JPH04502853A - 原始細胞コロニー刺激因子およびリンパ造血始原細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原始細胞コロニー刺激因子およびリンパ造血始原細胞１ｎ立旦 本発明は、骨髄移植に有用な細胞集団と骨髄細胞の増殖に関与するサイトカイン に関する。

良且恋１１ 獣医学とヒトの医学の両方において、造血を開始させ調節する能力は非常に重要 である。各種の疾患、免疫障害および悪性腫瘍は、造血系内の破壊に関連するよ うである。これらの障害の多くは、分化するようトリガーされると個体の欠損を 克服する始原（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞を用いて、造血系を再増殖させるこ とによって緩和および／または治癒することができる。ヒトにおいて現在行われ ている交換治療法は骨髄移植法である。しかしこの形態の治療法は、提供者と受 容者の両者にとって痛みがあり、かつ受容者に対しては、特に移植物が同種異系 の場合非常に危険である。骨髄移植を行う前に、提供者と受容者がＨＬＡのタイ プについて適合していても、同種異系骨髄移植を行った受容者の約半数は対宿主 性移植片病（ＧＶＨＤ）を起こす。ＧＶＨＤに対する現在の治療法は不完全であ り、この疾患は形状を損じおよび／または致命的である。したがって、ＧＶＨＤ が危険なために、骨髄移植の利用は、重篤な免疫不全障害、重篤な無形成貧血症 および悪性腫瘍のような致命的な疾患をもっている患者に制限される。

骨髄移植法には潜在的な利点があるので、ＧＶＨＤの原因と防止の研究が激励さ れている。動物実験では、ＧＶＨＤが、提供者の１９２８球が原因で生じること が分かつている。提供者の骨髄接種物（″移植物”）から１９２８球を除くと、 マウス、イヌおよびサルにおけるＧＶＨＤの発生が減少した。

ヒトでの試験では、骨髄の１９２８球を各種の方法で減少させたが、骨髄受容者 のＧＶＨＤを防止もしくは治癒ができな造血疾患に対して可能性のあるそのほか の治療法は、コロニー刺激因子の１つもしくは組み合せによって個体を治療する 方法である。血球形成の課程で、小数の自己再生性の幹細胞が、系統に拘束され た始原細胞を生成し、その後にこの系統に拘束された始原細胞は増殖、分化して 循環成熟血球を産生ずるが、この血球形成過程は、一群の糖タンパクホルモン成 長因子によって一生を通じて維持されている。これらのホルモンは、コロニー刺 激因子（Ｃ３Ｆ）として、集合体として知られている。

区１１」し鉱１服 コロニー刺激因子という用語は、ＣＳＦが各種の造血細胞系統の始原細胞を刺激 して、認識可能な成熟細胞の分離コロニーを形成するという生体外の観察結果に 由来している。各種の因子は、産生されるコロニーの主要タイプを示す接頭語で 、その働きに従い定義されている。マウスおよびヒトの５種のＣＳＦに対する遺 伝子がクローン化されており、そのタンパクの組換え形が産生され精製されてい る。これらの因子にハ、多分化能ＣＳＦ　（マルチ−ＣＳＦ）、１１粒状マクロ ファージＣ３Ｆ　（ＧＭ−ＣＳＦ）　、顆粒球Ｃ３Ｆ　（ＧＣＳＦ）、マクロフ ァージＣ５Ｆ　（ＭＣＳＦ）およびエリスロポイエチンが含まれる。これらの因 子の特性の総説としては、主要な標的細胞が記載されている５ｌｅｆｆ、　Ｊ、 　Ｃｌ１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ−、７９巻、１５４９頁、１９８７年がある。

１五旦１丞 本発明の目的は、造血障害の治療法としての骨髄移植法に対する代替法および／ または補助法を提供することである。

非接着性（ＮＡ）細胞系を、様々な種から単離された骨髄ストローマの培養物か ら発生させた。最初のＮＡ細胞系はウシストローマ細胞の単層の培養物から発生 させた。親ウシ骨髄細胞系から得た培養上澄み液を用いて、他のウシ骨髄ストロ ーマ培養物からと、およびウシ骨髄から、形態学的に類似のＮＡ細胞系を得た。

またＮＡ細胞系は、ヒト、ブタ、マウスおよび鳥類の骨髄を含む他の種由来のス トローマ細胞培養物中の細胞培養上清因子によっても誘発された。予想外のこと であるが、得られたＮＡ細胞は、形態、機能および表現型の分析からみて、非常 に原始的な性質を有し、実際に、多分化能の、替ンパ造血始原細胞のようである 。またこれらの細胞は、造血組織にホームするようであり、造血障害の治療に利 用できる。

タンパク因子である原始細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ）コロニー刺激因 子（ＰＣ−ＣＳＦ）は、ＮＡ細胞培養物と、骨髄由来のストローマ細胞培養物の 上澄み液中に同定され、これらから単離された。これらのＰＣ−ＣＳＦは、細胞 、特にＮＡ細胞の増殖を刺激する。したがって、これらの因子は、例えば創傷の 癒合および二ニーロンの障害を含む、細胞の増殖で緩和Ｆは、治療を受ける個体 内に存在しているか、または造血障害に対する治療プログラムの一部として個体 に注射されるリンパ造血幹細胞を増殖させることによって造血障害を治療するの 番−利用できる。

従って、本発明の一つの態様は、精製された原始細胞コロニー刺激因子（Ｐ　Ｃ −ＣＳ　Ｆ）である。

本発明の他の態様は、ＰＣ−Ｃ３Ｆをフードする組換えベクターと、このベクタ ーで形質転換された細胞である。

本発明のさらに他の態様は、精製されたＰＣ−ＣＳＦ−αである。

本発明のさらに他の態様は、精製されたＰＣ−Ｃ３Ｆ−βである。

本発明のさらに他の態様は、成熟したリンパ系細胞と骨髄性細胞とを実質的に含 有していない多分化能リンパ造血始原細胞（ＮＡ細胞）を含む細胞懸濁液である 。

本発明のさらに他の態様はヒト由来のＮＡ細胞の懸濁液であり、この懸濁液中で は前記細胞は、Ｍｙ１０抗原に対するモノクローナル抗体とは免疫学的に反応性 ではなく、このモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８４８３号のハ イブリドーマ細胞系によって産生される。

本発明の他の態様は、骨髄由来のＮＡ細胞と免疫学的に反応性のモノクローナル 抗体を産生ずるハイブリドーマと、そのハイブリドーマによって産生されるモノ クローナル抗体である。

本発明のさらに他の態様は、ＮＡ細胞を含有する細胞懸濁液を供給する工程；Ｐ Ｃ−ＣＳＦと、細胞を増殖するのに必須の他の成分とを含有する培地内で、細胞 増殖を促進する条件下で前記細胞懸濁液を増殖させる工程；細胞培養物からＮＡ 　（ＮＡ）細胞の集団を単離して回収する工程；およびＰＣ−ＣＳ　Ｆと、細胞 を増殖するのに必須の他の成分とを含有する培地内で、細胞増殖を促進する条件 下で前記の単離された細胞を増殖させる工程；を包含するＮＡ細胞を含有する細 胞集団の生産方法である。

本発明のさらに他の態様は、個体の造血組織から細胞懸濁液を供給する工程；得 られた細胞懸濁液を、ＮＡ細胞に対するモノクローナル抗体と接触させる工程、 この抗体は、ＮＡ細胞上の抗原を認識するが、成熟の進んだリンパ細胞と骨髄性 細胞上の抗原を認識しない；および前記細胞懸濁液から、前記抗体が結合した細 胞を分離して回収する工程：を包含する多分化能リンパ造血始原細胞を含有する 細胞集団の生産方法である。

本発明の他の態様は、薬学的に受容され得る媒体中のＮＡ細胞懸濁液を供給する 工程；造血障害を克服するのに十分な量のＮＡ細胞の投与量を個体に注射する工 程；を包含する造血系の障害について個体を治療する方法である。その個体は、 個体中のＮＡ細胞の増殖を刺激するに充分な投与量で、薬学的に受容され得る賦 形剤中のＰＣ−ＣＳＦの溶液を注射することによって治療してもよい。

本発明のさらに他の態様は、薬学的に受容され得る賦形剤中のＰＣ−ＣＳＦの溶 液を供給する工程；および所望の細胞を増殖させることによって障害の症状を緩 和するｐｃ−ｃｓＦの薬理的に有効な投与量を個体に投与する工程；を包含する 、細胞増殖によって緩和される障害について個体を治療する方法である。個体は 、造血障害を緩和するＰＣ−ＣＳ　Ｆの投与量を与えられて造血障害が治療され る。個体は、創傷の癒合を刺激するＰＣ−ＣＳＦの投与量を投与されて創傷が治 療される。個体は、二ニーロンの再生を刺激するｐｃ−ｃｓＦの投与量を投与さ れてニニーロンの超厚の障害が治療される。

」血！４服 図１は、ウシＮＫ細胞のウシＮＡ細胞に対する細胞障害作用を示すグラフである 。図ＩＡと図ＩＢはそれぞれ、ＩＬ−２がない場合とある場合を示す。

図２は、ヒトＮＫ細胞のヒ）ＮＡ細胞に対する細胞障害作用を示すグラフである 。図２Ａと図２Ｂはそれぞれ、ＩＬ−２がない場合とある場合を示す。

図３は、マウスＮＫ細胞のマウスＮＡ細胞に対する細胞障害作用を示すグラフで ある。図３Ａと図３Ｂはそれぞれ、ＩＬ−２がない場合とある場合を示す。

図４は、ＮＡ細胞系の誘導を示すチャートである。

図５は、ＰＣ−ＣＳＦ含有上澄み液のＮＡ細胞の増殖に対する効果を示すチャー トである。

図６は、ＰＣ−Ｃ３Ｆの精製法の体系を示すチャートである。

杢」己１Δ去Ｊし１汰 ■、支畏 本願で用いられる”個体”という用語は、を椎動物、特に哺乳類または鳥類のメ ンバーを意味し、家畜、スポーツ用動物、霊長類およびヒトが含まれるが、これ らに限定されない。

本願で用いられる”原始細胞コロニー刺激因子（“ＰＣ−ＣＳＦ”）”という用 語は、各個体由来の因子を意味し、これは骨髄ストローマ培養物由来の接着性お よび／または非接着性細胞を長期間増殖させる。ＰＣ−ＣＳＦが誘導される個体 は、を椎動物があり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは、ウシ、マウス 、ブタもしくはヒトの種である。′ＰＣ−ＣＳＦ”という用語は、骨髄ストロー マ培養物及び／または全骨髄培養物中の非接着性骨髄細胞の出現と増殖を刺激す る生物学的活性を示す因子の類似体と断片を含むことを意味する。この生物学的 活性は、例えば後記の実施例１３と１６に記載のアッセイによって検出される。

“精製ＰＣ−Ｃ３Ｆ“は、特に、細胞成分と、天然にＰＣ−ＣＳ　Ｆと共存する 他の可溶性生成物とを含有しないＰＣ−ＣＳＦを意味する。ＰＣ−Ｃ３Ｆのよう なポリペプチドを精製する方法は、当該技術分野では公知であり、後で説明する 。

本願で用いられる”本質的に含有していない”という用語は、細胞成分と可溶性 生成物を少なくとも約５０％含有していないことを意味し、好ましくは細胞成分 と可溶性生成物を少なくとも約７０％含有せず、さらに好ましくは細胞成分と可 溶性生成物を少なくとも約９０％含有していないことを意味する。

本願で用いる”培養物”という用語は、と（にことわらないかぎり、ＰＣ−ＣＳ Ｆを産生ずる骨髄細胞培養物を意味し、かつ免疫調節生のサイトカインである他 の因子を産生じてもよい。”培養物”は、骨髄由来の接着性細胞および／または 非接着性細胞を含有してもよい。細胞”培養物′°と細胞“系“という用語は互 換に用いられる。細胞培養物もしくは細胞系は、個体細胞、収穫細胞、およびそ の細胞系由来の細胞を含有する培養物を含む各種の態様を意味するがこれらに限 定されない。”由来の”という用語は子孫もしくは発生物（ｉｓｓｕｅ）を意味 する。貯蔵中もしくは移転中に、核型に自発的もしくは誘発された変化が起こる ことがあることは当該技術分野では公知である。それ故に、その細胞系由来の細 胞は、元の細胞もしくは培養物と性格には同じでないことを意味し、細胞培養物 は、かような変形物を含んでいる。

”多分化能リンパ造血始原細胞”は下記特徴を示す細胞である。この細胞は、骨 髄ストローマ培養物由来の細胞であり。

特に、培養物上清液中のＰＣ−ＣＳＦにより増殖が誘発される非接着性細胞由来 の細胞である。形態学的に、これらの細胞は、単球−マクロファージ系統の細胞 に類似している。表現型としては、この細胞は、Ｔ細胞特異的抗原、ＭＨＣクラ ス■抗原、マクロファージ／単球マーカー、およびＢ細胞マーカーを欠いている 。この細胞をＩＬ−２で処理しても、リンホカインで活性化されるキラー細胞に はなりにくい。ＩＦＮγ、ＩＮＦαおよびＴＮＦαで処理しても、これら細胞に よる活性酸素種の産生を誘発せず、Ｃ５ａすなわち強い走化性ペプチドへの方向 性の移動も誘発しない。この細胞を、■ＮＦγ、ＩＮＦαおよびＴＮＦαで処理 しても、細胞の増殖を誘発しないしまた細胞の形態の変化も誘発しない。多分化 能リンパ造血幹細胞は造血組織にホーム（ｈｏｍｅ　ｔｏ）　Ｌ、、発癌性テア リ、ＣＦＵ−Ｓアッセイによれば未分化のコロニーを生じさせる。′多分化能リ ンパ造血始原細胞”と”非接着性細胞”という用語は交互に使用される。

本願で用いられる”クローン”という用語は、単細胞の子孫を意味する。

”組換え宿主細胞”と”宿主細胞”という用語は、組換えベクターまたは他の伝 達ＤＮＡの受容体として用いることができ、もしくは用いられている、微生物細 胞または真核細胞を意味し、移入または形質転換された最初の細胞の子孫が含ま れる。１つの親細胞の子孫が、偶然もしくは故意の変異のために、形態と、ゲノ ムＤＮＡ相浦体もしくは全ＤＮＡ相補体とについて、元の親細胞とかならずしも 完全に同じでないことは理解されるであろう。所望のペプチドをコードするヌク レオチド配列の存在のような関連する特性で特徴づけられる、親細胞に十分に類 似している、親細胞の子孫は、この定義で示す子孫に含まれ、上記用語で扱われ る。

用いられる”形質転換”という用語は、例えば直接取り込み法、形質導入法およ びｆ交配法のような挿入法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞へ の挿入を意味する。

外因性ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドのような非統合的ベクターとし て保持され、あるいは宿主ゲノムに統合本願でＰＣ−Ｃ３Ｆをコードするポリヌ クレオチドを特徴づけるのに使用される”組換えポリヌクレオチド”という用語 は、ゲノム、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ半合成もしくは合成が起原のポリヌクレオチド を意味し、これらのポリヌクレオチドはその起原もしくは処理によって、（１） 天然にもしくはライブラリーの形態で接合しているポリヌクレオチドのすべても しくは一部と接合していないか、および／または（２）天然に結合しているポリ ヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結している。

用いられる”ポリヌクレオチド”という用語は、リボヌク゛レオチドもしくはデ オキシリボヌクレオチドの、ある長さを有する重合体形態のヌクレオチドを意味 する。この用語は、分子の一次構造のみを意味する。従って、二本鎖と一本鎖の ＤＮＡと、二本鎖と一本鎖のＲＮＡが含まれる。また、例えばメチル化および／ またはキャップ形成で修飾されたポリヌクレオチド、および非修飾のポリヌクレ オチドが含まれる。

”レプリコン”は、例えばプラスミド、染色体、ウィルスのような遺伝子要素で あり、これらの要素は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律性単位として挙動 し、すなわちそれ自体の制御下で複製することができる。

”ベクター”は、他のポリヌクレオチドセグメントが連結され、その連結された セグメントの複製および／または発現を行うレプリコンである。

”制御配列”は、連結されているコーディング配列の発現を行うのに必要なポリ ヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質は宿主生物によって異 なる。原核生物では、このような制御配列は一般にプロモーター、リボンーム結 合部位、およびターミネータ−をもっている。真核生物では一般にこのような制 御配列はプロモーター、ターミネータ−およびいくつかの例ではエンハンサ−を もっている。１制御配列”という用語は、少なくとも、発現のために存在する必 要がある全要素を含むことを意味するのがよく、また例えばリーダー配列のよう な、存在すると有利な追加の要素も含んでいてもよい。

”作動可能に連結されている”は、前記要素がその意図した方式で機能できる関 係で併置されていることを意味する。

コーディング配列に”作動可能に連結されている”制御配列は、コーディング配 列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方式で連結されている 。

”読み取り枠”は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であ るが、この領域は、コーディング配列の一部もしくは全コーディング配列を示す 。

”コーディング配列”は、適切な調節配列の制御下におかれたときｓ　ｍＲＮＡ に転写され、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列で ある。コーディング配列の境界は、５′−末端における翻訳開始コドンと３°− 末端における翻訳停止コドンで決定される。コーディング配列には、ｍＲＮＡ、 ｃ　ＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列を含むことができるがこれらに限 定されない。

”とともに／として免疫学的に同定可能な”という用語は、抗原が最初に同定さ れた型の細胞に存在する細胞抗原の中にエピトープが存在することを意味する。

免疫学的同一性は、抗体の結合および／または結合における競合によって測定さ れるが、これらの方法は当該技術分野の熟練者にとって公知であり、後述する。

本願で用いられる”エピトープ”という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意 味し、エピトープに独特の立体配座の３つのアミノ酸から構成されることが可能 である。一般にエピトープは、少なくとも５つのかようなアミノ酸を有し、より 一般的に少なくとも８〜１０のかようなアミノ酸で構成されている。

抗原は、そのポリペプチド内に含有されている特異的エピトープを抗体が認識し てその抗体と結合する場合は、抗体と”免疫学的に反応性である”。免疫学的反 応性は、抗体との結合、さらに詳しくは抗体との結合の動力学および／または抗 体が特異性を有するエピトープを含有する公知の抗原を、競合者として用いた競 合結合によって決定できる。抗原が抗体と免疫学的に反応性であるか否かを決定 する方法は当該技術分野で公知である。

”ポリペプチド”という用語は、ゲノム内にコードされている配列のアミノ酸生 成物を意味し、特定の長さを有する生成物を意味しない。したがって、ペプチド 類、オリゴペプチド類およびタンパクは、ポリペプチドの定義内に含まれる。

またこの用語は、例えばグリコジル化、アセチル化、リン酸化等の、ポリペプチ ドの発現後の修飾を意味しない。

本願で用いられる”治療”という用語は、予防および／または治療を意味する。

用いられる”造血系の障害”という用語は、以下のことから起こる障害を意味す る。すなわち、例えば造血組織の純系新生物（骨髄性新生物とリンパ球系新生物 、を含む）、免疫不全疾患、リンパ球減少症のような、造血に関与する分化プロ グラムの変化；例えばヒトのα−サラセミアおよび鎌状赤血球症のような、必須 タンパクに対する構造遺伝子の変異に関連する遺伝子欠陥；自己免疫疾患を含む 免疫反応性に関する遺伝欠陥、特に、例えばヒトの全身性エリテマトーデス、急 性ＧＶＨＤ自己免疫性溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、炎症性腸疾患 およびアトピー性湿疹が例示される膠原病のような、異常Ｔ細胞サブセットに関 連する自己免疫疾患である。

ニーｊ」し乞Ｉ胆 本発明は、特に記載がなければ、当該技術分野の方法である細胞生物学、細胞培 養法、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の通常の方法を使用 して実施する。このような方法は、文献に十分説明されてい墨。例えば以下のも のがあるｏ　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（１９８２年）　；　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ、Ｉ巻と■巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５年）　；　Ｏｌｉ ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔｌｉ集、 １９８４年）　；　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　 （Ｂ、Ｄ、ＢａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓｉｉ集、１９８４年） 　；　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｓｔｉｏｍ　（Ｂ 、Ｄ、Ｈａｍｅｓおよびｓ、　Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４年）；Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、　 Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、１９８７年）　；　１ｍ＋ａｏｂｉｌｉｚ ｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ、Ａｎｄ　Ｅｎｚｙａ＋ｅｓ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８６年）　；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　 Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ　（１９８４年）　；　ｔｈｅ　ｔ ｒｅａｔｉｓａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｇｏｌｏｇｙ　（Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、米国、二ニーヨーク）　；　Ｇｅｎｅ　Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１１ｓ（Ｊ 、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、Ｃａ１ｏｓｉｌ集、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８７年）　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１５４巻と１５５巻（Ｗｕら編集）　；　Ｉ ＋ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ１Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ａｎｄ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒｌｌ集、Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、英国、ロンドン、１９８７年）およびＨａｎｄｂ ｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｒｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｌ＋＋＋＊ｕｎｏｌｌｏｇｙ　Ｉ 　−Ｉ　Ｖ＠　（Ｄ、Ｍ。

ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｖｅｌ１編集、１９８６年）である。

本願に記載する全ての特許、特許願及び刊行物は、すでに記載したものとこれか ら記載するものの両方共に本願に援用するものである。

ｎ、Ａ１１ｌ及 リンパ造血始原細胞を含む新規な細胞系は、いくつもの種から得た骨髄培養物か ら単離した。これらの細胞は”非接着性”　（ＮＡ）細胞とも呼ばれるが、次の 特性を示す。これらの細胞は形態が始原形態である。これらの細胞は、形態が原 始的である。これらの細胞は、実施例に示すように、リンパ球系細胞と骨髄系細 胞と、これらの細胞系の幹細胞の特徴を示すある種の細胞表面マーカーを欠いて いる。生体外条件下で、以下のリンホカイン類、すなわちインターロイキン２（ Ｉ　Ｌ−２）、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、αインターフェロン（ＩＦ Ｎ−α）およびα細胞壊死因子（ＴＮＦ−α）の存在に関わりなく、これらの細 胞は、リンパ球系もしくは骨髄系の細胞には分化しない。しかしＮＡ細胞は、同 一の種に注射されると、接種された個体内の造血組織（例えば骨髄）にホームす るようである。その上に、その細胞は、造血ポテンシャルを測定することが知ら れている測定法、すなわちＣＦＵ−Ｓアッセイにおいて、多分化能幹細胞の造血 ポテンシャルを示す。したがって、これらの細胞は、多分化能始原細胞のようで ある。

ストローマ細胞とＮＡ細胞は、見かけ上、ＮＡ細胞を分化を併うことな（複製さ せる因子を分泌する。これらの因子のうちの１つは、培養中のマウスＮＡ細胞が 分泌するようであるが、見かけの分子量は約２０〜２５ｋｄであり、′原始細胞 コロニー刺激因子α″　（ＰＣ−Ｃ３Ｆ−α）と命名した。

他の因子はマウス骨髄ストローマ培養物の１生成物のようであるが見かけの分子 量は約６０〜７０ｋｄであり、この因子を原始細胞コロニー刺激因子β（ＰＣ− Ｃ３Ｆ−β）と命名（以下余白） Ｌ　Ｂ　ＰＣ−Ｃ３Ｆ ＰＣ−Ｃ３Ｆの活性は、ＮＡ細胞の増殖の誘発に対するその作用で監視すること ができる。ＰＣ−Ｃ５Ｆ活性に対する２種類の適切な検定は実施例に記載されて いる（実施例１５と１６参照。これらの実施例にはＮＡ細胞とストローマ細胞と を有する検定法とクローン原性検定法（ｃｌｏｎａｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）と がそれぞれ示しである）。興味深いのは、一つの種から単離したＰＣ−Ｃ３Ｆは 、他の種からのＮＡ細胞の増殖を誘発できるようであることである。

タンパクを単離する通常の方法を利用して、ＰＣ−Ｃ８Ｆを濃縮して、ＮＡ細胞 の馴化培地の他のタンパク性成分を実質的になくすることができる。タンパクの 精製方法は、当該技術分野の当業者には公知であり１例えば、沈澱による成分の 分離法：例えばイオン交換体、親和性物質への吸着を含む吸着法、色素リガンド クロマトグラフィー及び免疫吸着剤による分離；ならびにゲル濾過による溶液中 での分離、例えば電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、液相分配法 及び限外濾過法がある。５ｃｏｐｅｓの文献（１９８７年）参照。ＰＣ−Ｃ３Ｆ を精製し得る方法は実施例に記載されている。

ＰＣ−Ｃ３Ｆは、馴化培地及び造血組織から単離できるが、組換えＤＮＡ法を利 用して合成することもできる。これらの方法では、ＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする組 換え配列は、発現ベクターに挿入され、そのため、制御配列はＰＣ−Ｃ３Ｆをコ ードする組換え配列に作動可能に連結される。宿主細胞がこの組換えベクターで 形質転換され、適切な増殖条件下で組換えＰＣ−Ｃ３Ｆを発現する。

ＰＣ−Ｃ５Ｆをコードする組換え配列は９分子生物学上公知の方法で単離される 配列由来のものでもよい。例えばｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリ ーニングによって、またはｍＲＮＡが比較的高い存在率で存在する場合には、Ｐ Ｃ−Ｃ３Ｆをコードする単離されたｍ　ＲＮ　Ａの逆転写によって単離される。

ライブラリーのスクリーニングのために下記のようにして調製したプローブは、 所望のタンパクに翻訳されるｍ　ＲＮ　Ａを単離するためのプローブとして使用 することができる。ＮＡ細胞は溶解することができ、ＲＮＡはそのＤＮＡから分 離される。ポリ　（Ａ）が集積された両分は、ｍ　ＲＮ　Ａを含有するが、次に オリゴ−ｄＴもしくはオリゴ−ｄＵのカラムを利用して分離することができる。

重要なｍＲＮＡはさらに電気泳動法とノーイン法を用いて精製され、３２Ｐで標 識を付けたプローブで同定される。ｍＲＮＡが同定されたならば９分取ゲルから 切り取ることができる。

ＰＣ−Ｃ５Ｆをコードする配列は、市販されている逆転写酵素を利用して、ｍＲ ＮＡを逆転写することによってｒｎＲＮＡから調製することができる。得られた ｃＤＮＡをクローン化し、好ましくは配列を決定する。次にその組換えｃ　ＤＮ Ａは発現ベクターに挿入され、発現を制御する配列がｐｃ−ｃＳＦをコードする 配列に作動可能に連結される。

別の方法では、ｃＤＮＡライブラリーおよび／またはゲノムライブラリーが、骨 髄細胞から調製され得、好ましくはＮＡ細胞および／またはストローマ細胞から 、さらに好ましくはＮＡ細胞から調製される。ｃＤＮＡライブラリーの調製法は 、当該技術分野では公知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの文献、　１９８ ２年、及びＤＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＩ巻と２巻、　１９８５年を参照。

構築されるライブラリーのタイプは、ＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする配列を検出する ように設計されたオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされ得るライブ ラリー、例えば、λｇｔｌＯに構築されるライブラリーである。

ライブラリーをスクリーニングするために、ＰＣ−Ｃ３Ｆの断片をコードするプ ローブか、またはＰＣ−Ｃ３Ｆの断片をコードする配列の補体であるプローブを 構築する。このプローブは、ハイブリッド形成によってＰＣ−Ｃ５Ｆの配列を検 出できる長さを有し、好ましくは、約９〜約１２０のヌクレオチドの長さを有し 、さらに好ましくは、約３０〜約６０のアミノ酸の長さを有する。組換えポリヌ クレオチドプローブは、ＰＣ−Ｃ３Ｆのポリペプチド断片のアミノ酸配列から構 築される。精製されたＰＣ−Ｃ３Ｆを利用して、その分子の一部分の配拘を決定 することができる。配列を決定された部分は、所望の長さのプローブを得るのに 充分な大きさである。ポリペプチドの断片のアミノ酸配列を決定する方法は、当 該技術分野の、当業者には知られている。一般に問題のタンパクは。

分析を容易にするために、特異的に切断して小さなペプチドにする。特異的な切 断は、化学的方法もしくは酵素による方法で達成することができる。化学的方法 による切断法の例としては、臭化シアン、０−ヨードソベンゾエート　（ｏ−ｉ ｏｄｏｓ。

ｂｅｎｚｏａｔｅ）　、ヒドロキシルアミン及び２−ニトロ−５−チオシアノベ ンゾエートによる処理が含まれる。タンパク分解酵素を利用する方法の例として は、トリプシン、クロストリパイン及びブドウ球菌プロテアーゼによる処理が含 まれる。同定された断片のアミノ酸組成は測定することができ、次にその断片を １例えば、配列決定装置を用いて自動エドマン分解法によってアミノ酸分析を行 うことができる。配列決定装置は市販されており、配列決定はメーカーの指示に したがって実施することができる。ＰＣ−Ｃ３Ｆのペプチド断片は、オーバーラ ツプ断片を分析できる２種の方法で一般に調製される。

ＰＣ−Ｃ５Ｆ由来のペプチドの観察された配列に基づいて、アミノ酸配列をポリ ヌクレオチド配列に逆翻訳することによって、ＰＣ−Ｃ３Ｆだをコードする組換 えポリヌクレオチドプローブを設計することができる。これらのプローブには、 ＰＣ−Ｃ５Ｆが単離された種にふいて、その好ましいコドンを利用することを考 慮されている。

ＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする配列のライブラリーのスクリーニングは、　Ｍａｎｉ ａｔｉｓらの文献（１９８２年）及びＤ　Ｎ　Ａ　ＣｌｏｎｉｎｇＩ巻と■巻（ １９８５年）に記載されている方法を利用して行うことができる。その配列を含 有するクローンが同定されたならば、ＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする配列を単離し、 クローン化し、配列を決定する。ＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする配列の一部分だけが 単離された場合は、その単離された配列は、配列のオーバーラツプ断片を含有す る元のライブラリー内のクローンを検出するプローブを構築するのに使用するこ とができる。

次にこられの配列はクローン化され、配列が決定される。この方法は、ＰＣ−Ｃ ５Ｆをコードする全配列が定義されるまで繰り返すことができる。

次にＰＣ−Ｃ３Ｆをコードする組換えポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入さ れ、その発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に用いられる。上記の一般的な方 法は以下に述べる。

組換え宿主細胞は、クローン化によって選択され、所望のタンパクが発現される 条件下で培養される。そのタンパクが放出されていない場合は、細胞を収穫して 、通常の方法にしたがって溶解し、次いでタンパクを通常の方法で単離する。タ ンパクが放出されている場合は、そのタンパクを、使用した栄養培地から抽出す ることができる。

さきに考察したように、ポリペプチドの配列を決定する際に、ｃＤＮＡおよび／ またはゲノムライブラリーを調製してプローブすること、クローンの配列を決定 する際に、発現ベクターを構築し、細胞を形質転換することなどに用いられる一 般的な方法は、当該技術分野では公知であり、これらの方法が記載されている実 験手引を入手することができる。しかし、一般的な案内として、このような方法 と、これを実施するのに有用な材料について現在入手できるいくつかの情報源を 以下に述べる。

ｆｆ、ｃ、１．宿主および発現制御配列真核および原核の宿主細胞の両方ともに 、指定の宿主と適合する適当な制御配列が用いられる場合、所望のコーディング 配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち、イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ １１）が最も多く使用される。原核生物についての発現制御配列は、プロモータ ーを有し、任意にオペレータ一部分とリポソーム結合部位をもっている。原核細 胞宿主と適合性の伝達ベクターは通常、例えばｐＢＲ３２２由来のものである。

このｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与え るオペロンを含有するプラスミドである。さらに、種々のｐＵＣベクターも、抗 生物質耐性マーカーを与える配列を有している。これらのマーカーは、選択する ことによって満足すべき形質転換体を得るために利用される。

通常に用いられる原核細胞の制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ） とラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら１９７７年の文献）、トリプトファ ン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇ。

ｅｄｄｅｌｌら１９８０年の文献）、およびλ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ遺 伝子リポソーム結合部位（ＳｈｉＩＩＩａｔａｋｅらの文献、１９チルス属（Ｂ ａｃ　ｉ　１１ｕｓ）もしくはシ’Ｌ−トモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ　）の菌株のような対応する制御配列を有する他の原核細胞宿主も使用で きる。

真核細胞宿主には、培地系中の酵母と哺乳類の細胞が含まれる。サツカロミセス ・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　５ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とサツカ ロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　）が最も普通に用いられる酵母の 宿主であり、便利な真菌の宿主である。酵母に適合性のベクターは、栄養素要求 性変異体にプロトトロフィを与えるか、または野生型菌株に重金属に対する耐性 を与えることによって、満足すべき形質転換体を選択することができるマーカー をもっている。酵母上適合性のベクターには、２ミクロンの複製開始点（Ｑｒｏ ａｃｈらの文献、１９８３年）　、ＣＥＮ３とＡＲ３Ｉの組合せ、または、宿主 細胞のゲノムに適当な断片を組み込む配列などの複製を確保する他の方法を使用 し得る。酵母のベクターの制御配列は、当該技術分野で公知であり、解糖系酵素 の合成用のプロモーター（）ｌｅｓｓらの文献、１９６８年；　Ｈｏ１ｌａｎｄ らの文献、１９７８年）と、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（ Ｈｉｔｚｅｍａｎの文献、１９８０年）とを含有している。エノラーゼ遺伝子由 来のターミネータ−のようなターミネータ−（）ｌｏｌｌａｎｄの文献、１９８ １年）も含有されている。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド３−リン酸 デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター、またはアルコールデヒドロゲ ナーゼ（ＡＤＨ）を調節可能なプロモーター、ＧＡＰＤ）ｌ由来のターミネータ ー、および分泌が望ましい場合は、酵母α因子からのリーダー配列からなる制御 系である。その上、転写調節領域と転写開始領域が作動可能に連結され得るが、 これらは野生型生物内では天然に連結されていない。

発現用の宿主として入手し得る哺乳類の細胞系は、当該技術分野で公知であり、 アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる多 くの永久増殖性細胞系が含まれており、ヘラ（Ｈｅｌａ）細胞、チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＨＤ）細胞、新生仔ハムスター腎１１（ＢＨに）細胞、などの 多数の細胞系がある。哺乳類の細胞の適切なプロモーターも当該技術分野で公知 であり、サルウィルス４０　（ＳＶ４０）　（Ｆｉｅｒｓの文献、１９７８年） 、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、アデノウィルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫 ウィルス（ＲＰＶ）からのウィルスプロモーターのようなウィルスプロモーター が挙げられる。哺乳類細胞もターミネータ−配列とポリＡ付加配列が必要であり 、発現を増大させるエンハンサ−配列も含まれ、また遺伝子の増幅を起こす配列 も望ましい。これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類細胞中で複製す るのに適切なベクターとしては、ウィルスレプリコン、またはＮＡＮＢＶエピト ープをコードする適当な配列の宿主ゲノムへの組込みを保証する配列が挙げられ る。

ｎ　、　Ｃ，２，形質転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知の方法であり得、例え ばポリヌクレオチドをウィルスに充填して、宿主細胞にウィルスで形質導入する 方法、およびポリヌクレオチドを直接取り込むことによる方法がある。使用され る形質転換法は、形質転換される宿主によってきまる。例えば、イー・コリ宿主 細胞の、ＢＢ−ＮＡＮＢＶ配列を含有するλｇｔｌｌによる形質転換は後述の実 施例で考察する。直接取込みによる細菌の形質添加には、一般に、塩化カルシウ ムもしくは塩化ルビジウムによる処理が用いられる（Ｃｏｈｅｎの文献、１９７ ２年；　Ｍａｎｉａｔｉｓの文献、１９８２年）。直接取込みによる酵母の形質 転換は、旧ｎｎｅｎらの方法（ｌｉｎｎｅｎの文献、１９７８年）を用いて実施 され得る。直接取込みによる哺乳類の形質転換は、ＧｒａｈａＩＩＩとＶａｎ　 ｄｅｒ　Ｅｂのリン酸カルシウム沈澱法（ＧｒａｈａｍとＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ の文献、１９７８年）、またはこの方法の種々の公知の変形を用いて実施するこ とができる。

ｎ　、　Ｃ，３，ベクターの構築 ベクターの構築には当該技術分野で公知の方法が使用される。部位特異的ＤＮＡ 切断は、市販されている制限酵素のメーカーが一般に指定する条件下で、適切な 制限酵素によって処理することによって行う。一般に、約１μｇのプラスミドも しくはＤＮＡ配列を、１単位の酵素を含有する約２０マイクロリツトルの緩衝液 を用いて、３７℃にて１〜２時間インキュベートすることによって切断する。制 限酵素とともにインキュベートした後、タンパクをフェノール／クロロホルムで 抽出することによって除き、ＤＮＡをエタノールで沈澱させることによって回収 する。切断された断片は、εｎｚｙｍｏＩｏｇｙ、　６５巻、４９９〜５６０頁 、１９８０年の方法に見られる一般的方法にしたがって、ポリアクリルアミドも しくはアガロースのゲルによる電気泳動法を用いて分離することができる。

粘着末端の切断断片は、混合物中に存在する適当なデオキシヌクレオチド三リン 酸（ａＮＴＰ）の存在下、イー・コリＤ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（フレノウ） を用いて平滑断端にし得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理も用いることができ、 いずれの一本領ＤＮＡｆｉ分も加水分解される。

連結反応は、標準の緩衝液と温度の条件を用い、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼとＡＴ Ｐを使って実施する。粘着末端の連結反応は、必要とするＡＴＰとりガーゼが、 平滑末端の連結反応の場合よりも少ない。ベクター断片を、連結反応混合物の一 部として用いる場合、細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）もしくは仔つシ 腸アルカリホスファターゼで処理して５゛−リン酸を除いてベクターが再連結す るのを防止することが多い。

あるいは望ましくない断片の制限酵素による消化を連結防止に利用してもよい。

連結反応混合物を用いて、イー・コリのような適切なりローニング宿主を形質転 換し、次いで満足すべき形質転換細胞を、例えば抗生物質耐性によって選択し、 次いで正しい構造についてスクリーニングする。

報告されている自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて調製する。所望により、 合成された鎖は、反応の標準条件を用い、”Ｐ−ＡＴＰの存在下、ポリヌクレオ チドキナーゼで処理することによって３２Ｐで標識を付けてもよい。

ＤＮＡ配列には、ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡ配列が含まれるが 、例えばＺｏｌｌｅｒの文献１９８２年に記載されている。部位特異的変異誘発 法を含む公知の方法で修飾することができる。簡単に述べれば、修飾すべきＤＮ Ａは、−重鎮配列としてファージにパッケージされ、プライマーとして、修飾す べきＤＮＡの一部に対して相補的で、それ自体の配列中に所望の修飾部分を含ん でいる合成オリゴヌクレオチドを用い、ＤＮＡポリメラーゼによって二重鎖ＤＮ Ａに変換される。得られた二重鎖ＤＮＡを用いて、ファージを保持する宿主細菌 を形質転換する。形質転換された細菌の培養物は、ファージの各鎮の複製物を含 有しているが、寒天にプレートしてプラークを得る。理論的には新しいプラーク の５０％が、変異をした配列を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配 列を有する。プラークの複製物を、正しい鎖とハイブリッドを形成することがで きるが、未修飾の配列とは、ハイブリッドを形成できない温度と条件で、標識を つけた合成プローブとハイブリッドを形成させる。ハイブリッド形成で同定され た配列を回収してクローン化する。

ｎ　、　Ｃ，５，プローブによるハイブリッド形成りＮＡライブラリーを、Ｇｒ ｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓの文献、１９７５年の方法を用いてプローブし 得る。簡単にいえば、この方法において、プローブされるＤＮＡは、ニトロセル ロースフィルター上に固定化され、変性され、次に０〜５０％のホルムアミド、 ０．７５Ｍ　ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミンとポ リビニルピロリドンとフィコールを各々０．０２％（ｗｔ／ｖ）　、５０ｍＭリ ン酸ナトリウム（ｐ）１６．５＞、０．１％ＳＯＳ　、および１００μｇ／ｍｌ の担体で変性されたＤＮＡを含有する緩衝液でプレハイブリダイゼーションを行 う。上記緩衝液のホルムアミドの百分率と、プレハイブリダイゼーション工程と 次のハイブリッド形成工程の時間と温度の条件は、必要な緊縮性１．よってきま る。低い緊縮性条件を必要とするオリゴマープローブは、一般に、低パーセンテ ージのホルムアミド、低温および長いハイブリッド形成時間で使用される。ｃ　 ＤＮＡもしくはゲノム配列由来のヌクレオチドのようなヌクレオチドを３０もし くは４０より多く含有しているプローブは、一般に高い温度、例えば約４０〜４ ２℃、および高いパーセンテージの、例えば５０％のホルムアミドを用いる。プ レハイブリダイゼーションに続いて、５°−３２２標識化オリゴヌクレオチドプ ローブを緩衝液に添加し、次いで前記フィルターを、この混合物中で、ハイブリ ッド形成条件にてインキュベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオート ラジオグラフィーに付してハイブリッドを形成したプローブの位置を示す。元の 寒天プレート上の対応する位置にあるＤＮＡを所望のＤＮＡの超厚として使用す る。

通常のベクター構築法としては、連結混合物を用いて、イー・コリ菌株）ＩＢＩ ＯＩあるいは他の適切な宿主を形質転換し、満足すべき形質転換細胞が抗生物質 耐性あるいは他のマーカーによって選択される。次に形質転換細胞からのプラス ミドをＣｌｅｗｅｌｌらの文献、１９６９年の方法に従って調製し、次に通常ク ロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌの文献、１９７２年）を行う。そのＤ ＮＡを単離し、通常、制限酵素分析法および／または配列決定法によって分析す る。配列決定はＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒらの文献、１９７ ７年）、さらにＭｅｓｓｉｎｇらの文献、１９８１年に記載の方法、またはＭａ ｘａｍらの文献、１９８０年に記載の方法で行われる。ＧＣの多い領域に時々観 察されるバンドが込み合っているという問題は、Ｂａｒｒらの文献、１９８６年 に記載の方法にしたがってＴ−デアジグアノシンを用いて克服される。

Ｉｌ、Ｄ、ＮＡ細胞に対する抗体の調製異なる種から得たＮＡ細胞を使用して、 ポリクローナルとモノクローナルの両方の抗体が生産され得る。ポリクローナル 抗体がほしいときは、主題のＮＡ細胞に異種の選択された哺乳類（例えばマウス 、ウサギ、ヤギ、ウマなど）をＮＡ細胞もしくは溶解させたＮＡ細胞の調製物で 、好ましくはアジュバントの存在下で免疫化する。免疫化された動物からの血清 を集め、公知の方法に従って処理する。ＮＡ細胞に対するポリクローナル抗体を 含有する血清が、他の細胞の種類に対する抗体を含んでいる場合、ポリクローナ ル抗体は免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリク ローナル抗血清を生産して処理する方法は当該技術分野で公知である。例えばｌ １ｌａｙｅｒとＷａｌｋｅｒの文献、１９８７年を参照。

ＮＡ細胞の特異的エピトープに対して誘導されるモノクローナル抗体も、当該技 術分野の当業者によって容易に生産することができる。ハイブリドーマによって モノクローナル抗体を造る一般的な方法はよく知られている。不死の抗原−抗体 細胞系は、細胞融合法と、Ｂ’Ｊンパ球を癌ＤＮＡによって直接形質転換するか 、またはエプスタインパールウィルスによって移入するような他の方法で調製す ることができる。例えば、Ｍ、５ｃｈｒｅｉｅｒらの文献、１９８０年；　Ｈａ ｍｍｅｒｌｉｎｇらの文献、１９８１年ＨＫｅｎｎｅｔｔらの文献、１９８０年 、米国特許４．３４１．７６１号：同４．３９９．１２１号：同４．４２７．７ ８３号；同４．４４４．８７７号：同４，４５２、５７０号：同４．４６６、９ １７号：同４．４７２．５００号；同４．４９１．６３２号；および同４．４９ ３．８９０号を参照。ＮＡ細胞に対して産生されるモノクローナル抗体のパネル は、例えばフローサイトメトリーによる方法を含む公知の方法を用いて、ＮＡ細 胞に対する特異性についてスクリーニングすることができる。特にそのスクリー ニング法としては、後記の表１と２に列挙されたものを含む各種のより多くの成 熟細胞のタイプに対する抗体の試験が挙げられる。より多くの成熟細胞のタイプ と結合しない点で、ＮＡ細胞に対して特異的な抗体を選択する。その上に、抗体 も各種の特性、すなわちイソタイプ、エピトープ親和性などについてもスクリー ニングすることができる。

ＮＡ細胞に対して誘導されるモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方は 、これらの細胞の同定と単離に有用でこの方法は、骨髄あるいは他のリンパ造血 器官中のより多くの成熟細胞からＮＡ細胞を分離するために、抗体、好ましくは モノクローナル抗体を利用する方法を考慮している。一般に、造血細胞を含有す る組織（例えば骨髄、膵臓、嚢（ｂｕｒｓａ）　）から調製される細胞懸濁液を 、抗ＮＡ細胞抗体の調製物と接触させる。抗体が結合した細胞を、当該技術分野 の当業者に対して公知の手段によって未結合細胞から分離する。

抗体が結合した細胞を未結合細胞から分離する各種の方法が知られている。例え ば、抗体−細胞複合体は標識を付けることができるので、その細胞は、標識の存 在を検出する機械的細胞分取器で分離される。螢光標示式細胞分取器は当該技術 分野ではよく知られている。好ましい実施態様では、抗幹細胞抗体が固体の支持 体に結合される。各種の固体支持体が当該技術分野の当業者に知られており、ア ガロースビーズに限らず、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、プラスチック製ペ トリ皿が挙げられる。抗体が結合している細胞は、固体支持体を細胞懸濁液から 単に物理的に分離することによって、細胞懸濁液から取り出すことができる。

造血器官から細胞懸濁液を生産するのに、選択サイトホレーシス（Ｓｅｌｅｃｔ ｉｖｅ　ｃｙｔｏｐｈｏｒｅｓｊｓ）を用いることができる。

例えば、骨髄は提供者から適切な手段で得ることができる。

得られた骨髄は、回収される細胞を目的として主に使うことによって、所望どお りに処理することができる。骨髄細胞の懸濁液は、ＮＡ細胞上の抗原を認識する モノクローナル抗体と物理的に接触させることができ、その抗体は固体相に結合 される。固体相に結合された抗体と骨髄細胞懸濁液とのインキュベーションの正 確な条件と期間は、使用する系に特異的ないくつもの因子によってきまる。しか し適切な条件の選択は、当該技術分野の技術の範囲内にある。

適当な時間をかけて結合させた後、未結合の細胞を、生理緩衝液で溶離するかま たは洗い流す。次いで結合した細胞を、適当な方法によって、固体相から分離す る。例えば、結合細胞は激しく攪拌することによって溶離することができる。あ るいは、固体相と抗体を結合する″スペーサー″の配列を酵素で切断もしくは消 化することによって溶離することができる。

次に、細胞の溶離され濃縮された両分を緩衝液で洗浄し、次いで通常の凍結保存 法を用いて、後に使用するため生存可能な状態で凍結保存するか、または移植物 受容者に直ちに静脈注入する。代わりに、細胞は、後に使用するために、細胞培 養で保持してもよい。細胞を培養するのに適切な条件は当該技術分野の技術の範 囲内にあり、ＮＡ細胞が培養で保持される条件は実施例に記載しである。

ＮＡ細胞の上記細胞懸濁液は、始原細胞移植法と、当該技術分野の当業者にとっ て明らかな方法とのような治療法に用いることができる。例えば、薬学的に受容 され得る賦形剤中に懸濁された細胞集団は、細胞交換治療を要する個体に、個体 の造血系および／または免疫系を再構成するのに充分な量で、静脈内に直接投与 することができる。薬学的に受容され得る賦形剤には９例えば、生理食塩水のよ うな、生理学的に緩衝された等張塩溶液、およびグルコースまたはデキストロー スの等張溶液が含まれる。細胞懸濁液の他の成分は、ＰＣ−Ｃ３Ｆについて以下 に列挙するものでもよい。正確な有効量は、当該技術分野の当業者は容易に決定 することができ、勿論、その治療法で治療される正確な症状によって決まる。

しかし多くの用途において、吸出される骨髄の１７２から１１に見出されるのと ほぼ同じＮＡ細胞の数を含有する量が適当であるはずである。

個体の造血障害の治療法には、その個体をＰＣ−Ｃ５Ｆで治療する方法が含まれ る。ＰＣ−Ｃ３Ｆによる治療は、それ単独でもよく、または、例えば、ＮＡ細胞 による細胞交換もしくは細胞増加法のような他の治療法を組み合わせてもよい。

ＰＣ−Ｃ３Ｆは、液体溶液もしくは懸濁液のような注射剤として調製してもよく ：注射する前に調製される液体の溶液もしくは懸濁液用に適切な固体形態で造っ てもよい。製剤は乳化させてもよく、またはそのタンパクはリポソームでカプセ ルにしてもよい。活性ＰＣ−Ｃ５Ｆには、医薬として許容され、この活性成分と 適合性の賦形剤と混合することが多い。

適切な賦形剤としては９例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、 エタノールなどおよびその組合せがある。

その上に、所望により、ＰＣ−Ｃ３Ｆ製剤は、湿潤剤もしくは乳化剤、およびｐ Ｈ緩衝剤のような補助物質の少量を含有していてもよい。通常、この製剤は、例 えば静脈、皮下もしくは筋肉内に注射することによって非経口投与される。他の 投与法用に適切な他の製剤としては坐剤があり、いくつかの症例には経口製剤が 用いられる。これらの製剤に適切な材料は当該技術分野の当業者には公知である 。ＰＣ−Ｃ３，Ｆは、剤形と適合したしかたで、治療上有効な量で投与される。

投与量は、造血障漕と治療される治療を受ける者によって決まる。

ＰＣ−Ｃ３Ｆは、単一投与法で投与してもよいが、多数回投与法で投与する方が 好ましい。多数回投与法とは、最初の治療を１〜１０回の別個の投与で行い、次 に、治療反応を維持し、右よび／または強めるために必要な時間間隔をおいて、 別の投与を行う方法である。また投与計画は、少なくとも一部分は１個人の要求 によってきまり、および医師の判断によって決まる。

以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すために提供するものである。こ れら実施例は例示することだけを目的とし、本発明の請求の範囲を限定するもの でばない。

骨髄培養物は、２頭のホルスタイン仔ウシから吸出した骨髄由来のものであった 。骨髄細胞は、２頭の麻酔をかけた仔ウシ（両方とも１年齢より若い）の腸骨稜 から、２ｘクエン酸液中に集めた。得られた骨髄試料を、最小必須培地（ＭＥＭ ）を用いてクエン酸塩がなくなるまで洗浄し、２．０００ｒｐＩ１１で１５分間 遠心分離した。得られた細胞のペレットをＭＥＭ中に再懸濁させ、その細胞懸濁 液をフィコールハイバック密度勾配液上に層状に置いて室温（ｒｔ）にて３０分 間、２．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。遠心分離に続いて、勾配液の界面におけ る細胞を集め、１１１ＥＭで希釈し、再び１０分間、１．０００ｒｐｍで遠心分 離した。得られた細胞をさらに２回洗浄した。最後の洗浄の後に、細胞を、１０ ％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）で補充したＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させた。こ の細胞懸濁液を調節して、最終細胞濃度を２Ｘ１０’細胞／ｄにした。次にこの 骨髄細胞懸濁液を、１００　ｍｍ直径のベトリ皿（Ｃｏｓｔａｒ）中の、１５ｍ １体積の増殖培地（ＲＰＭＩ　＋　１０％ＦＢＳ）に、ｌＸｌ０’細胞／プレー トの濃度で接種した。次にこの培養プレートを、５％ＣＯ□含有の空気の雰囲気 下の加湿保温器内で、３７℃にてインキュベートした。得られた２つの培養物を Ｂ、　ＢＭ、　１およびＢ、　８Ｍ、　２と命名した。

培養をはじめて２〜３週間の間に、ベトリ皿の表面に成長した付着細胞集団が現 れた。これらの細胞が融合状態になったとき、次のようにしてＴ　７５ｃｏｆフ ラスコに移して継代培養した。接着細胞の融合単層の入っているベトリ皿を、バ ーセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ、　ＥＤＴＡの登録商標名）止トリプシンの溶液（５％ ）を用いて過剰の増殖培地がなくなるまで洗浄した。２回目の洗浄の後、２．０ ｒ１１１の前記のバーセン−トリプシン溶液を添加し、そのプレートを３７℃で ５分間インキュベートし、プレートを検査して細胞がプレート面からはずれたこ とを確かめた１そのプレートに、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭｌ　１０　ｍｌ 、を添加し、次いで攪拌することによって単細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸 濁液を１．００Ｏｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄み液を排除した。得られた細 胞ベレットを新しい増殖培地に再懸濁させ細胞数を２Ｘ１０”細胞／ｍｌ’に調 節した。次にこの細胞懸濁液を、４０艷の培地中に４Ｘ１０’細胞／フラスコの 濃度になるように、滅菌Ｔ　７５ＣＪｌフラスコに入れた。次にこの細胞を、１ ０％ウシ胎児血清で補充したダルベツコの最小必須培地を用いて接着集団として 連続して継代培養を行った。

Ｂ、　ＢＭ、　１およびＢ、　ＢＭ、　２の接着細胞集団を継代させることなし に２ケ月間さらに増殖させた結果、接着細胞の表面に重複したＮＡ細胞の集団を 増殖させることができた。両方のびんの細胞を継代培養し、貯蔵されている８、 　８Ｍ、　２の一部を液体窒素内で貯蔵した。Ｂ、　８Ｍ、　２は接着（ストロ ーマ）細胞とＮＡ細胞の混合集団として培養で維持した。

ＮＡ細胞の最初の培養と維持との間に、ＮＡ細胞が、ストローマ単層に物理的に 接着していることがわかった。ＮＡ細胞を、物理的な接着によらずに、離れさせ て、可溶性因子を−介して“連通”させることしかできないチャンバー内に入れ １　たところ、ＮＡ細胞は死滅した。しかしチャンバーの下のストローマがある 部分にはＮＡ細胞の小さなコロニーが発生した。

ストローマなしでＮＡ細胞集団を増殖さてせる最初の試みは失敗した。しかし最 初のＢ、　ＢＭ、　１培養物由来の馴化培地を利用することによって、ストロー マ細胞を含有しないＮＡ細胞系を単離して、培養で維持した。これらの細胞系は いくつもの種由来のものである。ある場合には、すなわちヒトとブタの骨髄の培 養物では、ＮＡ細胞培養物を得るには、骨髄培養物を、ウシ骨髄培養物由来の馴 化培地で２回処理する必要があった。これらの場合、馴化培地による処理は４日 間間隔を細胞系の構造分析は、薄片（ｔｈｉｎ−ｓｅｃｔｉｏｎ）電子顕微鏡を 用いて行った。ストローマ細胞およびＮＡ細胞を試験するため別個に調製した。

ＮＡ細胞は、充分に洗浄して、ピペッティングによって培養物から取出し、スト ロ−７細胞はトリプシン処理によって取り外した。細胞のベレットを２，５％の ゲルタールアルデヒドを含有するＯ、　１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７，１ 中で前固定し、１％０ＳＯＪ　ＰＢＳ中で後固定した。超薄片を酢酸ウラニルと クエン酸鉛とで染色し、フィリップス電子顕微鏡にて６０ｋＶで検査した。

トリプシン処理ではずしたストローマ細胞は、長さと厚みが変動している多数の フィリボディア（ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）のために波立った膜をもっているようで ある。その細胞本体は直径が２０〜２５ミリミクロンであった。その核は、核層 にそってヘテロクロマチンの狭いバンドを有し、非常に多形性で真正染色性であ った。大きな仁が通常存在していた。細胞質は電子密度が高く、細胞内器官が多 いようであった。細胞内器官は、よく発達したゴルジ領域、非常に密度が高いマ トリックスを有する細長いミトコンドリア、顆粒状と繊維状の内容物を有する多 数の小胞、および多数の粗面小胞体（ＲＥＲ）を含有している。ＲＥＲは膨張す ることがあり、密度が高いタンパク質性物質を含有している。多くの細胞に、繊 維状物質のパッチが、細胞質の周縁の領域を占めていた。これが細胞の”接着器 官”を構成している。

最初の培養形におけるＮＡ細胞は、有糸分裂の少数の細胞と、前顆粒球的特性を 有するまれな細胞を除いて、均一な大きさと形態の細胞であった。ＮＡ細胞の大 部分は直径が約１２〜１６ミリミクロンであった。この細胞は丸形もしくは二裂 形の核をもっているようであり、その核は通常、真正染色性であり、大きな膜が 連結した仁をもっている。その細胞質には細胞内器官が比較的少なかったが、そ の細胞内器官は、　ＲＥＲの少数の連鎖、数が変動し大きく膨張していることが 多いミトコンドリア、および少数の小さな電子密度の高い顆粒と多小胞体で構成 されていた。しかし、細胞質には、多数の遊離のリポソームとポリリポソームが 存在するので電子密度が高いようである。

二番目に誘発された培養物中のＮＡ細胞は、実施例２に記載されているようにし て調製したが、大きさと形態がより不均質のようであるが、これらはすべて単球 マクロファージ系統の細胞に似ていた。核の形はその初代培養物の核の形に似て いたが、その核はへテロクロマチンが豊富なことが多かった。その細胞質は、遊 離のリポソームとポリリポソームが豊富なことが特徴であって、さらに多くの細 胞が細胞内器官を充分に備えていた。顕著なゴルジ領域が多くの細胞に観察され 、この領域は平坦な小嚢の大きな積み重ねと連続した小胞で構成されていた。Ｒ Ｅ！Ｒも、これらの細胞中には、最初の培養系の細胞中よりも豊富であり、食作 用の徴候（ｅｘｏ／ｅｎｄｏ、　ａｕｔｏ）はいくつかの細胞内で明らかであっ た。細胞の不均質性はいくらか１分化の経路の差よりも細胞の年齢の差の方を反 映している。その理由は、老化の徴候も、時々細胞に表われており、またこれら の細胞の表現型形態が相同のようであるからである（実施例４と表１参照）。

（以下余白） 実施例４ を、半定量法の膜蛍光法とフローサイトメ）　ＩＪ−分析法を用いて研究した。

これらの細胞はＮＡ細胞系である。

２つのウシ細胞系Ｂ、　ＢＭ、　１とＢ、　ＢＭ、　３の表現型を、Ｔ細胞サブ セット、ＭＨＣクラスＩとクラス■の抗原、マクロファージ／単球、ヌル細胞（ 非Ｔ／非Ｂ）、＃よびＢリンパ球に対して特異的なモノクローナル抗体のパネル を用いて分析した。モノクローナル抗体のパネルは、米国、ワシントン州、プル マン、ワシントン州立大学のＷ、　Ｃ，ｌ１ａｖｉｓから入手した。使用した抗 体とそれらの特異性を表１に示す。

フローサイトメトリー分析を次のようにして行った。骨髄細胞をペレットにしく １．００Ｏｒ　ｐ　ｍで８分間）、０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ 、Ｃｏ、、米国、ミズーリ州、セントルイス）、１ｍＭアジ化ナトリウム、およ び２．０％の正常ウサギ血清（Ｃｏｏｐｅｒ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、米国、ペ ンシルバニア州、マルバーン）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　Ｇ） 中に２ＸＩＱ’の濃度で再懸濁した。表面の表現型を研究するために、５０μｌ の細胞懸濁液を、９６ウエルの平底微小滴定板中の適当なモノクローナル抗体５ ０μｌに添加し、４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ　Ｇ で３回洗浄し、次にＰＢＳ　Ｇでｌニア５に希釈したＦＩＴＣで標識したＦ（ａ ｂ’）２ヤギ抗マウス免疫グロブリン（重鎮および軽鎖特異的、Ｃｏｏｐｅｒ　 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、米国、ペンシルバニア州、マルバーン）の１００μｌと ともに４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をＰＢ ＳＧで３回洗浄し、ＰＢＳ　Ｇ中のホルムアルデヒドの２％溶液中で固定した。

得られた細胞調製物を、分析するまで４℃で暗所に置いた。細胞凝集物は、Ｆｃ 分析を行う直前に、６２ミリミクロンのナイロンモノフィラメントのメツシュ　 ＜Ｓｍａｌｌ　Ｐａｒｔｓ　Ｉｎｃ、、米国、フロリダ州、マイアミ）で濾過し て、全試料から除去した。Ｆｃ受容体（ＰｃＲ）の結合による非特異的標識化を 検出するために適当なコントロールを添加した。これらのコントロール中で、骨 髄細胞は、ＦＩＴＣで標識したＦ　（ａｂ’）ｚだけ、または無関係の抗原に対 して特異的な、イソタイプマツチド（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）モノク ローナル抗体と反応した。

ＦＩＴＣで標識をつけた骨髄細胞を、Ｃｏｕｒｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ 　Ｌｔｄ、のＥＰＩＣ３Ｖフローサイトメーターで分析した。２０．０００の細 胞からデータを集めて、モノクローナル抗体の反応性のパターンを分析した。前 方傾斜角光散乱（ＦＡＬＳ）対９０°光散乱（Ｌｉ２Ｏ）の２パラメ一タ分析を 利用して分析中の集団から死んだ細胞とデブリを除いた。蛍光のデータを、蛍光 に対するＦＡＬＳの両方の散乱プロットおよび、蛍光対細胞数のヒストグラムと して集めた。陽性細胞の百分率を、免疫プログラム（ＣｏｕｌｔｅｒＩｌ！Ｉｅ ｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｌｔｄ、、　Ｍ口ＡＤＳ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｖｅｒｓｉｏｎ 　３．１）を用いて決定した。

Ｂ、　ＢＭ、　１とＢ、　ＢＭ、　３のフローサイトメトリー分析の結果、これ らの細胞系がＴ細胞もしくはＢ細胞のマーカーを発現せず、また単球／マクロフ ァージのマーカーも発現しないことが分かった。またこれらの細胞系は、ＭＨＣ クラスＩ［（ＩＡ）抗原とＴ４ヘルパー細胞抗原の発現も欠いている。しかしす べての細胞がＭＨＣクラスＩ抗原を発現する。

これら細胞の特性決定をさらに行うために、これら細胞の免疫細胞化学的研究を 行った。表面膜と細胞質の表現型マーカーの免疫細胞化学的証明を、）１．Ｂｉ ｅｌｅｆｅｌｄｔ　Ｏｈｍａｎｎ、　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅａ＋、Ｃｙｔｏｃｈ ｅｍ、、３５巻、　６２７−６３３頁、　１９８７年に詳細に記載されていると おりにして行った。簡単に述べると、白血球の抗原を、免疫モノクローナル抗体 のパネル（表１）を用い、問題の抗体を適当に希釈して、ポリ−Ｌｉ−リシンで コートしたスライド上で、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物を、１時間 インキュベートすることによって検出した。３回洗浄した後、ウサギ抗マウスＩ ｇを添加し、インキュベーションを３０分間再度行い、次いで洗浄した。アルカ リホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ複合体を次に加える。最終の洗浄の 後、スライドを基質（２ＭｇＡｓ−Ｍ）ｌン酸を含有する、０゜２Ｍ）リス緩衝 液ｐＨ８，２，１ｍＭ　リドカイン、および１ｍｇのファーストＴＲ塩）ととも にインキュベートした。メチルグリーンで対比染色した後、細胞調製物を水性ゼ ラチン中に入れ、光学顕微鏡で検査した。

免疫細胞化学的方法を用いた表現型の分析の結果を表１に示す。これらの結果は 、フローサイトメトリーの分析結果と一致して、Ｂ、　ＢＭ、　１とＢ、　ＢＭ 、　３の細胞が、Ｔ細胞マーカー、Ｍ）Ｉｃクラス■抗原、Ｂ細胞マーカー、お よびいくつかのマクロファージマーカーを欠いていることを示した。しかし、フ ローサイトメトリーの分析とは対照的に、免疫細胞化学的方法を１８Ａ、　ＣＡ １３７ＡおよびＣｌ１１６Ａも存在していた。免疫細胞化学的方法は、細胞内抗 原と表面に結合した抗原を検出するが、フローサイトメトリー法は表面に結合し た抗原のみをモニターする。検出された差異は、２つの方法の特異性におけるこ の差異に関連し得る。

表１ 免疫細胞化学的方法で決定したウシ骨髄培養細胞の表現型の８７４　ヌル細胞　 ９９．ＯＮＴ ＢＬ８Ａ　顆粒球、単球　９２．７’　ＮＴサブセットＴ−リンパ球 サブセット　（？） ＤＨ５９Ｂ　血液単球　９７．９　Ｎ７Ｍ７１８　成熟マクロファージ　０．０ 　ＮＴＴ）１１４Ｂ　ＭＨＣクラスｎ　Ｏ，００Ｈ４２Ａ　ＭＨＣクラスｎ　ｏ 、ｏ　。

ＣＨ１２８Ａ　Ｔ−リンパ球（Ｅ−ｒｏｓｅｔ）　０．０　５．５　’Ｒ１（１ ２Ａ　ＭＨＣクラス１　５．２’　１００’ＢＩｇ７３　Ｂ−リンパ球（Ｉｇ） Ｉ）　＜２　０ＧＳ５Ａ　Ｂ＋Ｔ　リンパ球　？０　？サブセット ＢＡＱ４４　Ｂ−リンパ球　？　？ Ｈ１８Ａ　単球−サブセット（？）　１００　ＮＴＲ１（１６Ａ　ＭＨＣクラス Ｉ　−／？　１００ｂＢ２９Ａ　Ｐａｎ　Ｔ−リンパ球　ＯＮＴ１１３４Ａ　単 球−サブセット　９５．７　ＮＴＣ）１１６Ａ　単球−サブセット　９４．ＯＮ ＴＪＬ−２２７りｖ　７　ｙ−ジ　＜１’　ＮＴサブ集団（成熟細胞） Ｅ４ＣＴ−リンパ球サブセット　０，０　１１１ＴＥ４０ＣＯ，ＯＮＴ ）１ｔｌＨ２７顆粒球（好中球）　０．ＯＮＴＢ４Ｑ４Ａ　非Ｔ非Ｂ細胞　＜１ ’　ＮＴＢＡＳ９Ａ　Ｂ−リンパ球　？　ＮＴ １１３４Ａ　Ｍ）Ｉｃクラスｎ　ｏ、ｏ　。

ポリ−し一リシンでコートしたスライド上のサイトスピンの１９８７年）で、被 検マウスのモノクロナール抗体複合物を用いて染色した（後者の２つの試薬は口 ＡＫＯＰＡＴＴＳ　ａ／ｗ　、デンマーク、グロスドロップから入手）。クロモ ーゲンはナフトール−ＸＭ−ホスフェートであった。最低数１００個の細胞がス ライドごとに計数された。

４抗原のみ細胞内で発現。巨細胞のみ陽性。

ゝ弱い抗原反応（低い染色強度）。

６いくつかの細胞内／細胞上の弱い疑わしい反応。

６巨細胞中にのみ存在する陽性細胞。

カー、Ｂ細胞マーカーおよびいくつかの腫瘍細胞系に対するものである。

細胞をいずれかの系統のメンバーとして同定する機能をっもともに予めインキュ ベートしなかった細胞にも、腫瘍細胞標である、活性化ウシ血清へ移行する能力 （走化性）について能を示さなかった。

った。すなわち、ＩＦＮ−７，ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αはコロニーの数の変 化を誘発せずまた、細胞の形態とコロニーの種類の変化も観察されなかった。

ナチュラルキラーエフェクター（ＮＫ）細胞の主な役割の一つは、骨髄中の多分 化能幹細胞集団を除くかまたは調節することによって造血を調節することである ＜　Ｂａｒｌｏｚｚａｃｉ　ら、の文献、１９８７年）。ＮＫ細胞の骨髄細胞に 対する細胞の致死性作用を、標準の”ＣＲ放出微少細胞毒性アッセイを用いてモ ニターした。この方法はＮＡ骨髄細胞（Ｂ、ＢＭ、３．　）ＩＵ、ＢＭ、２およ びＭＵ、ＢＭ、　２）を”Ｃｒで標識して、ヒト、ウシおよびマウスの肺臓培養 物由来の末梢血液リンパ球と結合したＮＫに対する標的として用いる方法である 。このエフェクター細胞（ＮＫ）の、組換え型ＩＬ−２存在下および非存在下に ついて細胞溶解活性をアッセイした。

図１．２および３それぞれに示す結果から分るように、ウシ、ヒｌよび程度は低 いがマウスのそれぞれの骨髄細胞系は、推定上のウシ、ヒトおよびマウスのＮＫ 細胞による非ＭｌｌＣ−制限細胞溶解反応に対する標的として作用する。この細 胞溶解反応は、ＮＫ細胞を、接着骨髄細胞と相互作用する前に、ＩＬ−２で４８ 時間処理すると、著しく促進される。

骨髄細胞を組換え型ＩＬ−２で前処理しても、これら細胞に、それら自身または に５６２のような腫瘍標的に対するエフェクター機能を誘発しないことは注目に 値する。

マウスのＮＡ骨髄細胞、Ｍｌｌ、　ＢＭ、　２を３２ｐで標識し、マウスに静脈 を通じて接種した。接種後、適当な時間経過してから、マウスを殺してχ線フィ ルム上にのせた。露光させたＸ線フィルムを現像し、３２ｐで標識を付けた物質 が、接種されたマウスの造血組織に存在するか否かを決定するために検査した。

その結果次のことが分かった。すなわちマウス骨髄の３２ｐの量は２時間で検出 可能になり、３０時間でほとんど検出れ、標識をつけた細胞がマウスの造血組織 に帰巣したことを示した。

ＣＦ［Ｉ−Ｓアッセイによって多分化能幹細胞の造血ポテンシャルを測定する。

ＣＰＵ−５アツセイを、致死的に放射線を照射したマウスについて行った。ＢＡ ＬＢ／Ｃ種のマウスに、１２００ラド／全身（３００ラド／分）のＶ照射の線量 で放射線を照射した。この線量は、ＬＤ５゜線量であることを予め決定してあっ た。放射線を照射したマウスに、１０００個程度の少量のＭＵ、　ＢＭ、　１細 胞を接種したところ、肺臓に多数発生するという結果が得られた。１０３もしく は１０８の細胞を注射されたマウスは、１３日後に、マウス毎にそれぞれ、１０ コロニーと３０コロニ一以上を形成した。

接種されたマウスの肺臓の一般的な組織形態学的外形は、免疫活性を示唆してい た。この類別は、よく発達した二次卵胞と、太くて、細胞が多い細動脈周囲リン パ組織梢（ＰＡＬＳ）に基づいている。”白色膵臓”のこの膨張が起こると、” 赤色膵臓”の縮小が付随して起こった。

芽球様細胞の小さな群は小嚢ＩＪンパ球により２〜４倍大きいが、白色膵臓の要 素の間に、膵臓実質内に深く、またはそのカプセルの下に直接法がっていた。そ の小さな細胞コロニーは、非リンパ球系構造（結合組織もしくは内皮）によって 正常肺臓実質からは、明らかに分離されていなかった。これらの小さなコロニー 中の細胞は、相同のようであり、豊富な原形質と大きな正染性の核を含有してい た。有糸分裂は頻度が変化した。

また大きな被膜下コロニーが接種したマウスのａｍ内に存在していた。芽球様細 胞の小さなコロニーと異なり、この大きな被膜下コロニーは一層不均質であり、 有糸分裂細胞と核濃縮性細胞をもっていた。核濃縮は一般に細胞変性の指標であ る。このコロニーは、内皮／結合組織によって部分的に分画され、小動脈もしく は小静脈でよく血管化されていた。時々、凝固壊死がコロニーの中心に存在して いた。大きなコロニーは、リンパ節実質（副皮質領域）にいくらか類似している が、このコロニーは、未分化なことが最も大きな特徴である。

接種されたいくつかの動物の肺臓には、２つ以上の巨核球からなる群が含まれて いた。これらのコロニーの位置は、前記の″未分化な″コロニーの位置とは明ら かに無関係であった。

ＮＡ骨髄細胞は、可溶性因子を生成することによって、すなわち自己分泌自己増 殖によってそれ自身の複製を調節しているようである。この複製方法は、解除さ れると、腫瘍形成および転位の第１段階として関与してくる（Ｌａｎｇらの文献 、１９８５年）。ＮＡ骨髄細胞が腫瘍形成性であるか否かを決定するために、無 胸腺ヌードマウスにＢ、　ＢＭ、　３もしくはＨｔｌ、　ＢＭ、　２もしくはＭ ［Ｉ、　ＢＭ、　２由来の細胞を腸腔内もしくは皮下に接種した。

これら３種の細胞系はすべて腫瘍を生成したが、腫瘍生成は接種の経路とは独立 していた。腫瘍細胞を、充実性腫瘍と腹膜の両方から回収し、生体外で再培養す ることに成功した。

コントロールとして、細胞系Ｂ、　ＢＭ、　３とＨｌｌ、　ＢＭ、　２を、電子 顕微鏡と逆転写酵素に対するアッセイの両方を用いてレトロウィルスについてス クリーニングした。

逆転写酵素活性を測定する方法は次のとおりである。骨髄細胞系から得た上澄み 液を超遠心分―にかけて、生成したペレット中の潜在的なレトロウィルスを捕獲 した。ベレットを少量の緩衝液（ＲＴ緩衝液）中に再構成してから、Ｗｕら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７０巻、１２８９〜１３０２ 頁、１９７３年に記載の方法にしたがって分析した。

電子顕微鏡と逆転写酵素に対するアッセイとによる両方の分析の結果は、レトロ ウィルスの感染について否定的であった。

（以下余白） 大ｍ 地　に　る可汐　の′　： ＮＡ　の　と　の　１激 Ｂ、　ＢＭ、　１培養物が融合状態に到達した後、その培養物を０．２２ミクロ ンのフィルターで濾過してその培養物の上澄み液を通過させることによって馴化 培地を得た。この馴化培地を他の仔ウシから得た骨髄ストローマ培養物に添加し た。この骨髄ストローマ培養物は実施例１に記載しているのと同様にして調製し た。処理した後、４〜６日後にこれら培養物にＮＡ細胞が観察された。馴化培地 がなければ、ＮＡ細胞が生じるのに通常、約２ケ月を要する。馴化培地で処理し たウシ骨髄ストローマ培養物由来のＮＡ細胞系をＢ、　ＢＭ、　３と命名した。

支五匠Ｕ ウシストローマ細胞の培養物由来の馴化培地中の因子が、他の種由来のＮＡ骨髄 細胞の出現と増殖を刺激する活性があるか否かを決定するため、マウス、ヒト、 ブタおよび七面鳥由来の骨髄ストローマ培養物を馴化培地で処理した。すべての 場合に、馴化培地によって、ＮＡ細胞が出現するのに要する時間が短くなった。

この処理に由来するＮＡ細胞系を図４に示す。

コロニー　撤回　ＰＣ−ＣＳＦ　の生 ストローマ細胞由来の馴化培地は、潜在的な多分化能機能を有する原始ＮＡ骨髄 細胞を産生ずる正常骨髄ストローマ培養物を誘発するＰＣ−ＣＳＦを含有してい るが、次のようにして調製される。

Ｂ、ＢＭ、３ｆｆｌ細胞［置物（７５ｃｍ２フラスコ中）を、ストローマ細胞（ 接着性）が融合状態に到達するまで、気体（５％ＣＯ２含有空気）で満たした高 湿度インキュベータ内で３７℃にて培養した。

この培養期間中、過剰のＮＡ細胞を毎日除去した。ストローマ細胞が融合状態に 到達したならば、培地を取出し、新しい培地を添加した。ついでその培地をさら に２４〜３０時間再度インキュベートした。インキユベートした後、上澄み液を 集めて、遠心分離しく　２０００ｒｐｍ、　１０分間）、次いで０．２２ミクロ ンのミリポアフィルタ−を用いて濾過した。濾液を一７０℃で貯蔵する。

Ｋ立五且 ＰＣ−ＣＳＦの゛　のアッセイ 下記のようにして調製し、融合状態にまで増殖した１００＋ａｍ直径ペトリ血中 のウシストローマ培養物を、培地がなくなるまで洗浄し、実施例１４と同様にし て調製した粗ＰＣ−ＣＳＦを添加した。添加されたＰＣ−ＣＳＦは、希釈しない か、または２倍希釈法で２〜２５６倍の範囲の各種の希釈液を調製した。そのプ レートを、気体で満たした高湿度インキュベーター中で３７℃にて４時間インキ ュベートした。最初のインキ二ベーシコンの後、１０ａｅの増殖培地（抗生物質 なしの、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０）を添加し、次い で、プレートを少なくとも１４日間さらにインキユベートした。ＰＣ−ＣＳＦで 処理した培地を、ＮＡ細胞のコロニーの出現について毎日検査し、結果を記録し た。

ウシ骨髄ストローマ細胞培養物を調製するために、１年齢より若い、麻酔をかけ た仔ウシの腸骨稜もしくは胸骨からクエン酸塩処理した骨髄の試料を集めた。骨 髄の吸引液を室温にて２００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を除き 、得られた細胞のペレットを、抗生物質で補充した最少必須培地（ＭＥＭ）中に 再懸濁させた。生成した細胞懸濁液をフィコールハイバック密度勾配液上に層状 におき、室温にて２００ＯＲＰＭで３０分間遠心分離した。遠心分離した後、勾 配液の界面の細胞を集め、ＭＥＭの希釈液で洗浄し、次いで１１０００ｒｐで８ 分間遠心分離した。この洗浄を４回繰返した。最後の洗浄を行った後、１０％の 胎仔ウシ血清を含有する抗生物質なしのＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し、計数し 、希釈して最終濃度の５　Ｘ　１Ｇ’細胞／蹴にした。

得られた細胞懸濁液を、減菌した組織培養用の１００ｗｌ１１直径ベトリさらに 、１５蹴の増殖培地中５Ｘ１０’細胞／プレートの細胞濃度でプレートし、ガス （５％Ｃｏ２含有空気）で満たした高湿度インキニベーター中３７℃でインキユ ベートした。接着ストローマ細胞のコロニーの出現について培養物を毎日検査し たが、コロニーは、培養を始めて７〜１２日後に毎日出現した。ストローマコロ ニーが出現したときに、培養物をＮＡ細胞がなくなるまで洗浄し、増殖培地を補 充した。ストローマ細胞培養物は、融合状態に達したときに、トリプシン−ＥＤ ＴＡで処理しテ分散させ、得られた細胞懸濁液を、さらに、新しい１００ｍｍ直 径のベトリ皿に移して継代接種した。ストローマ培養物は通常１週間に１回継代 接種した。継代接種した細胞の一部を、１０％胎仔ウシ血清とｌＯ％ＤＭＳＯを 補充したＲＰＭＩ−１６４０からなる貯蔵培地内で、液体窒素中に貯蔵した。

粗ＰＣ−ＣＳＦアッセイの結果を図５に示す。ＮＡ細胞のコロニーは、馴化培地 を含有する希釈していないＰＣ−ＣＳＦで処理して４〜７日後に出現した。図５ において、十記号は１４日目間検出されたコロニーの数を示す。馴化培地を含有 するＰＣ−ＣＳＦがない場合、この時、ＮＡコロニーは検出されなかった。さら にＰＣ−ＣＳＦ活性は馴化培地を１６倍に希釈した時に検出可能であった。

叉ｍ硯 ＰＣ−ＣＳＦのクローン　アッセイ ＰＣ−ＣＳＦの活性を、次の方法によるクローン原性アッセイを用いて測定した 。この方法は、減菌法、ガラス器具および培地を利用している。ＰＣ−ＣＳＦを 含有していると推定される馴化培地を、常用対数希釈律（１０１′−１０’）で 希釈した。１ｘ１０６個の骨髄細胞を含有するＯ、　Ｓｗｔを、適当に希釈した 馴化培地０．５戚と５誠のバイアル中で混合した。骨髄細胞は、以下に記載した ようにして調製した。上記の各バイアルに１．６％のメチルセルロースを含有す るＲＰＭＩ−１６４０１，Ｏｍａを添加した。バイアルの内容物を混合し、混合 物の１．０誠をＣｏ５ｔａｒ　３５Ｘ　１０ｍｍのペトリ皿に添加した。各アッ セイは２回ずつ行った。プレートは、前後、左右にゆるやかに傾けて皿の表面全 体に均一に培地を分布させた。次にそれらのベトリ皿を直径１５０ｍｍのベトリ 皿内に入れ、この大きなペトリ皿には各々、水の入ったふたなしの３５Ｘ１０ｍ ｍのペトリ皿が１個入れられ、湿度を保持させた。次にこの大きなベトリ皿を、 ５％ＣＯ２含有の空気の雰囲気下３７°Ｃに保持したプレートをｌＯ日間毎日検 査し、倒立顕微鏡を用いてコロニーを計数した。

クローン原性アッセイに用いる骨髄細胞懸濁液を、麻酔をかけた仔ウシ（１年齢 より若い）の腸骨稜から２×クエン酸塩液に吸引して集めた骨髄の液から得た。

この骨髄試料を、ＭＥＭを用いて、クエン酸塩がなくなるまで洗浄し、室温にて ２００ＯＲＰＭで１５分間遠心分離した。生成した細胞ベレットをＭＥＭ中に再 懸濁し、その細胞懸濁液を、フィコールハイパツク密度勾配液上に層状に置いて 、室温にて３０分間２ＱＯＯＲＰＭで遠心分離した。遠心分離に続いて、勾配液 の界面に位置する細胞を集め、ＭＥＭで希釈し、室温にて８分間１１０００ＲＰ で遠心分離した。

洗浄を２回繰返し、細胞を、ｌＯ％胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭｌ−１６４０ 中に再懸濁させた。この細胞懸濁液を調節して、最終濃度を２ＸＩＯ’細胞／絃 にした。

クローン原性アッセイで得た結果は次のとおりである。プレートの毎日の検査で は、１０個の細胞より少ないコロニーは培養を始めて３日月に観察され、１コロ ニー当たり１５個細胞より大きいコロニーは培養４日間に現れた。滴定して、Ｐ Ｃ−ＣＳＦ活性の最終濃度を得るには、１０日間培養物をインキュベートするこ とが好ましい。

形態学的に、得られたコロニー中の細胞は、馴化培地がもたらされたＮＡ細細胞 −類似しているようである。他のタイプの細胞コロニーは全く観察されなかった 。さらに次のことが観察された。すなわち、ＮＡＡ胞由来の上澄み液はＰＣ−Ｃ ＳＦ活性を示したが、この活性は、ＮＡ細胞をウシ骨髄ストローマ培養物と共に インキュベートすることによって著しく促進されることが観察された。さらにこ の活性促進は、ＮＡ細胞が骨髄ストローマすなわちＢＯ，ＢＭ、　００１から単 離されたストローマと共にインキュベートされたＢＯ，ＢＭ、　３　（ＮＡ細胞 ）に対して異種であっても起こったようである。

クローン原性アッセイは、ストローマ細胞の誘発を測定する方法よりも感度が著 しく高いようである。最大のＰＣ−ＣＳＦ活性は、ストローマ細胞の誘発を利用 した場合、ｌ／１６の希釈度の上澄み液で得られたが、一方クローン原性アッセ イの場合、同じ上澄み液に対するピーク活性は、１／ｌｏｏ〜１／１０００の希 釈率で得られた。

またクローン原性アッセイでＰＣ−ＣＳＦのピーク活性を与える濃度において、 ストローマ細胞のクローンが増殖することがみられることが分かった。通常、ス トローマ細胞のクローンは、培養を始めて１０〜１４日までは出現しない。それ 故に、培養物の上澄み液は、骨髄培養物中に存在するストローマ細胞の増殖を促 進するようである。

支五五豆 ＰＣ−Ｃ５Ｆ−ａトＰＣ−Ｃ５Ｆ−ノＦ”　’ＰＣ−ＣＳＦ−αとＰＣ−ＣＳＦ −βを、第６図に示す計画Ａにしたがって、マウスストローマ細胞培養物とマウ スＮＡ細胞培養物由来の馴化培地から精製した。

この計画にしたがって、培地が適当なストローマ細胞培養物および／またはＮＡ Ａ胞培養物由来のものであることを除いて前記実施例１２に記載したのと同様に して、馴化培地が得られる。約２０誠の馴化培地をほぼ１８００μ込まで濃縮す る。あるいは、試料を濃縮するために、該培地を凍結乾燥し、その乾燥物を、減 菌二重蒸留水に再溶解して、約１５倍に濃縮された試料が得られる。濃縮された 試料をｏ、４ｓミクロンのＺｙｄｅｘフィルターで濾過し、５ｙｎＣｒｏｐａｋ 　ＧＰＣのカラム（米国、インディアナ州、ラフアイエツト、Ｓｙｒ＋ｃｈｒｏ ＩＩ＋Ｉｎｃ、）でＨＰＬＣゲル濾過する。このカラムの寸法は５００ｍｍＸ　 ｌｏｉｍ　（内径）である、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１と０．０５Ｍホスフェ−） 　（ｐＨ７，０）を含有する緩衝液を用いて定組成溶離を行い、カラムからタン パクを溶離する。溶離される画分のどれがＰＣ−Ｃ３Ｆを含有するかを決定する ために、画分の生物学的活性を、前記のりａ−ン原性アッセイを用いて測定する 。）’Ｃ−Ｃ５Ｆ活性を有する所望の画分を集め、凍結乾燥し、減菌二重蒸留水 に溶解する。ＰＣ−ＣＦＳを含有するこの溶液を、次に、Ｖａｒｉａｎ　ＬＣ５ ５００を用いて分取逆相高性能液体クロマトグラフィーにかける。試料を、Ｖｙ ｄａｃ　Ｐｒｏｔｅｔｎ　Ｃ４逆相カラム（米国、カリフォルニア州、Ｖｙｄａ ｃ　５ｅｐａｒａｔｆｏｎ　Ｇｒｏｕｐ）に詰め、ＰＣ−ＣＳＦを溶離する。溶 離は溶液Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸水溶液）で１０分間、続いてＡ液からＢ 液〔０，１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリル含有の水（９０：ＩＯ）〕に変 わって５０分間行う。このりａマドグラフィーによってＰＣ−ＣＳＦ活性を有す る２つの主要成分が得られる。すなわち、見掛けの分子量が約２０ＫｄのＰＣ− Ｃ３Ｆ−αと見掛けの分子量が約６０〜７０１：ｄであるＰＣ−ＣＳＦ−βとで ある。

単離された画分は、Ｖｙｄａｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ４逆相分析カラム（１５０ Ｘ４．５ｍｍ内径）を用いるＨＰＬＣと、高速タンパク液体クロマトグラフィー （、ＦＰＬＣ）とで分析した。

ＰＣ−ＣＳＰ活性を含む画分のクロマトグラフパターンに基づいて、ＰＣ−Ｃ３ Ｆ−αが、明かに均一に精製されたこと、およびＰＣ−ＣＳＦ−βがほぼ７０〜 ８０％の純度であると推定される。

ＰＣ−ＣＳＦ−βの画分のＨＰＬＣ逆相分析のプロフィルは低濃度のＰＣ−ｅｓ Ｆ−αで汚染されていることを示唆している。

ＰＣ−ＣＳＦ−αとＰＣ−ＣＳＦ−βはともに、前記のクローン原性アッセイで 、原始細胞コロニー形成単位（ＰＣ−ＣＦＵ）を誘発する性能について試験した 。両方のＰＣ−ＣＳＦとともにＰＣ−ＣＦＵを誘発することができる。またＰＣ −ＣＳＦ−βの活性は、ＰＣ−ＣＳＦ−αと組合わせた場合、少なくとも付加物 であり、かつ相乗的であり得る。

塞１■１１ ＰＣ−ＣＳＦ−αとＰＣ−Ｃ３Ｆ−の　の６ストローマ細胞のみ、ＮＡ細胞のみ 、およびストローマ細胞とＮＡ細胞を組合わせたものの培養物から得た馴化培地 を、ＳＤＳの存在下、垂直ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。その ゲルパターンは、ＰＣ−ＣＳＦ−αに匹敵する分子量（すなわち２０〜２５Ｋｄ ）を有するタンパクが、ＮＡ細胞、およびストローマ細胞プラスＮＡ細胞由来の 馴化培地中に存在することを示した。ＰＣ−ＣＳＦ−βに匹敵する分子量（すな わち６０〜７０Ｋｄ）を有するタンパクが、ストローマ細胞、およびストローマ 細胞プラスＮＡ細胞由来の馴化培地に存在している。このデータは、２０〜２５ ＫｄのタンパクがＮＡ細胞の生成物であり、一方６０〜７０Ｋｄのタンパクがス トローマ細胞の生成物であるということを示唆している。

微ユ士ＩｊＥｆｆｉシ妃１叛 下記の細胞系は、ブタペスト条約の協約に基づいて、米国、メリーランド州、ロ ックビル、パークローン・ドライブ、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレク ション（ＡＴＣＣ）に寄託され、次のような受託番号が与えられている。

（以下余白） 細胞系　ＡＴＣＣ番号　寄託日 ＢｏＢｍ３＋８０　ＣＲＬ−９８２５１９８８年９月１４日ＭｏＢｍ２＋４４　 ＣＲＬ−９８２６１９８８年９月１４日ＢｏＢｍストロ−ｖ＋　ＣＲＬ−９８２ ７１９８８年９月１４日ＰｏＢｍ　２÷１２　ＣＲＬ−９８２８１９８８年９月 １４日ＨｕＢｔｔｒ２＋４０　ＣＲＬ−９８２９１９８８年９月１４日本願が米 国特許として許可され発行されると、これら寄託物入手の制限はすべて最終的に 解除される。また本願が係属中は、特許庁長官が米国特許法施行規則（３７ＣＦ ｆり　１．１４と米国特許法（３５０ＳＣ）　１．２２に基づいて権利を与える ことを決定した者は上記指定の寄託物を入手する権利が得られる。さら最終の請 求があってから５年間、またはその米国特許の実施可能期間のいずれか長い期間 維持される。これらの寄託物は、便宜のために寄託されたものであって、本願の 説明からみてこの発明を実施するのに必要なものではない。

肚且又藍 以下の引用文献は、この発明を考察する際に引用されたものである。

Ｂａｒｒら　（１９８６）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ土：　４２８゜Ｂａｒ ｌｏｚｚａｃｉら（１９Ｂ？）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ 、　ＵＳＡ旦ニア６９１゜ Ｂｉｏｆｅｌｄｔ　Ｏｈｍａｎｎ　（１９Ｂ？）　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、 　Ｃｙｔｏｃｈｅ＋＋＋、　３５：６２７゜ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　（１９７９）　Ｇｅｎｅ　８　：　１７゜Ｂｒｏａｃｈ　（ １９８１）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ上：　４４５　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）　。

Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、１０ユニ３０７゜Ｃｈａｎ ｇら（１９７７）　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：　１０５６゜Ｃ１ｅｗｅｌ　ｌら（ １９６９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６２：　１ １５９゜Ｃｌｅｗｅｌｌ　（１９７２）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１０：　 ６６７゜Ｃｏｈｅｎ　（１９７２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　６９：　２１１０゜Ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）　Ｐｒｏｅ、Ｎａ ｔｏｌ　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　２９２：　１２８゜Ｆｉｅｒｓら（１９７ ８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７３：　１１３゜Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８　：　４０５７゜Ｇｒａｈａ＋ａおよびＶ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７１１）　Ｖｆｒｏｌｏｇｙ　５２：　５４６゜Ｇ ｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　７：し３９６１゜ Ｈａ＋＊＋ａｅｒｌｉｎｇら（１９８１）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−ＣｅｌｌＨｙｂｒｆｄｏｔａｓ。

Ｈｅ５ｓら　（１９６１３）　Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、７　：　１ ４９゜Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、７５：　１９２９゜Ｈｉｔｚｅｍａｎら（１９８０）　Ｊ、ＢｉｏＪ、Ｃｈ ｅｗ、２５５：　２０７３゜Ｈｏ１ｌａｎｄら（１９７Ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　１７：　４９００゜Ｈｏ１ｌａｎｄ　（１９８１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｔ　２５６　二　１３８５゜Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）　Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

Ｌａｅ＋ｅａ＋１ｉ　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：　６８０゜Ｌａｎ ｇら　（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４３：　５３１゜Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８ ２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ ｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、　Ｙ、　）。

ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ　ｅｄｓ、　（１９８７）　Ｉ＋ｗｍｕｎｏｃｈ ｅｉ＋１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｃｅ１ｌおよびＭｏｋｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅ＋ｇｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ）。

Ｍａｘａｍら（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６ ５：　４９９゜Ｓａｎｇｅｒら（１９７？）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ 、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７４：　５４６３゜５ｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０）　Ｈｙ ｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

５ｃｏｐｅｓ　（１９８７）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２ ｎｄ　ｅｄ、　（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ）。

Ｓｈｉｍａｔａｋｅら　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：　１２８゜Ｗａ ｒｎｅｒ　（１９ｇ４）　ＤＮＡ　３　：　４０１゜ＮｕおよびＧｒｏｓｓｍａ ｎ　（１９ｇ？）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ。

１５４、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ｐａｒｔ　Ｅ。

Ｗｕ　（１９８？）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｏｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、 １５５゜Ｒｅｃｏ＋＊ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ｐａｒｔ　Ｆ。

Ｚｏｌｌｅｒ　（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：　 ６４８７゜の　口 この発明のＮＡ細胞には、ＰＣ−ＣＳＦの生産、および造血障害のため細胞交換 治療を必要とする個体にその治療を行う商業的な有用性がある。ＮＡ細胞に対す るモノクローナル抗体は、これらＮＡ細胞の単離と同定に有用である。

ＰＣ−ＣＳＦは造血障害の治療に有用であり得る。特に、ＰＣ−ＣＳＦは、造血 速度を著しく変化させる場合、初期免疫性を調節するポテンシャルを持ち得、特 に新生児について感染症に対する免疫応答を調節するポテンシャルを持ち得る。

後者の場合、ヒトに対してのみならず農耕用動物を含む家畜の治療にも重要であ る。その上に、ＰＣ−ＣＳＦは、ＮＡ細胞に対する刺激剤であるから骨髄移植治 療を増大させるのに用いられ得る。

上記の外に、ＰＣ−ＣＳＦは、細胞の増殖が要望されるその外の症例、例えば創 傷の治癒、神経細胞、特に老化した神経細胞の増殖の刺激に用いられ得る。

ＦＩＧ、　ＩＡ ５　２５　５０　ｔｏ。

Ｅ二：　Ｔ　ｋ＋：、（％ン ＦＩＧ、　ＩＢ ＦＩＧ、　２Ａ 特表千４−５０２８５３　（１９） ＋　２５　５０　ｔｏ。

Ｅ：１比ｒ’ｔ） ＦＩＧ、　２Ｂ ５　２５　５０　ｔｏ。

１　２５　５０　ｔｏ。

仕ムニ充臣、Ｘ ＢＯ，Ｂ、Ｍ、−１ ４本）−；＋に哩 ＢＯ，Ｂ、Ｍ、−３ＨＬＪ、８．Ｍ、−Ｉ　ＭＬｌ、Ｂ、Ｍ、−Ｉ　ＰＯ，Ｂ、 Ｍ、−＄ＢＯ，Ｂ、Ｍ、−４ＨＬｌ、Ｂ、Ｍ、−２ＭＬｌ、Ｂ、Ｍ、−２ＢＯ， Ｂ、Ｍ、−３（泡＄ＡＮ゛レバ（１し７００　）ＨＵ、Ｂ、Ｍ、−２（緬４’Ｌ ”　ｂ〆＋し６°　）ＭＬｌ、Ｂ、Ｍ、−２（毛Ｌイル゛　レベ゛Ｃし　ｔθ　 ）ｐｏ、ｓ、Ｍ、−ｉ　（ＳＬ４’Ｌ’　しＳ’＋ｔ、−Ｊ−ｒ　）ｐＣ−ＣＳ Ｆ上ジ責　＋、５　＋４＋＋＋４　−　＋　＋　＋１、ＲＰＭ！−１６４０＋Ｉ Ｏ％ＦＢＳ２、　ウ３−　蓼４Ｘ＊ｂｋ＊　＊　２４ＱＭｄ’ｋｆＲｒ５　七− （ｔｒ＝　ｄｚｔ　（ｏ、ｎ、ｓ、ｙｃ＋ｔ−１−、ｖ：ハｔｕ＝もつj ３、　６時同／勤膏［虻１４ト伸八う　モ乳叡しＴ；様　μヒｃＤ、夢７．＋し ７−　で・　５７冠１したもの　）５、　コロニー１７　窒駿胚Ｊ１て・・１０ 同　Ａ１ぼ礒。

ＦＩＧ、　５ 上二ｉ！へ粁 ＦＩＧ、　６ 平成３年４月８日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．精製された原始細胞コロニー刺激因子（ＰＣ−ＣＳＦ）。
2. ２．マウス骨髄細胞由来の請求項１に記載の精製ＰＣ−ＣＳＦ。
3. ３．ウシ骨髄細胞由来の請求項１に記載の精製ＰＣ−ＣＳＦ。
4. ４．ヒト骨髄細胞由来の請求項１に記載の精製ＰＣ−ＣＳＦ。
5. ５．ＰＣ−ＣＳＦをコードする粗換えベクター。
6. ６．請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
7. ７．精製されたＰＣ−ＣＳＦ−α。
8. ８．精製されたＰＣ−ＣＳＦ−β。
9. ９．成熟リンパ細胞および骨髄細胞を実質的に含有していない多分化能リンパ造 血始原細胞（ＮＡ細胞）を含む細胞懸濁液。
10. １０．ヒト由来のＮＡ細胞懸濁液であって、該ＮＡ細胞が、Ｍｙ１０抗原に対す るモノクローナル抗体に対して免疫学的に反応性でなく、該モノクローナル抗体 がハイプリドーマ細胞系、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−８４８３によって産生される、 ヒト由来のＮＡ細胞懸濁液。
11. １１．骨髄由来のＮＡ細胞と免疫学的に反応性であるモノクローナル抗体を産生 するハイプリドーマ。
12. １２．請求項１１のハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
13. １３．ＮＡ細胞を含有する細胞集団の生産方法であって、（ａ）ＮＡ細胞を含有 する細胞懸濁液を供給する工程；（ｂ）ＰＣ−ＣＳＦと、細胞増殖に必須な他の 成分とを含有する培地内において、細胞増殖を促進する条件下で該細胞懸濁液を 増殖させる工程； （ｃ）該（ｂ）工程で得られる細胞培養物からＮＡ（ＮＡ）細胞の集団を単離し 回収する工程；および （ｄ）ＰＣ−ＣＳＦと、細胞増殖に必須の他の成分とを含有する培地内において 、細胞増殖を促進する条件下で該（ｃ）工程で単離された細胞を増殖させる工程 ； を包含する方法。
14. １４．多分化能リンパ造血始原細胞を含有する細胞集団の生産方法であって、 （ａ）個体の造血組織からの細胞懸濁液を供給する工程；（ｂ）該細胞懸濁液を 、ＮＡ細胞に対するモノクローナル抗体と接触させる工程、ここで該抗体は該Ｎ Ａ細胞上の抗原を認識するが、より成熟したリンパ細胞および骨髄細胞上の抗原 を認識しない；および （ｃ）核抗体が結合した細胞を、前記細胞懸濁液から分離し回収する工程； を包含する方法。
15. １５．造血系の障害について個体を治療する方法であって、（ａ）薬学的に受容 され得る媒体中のＮＡ細胞懸濁液を供給する工程； （ｂ）該造血障害を克服するのに充分な量のＮＡ細胞の投与量を個体に注射する 工程； を包含する方法。
16. １６．さらに前記個体が、該個体内でＮＡ細胞の増殖を刺激するのに充分な投与 量で、薬学的に受容され得る賦形剤中のＰＣ−ＣＳＦの溶液を注射することによ って治療される、請求項１５に記載の方法。
17. １７．細胞増殖によって緩和される障害について個体を治療する方法であって、 （ａ）薬学的に受容され得る賦形剤中のＰＣ−ＣＳＦの溶液を供給する工程； （ｂ）該障害の徴候を緩和するＰＣ−ＣＳＦの薬理学的に有効な投与量を個体に 投与する工程； を包含する方法。
18. １８．前記個体が造血障害について治療され、そして該造血障害を緩和するＰＣ −ＣＳＦの投与量が投与される、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記個体が創傷について治療され、そして、該創傷の治癒を刺激するＰＣ −ＣＳＦの投与量が投与される、請求項１７に記載の方法。
20. ２０．前記個体がニューロン起原の障害について治療され、そして、ニューロン の再生を刺激するＰＣ−ＣＳＦの投与量が投与される、請求項１７に記載の方法 。