワクシニアのベクター中に 調製されたこの免疫原がウィルスを無力化する抗体を誘導できることが示されて はいるが、全てのワクチン試験は、霊長類を野生型ＨＩＶ単離株の攻撃から防御 することにおいて失敗した。さらに、タンパク質ｇｐ１６０の残基７３５〜７５ ２および８４６〜８６０の二つの領域が、キャリアタンパク質に接合されたこれ らペプチドで免疫された動物において２分裂促進因子に対する正常ヒトリンパ球 の増殖応答を、抑制することが示された。このペプチドに介在される免疫抑制は 、疾患の病因に関して重要な役割を果たしているかもしれない、これらの結果ち また、ＡＩＤＳに対する何らかの合成ワクチンの合理的な設計の必要性を強調し ている。ＡＩＤＳに対する最良の合成ワクチンの候補の設計においては１強力で 長持ちする交差防御抗体応答を誘導するために、ウィルス単離株間に高度に保存 された配列を含む免疫原性のきわめて強いＢ−細胞を無力化するウィルスエピト ープ（ＢＥ）を強力なＴ−ヘルパー細胞決定因子（Ｔ　−ｂｅｌｐｅｒ　ｃｅｌ ｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　：　Ｔ　ＨＤ　）に結合させる必要がある。また、 ＨＩＶ疾息に対する必要な細胞性免疫を提供するために、対ＨＩＶ特異特異性細 胞障害性ソー９２８球エピトープｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ−１ｙ自ｐｈｏｃｙＬ ｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ　；　ＣＴ　Ｌ　）を合成する構造中に含ませねばならない 。

対Ｔ−細胞エピトープおよび対Ｂ−細胞エピトープの間の特異的および優先的な 空間的位置関係が、タンデムエピトープが効果的に処理されて免疫原性を発揮す るために必要なのかもしれない、したがって、提案される設計ワクチン中の対Ｔ −細胞エピトープおよび対Ｂ−細胞エピトープにおいては、Ｔ−およびＢ−細胞 双方のメモリーが効果的に引き出されて所望の特異性の抗体が産生され得るよう な最適の構造に組み立てられるかどうかを決定することが重要である。ＴＨＤは 、共通的なものではなく、適切な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原 との関連で提示される場合にのみ免疫学的に機能することが見出された。対Ｔ− 細胞エピトープ優性の特徴的なりラスがある。したがって５合成ＡＩＤＳワクチ ンを開発するためには、種々のＨＩＶｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌおよび他の遺 伝子産生物中の最も効力のあるＴＨＤを確認することが重要である。ｇｐ１６０ タンパク質の多数のＴＨＤおよびＢＥが完全に特徴づけされ、ｇａｇおよびｐｏ ｌタンパク質の対Ｂ−細胞および対Ｔ−細胞エピトープが標準的アルゴリズム（ ａ１ｇｏｒｉｔｈｓ■）によって予測されたが、これらエピトープの構造は実験 的に決定されねばならない、近年の研究によって、ｇａｇ遺伝子産生物がＨＩ　 Ｖ感染に対する免疫応答を引き出す際に決定的な役割を果たすかもしれないこと が示された。したがって、ＡＩＤＳの臨床的進行は、ｇａｇｐ２４に対する循環 性抗体の減少を伴っており、免疫優性のｇａｇｐ１７ベブチドに対して作られる 抗体はインビトロでＨＩ　Ｖ−１感染を防御することができる。さらに、Ｂ型肝 炎ウィルスのコアＴＨＤは、Ｓ表面抗原に対する抗体反応の誘導の補助において エンベロープＴＨＤよりも効果的であることが示された。Ｂ型肝炎ウィルス系と 同様に、ＨＩ　Ｖ中の有効なｇ　ａ、　ｇ　−Ｔ　ＨＤの同定が注目された。対 Ｔ−細胞および対Ｂ−細胞エピトープのための従来の構造予測アルゴリズムを用 いて、本発明者らは潜在的に免疫原性を有する一連のｇａｇペプチド（表１）を 同定して化学的に合成して、それらのうちの一つ、ｐ２４Ｅ、の免疫学的性質を 広く研究した。

発−Ｆ！Ｌ！！２ＵＪ 本発明の一蝙様に従い、本発明者らは、タンデム（むａｎｄｅ＋＋＋）　ｇ　ａ 　ｇ　−ｐ　２４の対Ｔ−および対Ｂ−細胞エピトープを含む効力のある合成Ｈ Ｉ　Ｖ　−１免疫原（ＨＩＶ−１ｐ２４）を見出した。フロイントの完全アジュ バント中の遊離１−１１　Ｖ　−１−ｐ　２４ペプチドで初回抗原刺激を行って からフロイントの不完全アジュバント中の同じペプチドでブースターしたマウス の近交系においては、ペプチド特異性酵素免疫法（ＥＩＡ）による判定による強 力な抗ＨＩＶ−１ｐ２４抗体による２次免疫応答が誘導された。この抗−ペプチ ド抗体はイムノブロッティングにおいてウィルスル２４タンパク質を認識した。

さらに、適当なＭＨＣコンテキスト（Ｍ　ＨＣｃｏｎｔｅｘｓｔ）に提示された 該ペプチドは、ｐ２４特異性ネズミＴ−細胞株に対する著しい刺激性を有するこ とが示された。

本発明者らはまた。ＨＩＶ−１−ｐ２４の対Ｔ−細胞エビトープ、ｐ２４Ｅ、が 異種Ｂ−細胞決定因子（例えばエンベロープＢ〜細胞決定因子）に対する抗体応 答を仲介し得ることを示し、そして抗エンベロープ抗体応答を誘導することがで きるいくつかの免疫原性キメラｐ２４／ｇｐ１６０オリゴペプチドを構築した。

本発明者らはさらに、対Ｔ−および対Ｂ−細胞エピトープの極性がキメラペプチ ドの免疫原性に影響すること、および二つのエピトープ間へのリンカ−の組み入 れがペプチドの免疫原性を調節し得ることを示した。

図面の簡単な説明 図１は、９２４Ｅタンパク質の構造を示す略図である。

発明の説明 Ｔ−細胞抗原決定基を予測するために、−次配列に基づいて二つのモデルが最近 提唱された。対Ｔ−細胞エピトープが、ヘリックス構造の一方に親水性基が位置 し、他方に疎水性基が位置するような安定した両親媒性のα−ヘリックス構造を とり得るタンパク質配列を含む可能性があることが提唱された（参考文献Ｉ）。

：れとは別に、−次配列のパターンがＴ−細胞抗原部位にしばしば見い出される ことが述べられている。このＴ−細胞結合主要素は、通常、荷電基またはグリシ ンとそれに続く二つまたは三つの疎水性基とそれに続く親水性基からなる（参考 文献２）。

ＨＩＶ−Ｉｐ２４タンパク質の潜在的対Ｔ−細胞エピトープの位置は、構造に関 するアルゴリズムによって予測された（表１）、予測された９２４対Ｔ−細胞エ ビ１゛−ブｃ７）　−−）　テアルｐ　２４　Ｅ　ノ配列ＧＰＫＥＰＦＲＤＹＶ ＤＲＦＹＫは、単離された種々のＨＩＶ−１株におしＳで高度に保存されている ものであり、図１に示されるような両親媒性α−へソックス構造を有すると考え られる。

ｐ　２４．　Ｅが対Ｔ−細胞エピトープを確かに含んで（〜るということを示す インビトロ増殖実験の結果を表２に示す、ｐ２４特異性ネズミＴ−細胞株である Ｔｐ２４１は合成ペプチドｐ２４Ｅにのみ応答するが、ｐ２４Ｅの部分配列をそ れぞれ含むＴＥＩＥまたはＴＢ８ペプチドのいずれに対しても応答しな（Ｘこと が見出された。

ｐ２４Ｈの対Ｔ−細胞キャリアとしての機能は、ｐ２４Ｅ（残基２９２〜３０６ ）を含む非接合オリゴペプチドＨＩＶ−１−ｐ２４、およびｇａｇタンパク質ｐ ２４の推定上のｐ２４対Ｂ−細胞エピトープＢ（残基３０７〜３１６）のそれぞ れの免疫原性を研究することによって示された。ＨＩＶ−１−ｐ２４およびＢｐ ２４ペプチドを個々にその量を増加して、フロイントの完全アジュバントに溶か して、異なる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハブロタイブの５つのマウス近文系 に注射した。３週間後、フロイントの不完全アジュバントに溶かした初めの半分 量のペプチドをマウスにブースター注射した。チャレンジ後９臼目に血清を集め て、ペプチド特異性１ｇＧ抗体の存在を分析した。

表３にまとめた酵素免疫分析の結果は、遊離９２４Ｂペプチドが試験した三つの 免疫投与量（４，２０および１．　ＯＯμｇ）で免疫原性とならなかったことを 示している。しかし、この対Ｂ−細胞エピトープは、ｐ２４Ｅ（ペプチド）−１ １Ｖ　−１−ｐ　２４　）のＣ末端に結合された場合には免疫原性となる。抗− 〇　Ｉ　Ｖ　−１−ｐ２４１ｇＧの高力価が五つの近文系統のうちの四つの系統 、すなわち、Ｂａ　ｌ　ｂ／Ｃ（＋（２ｄ）　、ＳＷＲ／Ｊ　（Ｈ−２ｑ）、Ｃ ３Ｈ（Ｈ−２におよびＣ５７Ｂ　Ｌ／６　（Ｈ−２ｂ）　、の免疫されたマウス の血清中に検出された。０５７Ｂ＋、／６およびＢａ１ｂ／ｃマウスはそれらの 血清中でのペプチドＩｇＧに対する高力価（それぞれ、１２０００および４００ ０）から判断して最良の応答を示すようであり、一方、１／１２００のＨＩＶ− １−ｐ２４に対する力価を示すＳＷＲ／ＪとＣ３Ｈ系統、および１／１５０の力 価を示すＳＪ　Ｌ／Ｊ系統は、ペプチドに対して中位および乏しい応答をそれぞ れ示した。

対Ｂ−細胞エピトープの免疫原性ば、Ｂおよびｐ２４Ｅペプチドの極性に依存す ることが見出された。対日−細胞エピトープＢがｐ２４ＥのＮ末端に結合してい るオリゴペプチドは、そのＢ−細胞決定因子に対する抗体応答を誘導することは できなかった（表３）。

抗ＨＩＶ−１−ｐ２４ＩｇＧ抗体の特異性は、標的抗原として組換えｐ２４また はｇｐ４１（デュポン社ンまたはｇｐ１６０　（レブリゲン社（Ｒｅｐｌｉｇｅ ｎ　Ｃｏｒｐ、））を用いるＥＩＡにおいて、Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃ　（Ｈ−２ｄ） 抗ＨＩＶ−Ｉ−ｐ２４抗血清がｐ２４に対してのみ反応し、他のウィルスタンパ ク質に対しては反応しないことを示すことによって明らかとされた。同じ抗血清 はまた、市販のＨＴ　Ｖ−１ウ工スタンブロツテイング細片（パン・データ・シ ステムズ、バイオ・ラド社（Ｐａｎ、　Ｄａｔａ　５ｙｓｔｅＩｌｓ、　Ｂｉｏ 　Ｒａｄ））を用いるイムノプロッティングにおいて・ウィルスル２４タンパク 質を特異的に認識した。したがって、これらの結果は、ｐ　２４Ｅが、外来性キ ャリアタンパク質の存在しない状態で自己ｐ２４対Ｂ−細胞エピトープに対する 抗体応答の産生を誘導するために「免疫学的な補助」を提供することができる有 効な対Ｔ−ヘルパー用エピトープ（Ｔｈ）であることを示す。

対Ｔ−ヘルパーエピトープ（Ｔｈ）ｐｚ４Ｅがまた、異種Ｂ−細胞決定因子に対 する抗体応答を仲介することができるかどうかを調べるために１発明者らは、ｐ ２４ＥのＣ末端に縦に直列して連結したＨ　Ｉ　Ｖ−１ｇｐ１６０エンベロープ タンパク質（参考文献３）のアミノ酸残基７２７〜７５１　（ＬＰＴＰＲＧＰＮ ＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤＲＳ）を有する非免疫原性対Ｂ−細胞用エピト ープ配列ＢＥ３を含むキメラオリゴペプチドｐ２４Ｅ−ＢＥ３１　を合成した。

ＨｒＶ−１−９２４ペプチドでの免疫のために用いるプロトコールに従って遊離 の上記キメラペプチドで免疫した五つのマウス近交系（Ｂａｌｂ／ｃ、ＳＪＬ／ Ｊ、Ａ／Ｊ、Ｃ３ＨおよびＣ５７ＢＬ／６）は１表４に示すように、エンベロー プ（ＢＨ３）に対する２次抗体応答を生じさせることができた。抗ＢＥ３血清Ｔ ｇＧの最高力価（１／１６００）は、１００μｇの９２４Ｅ−ＢＥ３ペプチドで 免疫したＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃおよびＣ５７ＢＬ／６系統マウスにおいて得ら れたが、これはこれら二つのハプロ型がキメラタンパク質に対する最良の応答を するものであることを示唆する。

発明者らは、対Ｔ−細胞エビトープと対Ｂ−細胞エビトープの間にスペーサー配 列を導入して、キメラペプチドＢＥ３−ｐ２４Ｅの免疫原性を調節した。ｐ２４ Ｅ−ＢＨ３の場合と異なり、ＢＨ３−ｐ２４ＥペプチドのＢＥ３配列はｐ２４Ｅ のＮ末端に位置している。

このＢＨ３−ｐ２４Ｂペプチドは、試験した五つの近文系マウス系統種において は免疫原性を示さなかった（表５）、これとは対照的に、二つのプロリン残基（ ＰＰ）が対Ｔ−細胞エピトープと対日−細胞エピトープとの間に挿入されている キメラペプチドＢＥ３−ｐｐ−ｐ２４Ｂは免疫原性であり、試験された五つの近 文系マウス系統種（ＳＪＬ／Ｊ、Ａ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ　／ 　ｃおよびＣ３Ｈ）において抗−ＢＥ３抗体産生を誘導することができた１以上 の結果を総合すると、Ｔ−細胞キャリアとしてｐ２４Ｅを用いてのＢＨ３の免疫 原性の増強は、エピトープの極性に依存することが示唆される０合成構築物の非 免疫原性型である場合の形態、すなわちＢＨ３−９２４Ｅは、エピトープ間にプ ロリン−プロリンのようなリンカ−を挿入することによって免疫原性になり得る 。

ｐ２４Ｅペプチドはまた、他の異種対日−細胞エピトープの免疫原性の増強にも 用いられた。キメラペプチドＥＮＶ−ＰＰ−ｐ２４Ｅおよびｐ２４Ｅ−ＰＰ−Ｅ ＮＶは、プロリン−プロリンリンカ−を介して、ｐ２４ＥのＮまたはＣ末端のい ずれかに縦に直列にそれぞれ連結されるエンベロープタンパク質ｇｐ１２０（参 考文献４）のアミノ酸残基２５６〜２７３　（ＧＩＲＰＶＶＳＴＱＬＬＬＮＧＳ ＬＡＥ）を含む他のＨＩ　Ｖ−１対Ｂ−細胞エピトープＥＮＶを用いて合成され た。構築物ｐ２４Ｅ−ＰＰ−ＥＮＶは、ＥＮＶペプチドに対する体液性応答によ って判断して、調べた五つの近文系系統種において免疫原性であることが見出さ れた（表６）、これに対して、ＥＮＶ−ＰＰ−ｐ　２４Ｅは、五つの系統のうち 三つのみにおいて免疫原性であった。これらの結果から、対Ｂ−および対Ｔ−細 胞エビトープの極性がキメラペプチドの免疫原性の決定において重大的要因であ ることが確認される。

９２４Ｅペプチドのキャリア機能は、他のキメラペプチドＶ３Ａ−ＰＰ−ｐ２４ Ｅの免疫原性を研究することによってさらに評価された。主要無力化Ｂ−細胞エ ビトープ（参考文献５）を含むＨＩＶ−１ｇｐ１２０における可変ループのＶ３ Ａ配列Ｎ丁ＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ　（残基３０８〜３２７）は 、近文系マウスにおいて免疫原性を示さない（表７）、Ｖ３Ａペプチドは。

プロリン−プロリンリンカ−を介してｐ２４ＥのＮ末端に連結されることによっ て免疫原性となる。最高の抗−Ｖ３ＡペプチドＩｇＧの最大力価は、Ｖ３Ａ−Ｐ Ｐ−９２４Ｅで免疫されたＳ　Ｔ　Ｌ　／　Ｊマウスの血清中で測定された。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。

！ｕ！Ｌ１ 上記の記載および実施例中で特に記載のないペプチド合成の方法、酵素免疫分析 （ＥＩＡ）および他の免疫学的な試験方法は、科学的文献において広く報告され ているもので、当業者によく知られたものである。

支ｍ 本実施例はペプチドの合成を説明するものである。

表１に示されたオリゴペプチドを、Ａ　Ｂ　Ｉ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　Ｉｎｃ）　４３０　Ａペプチド合成機を用いてＩＪＩ　Ｖ／ＬＡＶ単 離株について報告されたアミノ酸配列にしたがって合成した。固体和合成のプロ Ｉ・コール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、ヒスチジン添加を二重カップリングによっ て行ったこと以外は、入手先（メーカー）の説明書に従った。粗ペプチドを、ア ニソール、チオクレゾールおよび硫化ジメチルの存在下でフッ化水素酸で処理し 、続いてジエチルエーテルで沈澱させることによって樹脂から除去した。このペ プチドを、パイダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４カラムおよび０．１％のトリフルオ ロ酢酸中のアセトニトリル濃度勾配を用いる逆相高速度液体クロマトグラフィー （ＲＰ−）ＩＰＬｃ）によって精製した。アミノ酸分析によって、それぞれのＮ 製ペプチドのアミノ酸組成が正しいことが示された。

支五五ユニ 本実施例は、ｐ２４Ｅペプチドが機能性対Ｔ−細細胞エビトーマあることを示す ために用いられる方法を説明するものである。

ペプチドＨ１Ｖｌ−ｐ２４に特異的なネズミＴ−細胞株を、Ｓｉａ　（参考文献 ６）による既述と同様の方法によって作出した。ＨＴＶ−１−９２４ペプチドの 最適濃度（１００μｇ／ｍｌ）を１組換えインターロイキン−２（２０ｕ／ｍ＋ ）の存在下で抗原特異性Ｂａ１　ｂ　／　ｃ　Ｔ−細胞株の増殖に用いた。同− 遺伝子系の牌臓細胞によって供給された９　２４ＥペプチドのインビトロでのＴ −細胞株の増殖誘導能は、標準トリチウム化チミジンの取り込みを分析すること によって判定され、９２４Ｅが機能性対Ｔ−細細胞エビトーマ含んでいたことが 明確に示されたく表２）、加えて、フロイントのアジュバント中に乳化された遊 離９２４ＢペプチドによるＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｅマウスの免疫は、抗ｐ２４Ｅ 抗体応答を誘導しなかった。

支五五↓」ユ 本実施例は、ＨＩＶ−１−ｐ２４ペプチドおよびキメラオリゴペプチドの免疫原 性を試験するために用いるプロトコールを記述するものである。

異なるＭＨＣハブロ型の五つの近来系マウス系統、すなわち、Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃ 　（Ｈ−２ｄ）、ＳＪＬ／Ｊ　（Ｈ−２ｓ＞、Ａ／Ｊ　（Ｈ−２ａ）、Ｃ３Ｈ（ Ｈ−２ｋ）およびＣ５７Ｂ　Ｌ　／　６　（Ｈ−２ｂ　）を免疫原性の研究に用 いた。各系統からの４匹のマウスをそれぞれ４．２０または１００μｇＯ）遊離 オリゴペプチドで次のようにして免疫した。フロイントの完全アジュバント（Ｃ Ｆ　Ａ　）中で一定員のペプチドを動物に皮下注射した。

これに続いて３週間後に、フＬ１インドの不完全アジュバン！−（ＩＦＡ）中に 乳化させた同ペプチドの半分量を注射によりチャレンジ投与した。チャレンジ後 ９目目に集めた実験動物の血清について、標準ＥＩＡを用いてペプチド特異性１ ｇ（コ抗体を分析した。

火工施−例一↓−■ 本実施例は酵素免疫分析（ＥｉＡ）を用いる抗ベブ千ド抗体の試験を説明するも のである。

ＥＩＡプレート（マキシソーブ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）、Ｎ　ＩＪ　ＮＣ、デンマ ーク）を１μｇ／ウェルの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７、Ｏ）中のＨＩ 　Ｖ　−１−ｐ　２４でコートすることにより抗−ＨＩ　Ｖ−１−ｐ　２４抗体 の検出のためのＥｒＡを作成した。ペプチドの吸着を４℃で一晩行わせた。ペプ チド溶液をウェルから吸引して、ウェル当り３００μｍの２％（Ｗ　／　Ｖ　） 脱脂乳（カーネーション、英国）を添加して、プレートをブロックした。室温で ２時間インキュベートした拶、洗浄用緩衝液（０，０２５％のツイーン２０　（ Ｂｉｏ−ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　（：Ａ） を含むＰＢＳ、ｐＨ７゜０）でプレートを３回洗浄することによってプレートに 結合しなかったペプチドを除去した０次いで、０゜１％脱脂乳を含むＰＢＳを用 いて、試験血清サンプルの５０倍希釈液を得た後その各々の３倍希釈を順次行っ て１次いでこれらの希釈血清の１００μｍをペプチドコートしたウェルに加えた 。血清サンプルの各希釈を二重に分析した。血清抗−ＨＩＶ−１−ｐ、２４抗体 の固定化ペプチドへの結合を、ブレートを室温で１時間インキュベートすること によって行わせた。洗浄用緩衝液でプレートを３回洗浄することによって結合し なかった抗体を除去した０次いで、抗−ＨＩＶ−１−ｐ　２４　Ｉ　ｇＧの標的 ペプチドとの特異的結合を検出するために、入手先（メーカー）の処方に従って 洗浄用緩衝液で５０００倍に希釈したホースラディツシュ゛ペルオキシダーゼ（ Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ、）が接合された１００μＩのヤギ抗−マウスＩｇＧ抗 体を、各ウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、洗浄用緩衝液で プレートを４回洗浄することによって結合しなかった抗体接合体を除去した。１ ００μｍのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と過酸化水素の混合物（１１？１ １１のＴＭＢに対して９部の過酸化水素）を加えることによって結合した接合体 の量を分析した８発色を室温で暗所で１０−１５分間行わせて、１００μｍのＩ Ｎ硫酸の添加によって停止させた。酵素反応の光学濃度を。

タイターチック・マルチ・スカシ（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉ　５ｋａｎ） 分光光度計（ＭＣＣ／３４０型）で４５０ｎｍで測定した。結果は表３に示され る通りで、力価の平均値の逆数で表されている。正常マウス血清の力価の逆数は 、ハプロ型にかかわらず、常に＜５０であった。

支１１Δ 本実施例は、抗−ＨＩＶエンベローブベブチド抗体の検出をさらに説明するもの である。

抗−エンベロープペプチド抗体を、上記と同様のＥＴＡで以下の変法を行って検 出した。ＥＴＡプレートを、ＰＢＳに溶かしたストレプトアビジンの３μｇ／ウ ェルでコートした。プレートを２％脱脂乳でブロックした後、次いで、０．１Ｈ ｇのビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）エンベロープペプチド（ＢＨ３， ＥＮＶまたはＶ３Ａ）をストレプトアビジン−コートしたウェルのそれぞれに加 えた。ビオチン化ペプチドのストレプトアビジンへの結合を、２時間室温で行わ せた。結合しなかったペプチドをプレートを３回洗浄用緩衝液（０゜２５％のツ イーン２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７，０）で洗浄することによって除去した０次い で、抗−エンベローブＩｇＧ活性を、ストレプトアビジンと結合したビオチン化 ペプチドでコートされている各ウェルに、１％脱脂乳を含むＰＢＳで連続希釈し た試験血清１００μＩを加えて分析した０次いで、抗−エンベローブ抗体の結合 を、ホースラッディッシュ・ペルオキシダーゼに接合させたアフィニティー精製 ヤギ抗−マウス■ｇＧ抗体を用いて実施例ＩＶの記載のようにして検出した。結 果は表４．５，６および７に示される通りであった。

次１億」Ｌユ 本実施例はペプチドのピオンチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉ。

ｎ）を説明するものである。

１００μ＋のＮＨ３−ビオチン（１ｍ１ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶か した１　０ｍｇのＮＨ３−ビオチン）および０．２ｍｌの１Ｍ重炭酸ナトリウム を２ｍｌのＤＭＦまたは６Ｍグアニジン塩酸のＰＢＳ（ｐＨ７，５）溶液のいず れかに溶かした１ｍｇのペプチドに加えた。ペプチドを室温で２〜６時間ＮＨ３ −ビオチンと反応させた。修飾の後、ビオチン化ペプチドを逆相ＨＰＬＣまたは ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。

塞」Ｌ匠ｙ二Ｌ」 本実施例は、対Ｔ−細胞キャリアベブチドとしての対Ｔ−細胞エピトープｐ　２ ４Ｅの使用を説明するものである。

実施例ＩＩＩにおいてＨＩＶ−１−ｐ２４ペプチドのために記述されたプロトコ ールを用いて免疫原性を調べたところ、非接合型のキメラペプチドで免疫した五 つの近来系マウス系統（Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃ、ＳＪ　Ｌ／Ｊ、Ａ／Ｊ、Ｃ３Ｈおよ びＣ５７ＢＬ／６）は二次抗−エンベローブベブチド（抗−ＢＨ３）抗体反応を 生じさせ得ることが見出された（表４）。

支五五ヱ」ユニ 本実施例は、キメラペプチドの免疫原性を変化させるためのプロリン−プロリン リンカ−の使用を説明するものである。

ペプチドＢＥ３−ｐ２４Ｅ、および二つのプロリン基を対Ｔ−細胞エビトープと 対Ｂ−細胞エビトープの間に含むＢＨ３−ＰＰ−ｐ２４Ｅを用いて、実施例ＩＩ ■に記載と同様にして免疫原性実験を行った。標的抗原としてビオチン化ＢＥ３ を用いるＥＩＡによって。

抗−ＢＥ３抗体を測定した。結果は表５に示す通りである。

尖」Ｅ倒う（ユ 本実施例は、他の異種対Ｂ−細胞エピトープのために、Ｔ−細胞キャリアとして ９２４Ｅを使用することを説明するものである。

キメラペプチドＥＮＶ−ＰＰ−ｐ２４Ｅ、ｐ２４Ｅ−ＰＰ−ＥＮＶおよびＶ３Ａ −ＰＰ−ｐ２４Ｅを用いて、実施例ＩＩＩと同様の免疫原性実験を行った。結果 は、それぞれ表６および７に示す通りである。

火ｌ旦１ 本実施例は、イムノブロッティング法の使用を説明するものである。

合成ペプチドに対してマウスにおいて作られた抗体について、イムノ−プロット 法を用いてそれらの免疫特異性を試験した。ニトロセルロース細片に固定化され Ｉｎｃ、およびＢｉｏ−ｒａｄから購入し、それを用いてイムノブロッティング を入手先（メーカー）の説明書に従って行った。マウス血清をｌ／１００の希釈 で分析した。

豊」１うＪ吠じ− ］、Ｄｅｌｉｓｉ　ａｎｄ　Ｂｅｒｓｏｆｓｋｙ、　Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、、　８２ ．７０４．８゜２、ＲｏＬｈｂａｒｄ　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ、　ＥＭＢｏ、　 ７．９３．　（１９８８）３、Ｋｅｎｎｅｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２３１．５５６．　（１９８６）４、Ｈａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２３９．１０２１．　（＋９８８＞５、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ　ｅＬ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　６２（６）、　２１０７、　（１９８８ ） ６、Ｓｉａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｌｕｎｏｌｏｇｙ、　５１．７５５．　（１９ ８４）表↓ ＨＩＶＩのｇａｇ遺伝子産生物から推定される対Ｔ−細胞エピトープｇａｇ遺伝 子　ペプチド名　配列　種間類似性産生物 ｐ１７　ｐ１７Ａ　ＥａＲ３ＬＷＶＡＴ　９２％ｐ１７Ｂ　ＤＴＫＥＡＬｒＸＩ 圧囮穂臥　８αｐ２４　ｐＺ４Ａ　ＡＲＴＬＮＡＷＶＫＷＥＥＫＡＦＳＰＥＶＩ Ｐ　部Ｘｐ列Ｂ　ＬＫＥＴＩＮＥＥＡＡ圓Ｒ前岨Ｇ　嵐ｐ２４ＣＧＱＬＲＥＰＲ ＧＳＤＩＡＧＴＴＳＴＬＱＥＱｌ　９０％１）２４０　ＴＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩ ＩＬＧＬＮＫＩ■ＭＹＳＰ　８０％ｐ２／ｉ、Ｅ　ＧＰＫＦＰＦＲＤＹＶＤＲＦ ＹＫ　＆５％ＨＩＶＩ−ｐ２４　ｐＺ４Ｅ　ＴＬＲＡＥＱＡＳＱＥＶ　８０％Ｐ 　１５　ｐ１５Ａ　ＡＲＮＣＲＡＰＲＫＫＧ属に団Ｈ呪匡　８０χ合成ＨＩＶペ プチドに対するＢａ１ｂ／ｃｐ２４−特異性Ｔ−細胞株Ｔｐ２４１の増殖応答抗 原　配列　増殖Ｇ３Ｈ−Ｔｄｒ取り込み、カウント７分）１００μｇ　２０μｇ 　４μｇ　Ｏ，８μｇｐ２４　１７，４０６＋２．４１２　１９．５ｆ１２＋２ ．２４１　１６．８７５ｔｌ、Ｋ（６，２１７ｔ７７１ｐＺ４Ｅ　（ｐ２４）　 ＧＰＫＥＰＦＲ所■永隠　５，２１６±６１９　６．２７４±５’７２’　２， ６１２士よツ　７１２±８１丁Ｅ１ε　（ｐ２４）　ＧＰＸ？ＦＲＤＹ　４１２ ±４７　４２８±３２　３１１±５７３８６±４１（ρ２−３００） ＴＢ８（ｐ２４）　ＤＲＦＹＫＴＬＲ６ｆｌ１９＋７９　４１６＋５４　Ｘ１３ ０　２６１士ツＢＦ３（ｇｐ１６０）　ＬＦｒＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥａ；　 ４２ｆｉ±４８３６８±４４２６４±ｎｘ士ゐＧＦＲＤＲＤＲ３（７２７−花ｌ ） 対照　り田±２１ Ｃｏｎ　Ａ　（５μｇ／ｍｌ）　６１，７２７±７，４２８聚ジ ＨＩＶ−１−ｐ２４およびＦ３．−２４Ｅペプチドの免疫原性の比較研究抗−Ｈ ＩＶ−ｐ２４１ｇＧ力価の逆数 投与量 マウス系統　ハブ＋１型　４μｇ　２０μ、、　１００μｇＢ　）ＩＩＶ−１， ２４Ｅ　Ｂ、ｆ２４Ｅ　Ｂ　ＩＩＩＶ−１−ｐ２４Ｅ　Ｂ−ｐ２４Ｅ　ＲＨＩＶ −１−ｐ２４Ｅ　Ｂ。

１１＋ｌｌｂ／ｃｄ＜５０２，０Ｏｆ）＜５０＜５０４，０ｆＸｌ＜５０＜ｓｏ ４．０００５０塁〉、＋１ノ“Ｊｓ（５０５０＜ｓｏ＜５０５ｆｌｌ＜５０＜５ ０１５０５０ＳＷＲ／、Ｉｑ＜５０（５０＜５１１１（，５０５０＜５０＜５０ １，２００＜５０Ｃ３Ｈｋ＜５０＜５ｆ）＜５０＜５ｏｓｏ＜ｓｏ＜ｓｏ＋、、 ２０ｏ５０（：５７ＢＬ、’６ｂ（５０４，０００＜５０＜５０１２．０００５ ０＜５ｏｌｚ、（）００５０表１ ペプチド９２４Ｅ−ＢＥ３に対する抗体応答抗−ＢＥ３ペプチドＩｇＧ力価の逆 数 Ｂａ１ｂ／ｃ　ｄ　５０　４００　１．６００Ｃ３Ｈｋ　１００　４０ｆ）　４ ００ Ｃ５７ＢＬ／６　ｂ　５０　５０　１，６００抗−ＢＥ３ペプチドＩｇＧ力価の 逆数 抗−ＢＥ３−ｐ２４Ｅ　抗−ＢＨ３−ＰＰ−ｐ２４Ｅマウス系統　４μｇ　２０ μｇ　１００μｇ　４μｇ　２０μｇ　１００μｇ抗−ＥＮＶペプチドＩｇＧ力 価の逆数 ＥＮＶ−ＰＰ−ｐ２４Ｅ　ｐ２４Ｅ−ＰＰ−ＥＮＶマウス系統　４μｇ　ｚｏμ ｇ　ｔｏｏμｇ　４μｇ　２０μｇ　ｉｏｏμｇＣ３ＨＮＤ＜５０＜５０＜５０ ｔｏｏ４００Ｃ５７ＢＬ／６　ＮＤ　５０　５０　４００　３，２００　３，２ ０ＯＮＤ：　検出されず。

抗−Ｖ３ＡペプチドＩｇＧ力価の逆数 投与量 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月１日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質の対Ｔ−細胞エピトープのアミノ酸配列を含 む合成ペプチド。
2. ２．Ｔ−細胞エピトープがタンパク質ｐ２４Ｅ（残基２９２〜３０６）を含む請 求項１に記載のペプチド。
3. ３．アミノ酸配列ＧＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫ（ｐ２４Ｅ）を有する合成ペ プチド。
4. ４．アミノ酸配列ＧＰＸＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥＯＡＳＱＥＶ（Ｈ ＩＶ１−ｐ２４）を有する合成ペプチド。
5. ５．ＨＩＶ−１のエンベロープまたはコアタンパク質対Ｂ−細胞エピトープのア ミノ酸配列に連結したＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質の対Ｔ−細胞エピトープの アミノ酸配列を含む合成キメラペプチド。
6. ６．対Ｔ−細胞エピトープがｐ２４Ｅ（残基２９２〜３０６）またはＨＩＶｌ− ｐ２４である請求項５に記載のペプチド。
7. ７．対Ｂ−細胞エピトープが、ｐ２４Ｅタンパク質のＣ−末端に連結したｇａｇ タンパク質の対Ｂ−細胞エピトープのＣ−末端に連結したコアタンパク質の対Ｂ −細胞エビトープである請求項６に記載のペプチド。
8. ８．対Ｂ−細胞エピトープが、リンカー配列によってタンパク質ｐ２４ＥのＣ− 末端に接合したＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のアミノ酸残基７２７〜７５ １を含むＢＥ３配列である請求項６に記載のペプチド。
9. ９．対Ｂ−細胞エピトープが、リンカー配列によってタンパク質ｐ２４ＥのＣ− またはＮ−末端に連結した対Ｂ−細胞エピトープである請求項６に記載のペプチ ド。
10. １０．リンカー配列がＰＰである請求項９に記載のペプチド。
11. １１．対Ｂ−細胞エピトープがタンパク質Ｐ２４ＥのＮ−末端に連結したＢＥ３ を含む請求項１０に記載のペプチド。
12. １２．対Ｂ−細胞エピトープがＨＩＶ−１エンベロープコアタンパク質の酸残基 ２５６〜２７３を含むＥＮＶ配列を含む請求項１０に記載のペプチド。
13. １３．対Ｂ−細胞エビトープが、タンパク質Ｐ２４ＥのＮ−末端に連結したＨＩ Ｖ−１ｇｐ１２０タンパク質の可変ループのアミノ酸残基３０８〜３２７を含む Ｖ３Ａ配列を含む請求項１０に記載のペプチド。
14. １４．有効成分として、ＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質の対Ｔ−細胞エピトープ のアミノ酸配列を有する合成免疫原性タンパク質を含むＨＩＶ−１に対するワク チン。
15. １５．対Ｔ−細胞エピトープがタンパク質ｐ２４Ｅまたはタンパク質ＨＩＶ−１ −ｐ２４である請求項１４に記載のワクチン。
16. １６．対Ｔ−細胞エピトープがＨＩＶ−１タンパク質の対Ｂ−細胞エピトープに 対応する合成タンパク質に連結している請求項１５に記載のワクチン。
17. １７．対Ｂ−細胞エピトープがＢＥ３、ＥＮＶまたはＶ３Ａタンパク質である請 求項１６に記載のワクチン。
18. １８．対Ｂ−細胞エピトープがｇａｇタンパク質のＣ−末端に接合している請求 項１７に記載のワクチン。
19. １９．対Ｂ−細胞エピトープがリンカー配列によってＣ−末端に接合している請 求項１７または１８に記載のワクチン。
20. ２０．Ｂ−細胞エピトープが、ＰＰからなるリンカー配列によってｇａｇタンパ ク質に接合したＢＥ３、ＥＮＶまたはＶ３Ａタンパク質である請求項１６に記載 のワクチン。