JPH04502766A - ヒドロキシメトキシマンデル酸（ｈｍｍａ）とホモバニリン酸（ｈｖａ）の誘導体、及びこれらの誘導体から得られる抗体と標識物質並びにこれらを用いるイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドロキシメトキシマンデル酸（ＨＭＭＡ）とホモバニリン酸（ＨＶＡ）の誘導 体、及びこれらの誘導体から得られる抗体と標識物質並びにこれらを用いるイム ノアッセイ 本発明は、ヒドロキシメトキシマンデル酸（ＨＭＭＡ及びホモバニリン酸（ＨＶ Ａ）の誘導体の製造、抗体産生及び標識化合物の製造に係るこれらの用途並びに ＨＭＭＡ及びＨＶＡを目的とするイムノアッセイにがかる物質を使用することに 関する。

ＨＭＭＡ及びＨＶＡとは、以下の式で表される化合物である： なお、本式において、Ｒ’及びＲ３は、以下のように定義される：即ち、 Ｒ１化合物乞 ＯＨヒドロキシメトキシマンデル酸（ＨＭＭＡ）Ｈホモバニリン酸（ＨＶＡ） これらの化合物は、アドレナリン、ノルアドレナリン即ちドパミン（神経内分泌 系を制御する上で本質的な役割を果すカテコールアミン（Ａｘｅｌｒｏｄ　＆Ｗ ｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ、（１９７２）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ。

Ｍｅｄ　２８７．２３７））の尿中代謝物の主要なものである。

これら代謝物の産生量は、好クローム性細胞腫や神経芽細胞腫などの神経稜腫瘍 において顕著に増大する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ。

”Ｔｕｍｏｕｒｓ　ｔｈａｔ　５ｅｃｒｅｔｅ　ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ”Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　（１９８０））。この種の腫瘍を検索 スクリーニングすることは、ＨＭＭＡ及びＨＶＡ分析する簡単で、信頼性のよい 且つ安価なアッセイによって容易に行えるはずであるが、今なお、このような方 法は、−初利用出来ない状態である。

目下のところ、最も広く用いられているＨＭＭＡをアッセイする方法は、Ｐｉｓ ａｎｏ分光光度測定法（Ｐｉｓａｎ。

ｅｔ　ａｌｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ、　Ａｃｔ　（１９６２）、７．２８５、但し、 この方法は、薬物及び食品からの干渉を受ける（Ｒｏｃｋ。

Ｄ　ｉ　ａ　ｇ　ｎ　、　Ｍ　ｅ　ｄ　、　（Ｍ　ａ　ｙ　１９８５　）、２１ ）である。又、高速液体クロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィーにょる ＨＭＭＡアッセイ測定法（Ｋｒｓｔｕｌｏｖｉｃ、　”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖ ｅＡｎａｌｙｓｉｓｏ　ｆ　Ｃａ　ｔ　ｅ　ｃ　ｈ　ｏ　１　ａ　ｍ　ｉ　ｎ　 ｅ　ｓ　ａ　ｎ　ｄ　Ｒｅ　ｌ　ａ　ｔ　ｅ　ｄ　Ｃｏ　ｍ　ｐ　ｏ　ｐ　ｕ　 氏@ｄ　ｓ″ Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、（１９８６））もあるが、これらの方法は、 高価で、技術的に要求されるレベルが高（しかも処理可能なサンプル量に限界が ある。

イムノアッセイは、大量のサンプル量を検定スクリーニングする為には理想的な 方法であるが、抗体を培養し産生させ又ＨＭＭＡやＨＶＡを測定するイムノアッ セイを開発するための優れた方法は、現在のところない。

マンニッヒ反応を利用してハブテンをキャリアー蛋白にカップリングさせた場合 に、限定された、若干の成功が得られている（例えば、Ｙｏｓｈｉｏｋａ　ｅｔ 　ａｌ、　ＢｉｏｇｅｎｉｃＡｍｉｎｅｓ（１９８７）、４．２１１−１７．２ １９−２７　及び２２９−３５゜並びに　Ｋａｚａｋｅｔ　ａｌ、Ｌａｂ　Ｄｅ ｌｏ　１９８３　（５）。

２０−２）が、この方法は、化学的な制御及び再　現性に欠ける（例えば、”Ｐ ｒｏｂｅｌｍｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏ　ｆ　Ｒａ　ｄ　ｉ　 ｏ　ｉ　ｍ　ｍ　ｕ　ｎ　ｏ　ａ　ｓ　ｓ　ａ　ｙ　ｏ　ｆ　Ｃａ　ｔ　ｅ　ｃ 　ｈ　ｏ　１　ａ　ｍ　ｉ　ｎ　ｅ@ｓ　” ｂｙ　Ｅ、　Ｋｎｏｌｌ　＆　Ｈ，Ｗｉｓｓｅｒ　（Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ 。

Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｖｏｌ、　２２　（１９８４）　７４１−７４９ ）を参照のこと）。

本発明によれば、式ＩＩで表される上記化合物の誘導体は、好ましくは、ベンズ ヒドリル、ヘンヒドリルやｔ−ブチルなど立体的に障害の高い保護基でカルボキ シル基を保護し、次いでフェノール性ヒドロキシル基にブロモ酢酸メチルエステ ルなどのアルキル化剤を反応させて、エステル基を導入することによって、製造 される。このようにして導入されたエステル基を選択的に加水分解すれば、保護 された誘導体が得られ、これを、例えば活性エステルを用いて、キャリアー蛋白 に結合させて免疫原を生成させるか、又は例えば蛍光標識物、放射性同位元素又 は酵素などのような標識物と結合させることが出来る。

このカルボキシル基を好ましくは塩基で脱保護させると、かかる免疫原又は標識 されたハブテンが得られる。

化合物を製造するに際して官能基を保護することは、公知であり、例えば、ヨー ロッパ特許第０２７８９１１号（Ｃｉｂａ　−Ｇｅｉｇｙ）において、二環式ベ ータラクタムカルボン酸を製造するに際してアミノ基を保護する方法が、開示さ れている。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ等（Ｉｎｔ、　Ｊ、　ＰｅｐｅｔｉｄｅＰｒｏｔ ｅｉｎＲｅｓ、、Ｖｏｌ、３０．　Ｎｏ、２．　１９８７．２０６−２１６ペー ジ）は、ポリマー支持フェニルメチルアミンを製造するに際してアミノ基を選択 的に保護する方法を開示している。米国特許第４０４１０７６号（Ａｖｅｎｉａ ）は、フェネチルアミン化合物を検出する為の測定法に係るものであるが、アン フェタミン型化合物におけるアミノ基を選択的に保護する方法を開示している。

本発明の第一の局面においては、以下の式で表される化合物が提供される：即ち 、 （上記式において、Ｒ１は、水素又はヒドロキシルを、Ｒ２は、可逆的に保護さ れたカルボキシル基を、Ｒ４は、Ｈ又はＣ，−Ｃ，アルキルを、又Ｒ５は、結合 する（星印を付した）炭素原子に対してアルファ位のパイ電子系を有し且つカル ボキシル基、アミノ基又はアルデヒド基のうちの一つ以上を包含する置換基を、 それぞれ表す）。

このカルボキシル基を保護することは、好ましくは、該基を、例えば以下の式で 表される基などのように立体的に障害の高いエステルに変換することによって行 かかる保護基は、中性で、容易にアルキル化されるものであってならず、又所望 の場合は、通常は加水分解によって容易に脱離されものでなくてはならない。

好ましい保護基は、ベンゾヒドリルである。

式ＩＩで表される化合物を保護することは、ジフェニルジアゾメタン（Ｋ　ｕ　 ｍ　ａ　ｒ及びＭ　ｕ　ｒ　ｒ　ａ　ｙによって記載されているように−Ｊ、Ａ ｍｅｒ　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９８４）、１０６．１０４０）のジクロロメタ ン溶液で処理して、ベンゾヒドリル基を生成せしめることによって行ってもよい 。

式ＩＩで表される保護された化合物の結合反応は、好ましくは、５０℃以下の温 度においてアルキル化反応を行うことが出来るアルキル化剤を用いて行われる。

かかるアルキル化剤は、活性化原子団として機能するパイ電子系に対してアルフ ァ位に位置する適当な離脱基（好ましくは、ハロゲン、更に好ましくは、臭素も しくはヨウ素、又はトシレート、メシレートもしくはトリフレート基）を含有す る。活性化パイ電子を含有する適当な基は、カルボニル基、芳香族残基、又はア ルケニルニ重結合である。好ましいアルキル化剤は、ブロモ酢酸メチルエステル 、ブロモクロトン酸メチルエステル及びブロモメチル安息香酸メチルエステルで ある。

式Ｉで表される保護された誘導体は、キャリアー蛋白に結合していてもよく、又 保護基は、それ自体常法である方法によって脱離させて、以下の式で表される構 造を包含する抗体物質を生成せしめる：ｃＨＲｉｃｏｏＨ このような抗体物質は、式ＩＩで表される化合物に対する抗体を培養し産生せし める為に使用される。

式Ｉで表される保護された誘導体は、又検出可能な標識剤、例えば酵素、蛍光物 質又は放射性同位元素を有する物質と結合させ、ついで自体常法の手段によって 脱保護せしめて、上記にて定義した式ＩＩＩで表される構造を検出可能な標識剤 に結合せしめて、式ＩＩで表される化合物の標識された誘導体を生成せしめても よい。

式Ｉで表される誘導体をキャリアー蛋白又は標識剤と結合させることは、適当な 結合剤を用いて実施してもよい。その後、Ｒ２基を、例えば酸又は塩基による加 水分解によって脱保護させて、キャリアー蛋白又は標識剤と結合した、式ＩＩで 表される化合物の相当物を製造してもよい。かかる加水分解は、好ましくは塩基 条件下で行われる。前記結合剤は、好ましくは、例えばｌ−エチル−３（３−ジ メチルアミノプロピル）−カルボジイミド−塩酸塩などのカルボジイミドである 。結合も、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルなどの活性化エ ステルを用いて行ってもよい。

本発明に従って製造された抗原物質は、通常公知の方法を用いて動物体内に接種 することによって、上記式ＩＩで表される化合物に対する抗体を生成せしめる為 に使用することが出来る。得られた抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｌｓｔｅｉ ｎの方法に従って製造されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であっ てもよい。

得られたポリクローナル又はモノクローナル抗体は、例えば、酵素、放射性同位 元素又は蛍光標識剤を用いる標準イムノアッセイ方法に用いることが出来る。

かかるアッセイ方法は、好ましくは”競合”アッセイであって、このような方法 にあっては、限定された量の抗体（本発明に従って製造された抗体又は該当する 代謝物に対する異なる抗体のいずれであってもよい）が得られ、標識されたハブ テンと標識されていないハブテンが、結合部位をめぐって競合するのである。

本発明の多数の好ましい実施態様を、以下の実施例において説明する。

実施例　Ｉ 式Ｉで表される保護されたＨＭＭＡ誘導体の製造（ａ　）　ＨＭ　Ｍ　Ａのベン ゾヒドリルによる保護ＨＭＭＡ　Ｃ式ＩＩ、Ｒ’　＝　ＯＨ，１，ｇ　；　５． ０５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン−メタノール（４：　１　；　２０ｍ１）中に おいてジフェニルジアゾメタンのジクロロメタン溶液で、紫色が残留するまで処 理した。室温で１５分間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル 中に溶解し、１Ｍ重炭酸ナトリウム及び水で洗浄し、乾燥後、減圧下で濃縮して 、黄色固体を得た。この固体を酢酸エチル−シクロヘキサン（１：　１）で再結 晶して、融点が１２０−１２２℃の白色固体（１，０５ｇ　；　６１％）を得た 。

（ｂ）ベンゾヒドリル−４−０−メチルカルボキシメチルＨＭＭＡの製造 上記（ａ）において調製したベンゾヒドリルＨＭＭＡ（１ｇ　：　２．７４　ｍ ｍｏｌ）を乾燥ジメトキシエタン（１０ｍｌ）中において水素化ナトリウム（６ ０％分散液；１１０ｍｇ；２　、７４　ｍ　ｍ　ｏ　１　）を用いて処理し、室 温にて３０分間撹拌した。ブロモ酢酸メチルエステル（４６２ｍｇ　：　２８５ マイクロリットル；３．０２　ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を一晩撹拌し た。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカフラッシュクロマトグラフィー（溶出 溶媒、ジクロロメタン−メタノール、９９：ｌ）で精製した。当該カラムフラク ションを濃縮し、生じた油状物をアセトン−シクロヘキサン（３：　７）から再 結晶し融点が１１０−１１１’Ｃの白色結晶（５８０ｍｇ；４８％）を得た。

（Ｃ）ベンゾヒドリル−４−０−カルボキシメチルＨＭＭＡの製造 得た化合物（５８０ｍｇ　；　１．３３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１６ ｍｌ）及び水（６，７ｍ１）中において、１Ｍ水素化ナトリウム（１，３３ｍ１ ；　１．３３ｍｍｏｌ）で処理し、室温において１時間撹拌して、メチルカルボ キシメチルエステル基を選択的に加水分解した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を 酢酸エチルと０．１Ｍ塩酸との間に分配せしめた。有機層を乾燥し、次いで濃縮 して、透明な油状物を得たが、これを酢酸エチルエステルから再結晶すると、目 標化合物である融点が１０３−１０６℃の白色結晶（２４９ｍｇ；４４％）を得 た。

この合成における全ての工程は、収率が中程度ないし良好な状態で進行し、中間 物の全てについて充分な、満足すべき分光データ（２５０ＭＨｚ　’Ｈ核磁気共 鳴、赤外及びマススペクトルから成る）が得られた。このメチルエステルのけん 化は、事実上選択的であり、ベンゾヒドリルエステルの加水分解は極小であった 。

実施例　２ ＨＭＭＡ免疫原の製造 実施例１の製品（７２ｍｇ　；　０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍ　 ｌ　）中において、Ｎ−ヒドロキシ　コハク酸イミド（２０ｍｇ；Ｏ，１７ｍｍ ｏｌ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩 酸塩（５０ｍｇ；０．２６ｍｍｏｌ）で処理し、次いで室温において４５分間撹 拌した。その後では、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、式Ｉで表さ れるの保護された化合物の活性エステルが全て生成していることが判明した（展 開溶媒、ジクロロメタン−メタノール、３：１　、　Ｒｆ　＝　０．９５）。こ の活性エステル溶液は、キーホール−リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（ｌｏ ｏｍｇ；０゜３３マイクロモル）を燐酸−生理食塩水緩衝液（ｐＨ８，１０ｍ１ ）とピリジン（２ｍ　ｌ　）に溶かした溶液に、１５分間かけて滴下した。生じ た混合物を、−晩撹拌し、水道流水に対して３日間透析し、次いで残渣を凍結乾 燥すると、保護された抱合体（９０ｍ　ｇ　）を得た。このハブテン／キャリア ーの結合比は、２８０ｎｍにおけるＵＶ分光測定法によって検討し、その結果、 ＫＬＨ１分子当たりベンゾヒドリルＨＭＭＡ３２１分子であることが分かった。

このようにして調製した抱合体（９９ｍｇ）を、１Ｍ苛性ソーダ（１０ｍｌ）で 室温において２゜５時間処理した。

混合物を氷で冷却し、２Ｍ塩酸（４，５ｍ１）を加えると、ｐ　Ｈ１０の溶液を 得たが、この溶液を１Ｍリンゴ酸（６ｍ　ｌ　）を用いてｐＨ４に調製した。上 記のごとき透析を行い、次いで凍結乾燥すると、免疫原（９４ｍ　ｇ　）を得た 。

実施例　３ 標識ＨＭＭＡの製造 ベンゾヒドリル−４−０−カルボキシメチルＨＭ　Ｍ　Ａ（１０ｍｇ；２４マイ クロモル）をアセトニトリル（１ｍｌ）中において、実施例２において記載した 方法によって活性エステルに変換し、フルオレスセインチオカルバミルエチレン （ＦＴＣＨＤ）（８ｍｇ；　１８ｖイクロモル）を水−トリエチルアミン（１： １；２００マイクロモル）に溶かした溶液を添加した。

室温において３０分間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を１Ｍ塩酸で 処理した。得られた橙色の固体をろ過し、メタノールに溶解し、ＴＬＣ（溶出液 、ジクロロメタン−メタノール３；ｌ）で精製したところ、Ｒｆ　Ｏ，７３の一 つの主要バンドが得られ、これを同−溶媒系で溶出した。

得た化合物を、１Ｍ水酸化ナトリウム（５００マイクロリツトル）を用いて暗所 で３０分間室温において処理することによって脱保護した。この反応混合物を２ Ｍ塩酸（２００マイクロリツトル）で、次いで１Ｍクエン酸（１゜５　ｍ　ｌ　 ）を用いてｐＨ３に調節した。揮発物を、減圧下で除去し、残渣をメタノールに 溶かし、無機物をろ別したところ、透明な、黄色溶液が得られた。この溶液をＴ ＬＣ（溶出液、ジクロロメタン−メタノール−酢酸７５　：　２５　：　１）に 付したところ、Ｒｆ　０．１０の一つの主要バンドとして当該製品が得られた。

このものをメタノールで溶出し、暗所で一２０°Ｃにおいて保存した。

実施例　４ ポリクローナル羊抗体の製造 羊を、標準方法を用いて実施例２の製品４　ｍ　ｇで免疫化し、４週間の間隔で 投与量を２　ｍ　ｇとして免疫誘発を増強した。血清を、標準方法を用いて採取 した。

実施例５ イムノアッセイ法 種々のアッセイ方法は、防腐保存剤として０．１％アジ化ナトリウムを含有する ｐＨ７，５，５０ｍ　ｍ　ｏ　ｌ　ｅ濃度の燐酸緩衝液において行った。分極蛍 光イムノアッセイ（ＰＦＩＡ）用の緩衝液も、用いたガラスキュベツトに抗体が 付着するのを防止する為０．１％のつ°シガンマグロブリンを含有させたもので あり、又分離蛍光イムノアッセイ（ＳＦＩＡ）用の緩衝液は、粒子の凝集を防止 し且つデカンテーションを容易にする為に０６１％の洗剤（商標、ＴＲＩＴＯＮ 　Ｘ−１００）を含有させた。

実施例３において製造した標識ハブテン（５０マイクロリツトル）のメタノール 性溶液を、５０　ｍ　ｍ　ｏ　ｌ　ｅ濃度の重炭酸塩（ｐＨ９，０，２ｍ　ｌ　 ）中に溶解し、その濃度を、Ｐｏｕｒｆａｒｚａｎｅｈ等（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ 　（１９８０）　２６，７３０）の方法に従って、フルオレスセインのモル吸光 度係数が８．７８ｘ１０４Ｌｍｏｌ−’ｃｍ−’であると仮定して、４９２ｎｍ において測定した。この溶液を、上記した二種類のアッセイ用緩衝液に溶かし、 それぞれＰＦＩＡ試験用の３０ｎｍｏｌｅ濃度の溶液と５ＦＩＡ試験用の１５０ ｎｍｏｌｅ濃度の溶液とした。

ＰＦＩＡアッセイ ＨＭ　Ｍ　Ａ　（１０ｍ　ｇ　）を緩衝液（１０ｍ　ｌ　、溶液１リツトル当た りＩｇを生成する）に溶解し、次いでこの溶液を希釈して、１リツトル当たり０ 、■、５．１０．５０．１００゜５００及び１　、　ＯＯＯｍ　ｇの溶液を得る ことによって、標準溶液を調製した。標準溶液又は試料（１０マイクロリツトル ）及び標識剤（５００マイクロリツトル）とを、渦動混合し、次いで抗血清（標 準溶液の不存在下で２００　ｍ　Ｐの目盛りの読みを与えるに十分な希釈溶液５ ００マイクロリツトル）を接種し、１時間培養した。各チューブの分極蛍光の目 盛りを読み取った。

５ＦＩＡアツセイ法 上記実施例４において調製した抗血清を、５ｉｄｋｉ等（Ａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ　（１９８３）　２０．２２７）の方法に従って臭化シアンを用い て磁化可能な固体相にカップリングせしめて、固体相１ｍｇを緩衝液２０　ｍ　 ｌ中に分散させた分散液を得、この分散液を、必要となるまで４℃において保存 した。

上記した如く調製した標準溶液又は試料（５００マイクロリツトル）を、実施例 ３において調製した標識ハブテン（１５０ｎｍｏｌｅ　１００マイクロリツトル ）と共に渦動混合し、この混合物に、固相抗体（標準溶液の不存在下で標識剤の ５０％と結合するに充分な１００マイクロリツトルの希釈溶液）を加えた。絶え ず撹拌しつつ１時間培養した後、緩衝液を加え、チューブを沈降処理し、デカン テーションし、ｐＨ９，５０ナノモル濃度の重炭酸塩／メタノール（ｌ：４．１ 　、４　ｍ　ｌ　）の溶液で溶出し、上澄液の蛍光の目盛りを読み取り、標識剤 （１００マイクロリツトル）と溶出液（１、４ｍ　ｌ　）を含有するトータルチ ューブを基準にして比較して、結合百分率を算定した。

これらの抗体の交差反応性を、Ａｂｒａｈａｍ　（Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、（１９６９）　２９．８６６）の方法に従 って、５０％結合時における５ＦＩＡによって、構造的に類似した化合物を用い て試験した。試験に供したかかる構造的に類似した化合物は、バニリルマンデル 酸、４−ヒドロキシマンデル酸、３．４−ジヒドロキシマンデル酸、マンデル酸 、ホモバニリン酸、バニリン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル酢酸 、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニルグリコール、アドレナリン、ノルアド レナリン、ドーパミン、ドパ、メタネフリン、ノルメタネフリン及び３−メトキ シチラミンであった。これらは全て、ＨＭＭＡと比較して、結合度は低かった。

実施例６ 式Ｉ（式Ｉにおいて、Ｒ’　＝　Ｈ１Ｒ２＝ＮＨ，ＣＨ，００ＣＨ（ｐ　ｈ　） 、、Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’＝Ｃ０ＯＨ）で表される保護されたホモバニリン酸誘導体の 製造 出発物質として、ノルメタネフリン塩酸塩の代わりにホモバニリン酸を用いて、 実施例１を反復、繰り返した。得られた誘導体は、融点が１３７ないし１４０℃ であった。

上記した方法と同様な方法によって、免疫原及び標識誘導体とを製造する為に、 この保護されたホモバニリン酸誘導体を用いた。得られた免疫原を、実施例４に おいて記載したように、抗体を培養、産生させる為に使用し、実施例５において 記載したように、標的化合物を検定するイムノアッセイに用いた。

実施例３において記載した蛍光標識剤の代わりに、多くの公知の酵素標識剤（例 えば、セイヨウワサビのパーオキシダーゼ又はアルカリ性フォスファターゼ）又 は放射性標識剤（例えば、１２５　Ｉ−ヒスタミン又は３　Ｈ）の如何なるもの をも、実施例３の方法に利用することが出来るのであって、この際実施例５のア ッセイ方法には、それ相応の改良、変更を加える、ということは、当然理解され るであろう。更には、抗体産生方法は、Ｋ　ｏ　ｈ　１　ｅ　ｒ及びＭｉｌｌｓ ｔｅｉｎの方法に従って、種々のモノクローナル抗体を産生しめるように、改良 、変更することも出来る。

国際調査報告 ’−＝−−−１−＝Ｍ−−−−−−１　？：：！Ｇ：Ｉ　９０１０００４８国際 調査報告 ＧＢ　９ＤＯＯＯ４ａ ＳＡ３４２３ε

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ［上記式において、Ｒ１は、水素又はヒドロキシルであり、Ｒ２は、可逆的に保 護されたカルボキシル基であり、Ｒ４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ３アルキルであり又Ｒ ５は、星印をつけた炭素原子に対してアルファ位置にあるパイ電子系を有し且つ 一つ以上のカルボキシル、アミン又はアルデヒドを含有する置換基である］で表 される化合物。 ２．Ｒ４が水素であり又Ｒ５が式、−ＣＯ・Ｒ６、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ７又は ▲数式、化学式、表等があります▼ ［上記式において、 Ｒ６は、ＯＨ；カルボキシ、アミン又はアルデヒド置換基を有するＣ１−Ｃ２０ アルキレン又はＣ２−Ｃ２０アルケニレンであり、又Ｒ７は、ＣＯＯＨ；ＣＨＯ ；又はカルボキシ、アルデヒド又はアミン置換基を有するＣ１−Ｃ２０アルキレ ン又はＣ２−Ｃ２０アルケニレン基である］で表される基である、特許請求の範 囲第１項に記載された化合物。 ３．Ｒ５がＣＯＯＨ又はＣＨ＝ＣＨ・ＣＯＯＨである、特許請求の範囲第２項に 記載された化合物。 ４．Ｒ２が、式▲数式、化学式、表等があります▼で表される基又は式▲数式、 化学式、表等があります▼で表される基でであるか、又はＲ２が式−ＮＲ８−Ｃ Ｏ−Ｘ［本式において、Ｒ８は、水素又はメチルであり、又Ｘは、メチル、エチ ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル又はベンジル基で ある］で表される基である、特許請求の範囲前記各項のうちのいずれか１項に記 載された化合物。 １０．該カップリング剤がカルジイミドである、特許請求の範囲第９項に記載さ れた方法。 １１．該カップリング反応を、活性エステルの形成を介して行われる、特許請求 の範囲第１０項に記載された方法。 １２．特許請求の範囲第５項に記載された物質を動物に接種することによって培 養・産生される抗体。 １３．特許請求の範囲第５項に記載された物質を動物に接種することから成る、 抗−ＨＭＭＡ又は抗ＨＶＡ抗体を培養・産生する方法。 １４．特許請求の範囲第５項において定義された式ＩＩで表される化合物に該化 合物を反応させる工程を包含する、特許請求の範囲第５項において定義された式 ＩＩで表される化合物を検定するイムノアッエイを実施する方法であって、該抗 体が、特許請求の範囲第１２項に記載された抗体であること又は該イムノアッセ イを、特許請求の範囲第７項に記載された標識誘導体を用いて実施することを特 徴とする方法。 １５．式 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ［上記式において、Ｒ１は、水素又はヒドロキシルであり、Ｒ２は、可逆的に保 護されたカルボキシル基であり、Ｒ４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ３アルキルであり、又 Ｒ５は、星印をつけた炭素原子に対してアルファ位置にあるパイ電子系を有し且 つ一つ以上のカルボキシル、アミン又はアルデヒドを含有する置換基である］で 表される化合物を製造する方法であって、ＨＭＭＡ又はＨＶＡのカルボキシル基 を、好ましくは立体的に障害の高い保護基を用いて、可逆的に保護し、該生成物 にアルキル化剤を反応させ、次いで選択的加水分解を行うことから成る方法。