JPH04502469A

JPH04502469A - ヒンダードカップリング剤および方法

Info

Publication number: JPH04502469A
Application number: JP2502109A
Authority: JP
Inventors: キャロル，スティーブン　フィッツヒュー; ゴフ，デイン　エー．
Original assignee: ゾマ　コーポレイション
Priority date: 1988-12-22
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1992-05-07
Also published as: US5093475A; FI913049A7; AU4849190A; WO1990006774A1; EP0454726A1; NZ231988A; CA2006629A1; EP0454726A4; KR910700242A; DK121691A; AU645745B2; DK121691D0; NZ241869A; FI913049A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒン　−′　−言ン　１　゛本出願は、１９８８年１２月２２日に出願の第０７／２８８．５８６号（これは参考として本明細書に組み込まれる）の一部継続出願である。発明の背景本発明は接合体の形成に関し、特に結合の一部としてジスルフィド結合を使ってアミノまたは炭水化物成分の所で成る種を別の種に結合せしめることに関する。更に詳しくは、本発明は、置換２−イミノチオランハロゲン化水素塩および架橋剤としてのそれらの化合物の利用に関する。アミノまたは炭水化物成分への様々な結合が幾つかの理由で望ましい、免疫グロブリンを含む接合体の形成では、例えば、抗原結合部位または補体結合のためのＦｃ１ｉ上の部位への近づきやすさを維持するために、免疫グロブリン上の特定の領域における結合がしばしば望ましい、アミノまたは炭水化物成分への結合を所望する種は、しばしばそれらの成分と直接反応できる能力を欠いている。よって、反応成分を含む化合物に所望の種を連結するためには、幾つかの準備をしなければならない。免疫毒素は細胞毒性物質に化学的に結合した免疫グロブリンである。一般に免疫毒素は、細胞特異的抗原結合剤を細胞毒性物質に共有結合せしめることにより合成される０例えば、免疫毒素は、植物または細菌の毒素、例えばりシンＡ鎖またはアブリンＡ鎖に結合した免疫グロブリン抗体であることができる。それらの免疫毒素が標的細胞表面上の抗原に結合し、次いで細胞毒性物質が細胞に入り、細胞を殺す、抗体と毒素との接合は、通常は２つのタンパク質問にジスルフィド結合を導入する架橋剤によるものである。汎用されている２つのジスシフ。イドカップリング剤は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　■ドア２３−７３７．１９７８　）および２−イミノチオラン（２１Ｔ）　（Ｋｉｎｇら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌｌ：１４９９−１５０６．１９７８）である、しかしながら、それらの試薬により形成されるジスルフィド結合は生体内で不安定であることが報告されている（Ｔｈｏｒｐｅら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７：５９２４−５９３１゜１９８７）　。遊離抗体の放出を結果として伴うこのジスルフィド結合の崩壊は、標的細胞を殺すために利用可能である免疫毒素を減少させると同時に、放出された抗体が標的抗原を目当てに免疫毒素と競争し得るので問題である。　Ｔｈｏｒｐｅら（前掲）は、生体内でより安定なジスルフィド結合を存すると思われる２つのカップリング剤、５７４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェー）　（ＳＭＢＴ）と４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）を合成している。しかしながら、５ＰＤＰと同様にＳＭＢＴおよびＳＭＦＴは低い水溶解度を有し、修飾されるリジン残基の正電荷を中和し、そして２１Ｔよりも効果的でない接合を示す、更に、ＳＭＢＴ、ＳＭＰＴまたは５ＰＤＰとアミノまたは炭水化物基との反応は、本発明の架橋剤と異なり、修飾の最中にモニタリングすることができない。発明の要約本発明は、ジスルフィド結合の形成のための新規化合物および方法を提供する。より詳しくは、新規化合物は、下式（１）の置換２−イミノチオランハロゲン化水素塩カッブリ上式中、　（１）Ｘはハロゲンであり；Ｒ，はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換のまたはハロゲン化Ｃ１−、アルキル；非置換のまたはハロゲン化Ｃ１，。アルコキシ；非置換のまたはハロゲン化Ｃ！−、アルケニル；非置換のまたはハロゲン化Ｃ２−１アルキニル；非置換のＣ１−暑シクロアルキル；非置換のアリール；ハロゲン、アミノ、非置換のもしくはハロゲン化Ｃ７−１アルキル、または非置換のもしくはハロゲン化Ｃ０−、アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換の複素環；アミノ、ハロゲン、非置換のもしくはハロゲン化Ｃｌ−１アルキル、または非置換のもしくはハロゲン化Ｃ１ −、アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ１，Ｒ３およびＲ４は各々独立して水素であるかまたはＲ，の意義から選択され；またはＲ１およびＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ１−５アルキレン橋を形成し；またはＲ６およびＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ＋−ａアルキル基により置換されたＣＩ−Ｓアルキレン橋を形成し；そしてＲ３は水素またはＣ，、アルキルである。２つの種を共有結合せしめる方法も本発明に包含され、該方法は、２つの種の一方または両方を上式（１）の架橋剤と反応させ、次いで２つの種を一緒に反応させることを含んで成る。結合基を含む得られた接合種もまた本発明に包含される。更に、置換２−イミノチオランと核基との反応の直接測定を可能にしそして反応をより効率的にする失活剤の使用も本発明に含まれる。図面の説明図１は、様々な架橋剤およびＴＮＢと接合されたモノクローナル抗体７９１からのチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）のグルタチオン誘導性放出の相対速度を示す。図２は、Ｉｘｓｌ放射！！議実験により測定した４Ａ２１５−メチル−２１Ｔ／ＲＴＡｓ。および４Ａ２／５ＰＤＰ／ＲＴＡ３゜接合体のラット中での相対安定性を示す。発明の詳細な説明本発明の置換２−イミノチオランハロゲン化水素塩は、制御された安定性を存するジスルフィド結合により２つのタンパク質を共有結合せしめるための架橋剤として有用である。式（１）の本発明の化合物の幾つか、特にＲ３が低級アルキルでありそしてＲ２ −Ｒ４が水素または低級アルキルであるものは、除草剤および殺虫剤の中間体として有用な既知化合物である。それらの化合物は米国特許第３，３１８，９１０号および第３，３４８，９４０号において開示されている０本発明に含まれる他の化合物は新規である。その上、架橋剤としての式（１）の化合物の用途は新規である。置換基Ｒ１〜Ｒ４またはＸのいずれかがハロゲンであるかまたはハロゲンを含む場合、そのようなハロゲンは便利にはブロモ、クロロまたはフルオロから選択される。「ハロゲン化Ｃ＋−ｓアルキル」、ｒハロゲン化Ｃ＋−ａアルコキシ」、「ハロゲン化Ｃ！−１アルケニルＪおよび「ハロゲン化Ｃ！−，アルキニルＪなる用語は、１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個のハロゲンにより置換されたＣ　ｔ−Ｓアルキル、ＣＩ−アルコキシ、Ｃｚ−ａアルケニルおよび　ＣＩ−６フルキニルをそれぞれ言い、そのようなハロゲンは好ましくはブロモもしくはフルオロまたはその２つの組合せである。「複素環」または「複素環式化合物」なる用語は１〜３個のへテロ環原子を有する環含有化合物を言い、ペテロ原子は酸素、硫黄または窒素から選択される。複素環は１または複数の環を含むことができ、そして環は融合していてもいなくてもよい、最も好ましくは、複素環は唯一の環を含み、そしてフラニル、ピラニル、チオフェニルまたはピリジルであろう。本発明のプラクナス上、Ｘは好ましくはブロモまたはクロロであり、最も好ましくはクロロである。Ｒ８は、好ましくは、所望によりブロモで置換されることがあるＣ　１−４アルキル、もしくはアリールであり、またはＲ２と一緒になってＣ１−５アルキレン橋を形成し、またはＲ２と一緒になってＣＩ−Ｓアルキレン橋を形成する。Ｒ２は、好ましくは水素、もしくは所望によりブロモで置換されることがあるＣ１−４アルキルであり、またはＲ７と一緒になって０８−、アルキレン橋を形成する。Ｒ１は、好ましくは水素、Ｃ１−４アルキルもしくはアリールであり、またはＲ，もしくはＲ２と一緒になって、所望により１〜４個のＣＩ−Ｚアルキル基により置換されることがあるＣｌ−５アルキレン橋を形成する。Ｒ４は、好ましくは水素またはＣ７−４アルキルである。Ｒｓは、好ましくは水素またはＣ１−４アルキルである。上式（１）の範囲内の代表的化合物を表Ａに与える。ｌ八ム　ＲＩ　ＣＨＩ　）Ｉ　ＨＨＣ１、２Ｃ１Ｈｉ　Ｈｌ（ＨＣ１３Ｃ（ＣＨｓ）ｓ　’ＨＨＨＣ１４Ｃ１（ｓ　ＣＨｓ　ＨＨＣ１５（−ＣＨｔ（Ｃ）Ｉｔ）＊Ｃ）！、−Ｉ　ＨＨＣ１６Ｈ（−ＣＨＩ（ＣＨ，）、ＣＨＩ−）　ＨＣ１７ＣＨＩＣＨｔ　）ｌ　ＨＨＯｒ８　Ｃ）１．ｃＨ，Ｃ）！、　ＨＨＣ１１０ＣＨＩ　１１　Ｃ）１．　ＨＣＩＩｆ　ＨＨＣ１（、Ｃ）ｌ、　ＣＨＩ　２　ＣａＨ＊　ＣＨｘ　ＨＨＣ１１３４−ＣＩＣ＠Ｈ４ＨＨＨＣ１１４３−フラニル　ＨＨ）Ｉ　Ｃ１１５ＣＨ（ＣＨＩ）ｔ）ｌ　ＨＨＣ１＋６　ＣＨｓ　ＣＨ，（＆　ＣＨ，Ｃ目１７　ＣＪｔ＋　ＨＨＨＣ１１８ＣＨｔ［］ｒ　ＨＨＨＣ１１９ＣＦ、　ＨＨＨ，Ｃ１２０ＣＨ＝ＣＨ＊　Ｉ（ＨＨＣ１２１２−ＮＨ，Ｃ，）１．　ｌ（ＨＨＣ１２２）１　ｔ−Ｃ（Ｃ１ｌ−）ｚ−（ＣＨ−）＊−ＣＨ−Ｉ　ＨＣ１本発明の化合物は、所望の置換基に従って選択される当業者にとって周知の常用技術により調製される。より詳しくは、本発明の化合物は、米国特許第３．３１８．９１０号および第３．３４８゜９４０号に記載の方法によって調製され、該特許の開示は参考として本明細書中に組み込まれる。一般に、水性またはアルコール性媒質中で式（Ｉ［）のニトリル（ここでＺはＨまたは−Ｃ（０）Ｒ，であ’）、’Ｆ：　Ｌ／　”’ＣＲ＆　ハＣ１−６７）Ｌｔ＋）Ｌｔ’７：する）をハロゲン化水素Ｈ−Ｘ、例えば塩酸または塩化水素ガスと反応させ、式（１）の環化２−イミノチオランハロゲン化水素塩を得る。式（Ｉ）の化合物は、確立された方法により形成される反応混合物から回収することができる。式（１）の化合物を合成する方法において使用する出発物質および試薬は、既知であるか、またはそれらが新規である場合には当業界で既知の方法もしくはそのような方法に類似した方法により製造することができる。本発明の置換２−イミノチオランが少なくとも１つの不斉中心を有することに気づくだろう０本明細書中で開示される特定の化合物は、他に指摘しない限り、エナンチオマーの混合物を意味する０個々のエナンチオマーまたはそれらの混合物が本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物は、別の化合物上のアミノまたは炭水化物基の部位においてジスルフィド官能基を配置させる上で有用であり、同様に特定の官能基、即ち一方がアミノ基そして他方がチオールまたは核成分において結合させるのに有用である。それらのカップリング剤の実用性は、少なくとも１つの種に関して部位特異的方式で、そしてしばしば両方の種において部位特異的に、種間に結合を提供することにある。それらの剤は、従って例えばタンパク質または他の分子を別のタンパク質上のアミノ基または炭水化物に結合する際に使用することができる。それらは、別の種の核成分との反応への部位特異性のためにスルフヒドリル成分を導入するのに用いることもできる。本発明の置換２−イミノチオランはＵＶ吸収を示し１．その吸収は核性化合物による攻撃後に環が開環されると失われる。よって、反応が起こっている時に低分子量化合物（例えばアミノ酸または水）による加水分解の速度または程度を観察することができ、モニタリングしそして制御することを可能にするので、それらのカップリング剤は有用である。２４８ｎｓの波長での吸光度ＣＡｔ、ａ　）の変化を分光光度計で観察することにより、反応をモニタリングすることができる。本発明の置換２−イミノチオランは、２４８　ｎｓの波長での吸光度が高すぎて読めない時、それらとタンパク質との反応の直接測定を可能にするユニークな特性を有する。２−イミノチオランの硫黄原子は環構造内に環化されるので、スルフヒドリル基と反応する試薬（例えば芳香族ジスルフィド）との反応には利用することができない、一度開環が起こりそしてスルフヒドリル基が暴露されるようになれば、芳香族ジスルフィド（例えばジチオニトロ安息香酸、　ＤＴＮＢ）はスルフヒドリル基と反応することができる。そのような反応は別の波長（例えばＤＴＮＢについては４１２　ｎｍの波長、　Ａ４＋ｔ　）においてモニタリングすることができる。これは、速度論の直接定量と制御および修飾の程度、並びにスルフヒドリル形の活性化を可能にする。本発明の架橋剤は、５ＰＤＰ、ＳＭＰＴおよびＳＭＢＴと対照的に水溶性である。これは、それらを使用しやすくし且つより良好な接合収率を与える。また、接合を水性条件下で行うことができることによって、有機溶剤によりタンパク質が損傷を受ける可能性が回避される。本発明の架橋剤を用いて形成された結合は、非置換２−イミノチオランを用いて形成された結合を上回る幾つかの利点を有する。図１に示されるように、置換２ −イミノチオランを用いて形成された結合は、試験管内において還元に対する安定性の増加を示す、その上、本発明の結合は、基Ｒ８〜Ｒ４の少なくとも１つの存在が、分子を血清中のグルタチオンもしくは他のチオールによるジスルフィド交換に対してまたはジスルフィド結合を尚早に開裂し得る酵素攻撃に対して立体障害のあるものにするであろう。それらのカップリング剤は、特に免疫毒素の合成において有用である。病気の治療において有用である免疫毒素は２つの成分により特徴づけられる。１成分は、吸収されると細胞にとって致命的である細胞毒性物質である。第二成分である抗原反応性物質は、特定の細胞タイプ、例えばＴリンパ球またはＢリンパ球に毒性物質を供給するための手段を提供する。前記２成分は、様々な公知の化学的方法のいずれかによって複合体化されるかまたは一緒に結合される。最も一般的で且つ好ましい方法の１つは、ジスルフィド結合を有する架橋剤を使用することによるものである０本発明のカシプリング剤は、免疫グロブリン（Ｉｇ）抗原−反応性物質を、該１ｇに生来ある利用可能なアミノ基のところでスルフヒドリル含有細胞毒性物質（ｔｏｘ）に共有結合せしめ、免疫毒素を形成させるそのようなジスルフィド結合を提供する。そのような結合は次の構造を有するだろう：細胞毒性物質がチオール基を含まない場合、本発明の方法に従って置換２−イミノチオランを使って、そのような基を毒素に付加することができる。本発明では、芳香族ジスルフィド化合物を、毒素との反応の前に、免疫グロブリンおよび置換２−イミノチオランハロゲン化水素塩と反応させることができる。本発明において有用な芳香族ジスルフィド化合物の例は、ジチオニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、２．２′−および４．４′−ジ−ピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）、並びに２，２′−ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド〕である。免疫グロブリン／２１Ｔ反応混合物中の芳香族ジスルフィド化合物の存在は、（ｉ）反応の進行および程度のリアルタイムのモニタリングを可能にし、（ｉ　ｉ）暴露されたスルフヒドリルを活性化し、そして（ｔｉｉ）免疫グロブリン中の反応性スルフヒドリルをブロックして、毒素との次なる反応の前または最中の抗体三量化を防ぐ。更に、非置換または置換２−イミノチオランは両方とも結合反応中に重合し、そのためイミノチオラン由来の２〜５またはそれ以上の基の鎖がしばしば生成することがわかっている。イミノチオラン結合のスルフヒドリルの所での芳香族ジスルフィド化合物のような失活剤の存在は、そのような重合が起こるのを防ぎ、各反応部位のところに単一のイミノチオラン誘導基を生成せしめ、より効率的な反応をもたらす。本発明の一態様は、２つの種を共有結合せしめる方法であって、ａ）一方または両方の種を、芳香族ジスルフィド化合物のような失活剤と共に、非置換または置換２−イミノチオラン架橋剤と反応せしめ、ｂ）脱塩して試薬を除去し、そしてＣ）上記２つの種を混合する、ことを含んで成る方法である。様々な細胞毒性物質が免疫毒素における使用に適当である。本発明により期待される細胞毒性物質としては、放射性核種、例えばヨウ素−１３１、インドリウム−９０、レニウム−１８８およびビスマス−２１２；多数の化学療法剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびシスプラチン：並びに細胞毒性タンパク質、例えばリポソーム不活性化タンパク質、例えばアブリンおよびリシン（またはそれらのＡ鎖）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ等、またはそれらの組換え誘導体が挙げられる。（一般的には、加ｈｉｍｅｒｉｃ　Ｔｏｘｉｎｓ″、　０１ｓｎｅｓａｎｄ　Ｐｆｈｌ、　ＰｈａｒＩｌａｃ、　Ｔｈｅｒ、、　２５：３５５−３８１（１９８２）、および”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙどＢａ１ｄｖｉｎおよびＢｙｅｒｓ　１ｍ、　ｐｐ、１５９−１７９．２２４−２６６゜Ａｃａｄｅｗｔｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）を参照のこと、これは共に参考として本明細書中に組み込まれる。）毒素レクチンは本発明において特に着目されるものである。毒性レクチンの細胞障害作用、特にリシンとアブリンの細胞障害作用はよく研究されている。毒性レクチンがジスルフィド結合により連結した２つのポリペプチド鎖ＡとＢから成ることはよく知られている。細胞障害作用はＡ鎖と関係があり、有核細胞中のタンパク質合成の阻害に関係づけられている。Ｂ鎖は本質的にＡ鎖のための輸送ビヒクルであると考えられている。Ｂ鎖は細胞表面の多糖単位を認識し、そしてそのような単位との高親和性相互作用をつくり出す、一端Ｂ鎖が細胞表面の多糖単位と結合すれば、Ａ鎮が細胞内に取り込まれ、リポソームのタンパク質合成を阻止し、最終的には細胞致死をもたらす０本発明の一態様においては、リポソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）が毒性レクチンＡ鎖である。更なる態様では、毒性レクチンＡ鎖がリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）である、ＲＴＡは天然のものでもよく、それの組換え誘導体でもよく、または化学的に修飾されてもよく、例えば脱グリコＲＴＡであることができる０本発明ではりシンＡｌの使用が好ましい。リシンに類似した構造および機能のタイプの毒性レクチンとしては、アブリン、モデッシンおよびヤドリギ毒素が挙げられる。別のカテゴリーのＲＩＰは、リシンＡＭに類似したＩ！Ｐ、特性を有する１つのサブユニットのみを有する毒素である。このタイプのＲＩＰは、リシンＢ鎖に類似した結合性断片を生来持たないので、完全な細胞に対する毒性を欠（、この後者のタイプのＲＩＰの例としてはゲロニンおよびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。本発明によれば、ＡおよびＢポリペプチド鎖にスプライスすることができる任意の毒性レクチン、特にアブリン、モデッシンおよびヤドリギ毒素を、好ましいＢ様においてリシンを使用するのと同様な方法で使用す多ことができる。加えて、任意のＲＩＰ、特にゲロニンおよびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質をリシンＡ頓と同様にして使用することができる。そのような物質は、本発明の目的上毒性レクチンへ鎖と等価である。本発明において実質的にレクチンＢｔＸ不純物を含まない毒性Ａ鎖を使用することにより、細胞特異的細胞毒性を達成することが好ましい、実質的に純粋なレクチンＡ鎖を獲得するための好ましい方法は、米国特許第４，５９０，０７１号に記載されている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。免疫毒素の抗原反応性成分は、好ましくは、多数の源から得ることができ且つ細胞特異抗原と反応性である免疫グロブリンである。ｒ免疫グロブリン」なる用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、反応性断片、例えばＦｖ。Ｆａｂ、　Ｆ　（ａｂ）　ｔ　、合成免疫グロブリンおよび組換え免疫グロブリン、例えばキメラ免疫グロブリンまたはそれらの誘導体が含まれる。好ましくは、免疫グロブリンは、はとんどのＴ細胞またはＴ細胞とＢ細胞のサブセットの両方と反応性である、マウス、ヒトまたは他の哺乳類起源のＴｇＭまたは■ｇＧイソタイプのモノクローナル抗体（ａＡｂ）　、より好ましくはＴ細胞とＢ細胞の両方に見い出されるＣＤ５抗原と反応性のｍＡｂである。本発明のカップリング剤により共有結合された免疫毒素は水溶性であり、５ＰＤＰまたはＳＭＰＴに比べて大きい接合効率を有し、そして５ＰＤＰまたは２１Ｔで架橋された免疫毒素よりも大きく増加されたジスルフィド結合安定性を示す。本発明の免疫毒素は病気の治療においてを用である。そのような免疫毒素は、当業界で周知の方法に従って、試験管内では細胞もしくは組織にまたは生体内では患者に投与することができる。免疫毒素は療法的有効量、即ち病的状態がより正常な状態の方に変えられるように免疫毒素が標的細胞、例えばＴ細胞またはＢ細胞の除去を引き起こす用量、で投与すべきである。免疫毒素製剤の用量は、標的細胞、投与が試験管内もしくは生体内のいずれであるか、投与が他の免疫毒素もしくは治療薬と接合されているかどうか、または他のそのような要因に依存して広範囲に異なるであろう。一般に、本発明の免疫毒素を含有する医薬組成物は、「−同量」形態で患者に投与されるであろう、「−同量」なる用語は、ヒト被検者および動物にとって一回の投薬として適当である物理的に別々の単位を意味し、各単位は、必要とされる医薬希釈剤、担体、賦形剤またはビヒクルと共に、所望の医薬効果を生じるように設計された予め決められた量の活性物質を含有する。それらの薬剤の適当な賦形剤または担体としては無菌の非発熱性水溶液が挙げられる。それらの溶液は、好ましくは生理的領域に緩衝化された等張溶液、例えばリン酸塩緩衝化塩溶液（０，１Ｍリン酸Ｎａ　；　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐｌｌ　６．８〜７．２）である、これらの医薬組成物は、所望により保存剤を含んでもよい、保存剤の例としては、界面活性剤、特にポリソルベート８０等が挙げられる。加えて、該製剤は長期保存のため所望により凍結乾燥することができる。投与は、腹腔内注射または静脈内注射により達成することができる。静脈内注射が好ましい、投与量は患者の大きさおよび状態に従って異なるだろう、典型的な一回量は約５〜２０ｔａｇ／ｋｇ体重である。最も好ましい一回量は約１０〜１５　ｍｇ／ｋｇである。本明細書中で使用される「種」なる用語は、結合の一部としてジスルフィド結合を使ってアミノまたは炭水化物成分のところで第二の化合物に結合させることができる任意の化合物を包含する０本発明の架橋剤を用いて修飾することができる化合物は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド；タンパク質；核酸；多糖；非タンパク質化学療法剤；カルボン酸イオノホア、例えばモネンシン；炭水化物含有分子または樹脂；組織化学的または免疫化学的検出酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等；および特異的なレセプターまたは細胞を認識するポリペプチドまたはタンパク質、例えば成長因子またはペプチドホルモンが挙げられる。そのような化合物は、互いとまたは別のタンパク質、例えば細胞毒性物質もしくは免疫プロプリンと結合することができる０例えば、組織化学的または免疫化学的検出試薬を、置換２−イミノチオランで修飾されたモノクローナル抗体と接合させることができる。同様に、成長因子またはペプチドホルモンを、例えばカップリング剤により修飾し、そして細胞毒性物質に接合させることができる。実施例次の実施例は、本発明の実施を示すために与えられ、そして決して本発明を限定するつもりではない。次の略号をここで使用するＲＴ：室温。ＴＨＦ　：テトラヒドロフラン。ＰＢＳ　ニリン酸塩緩衝化塩溶液。ＤＴＮＢ　ニジチオニトロ安息香酸。ＴＮＢ　：チオニトロ安息香酸。ＩｇＧ：免疫グロブリン。ｍＡｂ：モノクローナル抗体。ＢＰ二ベースピーク。ｂ、　Ｐ、：摂氏度における沸点。ｍ、ｐ、：摂氏度における融点。ＮＭＲ：６０　ＭＨｚでの核磁気共鳴；全での化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に関するδｐｐｍ値において与えられる。ＬＲＭ−３二低分解能質量分析。 ■Ｒ：赤外スペクトル；ａ１１−’で与えられる値、Ｓ−強い、ｂｒ−ブロード、ｖ、ｓ、−非常に強い、ｖ、ｂｒ、ミ非常にブロード。ＩＬ２：インターロイキン２゜ＩＮＤＩは、ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ　８７５９で寄託された細胞系Ｘｉ聞Ｅ−００１により生産されるイソタイプＩ　ｇＧ２ａのモノクローナル抗体である。この謡＾ｂは米国特許第４，５９０，０７１号において記載されている。ＩＮＤ２は、ＡＴＣＣ受入番号）ＩＢ　８７６０　テ寄託された細胞系ＸＭＭＭＥ−００２により生産されるイソタイプＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体である。この＋ｓＡｂは米国特許第４，５９０．０７１号において記載されている。７９１は、＾ＴＣＣ受入番号ＨＢ　９１７３で寄託された細胞系ＸＭＭＣＯ−７９１により生産されるイソタイプＩｇＧ２ｂのモノクローナル抗体である。この −Ａｂは米国特許第４，７０８，８６２号において記載されている。４Ａ２（４Ａとしても知られる）は、イソタイプＴｇＧ２ａのモノクローナル抗体である。４＾２を生産するハイブリドーマ細胞系は、ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ　８３５０で寄託されている。このｍＡｂは米国特許第４．６７７．０５６号において記載されている。Ｈ６５はイソタイプＩｇＧ１のモノクローナル抗体であり、ＡＴＣＣに寄託されそして受入番号ＨＢ　９２８６を与えられたハイプリドーマ細胞系ＸＭＭＬＹ− ）１６５により生産される。この抗体はＫｅｒｎａｎら、　Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．　」：１３７（１９８４）に記載されたようにして調製される。ＲＴＡｓ−は、約３０ｋＤの分子量を有するリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）の一種であり、例えばＦｕ　Ｉ　ｔｏｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓｓ。％■：５３１４−５３１９（１９８６）およびＶｉｄａｌら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３ｆ１ニア０５−７１１（１９８５）に記載されたようなものである。Ａ、２−イミノチオーンハロ゛ン　の゛　：皇施皿上ニー　ルー２−イミノチオーンａ　メ　ルー２１Ｔ４−チオアセチルペンタンニトリル（７，２ｇ）を乾燥メタノール（５ｋｌ）に溶解させ、そして塩化水素ガスを溶液中にＲＴで５分間バブリングさせた０反応混合物をＲＴで２０時間攪拌し、次いで固体が晶出し始めるまで減圧濃縮した。エーテルを添加し、少量の固体生成物を濾過した。濾液を濃縮して橙色オイルを得、これを酢酸エチルでスラリー状にした０次いで溶液が得られるまで５０℃においてエタノールを添加した後、混合物を一２０°Ｃに冷却し、そしてエーテルを添加した。更に冷却すると、淡桃色の針状晶として４．１６　、　（６０％）の５−メチル−２−イミノチオラン塩酸塩、　＋ａ、ｐ、　１２２−１２３°Ｃ（化合物１゜表Ａ）を得た。生成物の分子構造は、下記のように目的の化合物のものと確認された。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　：　４．１０（ｓ、　ＩＨ，メチン）、　３．２３（ρｓ、ｔ、　２Ｈ）、　１．６０−２．６７（ｍ、　２８）、　１．３８（ｄ、　２Ｈ，Ｊ−７，０，５−Ｍｅ）。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　２８１０（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６１５（ｓ、、　ｂｒ、、　Ｃ＝＝Ｎ）。１５３０、１４５０．１４１５．１２４０．１０３０．９９０．８９０（ｓ、、　ｂｒ、）。６８５（ｓ、、　Ｃ−５）、　４２５　。１隻■ｌニーフェニルー２−イミノ　オーフ　ユニルー２ｒ工Ｌ４−フェニル−４−チオアセチルブタンニトリル（２，８２ｇ）を乾燥メタノール（３０ｓ＋１）に溶解させ、そして塩化水素ガスを溶液中にＲＴで５分間バブリングさせ、次いでＲＴで４時間攪拌した０反応混合物を減圧濃縮し、５０″Ｃでエタノール／酢酸エチルの混合物中に溶解させた。−２０℃に数時間冷却した後、エーテルを添加して白色固体を沈澱させ、これを濾過し、真空乾燥すると１．２２　ｇ　（４４％）の５−フェニル−２−イミノチオラン塩酸塩、　ｍ、ｐ、　１４２−１４４°Ｃ（化合物２９表Ａ）を得た。生成物の分子構造は、下記のように目的の化合物のものと確認された。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　：　７．５０（ｂｒ、ｓ、、　５Ｈ，フェニル）＋　５．４０（ｄｄ、　ＩＨ。メチン）、　３．２５−３．７５（ｍ、　２）１）、　２．２０−２．８４（ｍ、　２Ｈ）　。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　３３６０．２Ｂ７０（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６１５（ｓ、、　ｂｒ、。Ｃ電Ｎ）、　１５１５．１４９５．１４５０．１４０５．１３２５．１０２０．９８５．８３０゜７７０、７６０．７００（ｓ、）、　６７５（ｓ、）　。ス】１１１ニーｔ−゛　ルー　−々　オーフ　Ｌ−ブチル−１土工Ｌ５．５−ジメチル−４−メルカプトヘキサンニトリル（１゜５５ｇ）を乾燥メタノール（１５■■）に溶解させ、そして１（ＣＩガスを溶液中にＲＴで５分間バブリングさせた後、溶液をＲＴで２時間攪拌した。追加のＨＣＩガスを溶液にバブリングさせ、更に撹拌を続けた０反応混合物を減圧濃縮し、得られたオイルを温酢酸エチルで粉砕し、次いで溶液が得られるまで温エタノールを添加した。混合物を一２０℃に冷却した後、エーテルを添加した。これを−晩冷却し、次いで濾過すると、白色固体として０．４２　ｇ　（２２％）の５−ｔ−ブチル−２− イミノチオラン塩酸塩、　＋＊、ｐ、　２２６−２２８“Ｃ（化合物３１表Ａ）を得た。生成物の分子構造は、下記のように目的の化合物のものと確認された。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　：　４．１０（ｄｄ、ＩＬメチンン、　３．２５（ｍ、２）１）、１．８６−２．７０（＋ｍ、　２）１）、　１．０３（ｓ、　９）１．　ｔ−Ｂｕ）。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　２８９０（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６２０（ｓ、、　ｂｒ、、　Ｃ−Ｎ）。１４００（ｓ、）、　１３７０．１２５５．１１７５．９９５．６９０（ｓ、、　Ｃ−５）。爽胤阻土：５５−ジメチル−２−イミノチオーン　ａ　ジメチル−１上工Ｙ実施例１と２の方法に従って、乾燥メタノール中の４−メルカプト−４−メチルペンタニトリル（３，６ｇ）の溶液にＨＣＩガスをバブリングさせた。粗生成物を処理すると、白色固体として３．０　ｇ　（６５％）の５，５−ジメチル−２ −イミノチオラン塩酸塩、　ｍ、ｐ、　１５６−１５９°Ｃ（化合物４１表Ａ）を得た。生成物の分子構造は、下記のようなＮＭＲとＩＲにより目的の化合物のものとｉ認された。ＮＭＲ（口ＭＳＯ）　７　３．４５（ｔ、２８．　Ｊ−７，０）、２．１８（ｔ、２８．　Ｊ、７．０）。１．６０（ｓ、　６Ｈ，２−Ｍｅ）　。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　２９００（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６１０（ｓ、、　ｂｒ、、　Ｃ＝Ｎ）。１５１０、１３２５．１２４０．１２１５．１１２０．９９０．８７５．８４５．６９０（ｓ。Ｃ−５）　。！施■ｌ：２−イミノ−１−チアスピロ　４５−゛カン　スピュ：」二ＬＬとアルゴン下で〜７８℃においてＴ　ＨＦ　（１０■■）中のｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１０Ｍ溶液０．６７ｍ１）の溶液にア七ト二トリル（０，３５ｍ１．０．ロアミリモル）を添加した。混合物を１０分間攪拌した後、乾燥Ｔ　ＨＦ　（２ｍｌ）中の１−チアスピロ（２，５）オクタン（０，８６ｇ、　０．ロアミリモル）を中細した。冷却浴を除去し、そして反応液を２時間攪拌した。濃ＨＣＩ　（１，５＋ａｌ）と水（３゜５−１）の混合物でクエンチングした後、層を分離し、水相を酢酸エチル（２Ｘ２５　ａ＋１）で抽出した０合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧濃縮してオイルを得た。このオイルをメタノール（１０ｍυに溶解し、ＨＣＩガスを５分間激しくバブリングさせた０次いでＲＴで一晩攪拌した。溶媒を減圧留去し、そして固体が得られるまで油状残渣をエーテルで粉砕すると、０．１７ｇの２−イミノ−１−チアスピロ（４，５）デカン塩酸塩、　ｖａ、ｐ、　１３０−１３５℃（化合物５７表Ａ）が得られた。生成物の分子構造は、下記のようなＮＭＲとＩＨにより目的の化合物のものと確認された。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）　：　８．２３．７．３８．６．５３（３ｂｒ　ｓ、各々約０．５Ｈに積分。全てが完全に０．０と交換する。　ＮＨ）、　３．３６（ｔ、　Ｊ−７，０，２Ｂ。３−ＣＨｚ）、　２．１８（ｔ、　Ｊ−７，０，２１１，４−ＣＨｔ）、　１．００−２．００（ｂｒ　ＩＩ、　ＩＯＨ。シクロヘキシル）。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　３５００−２５００（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６１０（ｓ、、　ｂｒ、）＋１５２５、１４４５（ｓ、）、　１４０５（ｓ、）、　１２５０．１２０５．１１３０．１１００゜１０２０、９９０．８７５（ｓ、）、　６９０（ｓ、）、　４４５　。ス差１電２−イミノ−−チアビシクロ　３４０　ンユ１：」ニビＬルアルゴン下で、Ｔ　ＨＦ　（３０ｍｌ）を−７８°Ｃに冷却し、その後ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１０Ｍ、３．５９＋ｗｌ）を滴下添加し、次にア七ト二トリル（１，８８ｍ＋１．３５．９ミリモル）を滴下添加した０反応混合物を一７８°Ｃにて１０分間攪拌し、次いでシクロヘキサンスルフィド（３，９０ｇ、　３４．２ミリモル）を滴下添加した。添加が完了した後、冷却浴を除去し、混合物を室温まで温めた。２時間後、反応液を再び冷却し、濃ＨＣＩ（６ｍｌ）と水（１５ｍｌ）の混合物の添加によりクエンチングした０層を分離し、水相を酢酸エチル（２Ｘ２５＋ａｌ）で抽出した０合わせた有機相をＮａＳＯ４上で乾燥し、減圧濃縮して粗褐色液体（５，０８ｇ）を得た。この粗生成物を減圧蒸留すると、次のようなＮＭＲ，［ＲおよびＬＲＭＳを有する２、２６ｇの無色液体、　ｂ、ｐ、　８５−’８９°Ｃ（（）、３　ｍｍ）を得た。ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｚ）　：　２．６８（ｄ、２Ｈ，ＣＨｚＣＮ）、２．３２（ｓ、ＩＨ）、１．０−２゜３０（ｍ、　１０８．シクロヘキシル）。ＩＲ（ＮａＣ１上でのニート）　：　２９３０（ｓ、）、　２８６０（ｓ、）、　２５３０（ｗ、。ＳＲ）、　２２５０（ｍ、、　ＣＭ）、　１７３０．１４５０（ｓ、）、　１４２５．１１９５．９６５　。ＬＲＭＳ（＋＋／ｅ、　ＸＢＰ）　：　１５５　（Ｍ”　、　２９．９）　。上記液体を乾燥メタノール（３０ｍｌ）に溶解し、ＨＣＩガスを５分間激しくバブリングさせた後、反応混合物をＲＴで一晩攪拌した。溶媒を減圧留去して白色固体を得、これを酢酸エチルでスラリーにし、そして溶液が得られるまで熱エタノールで処理した。−２０°Ｃへの冷却により白色結晶質固体を得、これを濾過し、そして真空乾燥すると、３．１３ｇ　（５９％）の２−イミノ−１−チアビシクロ（３，４，０）ノナン塩酸塩＋　ｍ−ｐ。２４９℃（分解）（化合物６１表Ａ）が得られた。生成物の分子構造は下記のようなＮＭＲとＩＲにより目的の化合物のものと確認された。ＮＭＲ（４００ｄｚ、　ＤＭＳＯ）　：　３．５７（ｄｔ、　Ｊ−１１，５，３，４，ＬＨ，Ｈ−８）。３．２４（ｄｄ、　Ｊ−１７，５，７，ＬＨ，Ｈ−３）、　２．９１（ｄｄ、　Ｊ−１７，ＬＨ，Ｈ−３°）。２．２２（ｄｄ、　ＩＨ，Ｈ−９）、　１．９４−２．０３（＋＊、　２８）、　１．７５−１．８４（ｍ、　２Ｂ）。１．４５−１．５４（ａ＋、　１８）、　１．２８−１．３９（ｓ、　３Ｈ）　。ＩＲ（ＫＢｒ）　：　２８４０（ｖ、ｓ、、　ｖ、ｂｒ、）、　１６２４（ｓ、、　Ｃ−Ｎ）、　１５２Ｂ。１４５０、９９８．８９５．８８０．６９４（ｓ、）。Ｂ、ＡのＩＩＩＩＬ： ■ＮＤ　５−メ　ルー２ＩＴ　ＲＴＡＰＢＳ（ｐＨ７，０）中のＩＮＤＩ　＋ｍＡｂ（２０，０ｍＭ、　３．０ｍｇ／ｍｌ）、ＤＴＮＢ（０，５ｗＭ）および５−・メチル−２−イミノチオラン塩酸塩（３，４ｍＭ）の混合物をＡ４゜＝０．５１　（約１．８５８１モル）まで２５°Ｃでインキュベートした。次いでこの混合物を、ＰＢＳで平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５Ｆｉｎｅ（Ｇ２５Ｆ）樹脂のカラム上で脱塩した。ＴＮＢ：タンパク譬比を測定すると２．０７１を示した。上記のＩＮＤＩ／　５−メチル−２１７／ＴＮＢ複合体（６，４μＭ）をＲＴＩｈ。（３３゜０ｕ？Ｉ）と混合し、混合物を４℃で１６時間インキュベートした。反応混合物を精製し、免疫毒素ＩＮＤＩ／　５−メチル−２１７／ＲＴＩｈ。を得た。！ｌＬｉニア９　５−メチル−２ｒＴ　ＲＴＡＰＢＳ（ｐＨ７，０）中の７９１　＋１Ａｂ（３０，０ＨＭ、　４．５ｍｇ／ｍｌ）、ＤＴＮＢ（２，０ｍＭ）および５−メチル−２−イミノチオラン塩酸塩（３，０ｍＭ）の混合物をＡ、、、　−０，６０（約１．２５８１モル）まで２５ ℃でインキュベートした０次いでこの反応混合物をＧ２５Ｆ上で脱塩し、ＴＮＢ　：タンパク譬比を測定すると１．１　：　１を示した。上記の７９１１５−メチル−２ｒＴ／ＴＮＢ複合体（１１，０ＨＭ）をＲＴＡ　ｙ。（４４゜０ＨＭ）と混合した。混合物をＲＴで１５分間インキュベートし、次いで４°Ｃで１６時間インキュベートした０反応混合物を精製し、免疫毒素７９１１５−メチル−２ＴＴ／ＲＴ＾、。を得た。１隻斑エニー　エニルー　■Ｔ　ＲＴＡＰＢＳ（ｐＨ７，０）中の７９１　ｍＡｂ（４７，０Ｈ台、７．抛ｇ／ｍｌ）、ＤＴＮＢ（３，０−Ｍ）および５−フェニル−２−イミノチオラン塩酸塩（２゜０ｍＭ）の混合物をＡ４゜−１，１０（約１．６５８１モル）まで２５℃でインキュベートした。次いでこの反応混合物をＧ２５Ｆ上で脱塩し、そしてＴＮＢ　：タンパク譬比を測定すると１．７　：　１を示した。上記７９１１５−フェニル−２１７／ＴＮＢ複合体（７，３μＭ）をＲＴＩｈ。（４４，０ＨＭ）と混合した。混合物を肘で１５分間インキュベートし、次いで４°Ｃで１６時間インキュベートした０反応混合物を精製し、免疫毒素？９１１５−フェニル−２１７／ＲＴＡ３゜を得た。裏施炎上立：Ｈ６５５−メチル−２ｒＴ　ＲＴＡ上記方法に従って、Ｈ６５ｍＡｂを５−メチル−２−イミノチオラン塩酸塩およびＤＴＮＢと反応させ、そして得られた複合体をＲＴＡ３１１と反応させ、免疫毒素８６５１５−メチル−２１Ｔ／ＲＴＡ、。を得た。実ｍ上：ＩＬ２５−メチル−２１７ＰＴＡ。ＩＬ２、ＤＴＮＢおよび５−メチル−２−イミノチオラン塩酸塩の混合物を氷上で４時間インキュベートした９次に２５ｔｓＭホウ酸塩、５ｋＭ　ＮａＣ＋＋　ｐＨ８，５で平衡化されたＧ２５Ｆ上で脱塩し、そしてＴＮＢ　：タンパク雪止を測定すると１．０　：　１を示した。上記のＩＬ２１５−メチル−２１７／ＴＮＢ複合体をＰＴＡ３゜と混合し、混合物を４℃で１６時間インキュベートし、ＩＬ２１５−メチルー２１Ｔ／ＲＴＡｓ。を得た。！１ＬＬｉ：Ａ　−ルー　ＩＴ　ＲＴＡ　−’ 太１金実施例７〜１０の方法に従うて、４Ａ２を５−メチル−２−イミノチオラン塩酸塩およびＤＴＮＢと反応させ、次いで脱塩し、そして４．７　：　１のＴＮＢ　：　ｓ＋Ａｂ比を有する４Ａ２１５−メチル−２！Ｔ／τＮＢ複合体を得た。上記複合体（１，１ｇｇ／＊１．７．３ｙＭ＞をＲＴＡｓｅ（１，４ｍｇ／ｓ＋１．４７．０μＨ）と混合し、そしてＡ４．、をモニタリングしながら混合物を２丁でインキュベートした。Ａ４１！が０．１８５（約１．８１１７Ａ／■＾ｂ）になった時、２−メルカプトエチルアミン（５０μＨ）を添加した。Ａ　ａ　ｌｔを再びモニタリングし、読みが最大に達した時（０，４７゜３３　 μと・９６χ）　、　ＰＢＳ（ｐＨ７，５）で平衡化されたアガロースとアクリルアミドの混合樹脂（Ａｃ＾４４　；　ＬＫＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムで生成物をクロマトグラフィー精製し、１．９　ＲＴＡ／麟Ａｂの分析値（ゲル上で）を有する４Ａ２１５−メチル−２１Ｔ／ＲＴＡｓ。を得た。裏腹斑上主：ＥＮＤ　−メチル−２’ｌＴ　ＲＴＡ　−’並亙捜金実施例７の方法に従って、５．１　：　１のＴＮＢ　：　ｍＡｂ比を有するＩＮＤＩ／　５−メチル−２１７／ＴＮＢ複合体を調製した。上記複合体（６，７ｕ　Ｍ）をＲＴＡｓｅ（１，４＋ｓｇ／ｍ１．４７．Ｏｕ　Ｍ）と混合し、そしてＡ　４　Ｉｚをモニタリングしながら混合物をＲＴでインキュベートした。Ａ４１！が０．１０５（約１．Ｉ　ＲＴＡ／＋Ａｂ）になった時、シは、１．４　：　１のチオピリジン−Ｎ−オキシド：　ｍＡｂ比を有しスティン（２６５＃Ｍ、　５ＸＲＴＡ）を添加した。Ａａｔｔを再びモニタリングし、読みがプラトーに達した時（０，４８，９８χ最大ＴＮＢ）、生成物を精製し、１．１４　ＲＴ＾／ｍＡｂの分析値（ゲル上で）を有するＩＮＤＩ／　５− メチル−２１Ｔ／ＲＴＡ！。を得た。皇嵐五上互ニア　１　５（−ブチル−２１Ｔ　ＲＴＡＯ，１Ｍリン酸ナトリウム、０．１月塩化ナトリウム、ｐｉ　７．Ｓ中の７９１蒙Ａｂ（２０μＭ、　３ｍｇ／ｍｌ）、ＤＴＮＢ（２，５ｍＭ）および５−ｔ−ブチル−２ＩＴ（０，５ｍＭ）の混合物を、４１２ｎ＊での吸光度が０．４（約１．４ＳＲ１モルーＡｂ）に達するまで２６°Ｃでインキュベートした０次いでＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７，０）中に平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５Ｆｉｎｅカラム上でのクロマトグラフィーにより、反応混合物を脱塩した。　ＤＴＴとの反応により測定すると、ＴＮＢ　：　ｍＡｂ比は１．３　：　１であった。上記７９１１５−　ｔ−ブチル−２［Ｔ／ＴＮａ複合体（１，０ｍｇ／ｍ１．６．７．ｉｔ）とＲＴＡｓｅ（２，０ｍｇ／ｍｌ、　６７　（ｔ　Ｍ、　５倍モル過剰）とを混合し、４℃で１６時間インキュベートした０反応混合物を精製し、０．８ＲＴＡ／ｍＡｂを含む免疫毒素７９１１５−　ｔ−ブチル−２１Ｔ／ＲＴＡｓ＊を得た。皇旌班上ｌニア９１５−ｔ−ブチル−２１Ｔ　ＲＴＡ実施例１４の方法に従って、芳香族ジスルフィドであるジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）の存在下で？９１　ｍＡｂを５−ｔ−ブチル−２１Ｔと反応させた０反応を３３２ｎｍでモニタリングし、Ａｓ５ｚ　−０，１２５（約１．５　Ｓ＋（１モル＋ｍＡｂ）になった時停止させた。得られた７９１１５−ｔ−ブチル−２１Ｔ／チオピリジン−Ｎ−オキシド施例７〜ｌＯと同様にして接合を進行させた。接合が完了したた、５倍モル過剰のＲＴＡｓ。との反応により、１．３　：　１のＲＴＡ／■Ａｂ比を有する７９１１５ −　ｔ−ブチル−２ＩＴ／ＲＴＩｈ。を得た。災胤■上ｌ：Ｈ２ＩＴ　ＲＴＡ０１１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐ［Ｉ　７．Ｓ中のＨ６５ｍＡｂ（３ｍｇ／ｍ１．２０ｔＩＭ）および２−イミノチオラン塩酸塩の混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。　５０＋＊Ｍへのグリシンの添加により反応をクエンチングし、そしてＨＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐ）Ｉ　７．２）で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５Ｆｉｎｅカラム上でのクロマトグラフィーにより、誘導化されたｍＡｂを精製した。ＤＴＮＢの添加により測定すると、遊離５８１蒙Ａｂ比は１５　：　１であった。上記で調製したＨ６５／２−　ＪＴ−５）！複合体を、各試薬の最終濃度が２．０ｍｇ／＋１　（それぞれ１３μｉと６７μＭ）になるように、ＤＴＮＢで予め誘導化されているＩＩＴＡ　３゜（ＲＴＩｈ。−ＴＮＢが生成）と混合した。混合物を２５°Ｃで２時間インキュベートし、次いで４℃で更に３５時間インキュベートした後、）＋６５／２１丁／ＰＴＡ３゜接合体を精製した。　ＰＴＡ／ＩＩＡｂ比は０．６　：　ｌであった。Ｃ９止較ヱニＬ！１外上工：２−ＩＴ　いた　ムｔ　の７９１１５−メチル−２ｒＴ／ＴＮＢ複合体（実施例８から）および７９１１５ −フェニル−２！丁／ＴＮＢ複合体（実施例９から）の試料を、それぞれ４．０倍および６．３倍モル過剰のＰＴＡ　と混合した。実後、アリコートを５Ｏ３− ＰＡＧＥおよび色素結合のデンシトメトリーにより分析した。生成物のＲ丁Ａ／ｍＡｂ比を修飾抗体のＴＮＢ／ｍＡｂ比で割ることにより、置換率を決定した。結果を表１１」ＬＬｌ：の　ジスルフ　゛　いた　ｆｉｊｉ　の実施例１４および１５からのデータの比較は、ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）で誘導化された？９１　ｓ＋Ａｂが、ＤＴＮＢで誘導化された？９１　ｓＡｂよりも効率的な脱離基を生成したことを例証する。修飾率（活性化されたＳ）Ｉ／−＾ｂ）は非常に小さい（１，３〜１．４）けれども、同じ条件下で、７９１／チオピリジン−Ｎ−オキシド上に存在する脱離基の９３％に比べて、７９１／ＴＮＢ上に存在する脱離基の６２％が置換された。従って、芳香族ジスルフィドの適当な選択により、接合効率を更に増加させることができる。スＪ！ｆｉｌｌ：２−イミノチオーンおよび５ＰＤＰと　した　２−イミノチオーンの　および表ＣとＤは、代表的な置換２−イミノチオラン並びに非置換２−イミノチオランおよび５ＰＤＰについての性質を示す。表Ｃは、種々の化合物の反応速度を与える０次の反応速度を測定した。８．２４８ｎ−でモニタリングした、ＰＢＳ（ｐＨ７，２）中での２−イミノチオラン環の加水分解の速度。ｂ８反応液を０．５ａ＋Ｍ　０ＴＮＢと混合しそして４１２ｎｓでの吸光度の変化を追跡することによる、ＰＢＳ（ｐＨ７，２）中での２−イミノチオランと１６０　ｍＭグリシンとの反応の速度。Ｃ０反応液を０．ＩＭ　ＮａＰＯ，、０，１門ＮａＣ１，ｐＨ７，５中の２．５ｍＭ口ＴＮＢと混合しそして４１２ｎ＋ｓでの吸光度の変化をモニタリングすることによる、２−イミノチオラン（０，５ｓＭ）と７９１　ｍＡｂ（２０μＨ）との反応の速度。ｄ、グルタチオンにより誘導される７９１／イミノチオラン／ＴＮＢからのＴＮＢ放出の初速度、試料は０．５ｓＭ　ＥＴＤ＾を含むＰＢＳ（ｐＨ７，２５）中に約１０μＮのタンパク質−５−５−ｒＮＢおよび２００μｉのグルタチオンを含み、４１２ｎ驕でモニタリングした０図１はその結果をグラフに示したものである。表旦Ｅ　応　（２５℃ １ｍＭ　加水分解　グリシン　７９１　ＴＮＢ化合物Ａ、、、２４８ｎ＊　（！／　１９間）　ｋＸ１０’　ｋ　ＸＩＯ’　ｋＸ１０’（５−１）　（ｓ−重）　（ａ−’）環−２ＩＴ　２５０　９．０７　１３．４　３．４　５．６　８２．１（実施例６）メチル−２１Ｔ　２４７　９．２７　５．４　４．８　４．０　？５．３（実施例１）フェニル−２１？　２４６　９．００　１．５　５．２　Ｂ、８　４５．８（実施例２）ｔ−ブチル−２１７２４Ｂ　１１．７　６．１　４．４　７．４　、　１６．４（実施例３）ジメチル−２１Ｔ　２４７　１０．８　６．９　３．５　４．６　０．１３（実施例４）スピロ−２１？　２４Ｂ　１０．７　５．６　３．０　４．６　０．１１（実施例５）ＳＰＤＰ　−−−−−２６２，００非置換２−イミノチオランおよび５ＰＤＰと比較した置換２−イミノチオランのジスルフィド結合安定性の相対増加量（または相対速度減少量）を表りに与える。それは、非置換２−イミノチオランの速度定数（９，４２ｘｌＯ−３）を各々の置換２−イミノチオランの速度定数で割ることにより算出した。ジスルフィド結合安定性の相対増加量を７９１／５ＰＤＰ／ＴＮＢとも比較し、２１Ｔについてと同様にして決定した。常法に従って７９１　ｍＡｂを５ｐｏｐで誘導化し、ゲル濾過により副生成物を除去し、１ｍＭ　ＤＴＴを用いてＦＤＰ基を遊離せしめ、次いで遊離ジスルフィド基をＤＴＮＢと反応せしめることにより、７９１／５ＰＤＰ／ＴＮＢを調製した。ゲル濾過後、ＴＮＢの放出速度を上記の実施例１９ｄと同様にして測定した。下　に比　したジスルフィド　性の化合物　２１Ｔ　５ＰＤＰ環−２１？　１１．５　３．２（実施例６）メチル−２１７１２，５３，５（実施例１）フェニル−２ＩＴ　２０．６　５．８（実施例２）ｔ−ブチル−２１Ｔ　５７．４　１６．２（実ｊ１例３）ジメチル−２１７７２４６，０２０４６，０（実施例４）スピロ−２１Ｔ　８５６４．０　２４１８．０（実施例５）ＳＰＤＰ　３．６　１．００１ｍ止：人　の量　１１および゛　一実施例８．９．１４および１５に記載したようにして、ＲＴでの３時間に次いで４°Ｃでの１６時間のＰＴＡ　３゜との反応により、活性化７９１／イミノチオラン／丁ＮＢ誘導体から免疫接合体を調製した（スピロ−２ＩＴまたはジメチル −２１７では接合体は全く形成されなかった）　、　０．１Ｍ　ＮａＰＯ４，０，１Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５で平衡化されたＡｃＡ４４樹脂上での４℃でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、残った遊離ＲＴＡ　ｓ。を除去した。増加していく濃度のグルタチオンとのインキュベーション後に放出されるＰＴＡ　３゜の量を定量することにより、それらと別の接合体の相対安定性を評価した。　ＰＴＡ３゜の５０％放出を生ずるグルタチオンの濃度（１０ｄ　２−メルカプトエタノールとインキュベートした試料に関して）をＲＣ，。と称し、種々の接合体の安定性を比較する手段を提供した０表Ｅはそのような比較の結果を示す。ここで各接合体の相対安定性は７９１／５ｐｏＰ／ＲＴＡｓ。のものに対して標準化されている。メチル−２１７免疫接合体は、フェニル−２１Ｔ　（５，２倍）および環−２１？　（３，７倍）よりも安定であった。同様な結果が４Ｍ２抗体でも得られた。Ｕ直性−各接合体を標準アッセイにおいて抗原担持標的細胞中のタンパク質合成を阻害する能力についても試験した。７９１／Ｍ細胞を２〜２０００　＋ａｇ／ｍｌの範囲の濃度の７９１免疫接合体と共にインキュベートした　２Ｈ−ロイシンで４時間短期標識した後、細胞に結合した放射能を定量した。タンパク質合成を５０％阻害した免疫接合体の濃度をＩＣｓ。と称する０表Ｅはその結果を示す、これは、イミノチオラン連結接合体の安定性の増加が細胞毒性に不利に影響を与えなかったことを示す、参考のため、ＳＭＣＣ連結接合体（非還元性チオール結合を生じる）の活性も示す。裏旌且ｌ上：人の晋おび４Ａ２／メチル−２１Ｔ／ＲＴＡコ・および４Ａ２／ＳＰ［］Ｐ／ＲＴｌｈ。免疫毒素の安定性を更に動物実験した。４Ａ２抗体を用いて各接合体試料を調製しく実施例１２の方法に従って）、次いでＢｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ。Ｃｏｍｍ、（１９７８）　ｆＪＪ　：８４９−８５７に記載のヨードジエン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法により、Ｉｌｌ　ｌで約１μＣｉ／μｇに放射能標識した（米国特許第４．７０８，８６２号を参照のこと）、免疫接合体を含む溶液のアリコートをラットに腹腔内注射した。ラットから血液試料を定期的に採取し、そして血清中の放射能の量を測定した。血清計数は完全な接合体だけでなく、解離によりＲＴＡ　３゜部分を失った接合体の部分も表す、（遊離のＲＴＡ２゜は迅速に浄化され、全血清放射能に寄与しない、）従って、各時点における完全抗体との比率を決定するために、血清のアリコートを５Ｏ５−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによっても分析した６次いでそれらのデータを用いて補正した接合体クリアランス曲線を作成した０図２に与えた結果は、平均残留時間により測定すると、メチル−２１１接合体が５ｐｏｐ接合体よりもラット内でほぼ３倍安定であることを示す（それぞれ４１．３時間と１４．３時間）。盈旦７９　毒　の　および７９１／５ＰＤＰ／ＲＴＡユ。　ＩＣ５ｏ’拭粧　拉塩校旦ム宏定性二　頽ｄｍｌと７９１／５ＰＤＰ／ＲＴ＾、。　１．０　１１．４７９１／２１Ｔ／ＲＴＡｆｆ＠　０．６　９．６７９１ノ環−２ＩＴ／ＲＴ＾、。　３．７　９．８７９１／／　ｆ　ｋ−２１Ｔ／ＲＴＡｆｆｏ　８．３　１０．８７９１／フェニル− ２ＩＴ／ＲＴＡ１゜　５．２　１６．２７９１／ｌ−ブチル−２１Ｔ／ＲＴｘｉ。　３．０　？、２７９１／ＳＭＣＣ／ＲＴＡ３゜（チオエーテル）　測定せず　１４１２．０”　７９１／５ＰＤＰ／ＲＴＡ３＋のＲＣ，、に対する接合ＲＴＡ　３゜の５０χを放出するグルタチオン濃度（ＲＣ５゜）の比。ｂ標準７２時間アッセイにおいて抗原担持細胞中のタンパク質合成を５０χ阻害する各免疫毒素の濃度。グルタチオンにより誘導される活性化７９１　ＭＡｂからのＴＮＢの放出３００　ＩＪＭ　ＧＳＨ，２８度　、　ｐＨ７，２５時間（秒）ＦＩＧ、−Ｊ。時間（時）ＦＩＧ、−２゜国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の式（Ｉ）の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（上式中、Ｘはハロゲンであり；Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル：ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２ −５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−５アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）。
２．Ｒ１がＣ３−６シクロアルキルまたはフェニルである、請求項１に記載の化合物。
３．Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、請求項２に記載の化合物。
４．Ｒ２，Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、請求項２に記載の化合物。
５．Ｒ１とＲ２が一緒になってＣ２−５アルキレン橋を形成し、そしてＲ３およびＲ４の各々が水素である、請求項１に記載の化合物。
６．Ｒ１とＲ３が一緒になってＣ２−５アルキレン橋を形成し、そしてＲ２およびＲ４の各々が水素である、請求項１に記載の化合物。
７．２つの種を共有結合せしめる方法であって、ａ）一方または両方の種を次の式の架橋剤：▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘはハロゲンであり；Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２．Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）と反応させ；ｂ）脱塩して試薬を除去し；そしてｃ）前記２つの種を一緒に混合する、ことを含んで成る方法。
８．前記架橋剤と一方または両方の前記種を芳香族ジスルフィドと共に反応させることを更に含んで成る、請求項７に記載の方法。
９．細胞毒性物質を抗原反応性物質に共有結合せしめる方法であって、ａ）前記細胞毒性物質および抗原反応性物質の一方または両方を、次の式の架橋剤： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘはハロゲンであり；Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）と反応させ；ｂ）脱塩して試薬を除去し；そしてｃ）前記細胞毒性物質と抗原反応性物質を一緒に混合する、ことを含んで成る方法。
１０．前記架橋剤および前記細胞毒性物質と抗原反応性物質の一方または両方を芳香族ジスルフィドと共に反応させることを更に含んで成る、請求項９に記載の方法。
１１．前記細胞毒性物質がリボソーム不活性化タンパク質であり、そして前記抗原反応性物質が免疫グロブリンである、請求項９に記載の方法。
１２．第二の種に生来存在する利用可能なアミノまたは炭水化物基のところで第二の種に接合された第一の種を含んで成る接合体であって、少なくとも１つの次の式の結合を有する接合体： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）。
１３．抗原反応性物質に生来存在する利用可能なアミノ基のところで抗原反応性物質に接合された細胞毒性物質を含んで成る免疫毒素であって、少なくとも１つの次の式の結合を有する免疫毒素： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ１はＣＯＯ０Ｒ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）。
１４．前記細胞毒性物質がリボソーム不活性化タンパク質であり、そして前記抗原反応性物質が免疫グロブリンである、請求項１３に記載の免疫毒素。
１５．２つの種を共有結合せしめる方法であって、ａ）芳香族ジスルフィドの存在下において一方または両方の種を次の式の架橋剤： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘはハロゲンであり；Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素：ＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）と反応させ；ｂ）脱塩して試薬を除去し；そしてｃ）前記２つの種を一緒に混合する、ことを含んで成る方法。
１６．前記芳香族ジスルフィドがジチオニトロ安息香酸、２，２′−ジピリジルジスルフィド、４，４′−ジピリジルジスルフィドおよび２，２′−ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）から選択される、請求項１５に記載の方法。
１７．病気の治療方法であって、療法的有効量の免疫毒素を標的細胞に投与することを含んで成り、前記免疫毒素が抗原反応性物質に生来存在する利用可能なアミノ基のところで抗原反応性物質に接合された細胞毒性物質から成り、ここで前記免疫毒素が少なくとも１つの次の式の結合を有することを特徴とする方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）。
１８．細胞中のタンパク質合成の阻害方法であって、抗原反応性物質に生来存在する利用可能なアミノ基のところで抗原反応性物質に接合された細胞毒性物質から成る免疫毒素の有効量を細胞に投与することを含んで成り、前記免疫毒素が少なくとも１つの次の式の結合を有することを特徴とする方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ１はＣＯＯＲ５；ハロゲン；ニトロ；非置換Ｃ１−３アルキル；ハロゲン化Ｃ１−３アルキル；非置換Ｃ１−３アルコキシ；ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ；非置換Ｃ２−５アルケニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルケニル；非置換Ｃ２−５アルキニル；ハロゲン化Ｃ２−５アルキニル；非置換Ｃ３−５シクロアルキル；非置換アリール；ハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換されたアリール；非置換複素環；またはハロゲン、アミノ、非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルキル、または非置換もしくはハロゲン化Ｃ１−３アルコキシから選択された１〜３個の置換基により置換された複素環であり；Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素であるかまたはＲ１の意義から選択され；またはＲ１とＲ２は一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；またはＲ１またはＲ２はＲ３と一緒になって、非置換のまたは１〜５個のＣ１−４アルキル基により置換されたＣ２−５アルキレン橋を形成し；そしてＲ５は水素またはＣ１−３アルキルである）。